Anvendelse av Fluorescent Nanopartikler å studere Omforming av det Endo-lysosomal System av intracellulære bakterier

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen beskriver fremgangsmåter for syntese og fluorescerende merking av nanopartikler (NPS). NPS ble brukt i puls-chase eksperimenter å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler. Manipulering av endo-lysosomal system av aktiviteter av den intracellulære patogen Salmonella ente ble etterfulgt av levende celle bildebehandling og kvantifisert.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fluorescent nanopartikler (NPS) med ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper er lovende verktøy å merke intracellulære organeller. Her introduserer vi en metode med gull-BSA-NPs å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler og overvåke manipulasjoner av vertscelle pathways av den intracellulære patogen Salmonella ente. NPS ble lett internalisert av HeLa celler og lokalisert i sene endosomer / lysosomer. Salmonella infeksjon indusert omorganisering av blemmer og opphopning av NPs i Salmonella- indusert membranstrukturer. Vi rullet ut Imaris programvarepakke for kvantitative analyser av konfokalmikroskopi bilder. Antall objekter og deres distribusjons størrelse i ikke-infiserte celler var forskjellig fra de i Salmonella -infected celler, noe som indikerer ekstremt ombygging av endo-lysosomal system av WT Salmonella.

Introduction

Fluorescent nanopartikler (NPS), inkludert metall NPs, kvanteprikker, polymer NPs, silika NPs, karbon punktum, etc., har vakt betydelig oppmerksomhet i løpet av de siste tiårene 1,2. Sammenlignet med tradisjonelle organiske fargestoffer, fluorescerende NPs viser ønskelig kjemiske, optiske og mekaniske egenskaper, som for eksempel sterk signalstyrke, motstand mot fotobleking og høy biokompatibilitet 3,4. Disse fordelene gjør dem metoden for valg for intracellulær sensing og levende celle bildebehandling. Videre en rekke elektrontette NPs er synlige ved elektronmikroskopi (EM), tilrettelegging for deres bruk for korrelert mikroskopisk analyse, som tillater kombinasjon av levende celle sporing med lysmikroskopi (LM) og høyere oppløsning på ultrastructural nivå med EM 5. For eksempel har gull NPS vært lang tid effektivt anvendes som biosensorer i levende celler for sensitiv diagnostisering så vel som i felten av immun-merking 6. Nylige studies indikerer at gull NPS med forskjellig størrelse og form kan være lett opptak av et stort utvalg av cellelinjer og rutinemessig transporteres gjennom endosomale veien, har derfor et stort potensial som påføres for intracellulær transport vesikkel sporing og systemet merking endo-7,8 lysosomal .

Mikrobielle patogener, som Salmonella ente, Shigella flexneri og Listeria monocytogenes, har utviklet ulike mekanismer for å invadere ikke-fagocyttiske vertsceller 9. Etter å ha blitt internalisert, patogener, enten lokalisert i cytosol eller inne i de membranbundne avdelinger, samhandle mye med sine vertsmiljøer og modulere disse til å favorisere sin egen overlevelse 10. For eksempel ligger Salmonella ente og replikerer innenfor en intracellulær phagosomal rommet kalt Salmonella-holdige vakuole (SCV) ved infeksjon 11. Modning SCVtraffics mot Golgi-apparatet, gjennomgår kontinuerlige interaksjoner med endocytoseveien, og induserer dannelsen av omfattende rørformede strukturer, slik som Salmonella indusert filamenter (SIF), sortering nexin tubuli, Salmonella -indusert sekretorisk carrier membran protein 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Studere hvordan disse bakterielle patogener manipulere vertscelle veier er viktig for forståelse av smittsomme sykdommer.

Her ble gull-BSA-rhodamin NPS anvendt som fluid tracere for å merke vertscelle endo-lysosomal systemet, og den humane mage-patogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) ble anvendt som en modell for å studere bakterie interaksjoner av patogenet med vert endocytoseveien. Intracellulære gull-BSA-NPs i ikke-infiserte celler og celler infisert med WT Salmonella eller mutantstammer ble fotografert av et konfokal laser-scanning mikroskop (CLSM).Deretter Imaris programvare ble benyttet for å kvantifisere fordelingen av NPS, noe som viser at Salmonella-infeksjon indusert ekstrem omleiring av endosomer / lysosomer. Etter beskrivelsen av denne metoden, kan analoge eksperimenter være utformet for å spore langvarig skjebnen til de internalis NPS og for å undersøke innflytelsen av forskjellige eksogene stoffer eller endogene faktorer på endocytoseveien av eukaryote celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Syntese av 10 nm Gold Nanopartikler (Gold NPs) 15

  1. Forbered løsning A: tilsett 2 ml 1% vandig gull klorid i 160 ml Milli-Q, eller dobbelt destillert vann.
  2. Forbered oppløsning B: Tilsett 8 ml 1% tri-natriumcitrat x 2 H2O og 160 pl 1% Garvesyre i 32 ml Milli-Q eller dobbelt-destillert, vann.
  3. Varm opp løsning A og B til 60 ° C og bland dem under omrøring. Observere en mørk blå farge umiddelbart. Observere rød farge etter ca 15 min. Deretter varmes opp til 95 ° C, holde 5 min og kjøle løsningen på RT.
  4. Legg en dråpe av NP suspensjon på en karbon belagt rutenett og la det tørke i luft. Kontrollere størrelsen og morfologien til NPS ved transmisjonselektronmikroskopi.

2. Coating av gull NPs med BSA og merking med Rhodamine N-hydroksysuccinimidylester (NHS) 16

  1. Legg 900 ul gull NPS inn i et 1,5 ml Eppendorf-rør, sentrifuger ved 15 000 xg i 30 min. Opnalt, forberede flere rør kan på en gang.
  2. Kast supernatanten, re-suspendere pelleten i 900 pl sterilt Milli-Q vann og tilsett 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, blanding på en Vortex ved 800 rpm i 30 min.
  3. Å fjerne overflødig BSA, sentrifuger forberedelse på 15.000 xg i 60 min.
  4. Kast supernatanten, og re-suspendere gull BSA NPs i 125 mL PBS, tilsett 12,5 mL av en M bikarbonat.
  5. Umiddelbart før bruk, fremstille en 10 mg / ml oppløsning av rodamin NHS / DMSO, tilsett 30 pl av rodamin NHS / DMSO-oppløsning til 1 ml av gull-BSA NPS suspensjon. Inkuber reaksjonen i 2 timer (eller O / N) ved romtemperatur i løpet av 800 rpm omrøring, å unngå eksponering for lys.
  6. Rense gull BSA-rodamin NPs gjennom dialyse mot PBS ved 4 ºC med 5 buffer endringer over en periode på 36-48 timer.
  7. For å stabilisere NPs, legger 10 mL av 200 mg / ml BSA / PBS i hver en ml gull-BSA-NPs. For å fjerne den gratis eller sluppet BSA-rhodamin, sentrifuger ved 15,000 xg i 60 min. Resuspender pelleten i 2 mg / ml BSA / PBS, måle OD 520, og oppbevares ved 4 ° C, unngå eksponering for lys.
  8. Fortynne NPs 10 ganger med Milli-Q eller dobbelt destillert vann, tilsett en dråpe på en karbon-belagt rutenett, og la det tørke i luft. Kontroller størrelsen og morfologien til NPS ved transmisjonselektronmikroskopi (TEM).
    NOTE: Alle materialer som brukes for NP preparatet ble sterilisert og operasjonen ble utført i en cellekultur hette eller på en benk ved en flamme.

3. Kultur av HeLa celler

  1. HeLa-celler som uttrykker permanent LAMP1-GFP dyrkes i DMEM med 10% føtalt kalveserum (FCS) og dyrket ved 37 ° C i en atmosfære inneholdende 5% CO2.
  2. Seed celler ved en tetthet på 50 000 per brønn i en 8-brønners kammerskyveren (Ibidi) og inkuberes O / N.

4. Kultur av bakterier

  1. Bruk Salmonella ente serovar Typhimurium NCTC 12023 wild type (WT) stamme. Til sammenligning bruker mutantstammer Δ ssaV defekte i Spi2-T3SS og Δ Sifa mangler nøkkel effektor Sifa for SIF. Bruk stammer plasmid pFPV25.1 for konstituerende uttrykk for økt GFP.
    MERK: Bakteriestammer er rutinemessig dyrket i Luria-Bertani-medium (LB) med tilsetning av 50 ug / ml karbenicillin (WT) og LB med tilsetning av 50 ug / ml karbenicillin og / eller 50 ug / ml kanamycin (Δ ssaV, Δ Sifa ) av nødvendig for å opprettholde plasmider.
  2. Vaksinere en enkelt koloni av bakterier i 3 ml LB med passende antibiotika og vokse O / N ved 37 ºC i henhold risting vilkår for lufting, deretter fortynnes 1:31 i frisk LB og fortsette veksten i 3,5 timer. På dette tidspunkt punkt, kulturene når sen logfase og bakterier er meget invasiv. En "roller tromme 'er praktisk å ruge prøverørs kulturer med lufting.

5. Infeksjon av HeLa celler vedSalmonella og Gull-BSA-NPs Pulse Chase-merking (se figur 1 for ordningen)

  1. Måle OD 600 av sub-dyrket bakterier og fortynnet til OD600 = 0,2 i 1 ml PBS (3 x 10 ~ 8 cfu / ml), tilsett passende mengder av bakterier til HeLa-celler i 8-brønners kammerobjektglass for å oppnå et antall infeksjon (MOI) på 100.
  2. Inkuber i 30 min i celleinkubator, vaskes tre ganger med PBS for å fjerne ikke-internaliserte bakterier (dette tidspunkt ble angitt som 0 timer etter infeksjon, eller 0-t pi). Tilsett 300 ul friskt kulturmedium inneholdende 100 ug / ml gentamicin og opprettholde i 1 time. Deretter erstatte mediet med friskt medium inneholdende 10 ug / ml gentamicin for resten av inkubasjonstiden.
  3. Etter inkubering med kulturmedium inneholdende 100 pg / ml gentamicin i 1 time, blir mediet erstattet av tenkelig medium (Eagles MEM uten FCS, L-glutamin, fenolrødt og natriumbikarbonat, med 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml gentamicin. Gull-BSA-rhodamin NPS tilsatt til HeLa-celler for å oppnå en sluttkonsentrasjon på OD 520 = 0,1.
    MERK: Gull BSA-NPs kan også legges til celler før infeksjon, eller på ulike tidspunkter pi
  4. Etter 1 time inkubering, fjernes mediet, vaskes tre ganger med PBS, og tilsett 300 ul friskt avbildningsmedium inneholdende 10% FCS og 10 ug / ml gentamicin for resten av inkubasjonstiden.
    MERK: Varighet av inkubasjon kan variere avhengig av konsentrasjonen av NPS og cellelinjer som benyttes. For RAW264.7 makrofager, observerte vi at 30 min inkubering med NPS ved en konsentrasjon på OD 520 = 0,05 tillates tilstrekkelig internalisering.

6. Imaging

  1. Bruk en confocal imaging system for eksempel en konfokal laser-scanning (CLSM) eller en roterende disk (SD) mikroskop med en fuktet miljø kammer for Resolution Imaging på forskjellige tidspunkter høy.
  2. Slå på temperatur c-regulering system og vent til den er stabil. Optimalisere bildeinnstillinger som forstørrelse, skanning hastighet, oppløsning, Z-stack etc. Bruk passende eksitasjon / utslipps innstillinger for GFP og gull-BSA-NPs. For denne protokollen, bruker en 400 Hz skanning hastighet, oppløsning på 512 x 512 piksler, og Z-trinnstørrelse på 0,25 mikrometer. Opphisse GFP og gull-BSA-rodamin hjelp av en Ar laser (488 nm) og en HeNe laser (543 nm), henholdsvis. Omfatter en lys-feltet (BF) kanal for å observere formen på cellene. For andre mikroskopi systemer og smitteforhold, innstillingen må justeres tilsvarende.
    MERK: Bruk samme Ar laser som lyskilde av BF kanal og signal ble oppdaget med en foto multiplikator (PMT) detektor.
  3. På angitte tidspunkter pi, montere 8-brønners kammer lysbilder som inneholder infiserte celler på objektbordet og ta bilder.

7. Analyse av bilder

  1. Bruke mikroskopi bildeanalyse programvare (se Salmonella. Åpne data ved å klikke på 'Open' og velge filen.
    MERK: Alternativt kan åpen kildekode programvarepakker som ImageJ eller FIJI brukes til kvantitativ bildeanalyser.
  2. I formåls verktøylinjen i overgå utsikten klikk på ikonet Ikon å legge til en ny overflate element. Klikk på Ikon (Neste).
  3. Å analysere en region av interesse (ROI), velger segment en ROI. I et visningsområde, er et rektangel-grenset avsnittet kledde på bildet som representerer avkastning. Angi verdiene i den tilsvarende x-, y- og z-felt, eller klikk direkte på pilene i forhåndsvisnings rektangel å endre størrelsen og plasseringen av ROI. Deretter klikker Ikon = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (Neste).
  4. Som en kilde kanal, velger du kanal 3 (signal for Gold-BSA-NPs). Sjekk den glatte muligheten til å sette opp glatthet av den resulterende området. Definere en verdi manuelt eller godta automatisk generert verdi. For Threshold, velg Absolute Intensitet alternativet.
  5. For terskelen justering, velg manuelle alternativet og angi en verdi. I visningsområdet, er en overflate terskel forhåndsvisning vises i grått.
  6. I kategorien Gi Overflater den resulterende overflaten kan filtreres etter forskjellige kriterier. En standard filter er "antall lydelementer> 10 ', og andre filtre kan også inkluderes ved å klikke" Legg til ". Hvis en filtrering er ikke nødvendig, deretter slette alle filtre ved å klikke på sletteknappen. Klikk Ikon (Neste).
  7. For å fullføre Surface skapelse, klikk på/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Fullfør). I Objektliste, nå un-merke av i boksen for varen Volum og ny opprettet overflaten vises i visningsområdet.
  8. Eksportere statistikken. Nå, i overgå utsikten fargen av fagene varierer fra lilla til rødt i henhold til deres område. Og 'Plot Numbers område "tabellen viser statistikk informasjon (f.eks ID-nummer og området for gjenstander). Eksportere alle statistikk over overflaten 1 til en Excel-fil ved å klikke Ikon (Lagre).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gull NPs ble generert gjennom en veletablert metode via reduksjon av chloroauric syre ved citrate og garvesyre. Som vist i figur 2A, de syntetiserte gull NPS var kvasi-sfærisk form med en størrelse på ca 10 nm. BSA-belegg og rodamin-merking ikke påvirke deres morfologi eller størrelse (figur 2B).

Det har blitt rapportert at gull NPs kan lett tas opp av ulike pattedyrceller og endte opp i endocytiske systemer 7. I samsvar med tidligere arbeider, ble lyse røde fluorescens-signaler observert i HeLa-celler etter 1 timers inkubasjon med gull-BSA-rhodamin NPS (figur 3, WT 5 timer pi), hvilket indikerer effektiv internalisering av NPS av celler. De fleste av de røde signalene ble funnet colocalized med grønne signaler, som viser at NPs ble innesperret i sene endosomer eller lysosomer. Men i motsetning til jevn fordeling av NPs i sene endosomer / lysosomeri ikke-infiserte celler (figur 3, mock), ble deres plasseringer i stor grad omorganisert i WT Salmonella -infected celler. I den tidlige fasen av infeksjon (figur 3, WT 5 hr pi), replikerer Salmonella i SCV og SIF gjennomgå rask utvidelse eller sammentrekning bevegelse. På dette tidspunkt, var en brøkdel av NPs funnet i SCV og SIF, mens en annen fraksjon var fortsatt plassert i gratis sene endosomer / lysosomer. Ved 8 timers pi (figur 3, WT 8 timer pi), en stabilisert nettverk av SIF ble dannet, og de ​​fleste ble funnet NPS akkumulert inne i det rørformede strukturer, mens bare en meget liten del forble plassert i frie sene endosomer / lysosomer. Mutantstammene Δ ssaV og Δ Sifa utstilt forskjellige atferd. Som vist i figur 3ssaV), ved 8 timers pi, ble Δ ssaV avgrenset inne SCV mens ingen SIF strukturer ble dannet. Noen NPs ble observert rundt laksella inne SCV, men flertallet av NPs var fortsatt plassert i gratis sene endosomer / lysosomer. For Δ Sifa stamme (Figur 3, Δ Sifa), rømning av Salmonella i cytoplasma skjedde, og ingen forbindelse mellom NPs og bakterier ble observert.

I vår forrige undersøkelse ble det funnet at SIF visnings svært dynamiske egenskaper i den tidlige fasen av infeksjon (3-5 hr pi), men bli stabilisert i senere tid (> 8 timers pi) 12. Derfor er vi lurer på om Salmonella i tidlige og sene faser av infeksjon og har tilsvarende evne til å omorganisere fordeling av intracellulære NPs. Som vist i figur 4, ble gull NPS inkubert med HeLa-celler O / N før infeksjon, eller ved forskjellige tidspunkter etter infeksjon (1 - 7 timer pi) i 1 time, i alle tilfeller det meste av internalisert NPS ble observert akkumulert i SCV eller SIF.

Mikroskopisk observatørasjon avslørte at infeksjon med Salmonella resulterer i massiv omorganisering av endo-lysosomal system av vertsceller. Som et neste skritt, brukte vi Imaris programvarepakke for å analysere Salmonella -indusert vertscelle fenotyper i en kvantitativ måte. Ved hjelp av et bilde av en infisert HeLa celle ved 8 timers pi som et eksempel, er en trinn-for-trinn-instruksjon for kvantitativ analyse er vist i figur 5. Gjennom en intensitetsterskel på 15 og et 'antall voksler> 10' filter, 3D gjenstander ble hentet fra den originale bildefilen. Objektene skulle være intracellulære strukturer der det gull BSA-NPs plassert med. I dette eksempel ble 67 objekter ekstrahert totalt, med et summert område som 1,974.64 um 2. Det største objektet, som colocalized med SIF-nettverket, har et areal på 1,836.23 mikrometer 2, mens de andre er mindre enn 50 mikrometer to. For sammenligning, et eksempel som viser quantitative analyse resultat av en ikke-infisert celle ble gitt i. Her ble 431 objekter ekstrahert totalt, i hvilken den gjennomsnittlige verdien av området er 5 um 2 og den største gjenstand som har et areal på 34 mikrometer 2. Den summerte område av gjenstandene er 2252 um 2, som er sammenlignbar med den infiserte cellen i figur 4 (1975 um 2). Imidlertid er antallet objekter mye større enn den andre (431 og 67 gjenstander, henholdsvis), som indikerer stor grad fusjon av vesiklene med de Salmonella indusert rørformede strukturer.

Figur 1
Figur 1. Skjema for fremstilling av HeLa-celler for levende celle avbildning. HeLa-celler ble sådd ut i kammerobjektglass, mock-infiserte eller infisert med forskjellige Salmonella-stammer i 30 minutter, vasket tre ganger med PBS, deretter incubat ed med medium inneholdende 100 ug / ml gentamicin i 1 time. Deretter ble mediet erstattet med CCD-medium inneholdende 10 nm gull-BSA-rhodamin NPS (OD 520 = 0,1) og 10 ug / ml gentamicin, inkubert i 1 time, og deretter jaget av NP-fritt medium for resten av eksperimentet . Levende celle bildebehandling ble utført ved ulike tidspunkt etter infeksjon (pi). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. TEM bilder av kolloidale gull NPs før (a) og etter merking (b). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

måter "> Figur 3
Figur 3. Omforming av vertscelle endo-lysosomal system av intracellulære Salmonella. HeLa celler var mock-smittet eller infisert med Salmonella WT, Δ ssaV eller Δ Sifa mutantstammer og puls / jage med 10 nm gull-BSA-NPs ( OD 520 = 0,1) ble utført som beskrevet i figur 1. Toppen av intensitet projeksjoner av CLSM Z-stablene er vist. Skala barer, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Tilgjengelighet av endo-lysosomal system på ulike faser av Salmonella-infeksjon. HeLaCellene ble pulset med 10 nm gull-BSA-rhodamin NPS (OD 520 = 0,1) O / N før infeksjon, eller i 1 time ved forskjellige tidspunkter pi som angitt. Levende celle bildebehandling ble utført ved 8-9 timers pi Maximal intensitet projeksjoner av CLSM Z-stabler blir vist. Skala barer, 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Trinnvis instruksjon for kvantitativ analyse av Imaris å bruke et bilde av en infisert HeLa celle på åtte timers pi som et eksempel. (A) Åpne data ved å klikke på 'Open' og velge filen. (B) I formåls verktøylinjen i overgå utsikten legge en ny overflate element. (C) For å analysere en ROI, velg deretter segment en ROI. (D) inn verdiene i den tilsvarende x-, y- og z-felt eller (E) klikk direkte på pilene i forhåndsvisnings rektangel for å endre størrelsen og plasseringen av ROI. I dette eksempel ble en ROI ikke trenger og hele bildet ble analysert. (F) Som en kilde kanal velg Kanal 3 (signal fra Gold-BSA-NPs). Sjekk den glatte muligheten til å sette opp glatthet av den resulterende området. Definere en verdi manuelt eller godta automatisk generert verdi. Her ble 0,1 um brukes. For "Threshold" velges "Absolute Intensitet alternativet. (G) For terskelen justering velge manuelle alternativet og angi en verdi (i dette eksempelet 15 ble brukt). I visningsområdet en overflate terskel forhåndsvisning vises i grått. (H) I kategorien 'Gi Overflater' den resulterende overflaten kan filtreres etter forskjellige kriterier. En standard filter er "antall lydelementer> 10 '. Denfilteret kan justeres ved å legge inn en ny verdi og andre filtre kan tilsettes. I dette eksempelet vi holdt filte antall lydelementer> 10 '. (I) For å fullføre Surface skapelse klikk på "Finish". I Objektliste nå un-merke av i boksen for varen Volum og ny opprettet overflaten vises i visningsområdet i rødt. (J) I overgå utsikten fargen av fagene varierer fra lilla til rødt i henhold til deres område. (K) The 'Plot Numbers område "tabellen viser statistikk informasjon. Eksportstatistikken til en Excel-fil. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6. Kvantitativ analyse resultat av en ikke-infisert celle. ( (B) Den nye opprettet overflaten. (C) Den nye overflaten i overgå utsikten. (D) The 'Plot Numbers område "tabellen viser statistikk informasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endo-lysosomal system av pattedyrceller styrer viktige fysiologiske prosesser, herunder næringsopptak, hormon-mediert signaltransduksjon, immun overvåking, og antigenpresentasjon 17. Opp til nå, har en rekke markører vært brukt til merking av endocytoseveien og sporing studier. For eksempel, LysoTracker sonder er fluorescerende acidotropic prober utviklet av molekylære prober (Life Technologies, USA) for lysosome merking, som kan selektivt akkumuleres i mobilnettet lommer med lav indre pH og effektivt etiketten levende celler på nanomolare konsentrasjoner 18. Imidlertid kan lang tid inkubasjon av LysoTracker prober med celler induserer en økning i lysosomal pH og føre til potensielle fysiologiske endringer av lysosomer 19. Noen store biomolekyler som fluoroforpar merkede dekstraner, blir også ofte brukt for endosome / lysosomer merking. Imidlertid lav fotostabilitet, kort sirkulerende liv, og poor oppbevaring under fiksering hindrer sine søknader i langsiktig levende celle bildebehandling og samsvar mikroskop studerer 16,19. Her ble det gull-BSA-NPs brukes som væske tracere å merke vertscelle endo-lysosomal system. Høyt opptak effektivitet og sterke intracellulære fluorescens-signaler ble observert. Nesten fullstendig colocalization av NPs med lysosomal glykoprotein LAMP1, som er sterkt anriket på membranen av sene endosomer / lysosomer, verifisert riktig merking av endo-lysosomal system av NPs. Kombinere bruk av fluorescerende NPs med de andre markører som Lysotracker kan gi utfyllende informasjon om vertscelle vesikulært menneskehandel og modning.

Det er verdt å nevne at cellulær internalisering av NPS er svært avhengig av de fysiske dimensjoner og kjemiske komponenter. Vi har testet gull-BSA-rhodamin NPS med en størrelse på 5 nm, 10 nm, 15 nm og 30 nm, og tilsvarende fordeling i intracellulærside HeLa-celler ble observert (resultater ikke vist). Vi brukte HeLa celler som praktisk cellelinje for Salmonella infeksjonsstudier. Imidlertid gull-BSA-rhodamin NPS kan også lett internaliseres ved hjelp av forskjellige andre cellelinjer og primære celler er mottagelig. For eksempel ble det observert Salmonella indusert rørformede strukturer og merking av NP i CHO, COS-7, CaCo2 eller 3T3-celler, så vel som i interferon-γ-stimulert RAW264.7 makrofag-lignende cellelinje celler eller primære murine makrofager og dendrittiske celler. Imidlertid vil hver cellelinje krever justering av infeksjonen og puls / chase protokoller.

Det har blitt rapportert at fargestoff-innesluttet silika NPS kan brukes som et biokompatibelt, lang levende, og sterkt fotostabile lysosomet markeringen 19, og vi har også sammen oppførselen rhodamin-dopet silika NPS med varierende størrelse (30 - 1000 nm). Riktig merking av sene endosomer / lysosomer av silika NPs i ikke-infiserte celler og akkumulering av NPs i SCV og SIF i Salmonella -infected celler ble observert. Imidlertid, på grunn av dannelsen av aggregater av NPS eller den store størrelsen på enkeltsilika NPS, fordeling av NPS sammen med Salmonella indusert rørformede strukturer var ikke ensartet (data ikke vist).

Et karakteristisk trekk ved SCV samt SIF er nærværet av sterkt utbredte lysosomale glykoproteiner som LAMP1 12. Her ble en HeLa cellelinje som stabilt uttrykker LAMP1-GFP brukes for bekvemmeligheten av levende celle avbildning av endo-lysosomal system og SCV og SIF strukturer. Salmonella stammer konstitutivt uttrykker forbedret GFP ble brukt i smitteforsøk for å indikere plasseringen av bakterier . På grunn av den ensartede størrelse og form på de intracellulære bakterier, er den bakterielle GFP fluorescens generelt lett skjelnes fra GFP etiketten på endo-lysosomale membraner. Imidlertid, for fremtidige eksperimenter hvor fluorescerende signal fra bakterier og membranen proteins trenger å være nøyaktig differensiering, andre fluorescerende fusjonsproteiner, for eksempel, mTurquoise, er anbefalt å bli integrert. Dette resulterer imidlertid i flere runder med belysning og bildeopptak, bærer risikoen for høyere foto-skade i levende celleforsøk.

For å finne ut viktige gener og mekanismer for bakterier å manipulere vertscelle veier, mange mutanter må opprettes og deres forestillinger må nøye sammenlignet. For eksempel er Salmonella mutantstammer Δ ssaV og Δ Sifa sterkt svekket i systemisk virulens og intracellulær replikering 20,21. Begge Δ ssaV og Δ Sifa stammer ikke klarer å indusere SIF, og i tillegg Δ Sifa Salmonella mister SCV membranen i løpet av infeksjon 12. Sammenligning fenotyper av WT og mutantstammer er medvirkende i å forstå muligheten av Salmonella til remodel vertscelle vesicular trafikk. Basert på mikroskopisk undersøkelse, er det åpenbart at WT Salmonella grave verts cellulære endocytiske trasé til en mye høyere grad enn Δ ssaV og Δ Sifa mutantstammer. Denne funksjonen kan gjøre det mulig intracellulær Salmonella å få flere næringsstoffer for deres intracellulær overlevelse og replikering.

Konfokalmikroskopi bildene viser tydelig ombygging av vertscelle endo-lysosomal system av intracellulære bakterier. Imidlertid er kvantitativ analyse av de bilder som er nødvendig for nøyaktig sammenligning. I fremgangsmåten som er beskrevet her, er Imaris programvare som brukes for å trekke ut 3D-objekter som har fluorescensintensitet i Kanal 3> 15 og antallet voksler> 10. Disse gjenstander er ment å være intracellulære membranstrukturer som inneholder gull-BSA-rhodamin NPS. Fluorescensintensiteten terskel og filtre kan defineres i henhold til kvaliteten av bilder, men should holdes konstant for å sammenligne ulike tilstander eller stammer. Vist her er eksempler på en ikke-infisert celle og en WT Salmonella -infected celle ved 8 timers pi, med 431 og 67 objekter ekstrahert hhv. Til tross for den åpenbare forskjell, er det ikke rasjonelt å sammenligne bare antallet av de gjenstander, siden størrelsen av cellene er ikke det samme. En løsning er å normalisere antallet av objekter til summert område (i dette eksemplet, 2,252 um 2 og 1975 um 2, henholdsvis), eller summen av fluorescerende intensiteter av gjenstandene inne i cellene. Alternativt er det også mulig å spore en celle før infeksjon og ved forskjellige tidspunkter pi for å sammenligne fordelingen av NPS på ulike stadier av infeksjonen.

Som konklusjon, i denne metoden gull-BSA-rhodamin NPS ble anvendt til å merke endo-lysosomal system av eukaryote celler. Manipulering av vertscelle endo-lysosomal systemet av en intracellular patogen ble observert av levende celle CLSM og kvantitative analyseresultater indikerte ekstreme rearrangementer av sene endosomer / lysosomer vekt- Salmonella. Salmonella ble anvendt som en modell patogen i denne studien, men intracellulær oppførselen til andre bakterielle patogener som for eksempel Shigella flexneri og Listeria monocytogenes kan også undersøkes ved hjelp av denne metode. I prinsippet kan gull-BSA-rhodamin NPS internaliseres av et stort utvalg av cellelinjer, og derfor er lovende blir bredt anvendt i studier som undersøker interaksjonen av endocytoseveien med avvikende endogene eller eksogene substanser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. (2007).
  18. LysoTracker and LysoSensor Probes. Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics