Effektiv Gene Transfer i Chick näthinnor för Primär cellkulturstudier: En

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Embryonala chick retinala cellkulturer utgör värdefulla verktyg för studier av fotoreceptor biologi. Vi har utvecklat en effektiv genöverföring teknik baserad på ex ovo plasmid elektroporering av näthinnor före kultur. Denna teknik ökar avsevärt transfektionseffektivitet jämfört med för närvarande tillgängliga protokoll, vilket gör genmanipulation möjligt för detta system.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vergara, M. N., Gutierrez, C., Canto-Soler, M. V. Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach. J. Vis. Exp. (105), e52002, doi:10.3791/52002 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De kon fotoreceptorberikade odlingar härrör från embryonala chick näthinnor har blivit ett oumbärligt verktyg för forskare runt om i världen studerar biologi näthinnans nervceller, särskilt fotoreceptorer. Tillämpningar av detta system utöver grundforskning, eftersom de lätt kan anpassas till hög kapacitet teknik för läkemedelsutveckling. Dock har genetisk manipulation av retinala fotoreceptorer i dessa kulturer visat sig vara mycket utmanande, utgör en viktig begränsning av systemets användbarhet. Vi har nyligen utvecklat och validerat en ex ovo plasmid elektroporering teknik som ökar hastigheten för transfektion av retinala celler i dessa kulturer med femfaldigt jämfört med andra närvarande tillgängliga protokoll 1. I denna metod embryonala chick ögon är enucleated vid steget 27, RPE avlägsnas och näthinnans koppen placeras i en plasmid-innehållande lösning och elektro användning konstrueras enkelt kun-gjorda elektroder. Näthinnor därefter dissocieras och odlas med användning av standardförfaranden. Denna teknik kan tillämpas på överuttryck studier samt till nedreglering av genexpression, t ex via användning av plasmid-driven RNAi-tekniken, som vanligen uppnås transgen expression i 25% av fotoreceptorpopulationen. Videoformat i denna broschyr kommer att göra denna teknik lättillgängliga för forskare inom området, vilket möjliggör studier av geners funktion i primära retinala kulturer. Vi har även inkluderat detaljerade förklaringar av de kritiska stegen i detta förfarande för ett lyckat resultat och reproducerbarhet.

Introduction

Dissocierade cellkulturer från embryonala chick näthinnor har använts i stor utsträckning för att studera olika aspekter av fotoreceptor cellbiologi, inklusive deras överlevnad 2-9, differentiering 10-12, neuritutväxt 13, och mer. Fördelarna med detta system, som utvecklats på 1980-talet av Ruben Adler och medarbetare och fulländade av hans och andra grupper 14-20, bor i de inneboende egenskaperna hos ungen som en djurmodell 21. Den stora storleken på ungen ögat, även vid embryonala stadier, ger stora mängder material för kulturer. Dessutom, när odlingarna utfördes med användning av embryonala dag (ED) 5 - 6 näthinnor, 55 - 80% av deras ursprungsceller differentierar som fotoreceptorer 14,15,18,22,23, och eftersom cirka 86% av fotoreceptorer i detta djur är konerna 24, dessa kulturer är särskilt lämpliga för studier som fokuserar på denna celltyp.

Vi har nyligen utveckped och kännetecknas en enkel teknik som gör det möjligt för högeffektiv plasmidtransfektion av celler i dessa kulturer, vilket bredda användbarheten av detta system genom att underlätta genetisk missexpression studier 1. Utvecklingen av denna teknik härrörde från ett tomrum i den vetenskapliga litteraturen av metoder som skulle tillhandahålla en acceptabel nivå av transfektion för att medge studier av genfunktion i en cell självständigt sätt. Detta beror delvis på att primära neuronala kulturer är notoriskt svåra att transfektera 25,26. Några av de mest använda teknikerna tidigare tillgängliga för detta ändamål ingår kemiska transfektion metoder såsom lipofektion eller kalciumfosfat-medierad transfektion, vilket resulterar i effektivitetsvinster i storleksordningen 3-5% och kan utöva betydande toxicitet 27-32. Även om användning av plasmider med en enzymatisk reportersystem kan kringgå problemet med dålig transfektionseffektivitet genom att förstärka signalen, de intediskriminera cellspecifika effekter, och resultaten baseras på en liten cellpopulation som kanske inte är representativa för hela. En annan allmänt använd metod i chick, RCAS virusinfektion, är endast tillämplig på prolifererande celler och därmed inte lämpar sig för detta primära retinal odlingssystem 33.

I det nuvarande protokollet embryonala chick ögon är enucleated i steg 27 (ED 5), det retinala pigmenterade epitel (RPE) avlägsnas, och det retinala koppen placeras i en elektroporation kammare fylld med en plasmid innehållande lösning och elektro använder skräddarsydda elektroder, följt av retinal dissociation och kultur med hjälp av standardtekniker 21. Efter att optimera detta förfarande har vi kunnat uppnå genomgående transfektion effektivitet i storleksordningen 22% av det totala antalet celler i odling och 25% inom ensam ljusmätare befolkningen, utan att kompromissa med överlevnad och differentiering egenskaperkulturer 1. Här ger vi ett detaljerat protokoll beskriver alla viktiga steg i detta förfarande för att säkerställa framgång och reproducerbarhet av denna teknik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som beskrivs i detta arbete genomfördes i enlighet med de riktlinjer som rekommenderas av Animal Care och användning kommittén vid Johns Hopkins University.

1. Inför Tid: Beredning av instrument, reagens och Rätter

  1. Framställning av ägg: Inkubera befruktade Vit Leghorn hönsägg vid 37,5 ° C och 60% relativ fuktighet under 5 dagar i ett ägg inkubator.
    OBS: En inkubator med gungande kapacitet kan vara till hjälp för att standardisera och synkronisera fosterutveckling, men gunga är inte absolut nödvändigt för utgången av detta protokoll.
  2. Plasmidberedning:
    1. Design plasmidkonstruktion för gen överuttryck eller nedreglering (till exempel med hjälp av RNAi-teknik 1,34) efter behov. Inkludera en reportergen (t.ex. EGFP, RFP eller LacZ) i konstruktionen när det är möjligt.
      OBS: Några vanliga promotorer såsom CMV, kan bli tystas efter gång. CAG Promoter (kyckling beta-aktin promotor med CMV-förstärkare) är ett mycket bra alternativ, vilket ger en effektiv långsiktig expression av genen av intresse 35-37.
    2. Bered en plasmid lösning vid en koncentration av 1,5 | ig / | il i steril PBS. EXTRA: Förbered plasmid lösning i förväg och förvara den frysta tills den ska användas.
      OBS: Högre plasmid koncentrationer inte leder till en betydande ökning av effektivitet, medan användning av lägre plasmid koncentrationer sänker transfektionseffektiviteten 1.
  3. Elektroder:
    1. För anoden använda en tjock guld lutad elektrod (se tabell av specifika material / utrustning). Torka rent med 70% etanol.
      OBS: Isolering av det guld lutad elektroden, med ungefär 0,5 mm exponerade, är det lämpligt att minimera läckage av elektrisk ström. Information för isolerande material kan hittas i tabell av specifika material.
    2. Gör en katod av en 2,5 mm i kvadrat Boxe filament, 4,5 mm bred (som normalt används i mikropipett avdragare). Med hjälp av pincett, lossa rutan och räta filament i en lång remsa. Därefter, under dissektionsmikroskop och med användning av en linjal som en guide, böj filamentet till ett kvadratiskt "U" form 3 mm lång vid basen och 2 mm höga i ett sida, med den andra sidan den kvarvarande längden av filamentet (figur 1 , C - D). Använd pincett, doppa elektroden i 96% etanol och lågor för att sterilisera. Sedan fäster en elektrisk ledning med en liten krokodilklämma till den längre armen av elektroden.
  4. Elektroporation avdelningen Setup:
    1. Förbered elektroporering kammaren genom att skära locket till en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör och fastsättnings, flata sidan nedåt, till en 100 mm petriskål med tejp (figur 1E).
      OBS: Andra behållare i form av en brunn i liknande storlek skulle fungera; Men, är lättillgängligt och autoklaverbar ett lock mikrocentrifugrör. Brunnenmåste vara tillräckligt stor för att rymma en chick öga och katodelektrod, men inte så stor att det resulterar i ett slöseri av plasmid lösning.

2. Ex ovo Elektroporation Förfarande

  1. Framställning av instrument:
    1. Sterilisera mikro-dissektion verktyg (2 par stora böjda Moloney pincett för att öppna äggskal och ösa ut embryon, 2 par fin spets böjda Dumont pincett för att ta bort RPE, ett par Bonn tandade tång för att lossa linsen och glaskroppen) genom att doppa tips i 96% etanol och flammande. Ren dissektion omfattning med hjälp av våtservetter doppas i 70% etanol. Värm en flaska steril Kalcium-magnesium-fri Hanks balanserade saltlösning (CMF-HBSS) i en 37 ° C vattenbad. Fyll 100 mm steril petriskålar till 3/4 fullt med varmt CMF-HBSS.
    2. Placera elektroporering kammare under en annan ren dissektion mikroskop och fyll med 120 il plasmid lösning. Anslut elektroderna till elektroporering apparat, vilket görsäker skräddarsydd elektroden är ansluten till den negativa polen och guld lutad elektroden till den positiva polen.
  2. Embryo Samling:
    1. Rengör äggen genom att torka skal med våtservetter som fuktats i 70% etanol. Behåll steril procedur under resten av protokollet för att undvika att bära föroreningar i kulturerna. Med hjälp av stora krökta Moloney pincett öppna försiktigt ett hål i äggskalet genom att försiktigt trycka på den rundade spetsen av ett ägg (över luftkammaren) och sedan gripa och dra ut skal bitar.
    2. Med en annan pincett bort membran och samla embryo genom att ösa ut av ägget (försiktigt så att inte skada embryot). Placera den i en skål med CMF-HBSS.
      OBS: samla så många embryon som behövs för att uppnå det önskade antalet retinala koppar för elektroporering som anges i 2.4.4
    3. Avgörande steg: Stage embryon enligt Hamburger och Hamilton 38.
      OBS: För att få optimal effektivitet embryonmåste vara i steg 27 (Figur 2A).
    4. Euthanize embryon genom halshuggning med hjälp av Moloney pincett.
  3. Erhållande Retinala koppar:
    1. Med fin Dumont pincett, försiktigt enucleate ögonen och övergå till en ny CMF-HBSS skålen.
    2. Utgående från den bakre delen av varje öga, nära synnerven huvudet, och med hjälp av två fina Dumont pincett, införa ett tips av varje pincett mellan neurala näthinnan och RPE och försiktigt dissekera ut RPE vara försiktig att inte skada neurala näthinnan (Figur 2B).
      OBS: Avsaknaden av Ca2 + och Mg2 + i lösningen kommer att hjälpa RPE lossnar från neurala näthinnan lättare.
  4. Elektroporation:
    1. Ställ in elektroporator parametrar att leverera 5 fyrkantpulser av 15 volt, 50 ms varaktighet och 950 ms intervall. Place "U-formad negativ elektrod inuti elektroporering kammare (mikrolockfyllninged med 120 pl av plasmid-innehållande lösning).
    2. Använda böjda Dumont pincett överföra en retinal koppen till elektroporering kammaren (genom att ösa, inte trycka), och placera den inne i "U" formade elektroden, med den bakre delen av näthinnan mot botten av elektroden och linsen uppåt ( Figur 2D).
    3. Placera anoden så att den vidrör den främre delen av ögat, bredvid linsen, och använda elektroporator fot pedal leverera elektriska pulser.
    4. Överför electroporated retinal kopp i ett annat petriskål med CMF-HBSS och upprepa elektroporation förfarande med var och en av de återstående retinala koppar.
      OBSERVERA: Upp till 6 retinala koppar kan electroporated med samma plasmid lösning utan en signifikant minskning i transfektionseffektivitet.
    5. Ta bort lins och glaskroppen för varje elektro retinal cup genom att greppa dem med Bonn tandade pincett och dra försiktigt genom than elev öppning medan du håller ögat på plats med baksidan av den vikta Dumont pincett.
    6. Gå vidare till dissociation och kultur elektroporerade retinala celler efter standardprocedurer.
      OBS: För en detaljerad protokoll om dissociation och kultur chick retinalceller avser Vergara och Canto-Soler 2012, Gäst fil 4 21 I detta protokoll cellerna såddes vid låg densitet på polyomitin belagda 6-brunnsplattor eller 35. -mm rätter (6 x 10 5 celler / 35 mm diameter väl eller maträtt). Det använda mediet är mediet 199 med penicillin / glutamin, 10% fetalt kalvserum (FCS), och linolsyra-BSA vid 100 pg / ml. Odlingarna upprätthålls i en fuktig 37 ° C inkubator med 5% CO2. Med hjälp av detta förfarande 5 - kan 6 x 10 6 celler typiskt erhållas per varje steg 27 elektro öga.
      OBS: Helst ska högst 3 timmar passera mellan embryosamlings- och cell bordläggningen, för att säkerställa god cellöverlevnadoch minimera stress. En typisk tidpunkt för observation och ytterligare analys efter 4 dagar i kultur, eftersom det vid denna tidpunkt cellerna har uppnått goda morfologiska och molekylära differentiering och överlevnad är fortfarande hög.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Här presenterar vi ett enkelt protokoll för plasmidtransfektion i enukleerat chick retinal koppar för efterföljande dissocierade cellkultur. Transfektion åstadkoms genom elektroporering med användning av lätt att göra anpassade elektroder (fig 1 - 2). De parametrar som beskrivs i detta protokoll har optimerats för att få transfektion effektivitetsvinster som sträcker sig mellan 20 och 27% (med ett genomsnitt på 22%) (Figur 3D). Lägg märke till att för de skäl som anges ovan, är dessa resultat kvantifieras efter 4 dagar i odling. I detta sammanhang hänvisar transfektionseffektivitet till procentandelen av celler som uttrycker transgenen i den totala cellpopulationen. Om endast fotoreceptorpopulationen betraktas, transfektionseffektiviteten öka till ett genomsnitt på 25% (figur 3D). Detta är en viktig egenskap eftersom dessa typer av kulturer i första hand användas för att studera fotoreceptorer.

Cellkulturer som har electroporat ed användning av denna teknik är omöjlig att skilja från deras icke-electroporated motsvarigheter i deras morfologi enligt DIC belysning, cellöverlevnadsegenskaper, och uttryck av molekylära markörer såsom visinin (en allmänt använd markör av fotoreceptorer) och Pax6 1.

Figur 1
Figur 1. Tillverkning av elektroderna. (A - D) Katoden är gjord av en fyrkantig låda filament (A), som först rätas (B) och böjs sedan med pincett till en fyrkantig U-form (C - D). Anoden är en tjock guld lutad elektrod (D); Lägg märke till isoleringen runt anodelektroden, vilket innebär att endast 0,5 mm i spetsen utsätts för. (E) Elektroporation setup. Infällda bilden visar högre förstoring av inramade området.pg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Beredning av näthinnan Cups för elektroporation. (A) Chick embryo på Hamburger och Hamilton fosterstadiet 27. (B) RPE är försiktigt bort från enukleerade ögonen med skarpa Dumont pincett. (C) Den retinal koppen till höger saknar RPE och redo för elektroporering. (D ) Katodelektroden är belägen inuti en elektroporation kammare gjord av ett lock mikrocentrifugrör 1,5 ml fylld med plasmid-lösning. Näthinnans koppen noggrant överförs till katoden uppåt och anodelektroden placeras ovanpå, bredvid linsen. Klicka här för att se en större versionav denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Effektivitet av transgen expression i odlade celler efter elektroporering (A - C). Retinal koppar elektroporerades med en GFP-expressionsplasmid, dissocierades och odlades under 4 dagar. Fluorescensmikrofotografier visar DAPI färgade kärnor (A) och GFP som uttrycker retinala celler (B). Anti Visinin antikroppar färgning utfördes för att identifiera fotoreceptorceller (C). (D) Diagram illustrerande transfektionseffektivitet uppnås genom ex ovo elektroporering, representeras som procentandelen av GFP-uttryckande celler bland den totala cellpopulationen (DAPI-positiv), eller bland de fotoreceptor populationen i synnerhet (Visinin positiv). Resultaten representerar medelvärdet ± SEM av 5 oberoende experiment. Skala bar i (A - C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det mest kritiska steget för att lyckas med detta protokoll är att välja rätt skede av embryon. I tidigare publikationer är en rad av de embryonala stadierna ges för dessa kulturer, vanligtvis definieras av dagars inkubation eller embryonala dagar (ED); därför är det vanligtvis antas att användning av ED 5 till ED 6 embryon kommer att ge likvärdiga resultat. Vi har emellertid funnit att på scenen 27 (ED 5), kommer transfektionseffektiviteten vara runt 22% av den totala cellpopulationen, som nämnts ovan; men effektiviteten kommer att minska till 16% om du använder etapp 28 embryon (ED 5.5), och till 12% i etapp 29 (ED 6) 1. Andra viktiga steg innefattar att upprätthålla sterila förhållanden genom hela processen; förvärva nödvändig fingerfärdighet för att undvika skador på näthinnan under dissekering och elektroporering; och undvika långa mellanrum från insamlingen av embryon till tiden för cell plätering.

En annan viktig faktor för att säkerställa god transfektion efficientor är koncentrationen av plasmiden innehållande lösningen: den rekommenderade 1,5 ug / ul är den lägsta koncentration som vi testade som inte resulterade i en minskning i effektivitet. Denna koncentration leder till en stor mängd plasmid-material med tanke på att de retinala kopparna badar i denna lösning. Använda den minsta storleken väl som kommer att rymma ögat (såsom ett lock mikrocentrifugrör) kan minimera detta problem. Dessutom kan flera ögon ska elektroporeras med användning av samma lösning; Vi har inte sett en minskad verkningsgrad när electroporating upp till 6 retinal koppar i följd i samma plasmid lösningen, och mer skulle kunna göras, men vi kan inte intyga att skillnaden i effektivitet därefter.

Tidigare publicerade protokoll har typiskt låg effektivitet av genöverföring för denna typ av odling, och därför ofta måste de lita på tekniker som mäter en produkt av enzymatiska reaktioner på en cell lysate för att öka känsligheten. Ett sådant tillvägagångssätt har nackdelen av att inte tillåta celltyp diskriminering och att förlita sig på ett litet antal celler är ansvariga för den observerade resultatet, som kanske inte alltid är reflekterande av beteendet hos de större cellpopulationen. Ett annat sätt att kringgå problemet med låg effektivitet är att utföra gentransfektion in vivo före ögon enukleation och kultur. Detta är en framkomlig väg, men det kan oftast endast tillämpas på specifika experimentella paradigm, eftersom både plasmid elektroporering och RCAS virusinfektion (en gemensam gentransduktion vektor i chick) behöver vanligtvis utföras vid tidigare utvecklingsstadier, att skapa en tidsförskjutning mellan transfektion och kultur. Detta är en viktig faktor, eftersom under denna tidsfördröjning cellerna exponeras för effekterna av både den extracellulära mikromiljön liksom intracellulära faktorer, som har betydande konsekvenser i tolkningen av experimental resultat. Däremot kan den kraftiga ökningen av genöverföringseffektivitet uppnås med ex ovo elektroporering metod för att studera geners funktion i en cell-inneboende sätt. Dessutom kan fördelen med denna höga transfektion hastigheten ökas ytterligare när den används tillsammans med automatiserad hög genomströmning cellsanalys 1.

Vid det inledande skedet av utvecklingen av denna teknik, underhålls vi elektroporerade RPE-saknar ögonmusslor i kultur under 24 timmar för att utvärdera effektiviteten i elektroporering uppnås med olika villkor 1. Även om vi inte försöker till kultur dem längre period gånger, vår erfarenhet visar att det protokoll som beskrivs häri också kan tillämpas på studier som förlitar sig på näthinnan organotypic explants, förutsatt att lämpliga långsiktiga Explantation odlingsbetingelser används.

Slutligen skulle det vara möjligt att utöka tillämpligheten av thär ex ovo elektroporering förhållningssätt till andra djurmodeller. Till exempel i vår erfarenhet transfektion av mus ögon på postnatal dag 1 eller 4 med hjälp av detta protokoll gav kvalitativt goda resultat i Explantation kulturer, men när dissocierade cellkulturer försök transfektionseffektivitet var i storleksordningen 6%, liknande den för andra tekniker. Således kan detta vara ett enkelt alternativ till andra protokoll för denna djurmodell, men det skulle behöva optimeras för det speciella systemet, om höga effektiviteter erfordras. Notera, som nämnts ovan, fosterstadiet vid tidpunkten för elektroporering var nyckeln till hög effektivitet resultatet som erhållits i chick, så denna parameter bör noga övervägas vid tillämpningen av tekniken till andra modeller.

Sammanfattningsvis kan ex ovo elektroporering teknik utöka tillämpligheten av in vitro retinal system kraftfulla verktyg för att komplettera in vivo-studier, erbjuder nya möjligheter för retinal forskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ECM 830 Electro Square Porator BTX/ Harvard Apparatus 45-0052
Genetrode, L-Shaped, 5 mm Gold Tip BTX/ Harvard Apparatus 45-0115 model 512 Gold tipped electrode used as anode
Polyimide Tubing Vention Medical custom made Internal Diameter: 0.5 mm/wall thickness: 0.15 - 0.2 mm. Used for insulating gold tiped electrode
2.5 mm square box filament, 4.5 mm wide Sutter Instrument Company FB245B Used to make cathode electrode
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco - Life Technologies 14175-095
Moloney forceps Roboz RS-8254 Serrated; Slight Curve; 4.5" Length
Dumont tweezers 5/45 Roboz RS-5058 Pattern #5, 45 Degree Angle; .10 X .06mm Tip Size; 109mm Length
Bonn micro forceps, 1x2 teeth Roboz RS-5172 Tying Platform; 1x2 Teeth, 0.12 mm Teeth; 3.75" Length; 0.3 mm Tip Width

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vergara, M. N., Gutierrez, C., O'Brien, D. R., Canto-Soler, M. V. Ex vivo electroporation of retinal cells: a novel, high efficiency method for functional studies in primary retinal cultures. Exp Eye Res. 109, 40-50 (2013).
  2. Chalmel, F., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Mol Biol. 8, 74 (2007).
  3. Goureau, O., Regnier-Ricard, F., Desire, L., Courtois, Y. Role of nitric oxide in photoreceptor survival in embryonic chick retinal cell culture. J Neurosci Res. 55, (4), 423-431 (1999).
  4. Hewitt, A. T., Lindsey, J. D., Carbott, D., Adler, R. Photoreceptor survival-promoting activity in interphotoreceptor matrix preparations: characterization and partial purification. Exp Eye Res. 50, (1), 79-88 (1990).
  5. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36, 755-759 (2004).
  6. Lorentz, O., Sahel, J., Mohand-Said, S., Leveillard, T. Cone survival: identification of RdCVF. Adv Exp Med Biol. 572, 315-319 (2006).
  7. Nakamura, M., Singh, D. P., Kubo, E., Chylack Jr, L. T., Shinohara, T. LEDGF: survival of embryonic chick retinal photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, (5), 1168-1175 (2000).
  8. Paes-de-Carvalho, R., Maia, G. A., Ferreira, J. M. Adenosine regulates the survival of avian retinal neurons and photoreceptors in culture. Neurochem Res. 28, (10), 1583-1590 (2003).
  9. Stenkamp, D. L., Gregory, J. K., Adler, R. Retinoid effects in purified cultures of chick embryo retina neurons and photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34, (8), 2425-2436 (1993).
  10. Fuhrmann, S., Kirsch, M., Hofmann, H. D. Ciliary neurotrophic factor promotes chick photoreceptor development in vitro. Development. 121, (8), 2695-2706 (1995).
  11. Toy, J., Norton, J. S., Jibodh, S. R., Adler, R. Effects of homeobox genes on the differentiation of photoreceptor and nonphotoreceptor neurons. Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, (11), 3522-3529 (2002).
  12. Yan, R. T., He, L., Wang, S. Z. Pro-photoreceptor activity of chick neurogenin1. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, (12), 5567-5576 (2009).
  13. Adler, R. Regulation of neurite growth in purified retina neuronal cultures: Effects of PNPF, a substratum-bound, neurite-promoting factor. J Neurosci Res. 8, (2-3), 165-177 (1982).
  14. Adler, R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo. Prog Retin Eye Res. 19, (5), 529-557 (2000).
  15. Adler, R., Hatlee, M. Plasticity and differentiation of embryonic retinal cells after terminal mitosis. Science. 243, (4889), 391-393 (1989).
  16. Adler, R., Lindsey, J. D., Elsner, C. L. Expression of cone-like properties by chick embryo neural retina cells in glial-free monolayer cultures. J Cell Biol. 99, (3), 1173-1178 (1984).
  17. Adler, R., Magistretti, P. J., Hyndman, A. G., Shoemaker, W. J. Purification and cytochemical identification of neuronal and non-neuronal cells in chick embryo retina cultures. Dev Neurosci. 5, (1), 27-39 (1982).
  18. Belecky-Adams, T., Cook, B., Adler, R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the 'window-labeling' technique. Dev Biol. 178, (2), 304-315 (1996).
  19. Hyndman, A. G., Adler, R. Neural retina development in vitro. Effects of tissue extracts on cell survival and neuritic development in purified neuronal cultures. Dev Neurosci. 5, (1), 40-53 (1982).
  20. Politi, L. E., Adler, R. Generation of enriched populations of cultured photoreceptor cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 27, (5), 656-665 (1986).
  21. Vergara, M. N., Canto-Soler, M. V. Rediscovering the chick embryo as a model to study retinal development. Neural Dev. 7, 22 (2012).
  22. Adler, R. Determination of cellular types in the retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 34, (5), 1677-1682 (1993).
  23. Repka, A., Adler, R. Differentiation of retinal precursor cells born in vitro. Dev Biol. 153, (2), 242-249 (1992).
  24. Morris, V. B. Symmetry in a receptor mosaic demonstrated in the chick from the frequencies, spacing and arrangement of the types of retinal receptor. J Comp Neurol. 140, (3), 359-398 (1970).
  25. Li, H., Chan, S. T. H., Tang, F. Transfection of rat brain cells by electroporation. J Neurosci Methods. 75, (1), 29-32 (1997).
  26. Martinez, C. Y., Hollenbeck, P. J. Transfection of primary central and peripheral nervous system neurons by electroporation. Methods Cell Biol. 71, 339-351 (2003).
  27. Boatright, J. H., et al. The 5' flanking regions of IRBP and arrestin have promoter activity in primary embryonic chicken retina cell cultures. Exp Eye Res. 64, (2), 269-277 (1997).
  28. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr Protoc Neurosci. Chapter 3, Unit 3.11 (2001).
  29. Kumar, R., et al. The bZIP transcription factor Nrl stimulates rhodopsin promoter activity in primary retinal cell cultures. J Biol Chem. 271, (47), 29612-29618 (1996).
  30. Toy, J., Bradford, R. L., Adler, R. Lipid-mediated gene transfection into chick embryo retinal cells in ovo and in vitro. J Neurosci Methods. 104, (1), 1-8 (2000).
  31. Werner, M., Madreperla, S., Lieberman, P., Adler, R. Expression of transfected genes by differentiated, postmitotic neurons and photoreceptors in primary cell cultures. J Neurosci Res. 25, (1), 50-57 (1990).
  32. Yuan, L., Kawada, M., Havlioglu, N., Tang, H., Wu, J. Y. Mutations in PRPF31 inhibit pre-mRNA splicing of rhodopsin gene and cause apoptosis of retinal cells. J Neurosci. 25, (3), 748-757 (2005).
  33. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biol (Praha). 50, (3-4), 107-119 (2004).
  34. Das, R. M., et al. A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon. Dev Biol. 294, (2), 554-563 (2006).
  35. Nguyen, A. T., Dow, A. C., Kupiec-Weglinski, J., Busuttil, R. W., Lipshutz, G. S. Evaluation of gene promoters for liver expression by hydrodynamic gene transfer. J Surg Res. 148, (1), 60-66 (2008).
  36. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  37. You, L. M., et al. A hybrid promoter-containing vector for direct cloning and enhanced expression of PCR-amplified ORFs in mammalian cells. Mol Biol Rep. 37, (6), 2757-2765 (2009).
  38. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Dev Dyn. 195, (4), 231-272 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics