माउस अधिवृक्क क्रोमाफिन सेल में सेल संलग्न समाई माप के लिए तरीके

Neuroscience

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Varga, K. T., Jiang, Z., Gong, L. W. Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell. J. Vis. Exp. (92), e52024, doi:10.3791/52024 (2014).

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Abstract

Introduction

Synaptic प्रसारण न्यूरोट्रांसमीटर युक्त synaptic vesicles के exocytosis द्वारा मध्यस्थता है, और इन पुटिकाओं दीर्घकालिक में neuronal संचार बनाए रखने के लिए तंत्रिका टर्मिनल के भीतर स्थानीय endocytic रीसाइक्लिंग से गुजरना होगा. अन्तर्ग्रथनी पुटिका चक्र एक पूरे के रूप में सेलुलर संचार में एक बेहतर समझ की दिशा में एक आवश्यक आधार है का गठन किया कि आणविक मशीनरी को समझने, मस्तिष्क में synaptic प्रसारण की अनिवार्य भूमिका को देखते हुए. सेल मॉडल प्रणाली के अलावा, अधिवृक्क क्रोमाफिन सेल synaptic पुटिका रीसाइक्लिंग अंतर्निहित आणविक मशीनरी में सबसे निश्चित अंतर्दृष्टि के कुछ प्रदान की गई है. एक्सोसाइटोसिस, न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज में अंतिम कदम है, बेहद का अध्ययन किया और अधिवृक्क क्रोमाफिन सेल 1,2 के उपयोग के माध्यम से जांच की गई है. वास्तव में, स्रावी कणिकाओं के गठन, लक्ष्यीकरण, डॉकिंग, और फ्यूजन आर्केस्ट्रा कि आणविक खिलाड़ियों के अधिकांश के कारण div के आवेदन करने के लिए पहचान की गई हैक्रोमाफिन कोशिकाओं 1 में आइरिश तकनीक. इसके अलावा, एक्सोसाइटोसिस में शामिल प्रोटीन मशीनरी की एकल पुटिका समाधान के लिए अनुमति देने के लिए एक अवसर प्रदान करके, क्रोमाफिन सेल पुटिका संलयन 3 के सवालों का पता करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनी हुई है.

सेल संलग्न समाई माप पहले एक्सोसाइटोसिस 3 दौरान एकल पुटिका संलयन को हल करने में उपयोग किया गया. ~ व्यास में 60 एनएम का प्रदर्शन किया गया है के रूप में छोटे vesicles के exocytosis सेल संलग्न विन्यास 4-7 में पैच दबाना तकनीक के साथ कोशिका झिल्ली प्रवेश माप से पता लगाया जा सके. प्रवेश एक सर्किट या डिवाइस एक वर्तमान प्रवाह करने की अनुमति देगा कि कैसे आसानी से एक उपाय के रूप में परिभाषित किया गया है; यह प्रतिबाधा के उलटा है. इस प्रकार, प्रवेश माप झिल्ली समाई की समझ प्रदान करते हैं. यह प्लाज्मा झिल्ली में vesicular झिल्ली का समावेश करके पूरा किया है; इस समावेश सतह में परिवर्तन का पता चलता हैक्षेत्र 8. प्रत्येक fusing पुटिका झिल्ली समाई 9,10 में एक stepwise वृद्धि का कारण बनता है. साथ ही, यह प्रवेश माप झिल्ली प्रवाहकत्त्व और एक exocytotic घटना 3 दौरान संलयन ताकना प्रवाहकत्त्व प्रदान करता है. इस तकनीक एक्सोसाइटोसिस दौरान एकल पुटिका कैनेटीक्स पहचान पर एक अनूठे उपकरण प्रदान की गई है के रूप में, हमारी प्रयोगशाला हाल ही में एक पुटिका 11,12 के endocytosis पता लगाने के लिए इस अवधारणा को लागू किया गया है.

हमारे विशेष रुचि कई कोशिकाओं 13 में और neuronal टर्मिनलों 14,15 में synaptic पुटिका endocytosis के लिए एक मुख्य मार्ग के रूप में एक मौलिक हाउसकीपिंग घटक के रूप में माना गया है जो क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई), है. सीएमई हालांकि, इसकी कैनेटीक्स कारण विलक्षण endocytic घटनाओं की निगरानी में तकनीकी सीमाओं को अच्छी तरह से समझ नहीं रहना, जैविक रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है. क्रोमाफिन कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के बीच 1 exocytic तंत्र में समानता को देखते हुए, यह है PLक्रोमाफिन कोशिकाओं में विखंडन तंत्र संभावना न्यूरॉन्स में synaptic पुटिका endocytosis के लिए आवेदन कर सकते हैं कि ausible. सेल संलग्न समाई माप व्यक्ति endocytic घटनाओं पर नजर रखने और सबसे तरीकों को हल करने में असमर्थ हैं जो विखंडन कैनेटीक्स, विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है. हमारे सेल संलग्न रिकॉर्डिंग में, 20 kHz पर एक साइन लहर होल्डिंग क्षमता पर आरोपित है, और उत्पादन चालू एम्पलीफायर ताला में एक दो चरण से दूसरे चैनल में एक चैनल और झिल्ली समाई में झिल्ली प्रवाहकत्त्व में विभाजित है 16 18. झिल्ली प्रवाहकत्त्व और समाई में परिवर्तन से, एक संभावना पुटिका चुटकी बंद करने से पहले प्लाज्मा झिल्ली को internalizing पुटिका जोड़ता है कि ट्यूबलर झिल्ली गर्दन से मेल खाती है जो विखंडन ताकना, कैनेटीक्स गणना कर सकते हैं. सामूहिक रूप से, इस तकनीक हमें सीएमई के दौरान पुटिका विखंडन के नियामक तंत्र की जांच करने का अवसर देता है.

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Protocol

नोट: शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित के रूप में पूरी प्रक्रिया, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशा निर्देशों के अनुसार आयोजित किया गया था.

1 समाधान और संस्कृति मीडिया तैयारी

  1. अप करने के लिए छह महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सभी समाधान रखें. अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति मीडिया रखें.
  2. DMEM के साथ 100 मिलीलीटर ITSX (इंसुलिन transferrin-सेलेनियम अनुपूरण) के 1 कलम strep समाधान की मिलीग्राम और 1 मिलीलीटर मिश्रण से संस्कृति मीडिया की 100 मिलीलीटर की तैयारी.
  3. DMEM के 250 मिलीलीटर, 100 मिमी 2 CaCl के 2.5 मिलीलीटर, और 50 मिमी EDTA के 2.5 मिलीलीटर मिश्रण से एंजाइम समाधान तैयार है.
  4. DMEM के 225 मिलीलीटर, FBS की 25 मिलीलीटर, एल्बुमिन की 625 मिलीग्राम, और 625 मिलीग्राम trypsin अवरोध करनेवाला मिश्रण से निष्क्रियता समाधान तैयार है.
  5. 154 मिमी NaCl, 5.6 मिमी KCl, 5.0 मिमी HEPES, 3.6 मिमी NaHCO3, 5.6 मिमी ग्लूकोज की एक लोके के समाधान तैयार है. NaOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें.
  6. 50 मिलीग्राम / एमएल के एक पाली डी lysine (पीडीएल) समाधान तैयार है. कोट coverslips 1 मिलीग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता का प्रयोग करें.
  7. 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES-NaOH, और 10 मिमी ग्लूकोज की एक बाह्य समाधान तैयार है. ~ 310 nmol / किलो की एक परासारिता साथ NaOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें.
  8. 50 मिमी NaCl, 100 मिमी TEACl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, और 10 मिमी HEPES के पिपेट समाधान तैयार है. ~ 290 nmol / किलो की एक परासारिता साथ NaOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित करें.

2 अधिवृक्क ग्रंथि अलगाव

  1. बड़े और छोटे विच्छेदन कैंची और संदंश के दो जोड़े की एक जोड़ी आटोक्लेव. पूरी प्रक्रिया के दौरान दस्ताने पहनें और एक बर्फ बाल्टी पर विदारक ट्रे जगह है.
  2. दिन 0-3 पर ले लिया चूहों का प्रयोग करें. कत्ल के बाद दबाव सीओ 2 टैंक के साथ जानवरों euthanize.
  3. Cervi से रीढ़ निम्नलिखित पिल्ला के पीछे कटौती करने के लिए कैंची के छोटे सेट का उपयोग सीएएल क्षेत्र दुम को. त्वचा के नीचे अल्पज्ञता कटौती और शरीर गुहा में छेद नहीं करना सुनिश्चित करें.
  4. अगला, दूर रीढ़ से छील त्वचा कि मांसलता स्पाइनल कॉलम की एक स्पष्ट दृष्टि से देखते हैं के संपर्क में है तो. यहाँ से, गर्भाशय ग्रीवा रीढ़ की हड्डी में एक transectional काट कर और फिर रीढ़ की हड्डी के पक्ष के साथ दो समानांतर कटौती कर.
  5. पशु की मुख्य शरीर धारण संदंश की एक जोड़ी के साथ, स्पाइनल कॉलम हड़पने और गुर्दे उजागर कर रहे हैं जब तक रीढ़ वापस छील संदंश के अन्य जोड़ी का उपयोग करें.
  6. इस समय, गुर्दे के शीर्ष पर अधिवृक्क ग्रंथि कल्पना. तो ध्यान से लोके के समाधान के साथ भरा एक शंक्वाकार ट्यूब में प्रत्येक जानवर से दो ग्रंथियों जगह है.
    नोट: कभी कभी ग्रंथियों संदंश के लिए रहना होगा. यदि यह मामला है, धीरे संदंश से और लोके के समाधान में ग्रंथियों को हटाने में सहायता करने के लिए संदंश की एक और जोड़ी का उपयोग करें. ग्रंथियों 2 घंटे तक का समय के लिए इस हालत में रखा जा सकता है.
ई "> 3. ऊतक पाचन

  1. इस बीच, बुलबुला 15 मिनट के लिए 5% सीओ 2 + 95% ओ 2 के साथ एंजाइम समाधान से पहले उपयोग करने के लिए. Equilibrated समाधान गुलाबी / नारंगी रंग में एक उज्ज्वल गुलाबी रंग से बदल जाता है कि सुनिश्चित करें.
  2. 20-25 यूनिट / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता में हौसले से bubbled एंजाइम समाधान के लिए papain जोड़ें. Papain साथ एंजाइम समाधान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 40-60 मिनट के लिए प्रत्येक जानवर से ग्रंथियों के प्रत्येक जोड़ी सेते हैं.
  3. प्रत्येक ट्यूब निष्क्रियता समाधान के 75% में जोड़ें और एक और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इस ऊष्मायन papain के एंजाइम गतिविधि inactivates.
  4. निष्क्रियता समाधान के साथ 10 मिनट ऊष्मायन के बाद, धीरे एक नए लेबल ट्यूब में ग्रंथियों हस्तांतरण और फिर ग्रंथियों संस्कृति मीडिया के साथ 3X धो लो.

4 सेल हदबंदी और चढ़ाना

  1. धोने के बाद, संस्कृति मीडिया के 200 μl में दो ग्रंथियों डाल दिया और फिर धीरे ग्रंथियों ऊपर टाइट्रेट औरनीचे एक 200 μl विंदुक के साथ विंदुक टिप के माध्यम से अब कोई समाधान में ऊतक का एक बड़ा टुकड़ा है जब तक.
    नोट: titrating जब, 200 μl विंदुक टिप से एक नीचे बल के साथ ट्यूब के नीचे ग्रंथियों को बनाए रखने और धीरे और धीरे धीरे ऊतक संलग्न हैं. , धीमी, सतत स्ट्रोक का उपयोग करने के लिए निश्चित होना कभी तेज या अचानक pipetting.
  2. 450 μl अप करने के लिए संस्कृति मीडिया की कुल मात्रा को लाने के लिए एक अतिरिक्त 250 μl संस्कृति मीडिया जोड़ें.
  3. प्लेट एक 60 x 15 मिमी संस्कृति डिश में रखा जाता है, जो सात 12 मिमी पीडीएल पूर्व में लिपटे coverslips, में से प्रत्येक पर इस सेल युक्त समाधान के 60 μl.
  4. एक बार चढ़ाया, सेल व्यवहार्यता के लिए एक वातावरण सुनिश्चित करने के लिए 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 की एक सतत प्रवाह / आपूर्ति के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया और बनाए रखा है कि इनक्यूबेटर में पकवान. ऊष्मायन के बाद, धीरे संस्कृति डिश में पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के 5 एमएल जोड़ने और 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में वापस पकवान लौटने सेल अताशे से पहलेडी रिकॉर्डिंग.
    नोट: आमतौर पर, कोशिकाओं को 4 दिन के लिए electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

5 सेल पहचान और Gigaohm सील संरचना

  1. कोशिकी समाधान में 12 मिमी coverslip जगह. पूरे अधिवृक्क ग्रंथि सेल तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है, cortical कोशिकाओं (छोटे और सेल) क्रोमाफिन से dimmer के साथ संस्कृति में क्रोमाफिन कोशिकाओं (एक भूरा / बेज ​​रंग और एक के पास सही परिपत्र फार्म के साथ आम तौर पर बहुत उज्ज्वल (चित्रा 1) मिश्रण.
  2. एक प्रोग्राम पी -97 खींचने का उपयोग चार चरणों में पैच pipettes खींचो. फिर कांच की समाई कम करने और करने में मदद मिलेगी जो एक पिघला मोम, में पिपेट टिप डुबकी पिपेट टिप के अंदर से टिप "झटका दूर" पॉलिश इस मोम आग.
    नोट: पैच पिपेट समाधान के साथ भरा है, तो पैच pipettes आमतौर पर ~ 2 MΩ का प्रतिरोध किया है.
  3. कई मीटर के दायरे में सेल के करीब पैच पिपेट दृष्टिकोणicrons. एक सेल संलग्न विन्यास को प्राप्त करने के लिए, सेल के करीब पैच पिपेट के दृष्टिकोण के दौरान किसी भी मामूली सेल विरूपण के लिए देखो. एक GΩ मुहर हासिल की है जब तक कोमल चूषण लागू करें.

6 सेल संलग्न समाई रिकॉर्डिंग

  1. एक GΩ मुहर से पता चला है एक बार, एक ईपीसी-7 प्लस पैच दबाना एम्पलीफायर का उपयोग के माध्यम से सेल संलग्न रिकॉर्डिंग बनाने के लिए और एक दो चरण अनुरूप ताला में एम्पलीफायर (उपकरण के साथ संलग्न तालिका देखें). ताला में एम्पलीफायर से 50 एम वी (आरएमएस) के आयाम और 20 kHz के आवृत्ति के साथ एक sinewave लागू करें.
  2. 1 मिसे समय निरंतर और 24 डीबी पर ताला में एम्पलीफायर के उत्पादन फिल्टर सेट करें. ताला में एम्पलीफायर ऐसे कोमल चूषण दालों द्वारा उत्पादित क्षणिक समाई परिवर्तन केवल पैच प्रवाहकत्त्व (आरई) का पता लगाने में कोई प्रक्षेपण के साथ पैच समाई (आईएम) का पता लगाने में दिखाई देते हैं (चित्रा 2) के चरण निर्धारित करें.
    नोट: पुन में प्रणाली की जांच के लिए विवरण देखें19 सम्मेलन.
  3. "नीचे" कदम (चित्रा 3) द्वारा विशिष्ट समाई परिवर्तन की पहचान.
    ध्यान दें: एक ठोस रिकॉर्डिंग एकल पुटिकाओं internalizing जो इंगित करता है कई नीचे कदम के साथ एक "सीढ़ी" प्रकार समानता के रूप में देखा जाएगा. पट्टी प्रक्रिया कार्रवाई वर्तमान आमतौर पर सबसे अधिक कोशिकाओं से दर्ज किया जा सकता क्योंकि एक यांत्रिक उत्तेजना के रूप में कार्य करता है.
  4. उस फ़ाइल के भीतर dd / mm / वर्ष और अपने स्वयं के व्यक्तिगत नंबर (XX) के रूप में प्रत्येक कक्ष संलग्न रिकॉर्डिंग: व्यक्तिगत तिथि सहित फ़ोल्डरों के रूप में फाइल का नाम.

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Representative Results

सेल व्यवहार्यता और gigaohm सील की गुणवत्ता सेल संलग्न समाई रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता निर्धारित करने में महत्वपूर्ण हैं. इसलिए, यह पूर्व electrophysiological रिकॉर्डिंग, और ठेठ व्यवहार्य कोशिकाओं को चित्रा 1 में सचित्र हैं एक प्रभावी और कुशल सेल संस्कृति की खरीद के लिए महत्वपूर्ण है. अभ्यास और समय उच्च गुणवत्ता के साथ एक gigaohm सील को प्राप्त करने में सहायक होगा. एक स्पष्ट रूप से प्रोटोकॉल कदम 5.3 में वर्णित के रूप में पैच पिपेट सेल से आ रहा है जब सेल विरूपण देख सकते हैं, एक उच्च गुणवत्ता मुहर प्राप्त करने में एक बेहतर मौका है. 3 के साथ जुड़े कई नीचे की ओर कदम के साथ झिल्ली समाई की एक ठेठ रिकॉर्डिंग दर्शाता चित्रा एकल पुटिका endocytosis.

चित्रा 1
व्यवहार्य माउस अधिवृक्क क्रोमाफिन कोशिकाओं की संख्या 1 उदाहरणसेल संस्कृति के बाद 24 घंटे. 3 व्यवहार्य क्रोमाफिन कोशिकाओं को तीर बिंदु. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
सेल संलग्न रिकॉर्डिंग में चित्रा 2 चरण समायोजन. प्रारंभिक चरण सेटिंग के साथ, कोमल suctions क्षणिक दोनों समाई (आईएम) और प्रवाहकत्त्व (आरई) निशान में परिवर्तन, और फिर पता लगाने में अनुमानों के कारण एक 23 ° चरण से बाहर रद्द कर रहे हैं पाली. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3 एक ठेठ सीएकल पुटिका endocytosis के साथ जुड़े कई नीचे कदम के साथ रिकॉर्डिंग पक्ष संलग्न समाई. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

सेल संलग्न समाई माप सफलतापूर्वक उच्च गुणवत्ता के साथ रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम की आवश्यकता: अधिवृक्क ग्रंथि से तैयार 1) व्यवहार्य और स्वस्थ कोशिकाओं; Coverslips के 2) पीडीएल कोटिंग; 3) gigaohm मुहर गठन; 4) प्रणाली का शोर स्तर; और 5) चरण सुधार.

पशु शल्य चिकित्सा के लिए, एक संभावित बना सकते हैं संशोधनों सबसे अच्छा सूट निपुणता के लिए शल्य दृष्टिकोण को समायोजित करने के लिए और विच्छेदन के दौरान नुकसान को रोकने के लिए है. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाएगा कि कोशिकाओं अधिवृक्क ग्रंथि की मज्जा से विशेष रूप से आते हैं इसके अतिरिक्त, पता लगाने और अधिवृक्क ग्रंथियों को हटाने पर पर्याप्त अभ्यास जरूरी है. एंजाइम पाचन के लिए, यह 5% सीओ 2 + 95% ओ 2 के साथ समाधान बुदबुदाती द्वारा एंजाइम समाधान संतुलित करने के लिए महत्वपूर्ण है. सिलेंडर से जुड़े ट्यूबिंग कोई लीक के साथ पर्याप्त और तंग है कि कुछ हो. साथ ही, यह सुनिश्चित हो कि अंत मैंn समाधान ठीक से पूरे 15 मिनट बुदबुदाती समय के दौरान रखा गया है; इस उचित हवा का प्रवाह को निर्देशित करने के रूप में तो ट्यूबिंग के अंत में पा लिया गया है कि एक 20 जी सुई अंत रखने के साथ प्राप्त किया जा सकता है. इसके अलावा, इस कदम के लिए अतिरिक्त समय ट्यूब में समाधान अतिप्रवाह के रूप में airflow इतना शक्तिशाली नहीं है के रूप में इतने लंबे समय तक चोट नहीं होगा. सेल अनुमापन अभ्यास लगेगा कि एक और महत्वपूर्ण घटक है. अधिक-titrated यदि कोशिकाओं के बहुमत क्षतिग्रस्त किया जा सकता है; अनुमापन पर्याप्त नहीं है इसके विपरीत, यदि, ऊतकों से अलग बहुत कुछ एक अलग कक्षों की जाएगी. प्रभावी ढंग से टाइट्रेट करने के लिए, आप टाइट्रेट रूप ग्रंथियों धीरे 200 μl विंदुक टिप के माध्यम से पारित कर रहे हैं सुनिश्चित करते हुए, नीचे 7-8x ऊपर पिपेट करने के लिए एक 200 μl विंदुक टिप का उपयोग और.

पीडीएल कोटिंग के लिए, एक हमेशा coverslips की पर्याप्त कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए 3 घंटे तक का समय coverslips पर पीडीएल की ऊष्मायन समय का विस्तार कर सकते हैं. पीडीएल कोटिंग संलग्न करने के लिए कोशिकाओं क्रोमाफिन के लिए महत्वपूर्ण हैऔर सेल चढ़ाना के बाद coverslips पर हो जाना. पीडीएल कोटिंग पर्याप्त नहीं है, कोशिकाओं की सबसे gigaohm मुहर गठन मुश्किल कर देगा जो coverslip, से अलग किया जाएगा.

पट्टी तकनीक एक समर्पित प्रक्रिया के रूप में सेल संलग्न रिकॉर्डिंग हमेशा संशोधित और सुधार किया जा सकता है. कोमल और सूक्ष्म चूषण पैच पिपेट और सेल संपर्क में हैं जब gigaohm मुहर गठन को सुविधाजनक बनाने में महत्वपूर्ण है. बहुत ज्यादा चूषण पैच टिप सेल संपर्क को नष्ट कर देगा और चरम स्थितियों में, कोशिकाओं पैच पिपेट में चूसा जा सकता है. यह बहुत आसानी से एक पूरे सेल विन्यास में बदलकर या एक एक बहुत बड़ा करने के लिए लौटने के एक बहुत कम प्रतिरोध द्वारा आस्टसीलस्कप पर मनाया जाएगा; अभ्यास एक उच्च गुणवत्ता gigaohm मुहर गठन प्राप्त करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है.

उच्च मुहर प्रतिरोध सेल संलग्न रिकॉर्डिंग में शोर का स्तर कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, निम्नलिखित दो कदम भी हैंएकल endocytic घटनाओं को हल करने के लिए शोर के स्तर को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है: (1) पैच पिपेट समाधान में, TEACl वोल्टेज gated कश्मीर + चैनलों को ब्लॉक करने के लिए उपयोग किया जाता है; (2) पिपेट टिप चिपचिपा मोम के साथ लेपित है और पिपेट टिप अंदर मोम गर्मी चमकाने द्वारा हटाया जा सकता है.

प्रोटोकॉल कदम 6.2 में विस्तृत चरण समायोजन रिकॉर्डिंग के लिए प्रारंभिक चरण स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है, इस कदम के आदर्श नहीं हो सकता. इसलिए, यह व्यक्तिगत घटनाओं के लिए विखंडन ताकना विश्लेषण के दौरान चरण सुधार प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है. -65 एम वी के आराम झिल्ली क्षमता पर, पूरे सेल रिकॉर्डिंग एक ठेठ माउस क्रोमाफिन सेल के रूप में माउस क्रोमाफिन कोशिकाओं की झिल्ली प्रवाहकत्त्व ~ गणना करता है, जो 5 पीएफ का एक इनपुट समाई और 500 MΩ, का एक इनपुट प्रतिरोध किया है कि दिखाने के 0.4 पी एस / एफएफ. इस 1 सीमांत बल के एक समाई आकार के साथ एक endocytic घटना ~ 0.4 PS की झिल्ली प्रवाहकत्त्व का शुद्ध नुकसान होगा कि निकलता है. इस मूल्य पर की तुलना में नगण्य हैypical 50-100 पुनश्च झिल्ली प्रवाहकत्त्व परिवर्तन सेल संलग्न रिकॉर्डिंग में endocytic विखंडन ताकना बंद होने के साथ जुड़े. इसलिए, हम हमारे चरण सुधार हमें इस तरह के पहले और बाद के विखंडन ताकना बंद होने के स्तर पर ही है कि झिल्ली प्रवाहकत्त्व के आधारभूत समायोजित करने की अनुमति देता है कि विश्वास कर रहे हैं; इस प्रक्रिया हमारे डेटा विश्लेषण में <1% त्रुटि ला सकते हैं.

संक्षेप में, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल सेल संलग्न समाई रिकॉर्डिंग मॉडल प्रणाली के रूप में माउस क्रोमाफिन कोशिकाओं का उपयोग कर एक पुटिका endocytosis की निगरानी के लिए उपयोग किया जा सकता है दर्शाता है. इस तकनीक को एक endocytosis दौरान पुटिका विखंडन के लिए नियामक तंत्र का विश्लेषण करने के लिए अनुमति देता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine Sigma P0899
DMEM 15066024 Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Life Technologies
Cover Glass Carolina Biological 633029 12 mm
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122 100 ml
Insulin-Trans-Sel-X Life Technologies 51500056 Only thaw on ICE!
Papain Worthington 39S11614
EPC-7 plus patch amplifier HEKA
BNC-2090 data acquisition board National Instruments
Igor data acquisition software Wavemetrics
P-97 pipette puller Sutter Instruments
Microforge Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries Sutter Instruments B150-110-10 Outer diameter: 1.5 mm
Inner diameter: 1.10 mm
Length: 10 cm

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References

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