Toepassing van TL Nanodeeltjes naar herinrichting van de Endo-lysosomale systeem Bestudeer door intracellulaire bacteriën

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit artikel beschrijft methoden voor de synthese en TL-etikettering van nanodeeltjes (NP). De NP's werden toegepast in pulse-chase experimenten om de endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. Manipulatie van de endo-lysosomale systeem door de activiteiten van de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica werden gevolgd door live cell imaging en gekwantificeerd.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, Y., Krieger, V., Hensel, M. Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria. J. Vis. Exp. (95), e52058, doi:10.3791/52058 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

TL-nanodeeltjes (NP) met de gewenste chemische, optische en mechanische eigenschappen zijn veelbelovend tools waarmee intracellulaire organellen te labelen. Hier introduceren we een methode met behulp van goud-BSA-rhodamine NP aan de endo-lysosomale systeem van eukaryote cellen te labelen en te monitoren manipulaties van gastheer cellulaire routes door de intracellulaire pathogeen Salmonella enterica. De NP's waren direct geïnternaliseerd door HeLa-cellen en gelokaliseerd in de late endosomen / lysosomen. Salmonella-infectie veroorzaakte herschikking van de blaasjes en accumulatie van NP's in Salmonella geïnduceerde membraan structuren. We zetten de Imaris softwarepakket voor kwantitatieve analyses van confocale microscopie beelden. Het aantal objecten en hun grootteverdeling in niet-geïnfecteerde cellen werden verschillend van die in Salmonella geïnfecteerde cellen, wat aangeeft zeer remodelleren van de endo-lysosomale systeem WT Salmonella.

Introduction

TL-nanodeeltjes (NP), inclusief metalen NP, quantum dots, polymeer NP, silica NP, koolstof stippen, enz., Hebben veel aandacht gekregen in de afgelopen decennia 1,2. Vergeleken met traditionele organische kleurstoffen, fluorescerende NP vertonen wenselijke chemische, optische en mechanische eigenschappen, zoals sterk signaal sterkte, weerstand tegen fotobleken en hoge biocompatibiliteit 3,4. Deze voordelen maken ze de methode van keuze voor intracellulaire sensing en live cell imaging. Verder is een groot aantal elektron-dichte NP's zijn zichtbaar door elektronenmicroscopie (EM), het gebruik ervan voor gecorreleerde microscopische analyse, welke combinatie van live-cell tracking met een lichtmicroscoop (LM) en hogere resolutie op Ultrastructureel met EM-5 kunt faciliteren. Zo hebben goud NP lange tijd efficiënt als biosensoren in levende cellen voor gevoelige diagnoses en op het gebied van immuno-labeling 6 geweest. Recente studies aan dat goud NPs met verschillende grootte en vorm gemakkelijk kan opname door diverse cellijnen en routinematig transporteren door de endosomale route, daarom groot potentiaal toegepast intracellulaire vesikel transport volgen en de endo-lysosomale systeem labeling 7,8 .

Microbiële ziekteverwekkers, zoals Salmonella enterica, Shigella flexneri en Listeria monocytogenes, hebben verschillende mechanismen ontwikkeld om niet-fagocyterende gastheercellen 9 binnenvallen. Na te zijn geïnternaliseerd, de ziekteverwekkers, ofwel gelokaliseerd in het cytosol of afgezonderd in membraangebonden compartimenten, interactie uitvoerig met hun gastheer omgevingen en moduleren deze om hun eigen overleving 10 bevoordelen. Bijvoorbeeld, Salmonella enterica woont en repliceert binnen een intracellulaire phagosomal compartiment aangeduid als de Salmonella bevattende vacuole (SCV) na infectie 11. De rijping SCVtrafieken naar het Golgi-apparaat, dat voortdurend interacties met de endocytische route en induceert vorming van grote buisvormige structuren zoals Salmonella geïnduceerde filamenten (SIF), sortering nexine tubuli, Salmonella geïnduceerde uitscheiding drager membraaneiwit 3 (SCAMP3) tubuli, etc . 12-14. Bestuderen hoe deze bacteriële ziekteverwekkers manipuleren gastheer-cel trajecten is essentieel om inzicht besmettelijke ziekte.

Hier werden goud-BSA-rhodamine NP als vloeistof tracers aan de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem label en de menselijke maag pathogeen Salmonella enterica serovar Typhimurium (Salmonella) werd gebruikt als model bacterie om de interacties van de pathogeen het bestuderen hosten endocytose. Intracellulaire gold-BSA-rhodamine NPs in niet-geïnfecteerde cellen en cellen geïnfecteerd met WT of mutante Salmonella stammen werden afgebeeld door confocale laser scanning microscoop (CLSM).Vervolgens werd Imaris software waarmee de verdeling van NP kwantificeren, wat aangeeft dat Salmonella infectie veroorzaakte extreme herschikking van de endosomen / lysosomen. Na de beschrijving van deze werkwijze kan analoog experimenten ontworpen lot op lange termijn van de geïnternaliseerde NP te volgen en om de invloed van verschillende exogene stoffen of endogene factoren op de endocytische route van eukaryotische cellen te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Synthese van 10 nm Gold Nanodeeltjes (Gold NP) 15

  1. Maak een oplossing A: voeg 2 ml 1% waterige goudchloride in 160 ml Milli-Q, of dubbel gedestilleerd water.
  2. Maak een oplossing B: voeg 8 ml 1% tri-natriumcitraat x 2 H 2 O en 160 pi 1% tannine in 32 ml Milli-Q, of dubbel gedestilleerd water.
  3. Warm oplossing A en B tot 60 ° C en mengen onder roeren. Observeer een donkerblauwe kleur onmiddellijk. Observeren rode kleur na ongeveer 15 minuten. Verwarmen daarna tot 95 ° C, houdt 5 min en koel de oplossing tot kamertemperatuur.
  4. Voeg een druppel van de NP suspensie op een rooster koolstof beklede en laten drogen aan de lucht. Controleer de grootte en morfologie van NP's door transmissie elektronenmicroscopie.

2. Coating van Gold NP's met BSA en Labeling met Rhodamine N-hydroxysuccinimidylester (NHS) 16

  1. Voeg 900 ul goud NP in een 1,5 ml Eppendorf buis centrifugeer bij 15.000 xg gedurende 30 min. Opnaal, bereiden meerdere buizen kunnen in een keer.
  2. Verwijder het supernatant, resuspendeer de pellet in 900 ul gesteriliseerd Milli-Q water en voeg 100 ul 2 mg / ml BSA / PBS, mengen op een Vortex bij 800 rpm gedurende 30 min.
  3. Om overtollig BSA verwijderen, centrifuge de voorbereiding bij 15.000 xg gedurende 60 min.
  4. Verwijder het supernatant, en opnieuw op te schorten de goud-BSA NP's in 125 pi PBS, voeg 12,5 ul van 1 M bicarbonaat.
  5. Onmiddellijk vóór gebruik bereid een 10 mg / ml oplossing van rhodamine NHS / DMSO, voeg 30 ul van rhodamine NHS / DMSO oplossing 1 ml van de goud-BSA NP suspensie. Incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur (of O / N) bij kamertemperatuur gedurende 800 tpm mengen, vermijden van blootstelling aan licht.
  6. Zuiveren het goud-BSA-rhodamine NP's door dialyse tegen PBS bij 4 ° C met 5 buffer veranderingen in de periode van 36-48 uur.
  7. Om NP stabiliseren, voeg 10 ul 200 mg / ml BSA / PBS in elk 1 ml gold-BSA-rhodamine NP. Om het gratis of vrijgegeven BSA-rhodamine, centrifuge bij 15 te verwijderen,000 xg gedurende 60 min. Resuspendeer de pellet in 2 mg / ml BSA / PBS, gemeten OD 520 en bewaar bij 4 ° C, vermijden van blootstelling aan licht.
  8. Verdunnen de NPS 10 keer met Milli-Q of dubbel gedestilleerd water, voeg een druppel op een koolstof beklede raster, en laten drogen aan de lucht. Controleer de grootte en morfologie van NP's door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM).
    Opmerking: Alle materialen die voor NP bereiding werden gesteriliseerd en de operatie werd uitgevoerd in een celkweek kap of op een bank naast een vlam.

3. Culture of HeLa Cells

  1. HeLa-cellen permanent expressie LAMP1-GFP gekweekt in DMEM met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en gekweekt bij 37 ° C in een atmosfeer met 5% CO2.
  2. Zaad de cellen bij een dichtheid van 50.000 per putje in een 8-well kamer schuif (IBIDI) en geïncubeerd O / N.

4. Cultuur van Bacteriën

  1. Gebruik Salmonella enterica serovar Typhimurium NCTC 12023 wild-type (WT) stam. Ter vergelijking, gebruiken mutantstammen Δ ssaV defect in de SPI2-T3SS en Δ Sifa ontbreekt belangrijke effector Sifa voor SIF. Gebruik stammen die plasmide pFPV25.1 voor constitutieve expressie van verbeterde GFP.
    OPMERKING: Bacteriële stammen worden routinematig gekweekt in Luria-Bertani bouillon (LB) met toevoeging van 50 ug / ml carbenicilline (WT) en LB met toevoeging van 50 ug / ml carbenicilline en / of 50 ug / ml kanamycine (Δ ssaV, Δ SIFA ) van de vereiste plasmiden te handhaven.
  2. Inoculeer een enkele kolonie van bacteriën in 3 ml LB met geschikte antibiotica en te groeien O / N bij 37 ° C onder schudden voorwaarden voor beluchting, dan verdunnen 1:31 in vers LB en verder groei van 3,5 uur. Op dit moment-point, de culturen bereikt de late log-fase en bacteriën zijn zeer invasieve. Een 'roller drum' is handig om reageerbuis culturen incubeer met beluchting.

5. Infectie van HeLa cellen doorSalmonella en Gold-BSA-Rhodamine NP Pulse Chase-etikettering (zie figuur 1 voor de regeling)

  1. Meet OD 600 van de sub-gekweekte bacteriën en verdun tot OD 600 = 0,2 in 1 ml PBS (~ 3 × 10 8 kve / ml), voeg juiste hoeveelheden bacteriën om HeLa-cellen in 8-goed kamer dia's een veelvoud van bereiken infectie (MOI) van 100.
  2. Incubeer gedurende 30 min in celincubator, was 3 maal met PBS om niet-geïnternaliseerde bacteriën te verwijderen (dit tijdstip is ingesteld op 0 uur na infectie of 0 uur pi). Voeg 300 ul vers kweekmedium dat 100 ug / ml gentamicine en handhaven gedurende 1 uur. Plaats vervolgens het medium met vers medium dat 10 ug / ml gentamicine voor de rest van de incubatietijd.
  3. Na incubatie met kweekmedium dat 100 ug / ml gentamicine gedurende 1 uur wordt het medium vervangen door beeldmedium (Eagles MEM zonder FCS, L-glutamine, fenolrood en natriumbicarbonaat, met 30 mM HEPES, pH 7,4) containing 10 ug / ml gentamicine. Goud-BSA-rhodamine NP toegevoegd aan HeLa-cellen tot een uiteindelijke concentratie van OD 520 = 0,1 verkregen.
    OPMERKING: Gold-BSA-rhodamine NPs kunnen ook worden toegevoegd aan de cellen voordat infectie, of op verschillende tijdstippen pi
  4. Na 1 uur incubatie, verwijder het medium was 3 maal met PBS en voeg 300 ul vers beeldvormende medium dat 10% FCS en 10 ug / ml gentamicine voor de rest van de incubatietijd.
    OPMERKING: Duur van de incubatietijd kan variëren naargelang van de concentratie van de NP en cellijnen gebruikt. Voor RAW264.7 macrofagen, waargenomen dat 30 min incubatie met NP in een concentratie van OD 520 = 0,05 toegelaten voldoende internalisatie.

6. Imaging

  1. Gebruik een confocale beeldvormingssysteem zoals een confocale laser-scanning (CLSM) of draaiende schijf (SD) microscoop met een vochtige omgeving kamer voor hoge resolutie beeldvorming op verschillende tijdstippen.
  2. Schakel de temperatuur control systeem en wacht tot hij is stabiel. Optimaliseer de imaging-instellingen, zoals vergroting, scansnelheid, resolutie, Z-stack etc. Gebruik de juiste excitatie / emissie-instellingen voor GFP en goud-BSA-rhodamine NP. Voor dit protocol, gebruik maken van een 400 Hz scanning snelheid, resolutie van 512 x 512 pixels en Z-stapgrootte van 0,25 micrometer. Excite GFP en goud-BSA-rhodamine met een Ar laser (488 nm) en een HeNe laser (543 nm), respectievelijk. Neem een ​​helder-veld (BF) kanaal voor het waarnemen van de vorm van de cellen. Voor andere microscopie systemen en infectie voorwaarden, de instelling moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
    OPMERKING: Gebruik dezelfde Ar laser als lichtbron van BF-kanaal en het signaal werd gedetecteerd met een foto multiplier (PMT) detector.
  3. Bij bepaalde tijdstippen pi, monteer de 8-well kamer dia's met besmette cellen op de microscoop podium en beelden opnemen.

7. Analyse van Beelden

  1. Gebruik microscopie beeldanalyse software (zie Salmonella. Open de gegevens door te klikken op 'Open' en het kiezen van het bestand.
    OPMERKING: Als alternatief kan open source software pakketten zoals ImageJ of FIDJI gebruikt worden om kwantitatieve afbeelding analyses.
  2. In de objecten werkbalk van de klik Overtref uitzicht op het icoon Pictogram om een ​​nieuw oppervlak item wilt toevoegen. Klik op Pictogram (Next).
  3. Om een ​​Regio of Interest (ROI), selecteert segment een ROI te analyseren. In een weergavegebied, wordt een rechthoek begrensd gedeelte overlay op afbeelding van de ROI. Voer de waarden in de overeenkomstige X-, Y- en Z-velden, of klik direct op de pijlen in de voorvertoning rechthoek om de grootte en de positie van de ROI te wijzigen. Klik vervolgens op Pictogram = "/ Files / ftp_upload / 52058 / 52058icon2.jpg" /> (volgende).
  4. Als bron kanaal, selecteert u Kanaal 3 (signaal voor Gold-BSA-Rhodamine NP). Controleer de goede optie om de gladheid van de resulterende gebied. Definieer een waarde handmatig of accepteer de automatisch gegenereerde waarde. Voor Drempel selecteert u de Absolute Intensity optie.
  5. Voor de drempel aanpassing, selecteert u de handmatige optie en stel een waarde. In het weergavegebied, wordt een oppervlak drempel voorvertoning in het grijs weergegeven.
  6. Op het tabblad classificeren Surfaces de resulterende oppervlak kan worden gefilterd door verschillende criteria. Een standaard filter is 'aantal voxels> 10', en andere filters kunnen ook opgenomen worden door te klikken op 'toevoegen'. Als een filtering niet nodig is en verwijder vervolgens alle filters door te klikken op de knop verwijderen. Klik Pictogram (Next).
  7. Tot het scheppen van Surface voltooien, klikt u op/files/ftp_upload/52058/52058icon3.jpg "/> (Finish). In de lijst Object, nu het vinkje uit het vakje voor het item Volume en nieuwe aangemaakt oppervlak wordt weergegeven in het bekijken gebied.
  8. De statistieken exporteren. Nu, in het overtreffen oog de kleur van de proefpersonen varieert van paars naar rood naar hun omgeving. En de 'Plot Numbers Area' tabel toont de statistieken informatie (bijvoorbeeld, ID-nummer en het gebied van objecten). Alle statistieken van het oppervlak 1 exporteren naar een Excel-bestand door te klikken op Pictogram (Save).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Goud NP werden gegenereerd door een bekende methode om via vermindering chlorogoudzuur door citraat en looizuur. Zoals getoond in figuur 2A, de gesynthetiseerde goud NPs waren quasi-bolvormig met een grootte van ongeveer 10 nm. BSA-coating en rhodamine-etikettering leverde hun morfologie of grootte (Figuur 2B) niet beïnvloeden.

Vermeld is dat goud NP gemakkelijk kunnen worden opgenomen door verschillende zoogdiercellen en uiteindelijk in de endocytische systemen 7. In overeenstemming met eerdere werken, werden fel rode fluorescentie signalen waargenomen in HeLa-cellen na 1 uur incubatie met goud-BSA-rhodamine NP (Figuur 3, WT 5 uur pi), wijst op een effectieve internalisering van de NPS door cellen. Het merendeel van de rode signalen werden gevonden colocalized met groene signalen, waaruit blijkt dat de NPS werden opgesloten in de late endosomen of lysosomen. Echter, in tegenstelling tot een uniforme verdeling van NP's in de late endosomen / lysosomenin niet-geïnfecteerde cellen (figuur 3, mock), werden hun locaties grotendeels herschikt in WT Salmonella geïnfecteerde cellen. In de vroege fase van de infectie (figuur 3, WT 5 uur pi), Salmonella repliceert binnen de SCV en SIF ondergaan snelle uitbreiding of inkrimping beweging. Op dit tijdstip, een fractie van de NP werd gevonden in SCV en SIF, terwijl een andere fractie nog in de vrije late endosomen / lysosomen. Om 8 uur pi (figuur 3, WT 8 uur pi), een gestabiliseerde netwerk SIF werd gevormd, en de meeste NP gevonden geaccumuleerd binnen het buisvormige structuren, terwijl slechts een zeer klein deel bleef in de vrije late endosomen / lysosomen. De mutantstammen Δ ssaV en Δ Sifa tentoongesteld verschillende gedragingen. Zoals getoond in figuur 3ssaV), 8 uur pi, Δ ssaV werd gebonden aan SCV terwijl SIF structuren werden gevormd. Sommige NP's werden waargenomen omliggende Zalmella in de SCV, maar de meerderheid van NP's waren nog steeds in de vrije late endosomen / lysosomen. Voor de Δ Sifa stam (Figuur 3, Δ Sifa), ontsnapping van Salmonella in cytoplasma voorgedaan, en geen verband tussen NP en bacteriën werd waargenomen.

In onze vorige studie werd gevonden dat SIF beeldscherm zeer dynamiek in de vroege fase van infectie (3-5 uur pi), maar wordt gestabiliseerd in de latere periode (> 8 uur pi) 12. Daarom zijn we af of Salmonella in de vroege en late stadia van de infectie hebben die vergelijkbaar vermogen om verspreiding van intracellulaire NP herschikken. Zoals getoond in figuur 4, werden goud NP geïncubeerd met HeLa-cellen O / N vóór infectie, of op verschillende tijdstippen na infectie (1-7 uur pi) gedurende 1 uur, in alle gevallen meeste geïnternaliseerde NP waargenomen geaccumuleerd in SCV of SIF.

Microscopische OBSERVaties bleek dat infectie door Salmonella resultaten in massieve omlegging van de endo-lysosomale systeem gastheercellen. Als volgende stap gebruikten we de Imaris softwarepakket Salmonella geïnduceerde gastheercel fenotypes analyseren op een kwantitatieve wijze. De afbeelding van een geïnfecteerde HeLa cellen 8 uur pi als voorbeeld, wordt een stap-voor-stap instructie voor kwantitatieve analyse weergegeven in figuur 5. Via een intensiteit drempel van 15 en een 'aantal voxels> 10' filter, 3D voorwerpen werden uit de oorspronkelijke image-bestand. De objecten werden verondersteld om intracellulaire structuren waarin het goud-BSA-rhodamine NP zich met zijn. In dit voorbeeld werden 67 objecten geëxtraheerd in totaal, met een gesommeerde gebied 1,974.64 pm2. De grootste object, dat colocalized de SIF netwerk, heeft een oppervlakte van 1,836.23 um2, terwijl het andere kleiner dan 50 urn 2. Ter vergelijking, een voorbeeld die de quantitative analyseresultaat van een niet-geïnfecteerde cellen werd gegeven. Hier werden 431 objecten in totaal geëxtraheerde, waarin de gemiddelde waarde van gebied 5 urn 2 en het grootste object heeft een oppervlakte van 34 urn 2. De gesommeerde oppervlakte van de objecten 2252 um2, wat vergelijkbaar is met de geïnfecteerde cel in figuur 4 (1975 pm2). Echter, het aantal voorwerpen is veel groter dan de andere (431 en 67 voorwerpen, respectievelijk), die grotendeels fusie van vesicles met de Salmonella geïnduceerde buisvormige structuren aangeeft.

Figuur 1
Figuur 1. Schema voor de bereiding van HeLa cellen voor live cell imaging. HeLa-cellen werden uitgezaaid in kamer slides, mock-geïnfecteerd of geïnfecteerd met verschillende Salmonella stammen gedurende 30 min, 3 keer gewassen met PBS, vervolgens incubat ed met medium dat 100 ug / ml gentamicine gedurende 1 uur. Vervolgens werd het medium vervangen door beeldvorming medium met 10 nm goud-BSA-rhodamine NP (OD 520 = 0,1) en 10 ug / ml gentamicine, gedurende 1 uur, en vervolgens achtervolgd door NP-vrij medium voor de rest van het experiment . Live cell imaging werd uitgevoerd op verschillende tijdstippen na infectie (pi). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. TEM beelden van colloïdaal goud NP vóór (a) en na etikettering (b). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

manieren "> Figuur 3
Figuur 3. Verbouwing van de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem door intracellulaire Salmonella. HeLa-cellen werden mock-geïnfecteerd of besmet zijn met Salmonella WT, Δ ssaV of Δ Sifa gemuteerde stammen en de puls / chase met 10 nm goud-BSA-rhodamine NP ( OD 520 = 0,1) werd uitgevoerd zoals beschreven in figuur 1. Maximale intensiteit projecties van CLSM Z-stacks getoond. Schaal bars, 10 um. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. Toegankelijkheid van de endo-lysosomale systeem bij verschillende fasen van Salmonella-infectie. HeLacellen werden gepulseerd met 10 nm goud-BSA-rhodamine NP (OD 520 = 0,1) O / N eerdere infectie, of 1 uur bij verschillende tijdstippen pi aangegeven. Live cell imaging werd uitgevoerd bij 8-9 uur pi Maximale intensiteit projecties van CLSM Z-stacks worden getoond. Schaal bars, 10 um. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5. Stap voor stap instructie voor kwantitatieve analyse door Imaris behulp van een beeld van een geïnfecteerde HeLa cel om 8 uur pi als een voorbeeld. (A) Open de gegevens door te klikken op 'Open' en het kiezen van het bestand. (B) In de objecten werkbalk van de Overtref uitzicht een nieuw oppervlak item wilt toevoegen. (C) Om een ROI te analyseren, selecteer vervolgens segment een ROI. (D) Vul de waarden in de corresponderende x-, y- en z-veld of (E) direct op de pijlen in de voorbeeldrechthoek om de grootte en de positie van de ROI wijzigen. In dit voorbeeld werd een ROI niet nodig en het hele beeld geanalyseerd. (F) Als bron kanaal selecteert u het kanaal 3 (signaal van Gold-BSA-Rhodamine NP). Controleer de goede optie om de gladheid van de resulterende gebied. Definieer een waarde handmatig of accepteer de automatisch gegenereerde waarde. Hier werd 0,1 pm gebruikt. Voor 'Threshold' selecteert u de optie 'Absolute Intensity'. (G) Voor de drempel instelling te kiezen de handmatige optie en stel een waarde (in dit voorbeeld 15 werd gebruikt). In het weergavegebied een oppervlakte drempel voorbeeld wordt weergegeven in het grijs. (H) op het tabblad 'classificeren Surfaces' de resulterende oppervlak kan worden gefilterd door verschillende criteria. Een standaard filter is 'aantal voxels> 10'. Defilter kan worden aangepast door een nieuwe waarde en andere filters kunnen worden toegevoegd. In dit voorbeeld hebben we het filter 'aantal voxels> 10' gehouden. (I) tot het volledig creatie Surface klik op 'Finish'. In de lijst Object nu un-Vink het vakje voor het item Volume en nieuwe aangemaakt oppervlak wordt weergegeven in weergavegebied in het rood. (J) In het Overtref de mening van de kleur van de onderwerpen variëren van paars naar rood op basis van hun gebied. (K) De 'Plot Numbers Area' tabel toont de statistieken informatie. Uitvoerstatistiek naar een Excel-bestand. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. Kwantitatieve analyse resultaat van een niet-geïnfecteerde cellen. ( (B) De nieuwe gecreëerd oppervlak. (C) Het nieuwe oppervlak in de weergave overtreffen. (D) De 'Plot Numbers Area' tabel toont de statistieken informatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De endo-lysosomale systeem van zoogdiercellen controleert belangrijke fysiologische processen, waaronder de opname van voedingsstoffen, hormoon-gemedieerde signaaltransductie, immuunsurveillance, en antigeen presentatie 17. Tot nu verschillende merkers zijn gebruikt voor het labelen van de endocytische route en tracking studies. Bijvoorbeeld, Lysotracker probes acidotropic fluorescerende probes ontwikkeld door Molecular Probes (Life Technologies, USA) lysosoom etikettering, die selectief kan ophopen in cellulaire compartimenten met een lage interne pH en effectief labelen levende cellen bij nanomolaire concentraties 18. Kan echter lang incubatie van Lysotracker probes met cellen een toename lysosomale pH veroorzaken en leiden tot mogelijke fysiologische veranderingen van lysosomen 19. Enkele grote biomoleculen, zoals fluorofoor gemerkte dextranen, worden ook vaak gebruikt voor endosomale / lysosomen labeling. Echter, low-fotostabiliteit, korte levensduur in circulatie, en pretentie oor tijdens fixatie belemmeren hun toepassingen in de lange termijn live cell imaging en correlatieve microscoop bestudeert 16,19. Hier werden de goud-BSA-rhodamine NP gebruikt als vloeistof tracers aan de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem te labelen. Hoge opname-efficiëntie en sterke intracellulaire fluorescentiesignalen werden waargenomen. De bijna volledige colocalization van NP's met lysosomale glycoproteïne LAMP1, die zeer wordt verrijkt op het membraan van de late endosomen / lysosomen, geverifieerd juiste etikettering van de endo-lysosomale systeem door de NPS. De combinatie van het gebruik van fluorescerende NP met de andere markers zoals Lysotracker kan aanvullende informatie over de gastheercel vesiculaire mensenhandel en rijping te bieden.

Het is het vermelden waard dat cellulaire internalisatie van NP is sterk afhankelijk van hun fysieke afmetingen en chemische componenten. We hebben goud-BSA-rhodamine NP getest met een grootte van 5 nm, 10 nm, 15 nm en 30 nm, en soortgelijke intracellulaire verdelingside HeLa cellen waargenomen (resultaten niet getoond). We gebruikten HeLa-cellen als geschikte cellijn voor Salmonella-infectie studies. Echter, goud-BSA-rhodamine NP kan ook gemakkelijk worden geïnternaliseerd door diverse andere cellijnen en primaire cellen zijn vatbaar. Zo zagen we Salmonella geïnduceerde tubulaire structuren en etikettering NP in CHO, COS-7, Caco2, of 3T3-cellen, alsmede in interferon-γ-gestimuleerde RAW264.7 macrofaag cellijn cellen of primaire murine macrofagen en dendritische cellen. Echter, elke cellijn aanpassing van de infectie en puls / chase protocollen vereisen.

Vermeld is dat kleurstof ingesloten silica NPs kan worden gebruikt als een biocompatibele, langlevende, en zeer fotostabiele lysosoom marker 19, en we vergeleken het gedrag van met rhodamine gedoteerde silica NPs met variërende grootte (30 - 1000 nm). Correcte etikettering van late endosomen / lysosomen door silica NP's in niet-geïnfecteerde cellen en accumulatie van NP's in SCV en SIF in Salmonella geïnfecteerde cellen werd waargenomen. Vanwege de vorming van aggregaten van NPs of de grootte van één silica NP, verdeling van NP met Salmonella geïnduceerde buisvormige structuren niet uniform was (gegevens niet getoond).

Kenmerkend SCV en SIF is de aanwezigheid van veel voorkomt lysosomale glycoproteïnen zoals LAMP1 12. Hier een HeLa cellijn stabiel tot expressie LAMP1-GFP werd gebruikt voor het gemak van beeldvorming van levende cellen van de endo-lysosomale systeem en de SCV en SIF structuren. Salmonellastammen constitutief versterkte GFP werden gebruikt in de infectie experimenten plaats bacteriën aangeven . Door de uniforme grootte en vorm van de intracellulaire bacteriën, de bacteriële GFP fluorescentie in het algemeen gemakkelijk te onderscheiden van de GFP-label op endo-lysosomale membranen. Voor toekomstige experimenten waarbij fluorescentiesignaal van bacteriën en membraan proteins moeten nauwkeurig differentiëren andere fluorescente fusieproteïnen, bijvoorbeeld mTurquoise zijn aanbevolen worden geïntegreerd. Dit leidt echter tot extra ronden van verlichting en beeldacquisitie, waardoor het gevaar van hogere foto-schade in levende cel experimenten.

Om erachter essentiële genen en mechanismen voor bacteriële pathogenen gastheercel paden manipuleren moeten talrijke mutanten worden gecreëerd en hun prestaties moeten zorgvuldig worden vergeleken. Bijvoorbeeld, Salmonella mutante stammen Δ ssaV en Δ SIFA sterk verzwakt systemische virulentie en intracellulaire replicatie 20,21. Zowel Δ ssaV en Δ Sifa stammen niet SIF veroorzaken, en bovendien Δ Sifa Salmonella verliest de SCV membraan in de loop van de infectie 12. Vergelijking fenotypen van WT en mutante stammen is behulpzaam bij het ​​begrijpen van het vermogen van Salmonella remodel gastheercel vesiculaire verkeer. Op basis van microscopisch onderzoek, is het duidelijk dat WT Salmonella ondermijnen gastheer cellulaire endocytische paden in veel hogere mate dan met Δ ssaV en Δ SIFA mutante stammen. Deze functie zou intracellulaire Salmonella in staat stellen om meer voedingsstoffen te krijgen voor hun intracellulaire overleving en replicatie.

Confocale microscopie beelden tonen duidelijk aan de verbouwing van de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem door intracellulaire bacteriën. Echter kwantitatieve analyse van de beelden vereist voor nauwkeurige vergelijking. In de hier beschreven methode wordt Imaris software die wordt gebruikt voor de extractie van 3D-objecten die fluorescentie-intensiteit in het Kanaal 3> 15 en het aantal voxels> 10. Deze objecten worden verondersteld om intracellulaire membraan structuur met Gold-BSA-Rhodamine NP's zijn te hebben. De fluorescentie-intensiteit drempel en filters worden gedefinieerd volgens de beeldkwaliteit, maar should constante voor het vergelijken van verschillende omstandigheden of stammen worden bewaard. Hier worden voorbeelden van niet-geïnfecteerde cel en een WT Salmonella geïnfecteerde cellen 8 uur pi met 431 en 67 voorwerpen geëxtraheerd, respectievelijk. Ondanks de schijnbare verschil is niet rationeel te vergelijken alleen het aantal van de objecten, aangezien de grootte van de cellen niet hetzelfde. Een oplossing is om het aantal van de voorwerpen om de gesommeerde gebied normaliseren (in dit voorbeeld 2252 um 2 en 1975 um 2, respectievelijk) of de som van fluorescente intensiteiten van de voorwerpen in de cellen. Als alternatief is het ook mogelijk om een ​​cel vóór de infectie en op verschillende tijdstippen pi volgen om de verdeling van NPs vergelijken in verschillende stadia van de infectie.

Kortom, deze werkwijze goud-BSA-rhodamine NP werden op het endo-lysosomale systeem van eukaryotische cellen te labelen. De manipulatie van de gastheer cellulaire endo-lysosomale systeem door een intracellular pathogeen werd waargenomen in levende cellen CLSM en kwantitatieve analyse resultaten gaven extreme herschikkingen van late endosomen / lysosomen WT Salmonella. Salmonella werd gebruikt als model pathogeen in deze studie, maar intracellulaire gedrag van andere bacteriële pathogenen, zoals Shigella flexneri en Listeria monocytogenes Ook kon worden onderzocht met behulp van deze aanpak. In principe zouden goud-BSA-rhodamine NPs worden geïnternaliseerd door een grote verscheidenheid van cellijnen derhalve veelbelovend worden grotendeels studies die interactie van de endocytische route met uiteenlopende endogene of exogene stoffen toegepast.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gold chloride Sigma-Aldrich 520918
Tannic acid Sigma-Aldrich 403040
Tri-sodium citrate Sigma C8532
Bovine serum albumin Sigma A2153
NHS-Rhodamine Pierce 46406
DMSO Sigma D8418
HEPES Sigma H3375
Gentamicin Applichem A1492
Kanamcyin Roth T832
Carbenicillin Roth 6344
8-well chamber slides Ibidi 80826 tissue culture treated, sterile
Imaris Software Bitplane version 7.6 various configurations available

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Coto-Garcia, A. M. Nanoparticles as fluorescent labels for optical imaging and sensing in genomics and proteomics. Anal. Bioanal. Chem. 399, 29-42 (2011).
  2. Xie, J., Lee, S., Chen, X. Nanoparticle-based theranostic agents. Adv. Drug Deliv. Rev. 62, 1064-1079 (2010).
  3. Ruedas-Rama, M. J., Walters, J. D., Orte, A., Hall, E. A. Fluorescent nanoparticles for intracellular sensing: a review. Anal. Chim. Acta. 751, 1-23 (2012).
  4. Wu, C., Chiu, D. T. Highly fluorescent semiconducting polymer dots for biology and medicine. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 3086-3109 (2013).
  5. Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots. Nat. Methods. 2, 743-749 (2005).
  6. Kumar, D., Saini, N., Jain, N., Sareen, R., Pandit, V. Gold nanoparticles: an era in bionanotechnology. Expert Opin. Drug Deliv. 10, 397-409 (2013).
  7. Dykman, L. A., Khlebtsov, N. G. Uptake of engineered gold nanoparticles into mammalian cells. Chem. Rev. 114, 1258-1288 (2014).
  8. Chithrani, B. D., Ghazani, A. A., Chan, W. C. Determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells. Nano Lett. 6, 662-668 (2006).
  9. Finlay, B. B., Cossart, P. Exploitation of mammalian host cell functions by bacterial pathogens. Science. 276, 718-725 (1997).
  10. Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449, 827-834 (2007).
  11. Malik-Kale, P., et al. Salmonella - at home in the host cell. Front. Microbiol. 2, 125 (2011).
  12. Rajashekar, R., Liebl, D., Seitz, A., Hensel, M. Dynamic remodeling of the endosomal system during formation of Salmonella-induced filaments by intracellular Salmonella enterica. Traffic. 9, 2100-2116 (2008).
  13. Schroeder, N., Mota, L. J., Meresse, S. Salmonella-induced tubular networks. Trends Microbiol. 19, 268-277 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Howe, D., Steele-Mortimer, O. Salmonella trafficking is defined by continuous dynamic interactions with the endolysosomal system. Traffic. 8, 212-225 (2007).
  15. Slot, J. W., Geuze, H. J. A new method of preparing gold probes for multiple-labeling cytochemistry. Eur. J. Cell Biol. 38, 87-93 (1985).
  16. Zhang, Y., Hensel, M. Evaluation of nanoparticles as endocytic tracers in cellular microbiology. Nanoscale. 5, 9296-9309 (2013).
  17. Pollard, T. D., Earnshaw, W. C., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 22. Cell Biology. (2007).
  18. LysoTracker and LysoSensor Probes. Life Technologies Corporation. Carlsbad, CA. (2013).
  19. Shi, H., He, X., Yuan, Y., Wang, K., Liu, D. Nanoparticle-based biocompatible and long-life marker for lysosome labeling and tracking. Anal. Chem. 82, 2213-2220 (2010).
  20. Hensel, M. Genes encoding putative effector proteins of the type III secretion system of Salmonella pathogenicity island 2 are required for bacterial virulence and proliferation in macrophages. Mol. Microbiol. 30, 163-174 (1998).
  21. Beuzon, C. R., et al. Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA. EMBO J. 19, 3235-3249 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics