تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لتركيب ووضع العلامات الفلورية النانوية (NPS). تم تطبيق مصادر القدرة النووية في التجارب نبض مطاردة لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. وتلت التلاعب في نظام إندو الليزوزومية من الأنشطة من مسببات المرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة التي كتبها التصوير الخلية الحية وكميا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

النانوية الفلورسنت (NPS) مع المواد الكيميائية مرغوب فيه، الخصائص البصرية والميكانيكية هي أدوات واعدة لتسمية عضيات داخل الخلايا. هنا، ونحن نقدم طريقة استخدام الذهب-BSA-رودامين مصادر القدرة النووية لتسمية نظام إندو الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة ورصد التلاعب من المضيف مسارات الخلوية من قبل الممرض داخل الخلايا السالمونيلا الملهبة. وقد استوعبت مصادر القدرة النووية بسهولة عن طريق خلايا هيلا ومحلية في أواخر الإندوسومات / الجسيمات الحالة. عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الحويصلات وتراكم تلك المصادر في الهياكل غشاء Salmonella- المستحث. نحن نشر حزمة البرامج Imaris للالتحليلات الكمية من الصور مبائر المجهري. وكان عدد من الأشياء وتوزيع حجمها في الخلايا غير المصابة تختلف عن تلك الموجودة في خلايا -infected السالمونيلا، مشيرا إلى إعادة تشكيل للغاية من نظام إندو الليزوزومية التي كتبها WT السالمونيلا.

Introduction

وقد اجتذبت النانوية الفلورسنت (NPS)، بما في ذلك مصادر القدرة النووية المعدنية، ونقاط الكم، البوليمر مصادر القدرة النووية، مصادر القدرة النووية السيليكا، النقاط الكربون وغيرها، اهتماما كبيرا خلال العقود الماضية 1،2. مقارنة الأصباغ العضوية التقليدية، وتبين مصادر القدرة النووية الفلورسنت الكيميائية والخصائص البصرية والميكانيكية مرغوبة، مثل قوة قوية إشارة، ومقاومة للphotobleaching من وارتفاع 3،4 توافق مع الحياة. هذه المزايا تجعل منها طريقة اختيار للاستشعار داخل الخلايا والتصوير الخلية الحية. وعلاوة على ذلك، مجموعة متنوعة من NPS-الإلكترون كثيفة مرئية بواسطة المجهر الإلكتروني (EM)، وتسهيل استخدامها لتحليل مجهري مترابطة، والذي يسمح الجمع بين الخلية الحية تتبع مع ​​المجهر الضوئي (LM) ودقة أعلى في مستوى التركيبية مع EM 5. على سبيل المثال، كانت مصادر القدرة النووية الذهب وقت طويل استخدامها بكفاءة كما أجهزة الاستشعار في خلايا حساسة للتشخيص يعيشون وكذلك في مجال المناعة وضع العلامات 6. الصورة الأخيرةtudies تشير إلى أن مصادر القدرة النووية الذهب مع حجم وشكل مختلف يمكن أن يكون بسهولة امتصاص من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا ونقل بشكل روتيني من خلال مسار endosomal، وبالتالي يكون كبيرا يجري المحتمل تطبيقها لداخل الخلايا تتبع النقل حويصلة ووضع العلامات نظام إندو الليزوزومية 7،8 .

مسببات الأمراض الميكروبية، مثل السالمونيلا الملهبة، الشيجلا الفلكسنرية والليستريا المستوحدة، وضعت آليات مختلفة لغزو الخلايا المضيفة غير أكلة 9. بعد أن المنضوية، ومسببات الأمراض، والمترجمة إما في العصارة الخلوية أو عزلها في أماكن محددة الغشاء، تتفاعل على نطاق واسع مع البيئات التي تستضيفهم وتعدل هذه لصالح بقائهم على قيد الحياة 10. على سبيل المثال، السالمونيلا الملهبة لليقيم ويتكاثر داخل phagosomal حجرة داخل الخلايا وصفته السالمونيلا المحتوية فجوة (SCV) عند إصابة 11. وSCV النضجبالاتجار نحو جهاز جولجي، تمر التفاعل المستمر مع مسار التقامي، ويدفع تشكيل الهياكل واسعة أنبوبي، مثل السالمونيلا خيوط يسببها (SIF) والفرز الأنابيب نيكسين، السالمونيلا يسببها الناقل إفرازية البروتين غشاء 3 (SCAMP3) الأنابيب، الخ . 12-14. دراسة كيف يمكن لهذه مسببات الأمراض البكتيرية التلاعب مسارات خلايا المضيف أمر ضروري لفهم الأمراض المعدية.

هنا، تم استخدام مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين كأثر السوائل لتسمية المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية، واستخدم الإنسان الممرض الهضمي السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية (السالمونيلا)، وبكتيريا نموذج لدراسة التفاعلات من مسببات المرض مع استضافة المسار التقامي. تم تصوير مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين الخلايا في الخلايا غير المصابة والخلايا المصابة مع WT السالمونيلا أو سلالات متحولة من قبل متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي (CLSM).ثم تم استخدام البرمجيات Imaris لقياس توزيع مصادر القدرة النووية، مشيرا إلى أن عدوى السالمونيلا التي يسببها إعادة ترتيب الشديد من الإندوسومات / الجسيمات الحالة. وبعد وصف هذا الأسلوب، والتجارب المشابهة يمكن أن تكون مصممة لتتبع مصير طويلة الأجل للمعايير المهنية الوطنية المنضوية وللتحقيق في تأثير المواد الخارجية المختلفة أو العوامل الداخلية على مسار التقامي الخلايا حقيقية النواة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توليف 10 نانومتر الذهب النانوية (الذهب NPS) 15

  1. يعد حل A: إضافة 2 مل 1٪ مائي كلوريد الذهب إلى 160 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء.
  2. يعد حل ب: إضافة 8 مل 1٪ ثلاثي الصوديوم سترات × 2 H 2 O وحمض التانيك 160 ميكرولتر 1٪ إلى 32 مل ملي-Q، أو مزدوج المقطر والماء.
  3. الاحماء حل A و B إلى 60 درجة مئوية، ومزجها مع التحريك. نلاحظ اللون الأزرق الداكن على الفور. لاحظ اللون الأحمر بعد حوالي 15 دقيقة. ثم تسخين إلى 95 ° C، والحفاظ 5 دقائق وتبريد حل لRT.
  4. إضافة قطرة من تعليق NP على شبكة الكربون المغلفة والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم والتشكل مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ.

2. طلاء من الذهب مصادر القدرة النووية مع BSA وصفها مع رودامين N-hydroxysuccinimidyl استر (NHS) 16

  1. إضافة 900 ميكرولتر مصادر القدرة النووية الذهب إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب، الطرد المركزي في 15،000 x ج لمدة 30 دقيقة. المرجعدوليا هو، وإعداد أنابيب متعددة يجوز دفعة واحدة.
  2. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه في 900 ميكرولتر تعقيم المياه ملي-Q وإضافة 100 ميكرولتر 2 ملغ / مل BSA / PBS، مزيج على دوامة في 800 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  3. لإزالة الزائد BSA، أجهزة الطرد المركزي في إعداد 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة.
  4. تجاهل طاف، وإعادة تعليق مصادر القدرة النووية الذهب BSA في 125 ميكرولتر PBS، إضافة 12.5 ميكرولتر من 1 M بيكربونات.
  5. فورا قبل الاستخدام، ويعد حل 10 ملغ / مل من رودامين NHS / DMSO، إضافة 30 ميكرولتر من رودامين NHS حل / DMSO إلى 1ml من تعليق الذهب BSA مصادر القدرة النووية. احتضان رد فعل لمدة 2 ساعة (أو O / N) في RT خلال 800 دورة في الدقيقة الاختلاط، وتجنب التعرض للضوء.
  6. تنقية الذهب NPS-BSA-رودامين من خلال غسيل الكلى ضد PBS في 4 درجة مئوية مع 5 التغييرات عازلة خلال الفترة من 36 - 48 ساعة.
  7. لتحقيق الاستقرار في مصادر القدرة النووية، إضافة 10 ميكرولتر من 200 ملغ / مل BSA / PBS في كل 1 مل مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لإزالة أجهزة الطرد المركزي مجانا أو الإفراج عنهم BSA-رودامين، في 15،000 x ج لمدة 60 دقيقة. Resuspend وبيليه في 2 ملغ / مل BSA / PBS، وقياس OD 520، وتخزينها في 4 ° C، وتجنب التعرض للضوء.
  8. تمييع مصادر القدرة النووية 10 مرات مع ميلي-Q أو الماء المقطر مزدوج، إضافة قطرة على شبكة المغلفة الكربون، والسماح ليجف في الهواء. التحقق من حجم ومورفولوجية مصادر القدرة النووية بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (TEM).
    تم تعقيمها جميع المواد التي تستخدم في إعداد NP وأجريت العملية في غطاء ثقافة الخلية أو على مقاعد البدلاء بجانب لهب: ملاحظة.

3. ثقافة خلايا هيلا

  1. خلايا هيلا معربا عن LAMP1-GFP بشكل دائم يتم تربيتها في DMEM مع المصل 10٪ العجل الجنين (FCS) ونمت عند 37 درجة مئوية في جو تحتوي على 5٪ CO 2.
  2. البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 50،000 لكل بئر في 8 جيد غرفة الشريحة (Ibidi)، واحتضان O / N.

4. ثقافة البكتيريا

  1. استخدام السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي التيفية الفأرية NCTC 12023 فيلد من نوع (WT) سلالة. وعلى سبيل المقارنة، واستخدام سلالات متحولة Δ ssaV المعيبة في SPI2-T3SS وΔ سيفا تفتقر المستجيب رئيسيا سيفا لSIF. استخدام سلالات إيواء بلازميد pFPV25.1 للتعبير التأسيسي من تعزيز GFP.
    ملاحظة: سلالات جرثومية يتم تربيتها بشكل روتيني في لوريا، BERTANI مرق (LB) مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين (WT) وLB مع اضافة 50 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و / أو 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (Δ ssaV، Δ سيفا ) من المطلوب للحفاظ على البلازميدات.
  2. تطعيم مستعمرة واحدة من البكتيريا في 3 مل LB مع المضادات الحيوية المناسبة وتنمو O / N في 37 درجة مئوية تحت ظروف اهتزاز للتهوية، ثم تمييع 01:31 في LB جديدة ومواصلة نمو 3.5 ساعة. في هذه النقطة الوقت، والثقافات تصل إلى مرحلة سجل في وقت متأخر والبكتيريا والغازية للغاية. A 'طبل الأسطوانة "هو ملائم لاحتضان الثقافات أنبوب اختبار مع التهوية.

5. العدوى من خلايا هيلا بواسطةالسالمونيلا والذهب BSA-رودامين مصادر القدرة النووية نبض تشيس وضع العلامات (انظر الشكل 1 للمخطط)

  1. قياس OD 600 من البكتيريا شبه مثقف وتمييع لOD 600 = 0.2 في 1 مل PBS (~ 3 × 10 8 وت م / مل)، إضافة الكميات المناسبة من البكتيريا إلى خلايا هيلا في الشرائح غرفة 8-جيدا لتحقيق تعدد العدوى (وزارة الداخلية) من 100.
  2. احتضان لمدة 30 دقيقة في الحاضنة خلية، وغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة البكتيريا غير المنضوية (تم تعيين هذه النقطة الوقت ك 0 ساعة بعد العدوى، أو 0 ساعة بي). إضافة 300 ميكرولتر من مستنبت الطازجة تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جنتاميسين والحفاظ لمدة 1 ساعة. ثم استبدال المتوسطة مع المتوسطة الطازجة تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة.
  3. بعد الحضانة مع الثقافة المتوسطة التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمدة 1 ساعة، يتم استبدال المتوسطة عن طريق التصوير المتوسطة (النسور MEM دون FCS، L-الجلوتامين، الفينول الحمراء وبيكربونات الصوديوم، مع 30 ملي HEPES، ودرجة الحموضة 7.4) شاركntaining 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين. تضاف NPS-الذهب BSA-رودامين إلى خلايا هيلا للحصول على التركيز النهائي من OD 520 = 0.1.
    ملاحظة: يمكن أيضا إضافة مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين إلى الخلايا قبل الإصابة، أو في مختلف نقاط في الوقت بي
  4. بعد 1 ساعة الحضانة، وإزالة المتوسطة، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 300 ميكرولتر من المتوسطة التصوير الطازجة تحتوي على 10٪ FCS و 10 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لبقية فترة حضانة.
    ملاحظة: مدة حضانة المرض قد تختلف اعتمادا على تركيز تلك المصادر وخطوط الخلايا المستخدمة. لالضامة RAW264.7، لاحظنا أن 30 دقيقة الحضانة مع مصادر القدرة النووية بتركيز OD 520 = 0.05 يسمح استيعاب كافية.

6. التصوير

  1. استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل متحد البؤر الليزر المسح الضوئي (CLSM) أو قرص الغزل (SD) المجهر مع الغرفة البيئية مرطب للالتصوير عالية الدقة على مختلف نقاط الوقت.
  2. التبديل على درجات الحرارة جontrol النظام والانتظار حتى أنها مستقرة. تحسين إعدادات التصوير مثل التكبير، سرعة المسح الضوئي، والقرار، Z-كومة الخ استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة لGFP ومصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين. لهذا البروتوكول، استخدم 400 هرتز سرعة المسح الضوئي، وقرار من 512 × 512 بكسل وحجم Z-خطوة من 0.25 ميكرون. تثير GFP والذهب-BSA-رودامين باستخدام الليزر هارون (488 نانومتر) والليزر الحنة (543 نانومتر)، على التوالي. تشمل مشرق الميدان (BF) قناة لرصد شكل الخلايا. لغيرها من نظم المجهري والشروط العدوى، والإعداد يجب أن يتم تعديلها وفقا لذلك.
    ملاحظة: استخدم نفس الليزر AR كمصدر للضوء من قناة BF وإشارة تم الكشف مع صورة المضاعف (PMT) كاشف.
  3. في الوقت المشار إليه نقاط بي، جبل الشرائح الغرفة 8 جيدا تحتوي على الخلايا المصابة على المسرح المجهر والصور قياسية.

7. تحليل الصور

  1. استخدام برامج التحليل المجهري صورة (انظر السالمونيلا. فتح البيانات عن طريق النقر على 'فتح' واختيار الملف.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، مفتوحة حزم برمجيات المصدر مثل يماغيج أو فيجي يمكن أن تستخدم لصورة الكمية تحلل.
  2. في شريط الأدوات كائنات من فق رأي انقر على أيقونة رمز لإضافة عنصر سطح جديد. انقر على رمز (التالى).
  3. لتحليل المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، حدد جزء من العائد على الاستثمار. في منطقة المشاهدة، قسم تحدها المستطيل مضافين على الصورة ويمثل العائد على الاستثمار. أدخل القيم في X- المقابلة، Y-، وحقول Z-، أو النقر مباشرة على الأسهم في المعاينة المستطيل لتعديل حجم وموضع من العائد على الاستثمار. ثم انقر فوق رمز = "/ الملفات / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (التالي).
  4. كقناة المصدر، حدد القناة 3 (إشارة للذهب-BSA-رودامين NPS). التحقق من الخيار السلس لإعداد نعومة المنطقة الناتجة عن ذلك. تعريف قيمة يدويا أو قبول القيمة التي تنشأ تلقائيا. للعتبة، حدد الخيار كثافة المطلق.
  5. لتعديل العتبة، حدد الخيار اليدوي وتعيين قيمة. في مساحة العرض، يتم عرض معاينة عتبة السطح في الرمادي.
  6. على علامة التبويب صنف السطوح السطح الناتجة يمكن أن تتم تصفيته وفقا لمعايير مختلفة. مرشح الافتراضي هو يمكن أيضا أن يدرج 'عدد من voxels> 10'، وغيرها من المرشحات بواسطة الضغط على 'إضافة'. إذا كان الترشيح ليست ضرورية، ثم حذف جميع المرشحات عن طريق النقر على زر حذف. انقر رمز (التالى).
  7. لاستكمال إنشاء السطحية، انقر على/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (إنهاء). في قائمة كائن، والآن برنامج الأمم المتحدة للتحقق مربع لهذا البند حجم والجدد سطح إنشاؤها يتم عرض في عرض المنطقة.
  8. تصدير الإحصاءات. الآن، في رأي فق لون الموضوعات تختلف من الأرجواني إلى الأحمر وفقا لمنطقتهم. ويبين الجدول 'أرقام مساحة الأرض' المعلومات إحصاءات (على سبيل المثال، رقم الهوية ومجال الكائنات). تصدير جميع الإحصاءات من سطح 1 إلى ملف Excel عن طريق النقر رمز (حفظ).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد تم توليد مصادر القدرة النووية الذهب من خلال طريقة راسخة عبر الحد من حمض chloroauric بواسطة سترات وحمض التانيك. كما هو مبين في الشكل 2A، كانت مصادر القدرة النووية الذهب توليفها شبه كروية الشكل مع حجم ما يقرب من 10 نانومتر. لم BSA طلاء ورودامين وضع العلامات لا تؤثر التشكل أو حجم (الشكل 2B).

وقد أفيد أن مصادر القدرة النووية الذهب يمكن أن تؤخذ بسهولة من قبل خلايا الثدييات المختلفة، وانتهى بها المطاف في النظم التقامي 7. وفقا للأعمال السابقة، وقد لوحظت إشارات مضان الحمراء الزاهية في خلايا هيلا بعد 1 ساعة الحضانة مع مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين (الشكل 3، WT 5 ساعة بي)، مما يدل على استيعاب الفعال لمصادر القدرة النووية من قبل الخلايا. عثر colocalized معظم إشارات حمراء مع إشارات خضراء، وتبين أن مصادر القدرة النووية اقتصرت في الإندوسومات المتأخرة أو الجسيمات الحالة. لكن، خلافا لتوزيع موحد للمصادر القدرة النووية في أواخر الإندوسومات / الجسيمات الحالةفي الخلايا غير المصابة (الشكل 3، وهمية)، تم إعادة ترتيب مواقعها إلى حد كبير في الخلايا -infected WT السالمونيلا. في المرحلة المبكرة من العدوى (الشكل 3، WT 5 ساعة بي)، السالمونيلا يعيد داخل SCV وSIF الخضوع لتمديد سريع أو حركة الانكماش. عند هذه النقطة الوقت، تم العثور على جزء بسيط من مصادر القدرة النووية في SCV وSIF، بينما جزء آخر كان لا يزال تقع في حرة الإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة. في 8 ساعة بي (الشكل 3، WT 8 ساعة بي)، تم تشكيل شبكة استقرت من SIF، ووجد معظم مصادر القدرة النووية المتراكمة داخل الهياكل الأنبوبية، في حين سوى جزء صغير جدا ظلت تقع في حرة الإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة. سلالات متحولة Δ Δ ssaV وسيفا أظهرت سلوكيات متميزة. كما هو مبين في الشكل (3)ssaV)، في 8 ساعة بي، اقتصر Δ ssaV داخل SCV في حين تم تشكيل أية هياكل SIF. وقد لوحظت بعض مصادر القدرة النووية المحيطة السلمونتم ايلا داخل SCV، ولكن الغالبية مصادر القدرة النووية لا تزال تقع في حرة الإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة. لسلالة Δ سيفا (الشكل 3، Δ سيفا)، والهروب من السالمونيلا في السيتوبلازم حدث، ولوحظ عدم وجود علاقة بين مصادر القدرة النووية والبكتيريا.

في دراستنا السابقة تبين أن عرض SIF خصائص ديناميكية للغاية في المرحلة المبكرة من العدوى (3-5 ساعة بي)، ولكن تصبح استقرت في فترة لاحقة (> 8 ساعة بي) 12. ولذلك، فإننا يتساءلون عما إذا السالمونيلا في المراحل المبكرة والمتأخرة من العدوى لها قدرة مماثلة لإعادة ترتيب توزيع مصادر القدرة النووية داخل الخلايا. كما هو مبين في الشكل (4)، وحضنت مصادر القدرة النووية الذهب مع خلايا هيلا O / N قبل الإصابة، أو في مختلف نقاط وقت بعد الإصابة (1 - 7 ساعات بي) لمدة 1 ساعة، في جميع الحالات للمعايير المهنية الوطنية المنضوية وحظت المتراكمة في SCV أو SIF.

observ المجهريكشفت ations أن العدوى عن طريق النتائج السالمونيلا في إعادة ترتيب واسع النطاق للنظام إندو الليزوزومية من الخلايا المضيفة. وكخطوة تالية، كنا حزمة البرامج Imaris لتحليل الظواهر الخلية المضيفة السالمونيلا يسببها بطريقة كمية. باستخدام صورة من خلية واحدة هيلا المصابين في 8 ساعة بي كمثال على ذلك، وصفت تعليمات خطوة بخطوة للتحليل الكمي في الشكل 5. ومن خلال عتبة كثافة 15 و 'عدد من voxels> 10' مرشح، 3D تم استخراج الكائنات من ملف الصورة الأصلية. كان من المفترض أن تكون هياكل داخل الخلايا التي الذهب-BSA-رودامين مصادر القدرة النووية تقع مع الكائنات. في هذا المثال، تم استخراج 67 الكائنات في المجموع، مع مساحة لخص كما 1،974.64 ميكرون 2. أكبر الكائن، الذي colocalized مع شبكة SIF، تبلغ مساحتها 1،836.23 ميكرون في حين أن البعض الآخر أصغر من 50 ميكرون 2. وعلى سبيل المقارنة، مثال واحد يظهر في ضليع في الرياضياتأعطيت تحليل itative نتيجة الخلايا غير المصابة في. وهنا، تم استخراج 431 الكائنات في المجموع، وضمنه متوسط ​​قيمة المنطقة هي 5 ميكرون 2 وأكبر كائن تبلغ مساحتها 34 ميكرون 2. المنطقة لخص الكائنات هي 2،252 ميكرون وهو مشابه إلى الخلية المصابة في الشكل 4 (1،975 ميكرون 2). ومع ذلك، فإن عدد الكائنات هو أكبر بكثير من غيرها من واحد (431 و 67 الأشياء، على التوالي)، مما يدل على الانصهار حد كبير من الحويصلات مع السالمونيلا الهياكل الأنبوبية يسببها.

الشكل (1)
الشكل 1. مخطط لإعداد خلايا هيلا لتصوير الخلايا الحية. والمصنفة خلايا هيلا في الشرائح غرفة، المصابة وهمية، أو المصابين سلالات السالمونيلا المختلفة لمدة 30 دقيقة، وغسلها 3 مرات مع PBS، ثم incubat إد مع المتوسط ​​تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الجنتاميسين لمدة 1 ساعة. وفي وقت لاحق، تم استبدال المتوسطة عن طريق التصوير المتوسطة التي تحتوي على 10 نانومتر مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين (OD 520 = 0.1) و 10 ميكروغرام / مل جنتاميسين، المحتضنة لمدة 1 ساعة، ثم مطاردا من قبل متوسطة مجانا NP-لبقية التجربة . تم إجراء تصوير الخلايا الحية في نقاط زمنية مختلفة الرد على العدوى (بي). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. صور TEM من الغروية مصادر القدرة النووية الذهب قبل (أ) وبعد وضع العلامات (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

طرق "> الشكل (3)
وكان الرقم 3. إعادة عرض لنظام إندو الليزوزومية الخلوي المضيف عن طريق خلايا السالمونيلا. هيلا داخل الخلايا المصابة وهمية، أو المصابين السالمونيلا WT، Δ Δ ssaV أو سيفا سلالات متحولة ونبضة / مطاردة مع 10 نانومتر مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين ( تم إجراء OD 520 = 0.1) كما هو موضح في الشكل (1). وتظهر توقعات كثافة القصوى من CLSM Z-مداخن. الحانات النطاق، 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4. سهولة الوصول للنظام إندو-الليزوزومية في مراحل مختلفة من العدوى السالمونيلا. هيلاتم نابض الخلايا مع 10 نانومتر مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين (OD 520 = 0.1) O / العدوى مسبق N، أو لمدة 1 ساعة في مختلف نقاط في الوقت بي كما هو مبين. تم إجراء التصوير الخلية الحية في 8-9 ساعة بي التوقعات كثافة القصوى من CLSM Z-مداخن ترد. الحانات النطاق، 10 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5. الخطوة خطوة تعليمات للتحليل الكمي من قبل Imaris باستخدام صورة لخلية هيلا المصابين في 8 ساعة بي كمثال على ذلك. (A) افتح البيانات عن طريق النقر على 'فتح' واختيار الملف. (B) في شريط الأدوات كائنات من وجهة النظر فق إضافة عنصر سطح جديد. (C) لتحليل العائد على الاستثمار، ثم حدد جزء من العائد على الاستثمار. (D) أدخل القيم في X- المقابلة، Y-، وحقول ض أو (E) النقر مباشرة على الأسهم في المعاينة المستطيل لتعديل حجم وموقع العائد على الاستثمار. في هذا المثال، تم في ROI لا تحتاج وتم تحليل الصورة كاملة. (F) وقناة مصدر حدد القناة 3 (إشارة من الذهب BSA-رودامين NPS). التحقق من الخيار السلس لإعداد نعومة المنطقة الناتجة عن ذلك. تعريف قيمة يدويا أو قبول القيمة التي تنشأ تلقائيا. هنا، تم استخدام 0.1 ميكرون. ل"عتبة" حدد الخيار "كثافة المطلقة". (G) لتعديل عتبة تحديد الخيار اليدوي وتعيين قيمة (في هذا المثال تم استخدام 15). في منطقة العرض يتم عرض سطح معاينة العتبة في الرمادي. (H) في علامة التبويب "صنف السطوح" سطح الناتجة يمكن أن تتم تصفيته وفقا لمعايير مختلفة. مرشح الافتراضي هو "عدد من voxels> 10 '. المرشح يمكن تعديلها عن طريق إدخال قيمة جديدة والفلاتر الأخرى ويمكن أن يضاف. في هذا المثال، حافظنا على "عدد من voxels> 10 'التصفية. (I) لاستكمال إنشاء السطحية اضغط على "إنهاء". في قائمة كائن الآن إلغاء الاختيار يتم عرض مربع لهذا البند حجم والجدد سطح إنشاؤها في منطقة المشاهدة باللون الأحمر. (J) في فق عرض لون الموضوعات تختلف من الأرجواني إلى الأحمر وفقا لمنطقتهم. (K) ويوضح "أرقام مساحة الأرض 'الجدول المعلومات الإحصاءات. إحصاءات الصادرات في ملف إكسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. التحليل الكمي نتيجة الخلايا غير المصابة. ( (B) على سطح الجديدة التي تم إنشاؤها. (C) على سطح الجديد في رأي فق. (D) ويبين "أرقام مساحة الأرض 'الجدول المعلومات الإحصاءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

النظام إندو-الليزوزومية من خلايا الثدييات يتحكم العمليات الفسيولوجية الهامة، بما في ذلك امتصاص العناصر الغذائية، بوساطة هرمون نقل الإشارة والمراقبة المناعة، وعرض المستضد 17. حتى الآن، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من علامات لوضع العلامات على مسار وتتبع الدراسات التقامي. على سبيل المثال، تحقيقات LysoTracker هي تحقيقات acidotropic الفلورسنت التي وضعتها المسابر الجزيئية (الحياة تكنولوجيز، الولايات المتحدة الأمريكية) لوصفها يحلول، والتي يمكن أن تتراكم بشكل انتقائي في مقصورات الخلوية مع انخفاض الرقم الهيدروجيني الداخلية وتسمية الخلايا الحية بتركيزات nanomolar 18 على نحو فعال. ومع ذلك، حضانة زمنية طويلة من التحقيقات LysoTracker مع الخلايا قد يحرض زيادة في الليزوزومية درجة الحموضة ويؤدي إلى التغيرات الفسيولوجية المحتملة من الجسيمات الحالة 19. بعض الجزيئات الحيوية الكبيرة، مثل dextrans المسمى fluorophore، وأيضا كثيرا ما تستخدم لدخلول؛ جسيم داخلي / الجسيمات الحالة وضع العلامات. ومع ذلك، وانخفاض صمود، الحياة تعميم قصيرة، وصالاحتفاظ OOR خلال تثبيت تعيق تطبيقاتها في المدى الطويل التصوير الخلية الحية ودراسات المجهر المتلازم 16،19. هنا، تم استخدام مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين كأثر السوائل لتسمية المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية. وقد لوحظت كفاءة امتصاص عالية وإشارات قوية مضان داخل الخلايا. وcolocalization شبه الكامل مصادر القدرة النووية مع الليزوزومية بروتين سكري LAMP1 التي التخصيب على الغشاء من الإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة، التحقق من وضع العلامات السليم للنظام إندو-الليزوزومية من قبل مصادر القدرة النووية. الجمع بين استخدام مصادر القدرة النووية الفلورسنت مع علامات أخرى مثل Lysotracker قد توفر معلومات تكميلية حول الخلية المضيفة الاتجار حويصلي والنضج.

ومن الجدير بالذكر أن استيعاب الخلوي مصادر القدرة النووية يعتمد اعتمادا كبيرا على أبعادها المادية والمكونات الكيميائية. لقد اختبرنا مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين بحجم 5 نانومتر و 10 نانومتر و 15 نانومتر و 30 نانومتر، وتوزيع الخلايا مماثل فيوقد لوحظت الجانب خلايا هيلا (النتائج لا تظهر). استخدمنا خلايا هيلا كما خط الخلية مريحة للدراسات عدوى السالمونيلا. ومع ذلك، NPS-الذهب BSA-رودامين يمكن أيضا أن المنضوية بسهولة من قبل مختلف خطوط الخلايا الأخرى والخلايا الأولية قابلة. على سبيل المثال، لاحظنا يسببها السالمونيلا الهياكل الأنبوبية ووضع العلامات من قبل NP في CHO، COS-7، CaCo2، أو 3T3 الخلايا، وكذلك في الانترفيرون حفز-γ-RAW264.7 خلايا خط الخلية تشبه البلاعم أو الضامة الفئران الابتدائية و الخلايا الجذعية. ومع ذلك، فإن كل خط خلية يتطلب تعديل العدوى والبروتوكولات نبضة / مطاردة.

وقد أفيد أن مصادر القدرة النووية السيليكا شرك الصبغة يمكن أن تستخدم حيويا، والعيش لفترة طويلة، وصامد للغاية يحلول علامة 19، ونحن أيضا مقارنة سلوك تلك المصادر السيليكا مخدر رودامين مع حجم مختلفة (30 - 1،000 نانومتر). وضع العلامات السليم للالإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة التي كتبها السيليكا مصادر القدرة النووية في الخلايا غير المصابة وتراكم تلك المصادر في Sوقد لوحظ CV وSIF في الخلايا السالمونيلا -infected. ولكن نظرا لتشكيل المجاميع مصادر القدرة النووية أو حجم كبير من مصادر القدرة النووية السيليكا واحدة، وتوزيع مصادر القدرة النووية جنبا إلى جنب مع السالمونيلا الهياكل الأنبوبية يسببها لم يكن موحدة (لا تظهر البيانات).

وهناك سمة مميزة من SCV وكذلك SIF هي وجود بروتينات سكرية الليزوزومية وفيرة للغاية مثل LAMP1 12. هنا، تم استخدام خط الخلية هيلا معربا عن ستابلي LAMP1-GFP لتوفير الراحة لتصوير الخلايا الحية للنظام إندو-الليزوزومية والهياكل SCV وSIF. واستخدمت سلالات السالمونيلا التعبير جوهري تعزيز GFP في التجارب العدوى للإشارة إلى موقع البكتيريا . نظرا لحجم موحد وشكل البكتيريا داخل الخلايا، ومضان GFP البكتيرية بشكل عام هو تمييزها بسهولة من التسمية GFP على الأغشية-إندو الليزوزومية. ومع ذلك، لإجراء التجارب المستقبلية التي فلوري إشارة من البكتيريا وغشاء العلاقات العامةoteins بحاجة إلى أن يكون التفريق بدقة، وغيرها من البروتينات الانصهار الفلورسنت، على سبيل المثال، mTurquoise، وينصح أن تكون متكاملة. هذا، ومع ذلك، يؤدي إلى جولات إضافية من الإضاءة والحصول على الصور، والتي تحمل مخاطر أعلى الصور الضرر في التجارب الخلية الحية.

لمعرفة الجينات وآليات أساسية لمسببات الأمراض البكتيرية لمعالجة مسارات الخلية المضيفة، تحتاج العديد من المسوخ المراد إنشاؤها وتحتاج أدائهم ليتم مقارنة بعناية. على سبيل المثال، الموهن للغاية السالمونيلا سلالات متحولة Δ Δ ssaV وسيفا في الفوعة النظامية والتكرار داخل الخلايا 20،21. فشلت كل من سلالات Δ Δ ssaV وسيفا للحث على SIF، وبالإضافة إلى ذلك Δ سيفا السالمونيلا تفقد غشاء SCV خلال العدوى 12. وبمقارنة الظواهر من WT وسلالات متحولة بدور أساسي في فهم قدرة السالمونيلا إلى remodel الخلية المضيفة حركة المرور حويصلي. وبناء على الفحص المجهري، فمن الواضح أن WT السالمونيلا تخريب المضيف مسارات التقامي الخلوية إلى حد أعلى بكثير بالمقارنة مع Δ Δ ssaV وسيفا سلالات متحولة. هذه الوظيفة قد تمكن السالمونيلا داخل الخلايا للحصول على مزيد من المواد الغذائية للبقاء على قيد الحياة داخل الخلايا وتكرارها.

تظهر الصور المجهري مبائر بشكل واضح في إعادة بناء المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا. ومع ذلك، هناك حاجة التحليل الكمي من الصور للمقارنة دقيقة. في الطريقة الموصوفة هنا، يتم استخدام البرمجيات Imaris لاستخراج الأجسام 3D التي لديها كثافة مضان في القناة 3> 15 وعدد من voxels> 10. من المفترض أن تكون هياكل غشاء الخلايا التي تحتوي على الذهب BSA-رودامين مصادر القدرة النووية هذه الكائنات. عتبة كثافة مضان والمرشحات يمكن تعريف فقا لجودة الصور، ولكن شولد أن تبقى ثابتة لمقارنة شروط أو سلالات مختلفة. المعروضة هنا هي أمثلة على الخلايا غير المصابة وخلية -infected WT السالمونيلا في 8 ساعة بي، مع 431 و 67 الأجسام المستخرجة، على التوالي. وعلى الرغم من اختلاف واضح، فإنه ليس العقلاني للمقارنة فقط عدد من الكائنات، لأن حجم الخلايا ليست هي نفسها. حل واحد هو لتطبيع عدد من الكائنات إلى منطقة لخص (في هذا المثال، 2،252 ميكرون 2 و 1،975 ميكرون 2 على التوالي) أو مجموع من شدة الفلورسنت من الكائنات داخل الخلايا. بدلا من ذلك، فمن الممكن أيضا لتعقب خلية واحدة قبل حدوث الإصابة وعلى مختلف نقاط في الوقت بي من أجل مقارنة توزيع مصادر القدرة النووية في مراحل مختلفة من العدوى.

في الختام، في هذه الطريقة طبقت مصادر القدرة النووية الذهب BSA-رودامين لتسمية نظام إندو-الليزوزومية من الخلايا حقيقية النواة. التلاعب المضيف الخلوي نظام إندو-الليزوزومية من قبل intracellulaوقد لوحظ ص الممرض من قبل CLSM الخلايا الحية ونتائج التحليل الكمي أشار إعادة ترتيب المتطرفة من الإندوسومات أواخر / الجسيمات الحالة التي كتبها WT السالمونيلا. السالمونيلا تم استخدامها بوصفها نموذج الممرض في هذه الدراسة، ولكن السلوك داخل الخلايا من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى، مثل الشيجلا الفلكسنرية والليستريا المستوحدة ويمكن أيضا أن يتم التحقيق باستخدام هذا النهج. من حيث المبدأ، يمكن المنضوية الذهب BSA-رودامين مصادر القدرة النووية من قبل مجموعة كبيرة ومتنوعة من خطوط الخلايا، وبالتالي واعدة يجري تطبيقها على نطاق واسع في الدراسات التحقيق تفاعل مسار التقامي مع المواد الذاتية أو الخارجية متباينة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. (2007).
  18. LysoTracker and LysoSensor Probes. Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics