A metilação in vitro Ensaio de Proteína Estudo Arginina metilação

1Department of Pulmonary, Critical Care, Sleep, and Allergy, University of Illinois at Chicago, 2Department of Hematology and Oncology, University of Illinois at Chicago, 3Jesse Brown Veterans Affairs Medical Center
Published 10/05/2014
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Biology

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Summary

Proteína arginina metilação, catalisada por uma classe de enzimas viz., Proteína arginina metil transferases (PRMTs), é o processo de adição enzimática do grupo (s) metilo para argininas dentro proteínas. O ensaio de metilação in vitro é a ferramenta mais confiável para avaliar o estado de metilação de substratos PRMT conhecidos ou novos.

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Bikkavilli, R. K., Avasarala, S., Van Scoyk, M., Karuppusamy Rathinam, M. K., Tauler, J., Borowicz, S., et al. In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation. J. Vis. Exp. (92), e51997, doi:10.3791/51997 (2014).

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Abstract

Proteína arginina metilação é uma das modificações pós-traducionais mais abundantes no núcleo. Proteína arginina metilação pode ser identificada e / ou determinada por meio de métodos de proteómica, e / ou imunotransferência com anticorpos específicos metil-arginina. No entanto, essas técnicas às vezes pode ser enganosa e muitas vezes fornecem resultados falsos positivos. Mais importante, estas técnicas não podem constituir uma prova directa de apoio à especificidade do substrato PRMT. Ensaios in vitro de metilação, por outro lado, são os ensaios bioquímicos, que são sensíveis, e consistentemente se revelar as proteínas identificadas são realmente substratos PRMT. Um ensaio típico de metilação in vitro inclui, PRMTs activa purificada, purificada e substrato marcado com um radioisótopo doador de metilo (S-adenosil-L-[metil-3H] metionina). Aqui, descrevemos um protocolo passo-a-passo para isolar PRMT1 cataliticamente activo, um membro da família PRMT ubiquamente expressa. A mimtilo transferase da PRMT1 purificados foram depois testados em proteína Ras-activação da GTPase de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato PRMT conhecido, na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Este protocolo pode ser utilizado não só para o estabelecimento do estado de metilação de novos substratos PRMT1 fisiológicos, mas também para a compreensão do mecanismo de base de arginina proteína metilação.

Introduction

Metilação proteína foi descrita pela primeira vez em 1968 1. Foi só a primeira clonagem de PRMT1 em 1996, que os pesquisadores começaram a apreciar a importância desta modificação pós-tradução 2. Curiosamente, cerca de 2% de resíduos de arginina em proteínas de extractos nucleares são metilados 3, indicando que a abundância desta modificação. A arginina é um aminoácido carregado positivamente, com uma cadeia lateral básica e os de azoto / s nas cadeias laterais de arginina pode ser modificada após a tradução através da adição de um grupo metilo, um processo conhecido como arginina metilação 4-6. Metilação arginina é catalisada por uma classe de enzimas viz. Transferases de proteína de metilo, arginina (PRMTs). Argininas pode ser ou dimetilado monomethylated e este último pode ser simétrica ou assimétrica, dependendo do tipo de PRMTs que catalisam o processo de 4-6.

Proteínas que mostrar argininae-glicina motivos ricos são alvos potenciais para a catálise mediada por PRMT. Metilação mediada por PRMT de substratos foi mostrado para modular a interacção proteína-proteína, interacção proteína-ácido nucleico, a função da proteína, a expressão do gene, e / ou de sinalização celular, as quais são essenciais para a homeostase celular normal 7-9. A fim de entender o papel biológico da proteína arginina metilação, ensaios precisos, eficientes e reproduzíveis são necessários para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados.

No ensaio in vitro de metilação, que avalia a capacidade de catalisar a PRMTs purificados metilação dos seus substratos, é um ensaio bem aceite para o estudo de metilação arginina 10-12. O êxito geral deste ensaio depende em grande parte da actividade dos PRMTs purificadas. PRMTs pode ser expressa e purificada a partir de bactérias ou células de mamífero 10,11. Este ensaio in vitro de metilação, como dPORMENORIZADA na secção de protocolo, baseia-se num método originalmente descrito por Tini e colegas 10. Neste protocolo, que mostram em detalhe os passos envolvidos na expressão e purificação da PRMT1 em células de mamíferos. A capacidade da PRMT1 purificada catalisar a metilação em Ras-activação da GTPase da proteína de ligação da proteína 1 (G3BP1), um substrato conhecido PRMT 8, foi depois avaliado na presença de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina como o doador de metilo. Utilizando este ensaio, pode-se definir de forma fiável a capacidade dos PRMTs a novel metilato ou substratos conhecidos, o que é um passo fundamental no estudo da proteína arginina metilação.

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Protocol

1: Preparação de construções de expressão

  1. Antes de se iniciar o protocolo, PRMTs clones em vectores de expressão de mamíferos com um epitopo tag N-terminal (Myc ou HA), e o substrato em-quadro com a glutationa-S-transferase (GST) para a expressão de proteínas de nível elevado e purificação a partir de células bacterianas Os lisados, utilizando técnicas de biologia molecular padrão.

2 Purificação de PRMTs

  1. Utilizar placas de 100 mm de cultura para manter as células epiteliais brônquicas humanas (Beas2B). Passagem das células a cada três dias e não deixá-los crescer até confluência.
  2. No dia antes da transfecção, 7,5 x 10 semear 5 células em 10 ml de meio de cultura de uma cultura de 100 mm de prato. Redemoinho para dispersar uniformemente as células, e incuba-se a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificado incubadora.
  3. No dia seguinte, aspirar a mídia e adicionar 5 ml de meio de cultura sem soro e antibióticos. Agitar e aspire o meio. Repita este passo ummais tempo e, finalmente, adicionar 5 ml de soro / meio sem antibiótico e prossiga para transfecção.
  4. Dilui-se 6 ug de ADN de plasmídeo em 750 ul de meio isento de soro em um tubo de 1,5 ml de centrífuga de plástico estéril.
  5. Em outro tubo de 1,5 ml de centrífuga de plástico, diluir 30 ul de reagente de transfecção em 750 ul de meio isento de soro.
  6. Transferir a solução de reagente de transfecção diluída (passo 2.5), para o tubo contendo ADN diluído (passo 2.4). Misture com cuidado pipetando para cima e para baixo várias vezes.
  7. Incubar a mistura de transfecção à temperatura ambiente durante 15 min.
  8. Após 15 min, a mistura de transfecção pipetar suavemente sobre as células, redemoinho para misturar uniformemente, e incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificado incubadora.
  9. Depois de 3 horas, aspirar o meio contendo misturas de transfecção das células. Adicionar meio de cultura celular fresco suplementado com soro e antibióticos.
  10. Incubar a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2 humidificadoincubadora durante 48 horas.
  11. Após 48 horas, lisar as células em 1 ml de tampão de lise (1 x solução salina tamponada com fosfato, 1% de Nonidet P-40, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de dodecil sulfato de sódio, e 1 ug / ml de fluoreto de sulfonilo phenlymethyl). Recolher os lisados ​​para um tubo de centrífuga de plástico com um tirante de células e incuba-se os lisados ​​em gelo durante 30 min.
  12. Centrifugar os lisados ​​a 15000 xg durante 10 min numa centrífuga de bancada para limpar os lisados ​​a partir de detritos de células. [* É altamente recomendável para confirmar a expressão da HA-PRMT1 via immunoblotting de uma alíquota de lisados ​​com anticorpos anti-HA, antes de prosseguir para a purificação das enzimas, para ensaio de metilação.]
  13. Para a purificação de PRMTs, incubar 3 mg de lisados ​​de células com 30 ul de suspensão de 50:50 anti-HA matriz de afinidade em tampão fosfato salino (PBS), e rodar durante a noite a 4 ° C em um tubo de rotor.
  14. No dia seguinte, girar os tubos a 14.000 xg em uma centrífuga de bancada para 2 min para recolheros grânulos. Descartar o sobrenadante e lava-se as pérolas de 3x com 1 ml de tampão RIPA [Tris 20 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, EDTA 5 mM e 1% de Triton-X-100], em cada lavagem foi seguido por centrifugação a 14.000 xg durante 2 min. Após a terceira lavagem, lavagem das esferas uma vez com 100 ul de tampão de metilação (50 mM Tris pH 8,5, KCl 20 mM, 10 mM de MgCl2, 1 mM de β-mercaptoetanol, 100 mM de sacarose). Após a centrifugação, remove-se o sobrenadante. As contas contendo os PRMTs imobilizados está pronto para ser utilizado no ensaio de metilação. [* É altamente recomendável usar as PRMTs imobilizados imediatamente no ensaio de metilação.]

3 Purificação de Substrato

  1. Inocule uma colónia única de GST-G3BP1 BL21 transformada em 5 ml de meio de Luria-Bertani (LB) contendo 100 ug / ml de ampicilina. Crescer as culturas durante a noite a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
  2. No dia seguinte, a transferência da cultura durante a noite para 50 ml de meio fresco LB e contInue a crescer a um OD 600 de 0,5-0,7 (Demora cerca de 2 horas).
  3. Quando a DO600 atinge 0,5-0,7, adicionar isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) até uma concentração final de 1 mM e continuar a cultura durante 4 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
  4. Colher as células por centrifugação a 1500 xg durante 10 min, e processar o pellet para a purificação de GST ou armazenar a -80 ° C.
  5. Re-suspender o sedimento de bactérias em 5 ml de tampão de lise (PBS 1x com inibidores de protease, 100 ug / ml de lisozima, e 0,1% de Triton-X-100) e incuba-se os lisados ​​a 37 ° C durante 30 min. Nesta altura, os lisados ​​aparece turvo e viscoso, devido à libertação de ADN genómico bacteriano.
  6. Cisalhamento do ADN genómico por ultra-sons (10 impulsos de 1 segundo cada um com uma amplitude de 30%).
  7. Limpar os lisados ​​por centrifugação a 15.000 xg durante 10 minutos e transferir o sobrenadante límpido para um tubo de 15 ml. Se o sobrenadante é claro não repetir o centrifugação processo mais uma vez.
  8. Enquanto isso, lavar as esferas de GST-Sepharose duas vezes com PBS gelado e se obter uma suspensão de GST-Sepharose em PBS de 50:50. Adicionar 200 ul da suspensão de GST-Sepharose para o ligado celular bacteriana foi afastada e rodam a 4 ° C durante 1 hora.
  9. Depois de 1 hora, centrifugar os tubos a 500 xg por 3 min para recolher as esferas. Lavam-se as esferas de 3x com PBS gelado.
  10. Após a lavagem final, voltar a suspender as pérolas em 100 ul de tampão de eluição (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, glutationa 30 mM) e rodar a 4 ° C durante 10 min.
  11. Centrifugar os tubos a 15.000 xg durante 2 minutos e transfere-se o sobrenadante contendo a proteína purificada num outro tubo de centrífuga de plástico. Efectuar a electroforese de gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) em 5 ul de análise da proteína purificada, juntamente com quantidades conhecidas de albumina de soro bovino (BSA) para estimar a concentração de proteína purificada.

4. metilação Assay

Nota: Execute seguintes passos em uma área separada designada para o trabalho de radioisótopos e de acordo com os protocolos da instituição sobre a realização de experimentos com isótopos radioativos.

  1. Adicionar 2 mg de substrato purificada GST-e uma mistura mestre contendo tampão de metilação 1x (50 mM Tris pH 8,5, KCl 20 mM, 10 mM de MgCl2, 1 mM de β-mercaptoetanol, 100 mM de sacarose), 1 uCi de S-adenosil- L-[metil-3H] metionina, e água até um volume final de 10 ul às PRMTs imobilizadas passo (2.13) e incuba-se a reacção a 30 ° C durante 1 hora.
  2. Após 1 h, parar a reacção por adição de 10 ul de tampão de amostra 2x SDS. Após a desnaturação das amostras a 95 ° C durante 10 min, separar as amostras sobre um gel de SDS-PAGE
  3. Mais tarde, transferir as proteínas separadas a partir do gel de SDS para uma membrana de nitrocelulose usando uma transferência electroforética semi-seca.
  4. Após a transferência, a membrana de cobertura com umautofluor (intensificador de imagem autorradiográfica), e agitar suavemente durante 2 horas à temperatura ambiente. Após 2 horas, despeje o autofluor e guarde para uso posterior. [* Rotular o tubo de material radioativo]
  5. Ar rapidamente secar a membrana sobre um papel de filtro, selá-lo em um saco de plástico e expor a membrana a um filme de raios-X a -20 ° C. Tempo de exposição suficiente varia entre 5-30 dias.

5. Confirmação de Expressão PRMT e carga igual de substrato

  1. Depois de atingir posições suficientes, transferir a membrana a uma caixa de plástico que contém um tampão de bloqueio [solução salina tamponada com Tris com Tween-20 (TBST + 3% de leite magro)] e agitar suavemente durante 1 hora.
  2. Descarte o tampão de bloqueio como resíduos radioactivos. Incubar a membrana com anticorpo anti-HA (1: 1000 de diluição) em TBST durante a noite a 4 ° C, com balanço suave.
  3. Lava-se a membrana 3 x com TBST e incubar a membrana com um anticorpo secundário marcado com HRP anti-rato(1: 5000 de diluição) em TBST à temperatura ambiente durante 1 hora com agitação suave.
  4. Após 1 h, lavar a membrana com TBST 3x, e realizar a detecção de proteínas chemiluminiscence com um substrato HRP.
  5. Após a detecção dos PRMTs marcadas com HA, incubar a membrana com uma solução de coloração Ponseau-S, durante 5 minutos à temperatura ambiente. Lavar rapidamente as membranas 3x com água para detectar os substratos etiquetados com GST. Digitalizar a imagem.

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Representative Results

As capacidades de HA-PRMT1 para metilar GST-G3BP1 foram determinadas por um ensaio in vitro de metilação. PRMT1 marcada com HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B foi utilizado numa reacção de metilação contendo GST-G3BP1, e 1 ^ Ci de S-adenosil-L-[metil-3H] metionina, como um doador de metilo. PRMT1 poderia catalisar eficientemente a metilação de GST-G3BP1 (Figura 1, painel superior). Reacções de metilação, utilizando menus pendentes executadas em lisados ​​de células transfectadas de vector vazio Beas2B serviram como controlo negativo (Figura 1, painel superior, faixa 1). Imunotransferência com anticorpos anti-HA, confirmaram a expressão da PRMT1 (Figura 1, painel do meio). Ponseau-S coloração foi utilizado para demonstrar a igual carga de GST-G3BP1 em ambas as reacções (Figura 1, painel inferior).

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Figura 1 metilatos PRMT1 G3BP1. PRMT1 mediada G3BP1 metilação foi avaliada usando uma reacção de metilação in vitro que inclui PRMT1 marcada com HA purificada a partir de lisados ​​de células Beas2B, GST-G3BP1 purificado a partir de E. coli e S-adenosil-L-[metil-3H] metionina, como um doador de metilo. O painel superior representa o fluorograph para G3BP1 metilação. Painel do meio representa o imunotransferência confirma a expressão da PRMT1 marcada com HA. E, o painel inferior representa Ponseau-S mancha corada para determinar a igualdade de carga do substrato (GST-G3BP1).

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Discussion

O protocolo aqui descrito, é rotineiramente utilizada para estabelecer o estado de metilação dos substratos PRMT identificados. Este ensaio robusto e consistente também irá fornecer provas definitivas sobre a especificidade da PRMTs para os seus substratos. Os componentes essenciais para o sucesso deste ensaio são os seguintes: 1 Expressão de PRMTs em células de mamíferos, 2 Actividade de PRMTs purificadas, 3 Expressão e purificação de substrato, e 4 completa transferência western das proteínas para a membrana de nitrocelulose.

PRMTs recombinantes expressos e purificados a partir de bactérias, também podem ser usadas em reacções de metilação in vitro 10,11,13. No entanto, uma vez que cada PRMT requer estratégias de purificação diferentes, as condições de armazenagem e temperaturas de armazenagem, o uso de PRMTs recombinantes in vitro reacções de metilação pode não ser ideal. Além disso, PRMTs recombinantes também são de curta duração 11. Considerando esses desafios, acreditamos que purificação de PRMTs de células de mamíferos é conveniente, e consistente para executar in vitro reações de metilação. Se a expressão transitória de PRMTs em células de mamíferos parece ser inconveniente, em alternativa, pode-se considerar a possibilidade de linhas de células estáveis ​​para PRMTs. Mais importante ainda, a expressão da PRMTs em células de mamíferos, é a única forma disponível para determinar actividades catalíticas PRMT em resposta a estímulos, por exemplo, factores de crescimento, citocinas, etc

A principal limitação do uso de PRMTs purificados a partir de fontes de mamíferos, é a contaminação com outras PRMTs durante o processo de purificação. No entanto, pode-se utilizar construções mutantes dos PRMTs que são desprovidos de actividade de transferase de metilo como controlos adicionais. Se os PRMTs sob investigação podem formar homod�meros, construções mutantes podem não ser bons controles. Alternativamente, pode-se considerar a utilização de PRMTs purificadas a partir de células esgotadas de PRMTs alvo como um controlo negativo ou usar recombinantePRMTs a partir de fontes bacterianas. O protocolo apresentado descreve um ensaio simples, conveniente e consistente para sondar proteína arginina metilação. O método descrito não é apenas essencial para a identificação e estabelecimento do estado de metilação de substratos PRMT novos, mas também para a nossa compreensão básica do mecanismo de arginina proteína metilação.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado por um Prémio de Mérito do Departamento de Assuntos de Veteranos dos Estados Unidos, e um NIH conceder R01CA138528 a RW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine Perkin Elmer
Ecoscint ultra  National Diagnostics LS-270
Bottle top dispenser National Diagnostics LS-900
AutoFluor National Diagnostics LS-315
6 ml Scintillation Vials National Diagnostics SKU:SVC-06
GST-sepharose GE Life Sciences
L-Glutathione Reduced Sigma G4251
Lipofectamine Invitrogen Transfection reagent
Beas2B ATCC
Optimem Invitrogen
NP-40 US-Biologicals
SDS Sigma
Sodium deoxycholate Sigma
PMSF Sigma
anti-HA affinity matrix Roche
Tris Sigma
Nacl Sigma
Bio-rad gel doc Bio Rad
anti-HA antibody roche
Ponseau S Fisher Scientific

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References

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