Methoden für die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen in Maus-chromaffinen Nebennierenzell

Neuroscience

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Varga, K. T., Jiang, Z., Gong, L. W. Methods for Cell-attached Capacitance Measurements in Mouse Adrenal Chromaffin Cell. J. Vis. Exp. (92), e52024, doi:10.3791/52024 (2014).

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Abstract

Introduction

Synaptischen Übertragung wird durch Exocytose von Neurotransmitter-haltigen synaptischer Vesikel vermittelten, und diese Vesikel müssen lokale endozytischen Recycling innerhalb der Nervenendigung unterziehen, um neuronale Kommunikation langfristig aufrecht zu erhalten. Angesichts der wesentlichen Rolle der synaptischen Übertragung im Gehirn, das Verständnis der molekularen Maschinerie, die synaptischen Vesikel-Zyklus ist eine wesentliche Grundlage für ein besseres Verständnis der zellulären Kommunikation als Ganzes darstellt. Unter Zellmodellsysteme, hat die chromaffinen Nebennierenzell einige der endgültige Einblick in die molekulare Maschinerie zugrunde liegenden synaptischen Vesikel-Recycling zur Verfügung gestellt. Exozytose, der letzte Schritt in der Neurotransmitterfreisetzung, wurde immens sucht und durch die Verwendung des chromaffinen Nebennierenzellen 1,2 untersucht. In der Tat sind die meisten der molekularen Spieler, die die Bildung, Ausrichtung, Docking und Fusion von sekretorischen Granula instrumentieren wurden aufgrund der Anwendung von div identifizierterse Techniken in chromaffinen Zellen 1. Darüber hinaus, indem sie eine Möglichkeit, sich für einzelne Vesikel-Auflösung der Proteinmaschinerie in Exozytose beteiligt zu ermöglichen, bleibt die chromaffinen Zellen ein leistungsfähiges Modell, um die Fragen der Vesikel-Fusion-3-Adresse.

Cell-Attached-Kapazitätsmessungen wurden zunächst bei der Lösung von Einzel Vesikelfusion während Exozytose 3 genutzt. Exocytose von Vesikeln so klein wie ca. 60 nm im Durchmesser, wurde gezeigt, dass durch die Zellmembran Admittanz Messungen mit der Patch-Clamp-Technik in der Zelle verbundene Konfiguration 4-7 detektiert werden. Zulassung als Maß dafür, wie leicht eine Schaltung oder Vorrichtung ermöglicht, dass ein Strom fließen definiert; es ist das Inverse der Impedanz. Somit Admittanz Messungen liefern ein Verständnis der Membrankapazität. Dies wird durch den Einbau der Vesikelmembran in die Plasmamembran durchgeführt; Dieser Einbau zeigt Veränderungen der OberflächenBereich 8. Jedes Schmelzen Vesikel bewirkt eine schrittweise Erhöhung der Membrankapazität 9,10. Zusätzlich liefert diese Admittanzmessung die Membranleitfähigkeit und der Fusionsporen Leitfähigkeit während einer Exozytose-Ereignis 3. Wie diese Technik ein einzigartiges Werkzeug zur Identifizierung Single-Vesikel Kinetik während Exozytose vorgesehen ist, hat unser Labor vor kurzem angewendet dieses Konzept auf die Endozytose von einzelnen Vesikeln 11,12 zu erkennen.

Unser Interesse gilt Clathrin-vermittelte Endozytose (CME), die als Grundkomponente Housekeeping in vielen Zellen 13 und ein Hauptpfad für die synaptische Vesikel Endozytose in neuronalen Anschlüsse 14,15 in Betracht gezogen wurde. CME ist bekannt, biologisch wichtig zu sein, bleiben jedoch seine Kinetik nicht gut verstanden aufgrund technischer Einschränkungen bei der Überwachung Singular endozytischen Veranstaltungen. Angesichts der Ähnlichkeiten in Exozytose Mechanismen zwischen chromaffinen Zellen und Neuronen 1 ist es plausible, dass die Spaltung in chromaffinen Zellen Mechanismen kann wahrscheinlich synaptischen Vesikel Endozytose gelten in Neuronen. Die Cell-Attached-Kapazitätsmessungen verwendet worden, um einzelne endozytischen Ereignisse zu überwachen und zu analysieren, die Spalt Kinetik, die die meisten Methoden nicht lösen können. In unserem Zell angebracht Aufnahmen wird eine Sinuswelle bei 20 kHz über die Haltepotential überlagert, und der Ausgangsstrom wird in Membranleitfähigkeit in einem Kanal und Membrankapazität in den anderen Kanal aus einem Zweiphasenverriegelungsverstärker 16 getrennt 18. Aus den Veränderungen in der Membranleitfähigkeit und die Kapazität kann man die Kinetik der Spaltung Poren, die wahrscheinlich entspricht der röhrenförmigen Membran, die den Hals Internalisierungsfaktor Bläschen an der Plasmamembran-Vesikel vor der Abschnürung verbindet berechnen. Kollektiv, gibt uns diese Technik die Möglichkeit, die regulatorischen Mechanismen der Vesikel Spaltung während CME zu prüfen.

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Protocol

HINWEIS: Das gesamte Verfahren wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt, wie von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität von Illinois in Chicago genehmigt.

1. Lösungen und Kultur Medien Vorbereitungen

  1. Halten Sie alle Lösungen bei -20 ° C für bis zu sechs Monate. Halten Sie das Kulturmedium bei 4 ° C für bis zu 3 Monate.
  2. Planen 100 ml Kulturmedium durch Mischen von 1 ml Pen-Strep-Lösung und 1 ml itsX (Insulin-Transferrin-Selen-Ergänzung) auf 100 ml mit DMEM.
  3. Vorbereitung Enzymlösung durch Mischen mit 250 ml DMEM, 2,5 ml 100 mM CaCl 2 und 2,5 ml 50 mM EDTA.
  4. Vorbereitung Inaktivierung durch Mischen von 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg Albumin und 625 mg Trypsininhibitor.
  5. Bereiten Sie eine Locke-Lösung von 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM Glucose. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,3.
  6. Vorbereiten einer Poly-D-Lysin (PDL) Lösung von 50 mg / ml. Verwenden eine Endkonzentration von 1 mg / ml beschichtet Deck.
  7. Vorbereiten eines extrazellulären Lösung von 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 10 mM HEPES-NaOH und 10 mM Glucose. Den pH-Wert auf 7,3 mit NaOH mit einer Osmolarität von ~ 310 nmol / kg.
  8. Vorbereiten einer Pipettenlösung von 50 mM NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES. PH auf 7,3 mit NaOH mit einer Osmolarität von ca. 290 nmol / kg.

2. Nebenniere Isolation

  1. Autoklaven ein Paar von großen und kleinen Dissektion Schere und zwei Paar Pinzette. Schutzhandschuhe tragen während des gesamten Prozesses und setzen Sie den Seziersaal Tablett auf einem Eimer Eis.
  2. Verwenden Mäuse an Tag 0-3 übernommen. Tiere einschläfern mit einem Drucktank CO 2, gefolgt von Enthauptung.
  3. Nutzen die kleineren Satz von Schere, um die Rückseite der Welpen nach der Wirbelsäule aus Cervi reduzieren cal zu Region kaudal. Achten Sie darauf, oberflächlich unter der Haut geschnitten und nicht in die Körperhöhle zu durchbohren.
  4. Als nächstes Haut weg von der Wirbelsäule, so dass Muskulatur ausgesetzt ist, um eine klare Sicht auf die Wirbelsäule haben. Von hier aus, machen Sie einen Schnitt an der transectional zervikalen Rückenmark und dann zwei parallele Schnitte an den Seiten der Wirbelsäule.
  5. Mit einer Zange hält den Hauptkörper des Tieres, mit der anderen Pinzette zu greifen und Wirbelsäule abziehen Wirbelsäule bis Nieren ausgesetzt sind.
  6. In diesem Moment sichtbar die Nebennieren an der Oberseite der Nieren. Dann vorsichtig die zwei Drüsen von jedem Tier zu einem konischen Rohr mit Locke-Lösung gefüllt.
    HINWEIS: Manchmal sind die Drüsen auf der Zange festhalten. Wenn dies der Fall ist, leicht zu verwenden weiteres Paar von Zangen, um die Entfernung der Drüsen aus der Zange und in die Locke-Lösung zu unterstützen. Die Drüsen können in diesem Zustand für bis zu 2 Stunden gehalten werden.
e "> 3. Tissue Verdauung

  1. In der Zwischenzeit Blasen die Enzymlösung mit 5% CO 2 + 95% O 2 für 15 Minuten vor der Verwendung. Stellen Sie sicher, dass die Lösung ins Gleichgewicht dreht sich von einem hellen rosa Farbe in rosa / orange Farbe.
  2. Füge das Papain auf die frisch geperlt Enzymlösung in einer Endkonzentration von 20-25 Einheiten / ml. Jedes Paar von Drüsen aus jedem Tier inkubieren 40-60 min bei 37 ° C in der Enzymlösung mit Papain.
  3. Fügen 75% Inaktivierung Lösung in jedes Röhrchen und Inkubation bei 37 ° C für weitere 10 min. Diese Inkubation inaktiviert das Enzym-Aktivität von Papain.
  4. Nach der 10 min Inkubation mit der Inaktivierung Lösung, übertragen Sie leicht die Drüsen in ein neu beschriftet Rohr und dann waschen die Drüsen 3x mit Kulturmedien.

4. Zelldissoziation und Oberflächen

  1. Nach dem Waschen, legen Sie die zwei Drüsen in 200 ul der Kulturmedien und dann sanft titriert die Drüsen undnach unten durch die Pipettenspitze mit einer 200 ul-Pipette, bis es nicht länger ein großes Stück des Gewebes in die Lösung.
    HINWEIS: Bei der Titration, zu erhalten Verschraubungen am Boden des Röhrchens mit einer Abwärtskraft von 200 ul Pipettenspitze und greifen das Gewebe vorsichtig und langsam. Seien Sie sicher, langsame, kontinuierliche Schläge zu verwenden, nie Pipettieren schnell oder abrupt.
  2. Fügen Sie eine zusätzliche 250 ul Kulturmedien, um das Gesamtvolumen von Kulturmedien bis zu 450 ul zu bringen.
  3. Platte 60 ul dieser Zellen enthaltenden Lösung auf jeder der sieben 12 mm PDL-pre-beschichtete Deckgläser, die in einer 60 x 15-mm-Kulturschale gegeben werden.
  4. Einmal überzogen, die Schale in den Brutschrank, die bis 37 ° C mit einem stetigen Fluss / Versorgung von 5% CO 2 für 30 min eingestellt und gewartet werden, um eine Umgebung für die Lebensfähigkeit der Zellen zu gewährleisten. Nach der Inkubation vorsichtig mit 5 ml vorgewärmten Kulturmedien in der Kulturschale und gibt das Gericht zurück in den Brutschrank für 24 Stunden vor der Zell-Attached-Aufnahmen.
    HINWEIS: In der Regel können die Zellen für elektrophysiologische Aufzeichnungen für 4 Tage verwendet werden.

5. Zellidentifikation und Gigaohm Seal Bildung

  1. Legen Sie die 12 mm Deckglas in der extrazellulären Lösung. Da die ganze Nebennieren sind für die Zellherstellung verwendet, mischen die chromaffinen Zellen (in der Regel sehr hell mit einem bräunlichen / beige Farbgebung und einer fast perfekten Kreisform (Abbildung 1) in Kultur mit Rindenzellen (kleiner und dunkler als chromaffinen Zellen).
  2. Ziehen Sie die Patch-Pipetten in vier Stufen unter Verwendung eines programmierbaren P-97 Magnet. Tauchen Sie die Pipettenspitze in einem geschmolzenen Wachs, die dazu beitragen, die Kapazität des Glas reduzieren und dann wird Feuer Lack die Spitze zu "Blow-weg" das Wachs aus dem Inneren der Pipettenspitze.
    HINWEIS: Bei der Patch-Pipette mit Lösung gefüllt, haben Patch-Pipetten typischerweise einen Widerstand von ~ 2 MOhm.
  3. Nähern Sie sich dem Patch-Pipette in der Nähe der Zelle in mehreren microns. Um einen Cell-Attached-Konfiguration zu erreichen, suchen Sie nach jedem leichten Zell Verformung während der Annäherung der Patch-Pipette näher an der Zelle. Gelten, bis eine sanfte Saugwirkung GOhm Dichtung erreicht wird.

6. Cell-Attached-Kapazität Recordings

  1. Sobald ein GOhm Dichtung offenbart, machen Cell-Attached-Aufnahmen durch den Einsatz von einem EPC-7 sowie Patch-Clamp-Verstärker und ein Zwei-Phasen-Analog Lock-in-Verstärker (siehe beigefügte Tabelle der Ausrüstung). Anwenden eines Sinuswelle mit einer Amplitude von 50 mV (RMS) und einer Frequenz von 20 kHz von dem Lock-in-Verstärker.
  2. Den Ausgangsfilter des Lock-in-Verstärker auf 1 ms Zeitkonstante und 24 db. Stellen Sie die Phase des Lock-in-Verstärkers, so daß transiente durch vorsichtiges Absaugen Impulse erzeugt Kapazitätsänderungen nur in der Patch-Kapazität (Im) Spur ohne Projektion in die Patch Leitfähigkeit (Re) Spur auf (Abbildung 2).
    HINWEIS: Bitte beachten Sie die Angaben für die Kalibrierung des Systems in reKonferenz 19.
  3. Identifizieren typische Kapazitätsänderungen durch "nach unten" Schritte (Abbildung 3).
    HINWEIS: Eine solide Aufnahme wird als eine "Treppe" Art Ähnlichkeit mit vielen nach unten Schritte, die Internalisierung einzelne Vesikel zeigt an, betrachtet werden. Der Patch-Prozess dient als mechanische Stimulation seit Aktionsstrom kann in der Regel von den meisten Zellen aufgenommen werden.
  4. Benennen Sie die Dateien als einzelne Ordner mit Datum: mm / tt / Jahr und jedes Cell-Attached-Aufnahme als seine eigene individuelle Nummerierung (xx) in dieser Datei.

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Representative Results

Die Zelllebensfähigkeit und die Qualität der Dichtung Gigaohm sind entscheidend für die Qualität der Cell-Attached-Kapazität Aufnahmen. Daher ist es wichtig, eine effektive und effiziente Zellkultur vor der elektrophysiologischen Ableitungen und typische lebensfähigen Zellen beschaffen sind in Abbildung 1 dargestellt. Üben und Zeit hilfreich, um eine Giga-Ohm Dichtung mit hoher Qualität sein. Wenn man kann deutlich sehen, Zellverformung, wenn der Patch-Pipette nähert sich der Zelle, wie in Schritt-Protokoll 5.3 beschrieben, gibt es eine bessere Chance bei der Erlangung einer hochwertigen Abdichtung. Abbildung 3 zeigt eine typische Aufzeichnung der Membrankapazität mit mehreren Schritten nach unten im Zusammenhang mit Einzel Vesikel Endozytose.

Figur 1
Abbildung 1. Beispiele von lebensfähigen Maus chromaffinen Nebennierenzellen24 Stunden nach der Zellkultur. Pfeile zeigen auf 3 tragfähige chromaffinen Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Phase-Einstellung in den Cell-Attached-Aufnahmen. Mit der Anfangsphase Einstellung, sanft saugt zu kurzzeitigen Veränderungen sowohl Kapazität (Im) und Leitfähigkeit (Re) Spuren, und die Vorsprünge in Re-Trace sind von einem 23 °-Phase abgebrochen verschieben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Eine typische cell angeschlossene Kapazität der Aufnahme mit mehreren Schritten nach unten, mit Einzel Vesikel Endozytose assoziiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Cell-Attached-Kapazitätsmessungen erfordern mehrere wichtige Schritte, um Aufnahmen mit hoher Qualität erfolgreich zu erhalten: 1) lebensfähig und gesunden Zellen von Nebennieren hergestellt werden; 2) PDL Beschichtung der Deck; 3) Gigaohm Dichtung Bildung; 4) Geräuschpegel des Systems; und 5) Phasenkorrektur.

Für Tierchirurgie, ist eine potenziell Änderungen machen können, um den chirurgischen Ansatz, um am besten anpassen und Geschicklichkeit, um Schäden bei der Präparation zu verhindern. Darüber hinaus ist eine ausreichende praktische Erfahrung auf das Auffinden und Entfernen der Nebennieren Imperativ als Zellen, die für die elektrophysiologischen Ableitungen verwendet werden, stammen ausschließlich aus der Medulla der Nebenniere. Enzymverdauung, ist es kritisch, die Enzymlösung durch Blasenbildung der Lösung mit 5% CO 2 + 95% O 2 zu äquilibrieren. Seien Sie sicher, dass der Schlauch mit dem Zylinder verbunden ist ausreichend und engen ohne Lecks. Zusätzlich sicher, dass das Ende in Lösung richtig während der gesamten 15 Minuten Zeit Blasenbildung gelegt; Dies kann mit der Platzierung einer 20 G Nadel Ende, das am Ende des Schlauches geglättet worden ist, so daß Luftstrom in geeigneter Weise direkt erreicht werden. Darüber hinaus wird zusätzliche Zeit für diesen Schritt nicht schaden, solange die Luftströmung nicht so stark wie die Lösung in dem Rohr überläuft. Zell Titration ist ein weiterer kritischer Komponente, die der Praxis stattfinden wird. Der Großteil der Zellen geschädigt, wenn über titriert werden; Umgekehrt, wenn die Titration nicht genug ist, wird es sehr wenige einzelne isolierte Zellen aus dem Gewebe getrennt werden. Um effektiv zu titrieren, nutzen eine 200 ul Pipettenspitze Pipette auf und ab 7-8x, sicherstellen, dass die Drüsen werden sanft durch die 200 ul Pipettenspitze übergeben, wie Sie titrieren.

PDL-Beschichtung, kann man immer verlängern die Inkubationszeit der PDL auf den Deckgläsern bis zu 3 Stunden, um eine ausreichende Beschichtung der Deckgläser zu gewährleisten. Der PDL-Beschichtung ist für chromaffinen Zellen zu befestigenauf und wachsen an den Deckgläsern nach Zellbeschichtung. Wenn PDL Beschichtung nicht ausreichend ist, werden die meisten der Zellen, die aus dem Deckglas, das die Dichtung Gigaohm Bildung erschwert wird abnehmen werden.

Cell-Attached-Aufnahmen können immer modifiziert und verbessert werden, da der Patch-Technik ist ein spezielles Verfahren. Sanften und feinen Ansaugen ist kritisch bei der Erleichterung der Gigaohm Dichtungsbildung bei der Patch-Pipette und Zellen in Kontakt sind. Zu viel Sog der Patch Spitze-Zell-Kontakt zerstören und in extremen Situationen können die Zellen in der Patch-Pipette abgesaugt werden. Dies wird sehr einfach auf dem Oszilloskop, indem in ein Ganzzellkonfiguration oder mit einem sehr geringen Widerstand Rückkehr zu einem sehr große beobachtet werden; Praxis ist von größter Bedeutung, um eine hohe Qualität Gigaohm Dichtung Bildung zu erhalten.

Während hohe Dichtungswiderstand ist entscheidend, um den Geräuschpegel in der Cell-Attached-Aufnahmen zu minimieren, sind auch die folgenden zwei Schrittewichtig, um den Geräuschpegel zu reduzieren, um einzelne endozytischen Ereignisse lösen: (1) In der Patch-Pipette Lösung, TEACl wird verwendet, um spannungsabhängigen K +-Kanäle zu blockieren; (2) der Pipettenspitze mit Klebewachs beschichtet und das Wachs im Inneren der Pipettenspitze kann durch Wärme Polieren entfernt werden.

Während die Phaseneinstellung in Protokoll 6.2 aufgeführten Schritt ist entscheidend für die Anfangsphase für die Aufnahme einzurichten, kann dieser Schritt nicht ideal. Daher ist es wichtig, die Phasenkorrektur während des Spaltporenanalyse für einzelne Ereignisse durchführen. In einem Ruhemembranpotential von -65 mV, zeigen Ganzzellableitungen, dass eine typische Maus chromaffinen Zelle eine Eingangskapazität von 5 pF und einen Eingangswiderstand von 500 MOhm, die die Membranleitfähigkeit von Maus-chromaffinen Zellen berechnet ~ 0,4 pS / fF. Dies bedeutet, dass ein endozytischen Veranstaltung mit einer Kapazität Größe von 1 fF wird in einem Nettoverlust von Membranleitfähigkeit von ~ 0,4 pS führen. Dieser Wert ist im Vergleich zuypische 50-100 pS Membranleitfähigkeit Wechsel mit endozytischen Spaltung-Porenverschluss in Cell-Attached-Aufnahmen verbunden. Daher sind wir zuversichtlich, dass unsere Phasenkorrektur ermöglicht es uns, die Grundlinie der Membranleitfähigkeit, so dass die Pre-und Post-Spaltung Porenverschluss ist auf der gleichen Ebene zu justieren; Dieser Prozess kann in unserer Datenanalyse zu bringen <1% Fehler.

Zusammenfassend ist die hier beschriebene Protokoll zeigt, wie Cell-Attached-Kapazität Aufnahmen können verwendet werden, um zu überwachen einzelne Vesikel Endozytose mit Maus chromaffinen Zellen als Modellsystem werden. Diese Technik erlaubt es, die Regulationsmechanismen für Vesikel Spaltung während der Endozytose zu untersuchen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-D-Lysine Sigma P0899
DMEM 15066024 Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Life Technologies
Cover Glass Carolina Biological 633029 12 mm
Penicillin Streptomycin Life Technologies 15140122 100 ml
Insulin-Trans-Sel-X Life Technologies 51500056 Only thaw on ICE!
Papain Worthington 39S11614
EPC-7 plus patch amplifier HEKA
BNC-2090 data acquisition board National Instruments
Igor data acquisition software Wavemetrics
P-97 pipette puller Sutter Instruments
Microforge Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries Sutter Instruments B150-110-10 Outer diameter: 1.5 mm
Inner diameter: 1.10 mm
Length: 10 cm

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References

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