En guide til Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting med fejlfinding Strategies

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Eaton, S. L., Hurtado, M. L., Oldknow, K. J., Graham, L. C., Marchant, T. W., Gillingwater, T. H., Farquharson, C., Wishart, T. M. A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies. J. Vis. Exp. (93), e52099, doi:10.3791/52099 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Slutningen af ​​1970'erne oplevede den første offentligt rapporterede brug af western blot, en teknik til at vurdere tilstedeværelsen og den relative rigelighed af specifikke proteiner i komplekse biologiske prøver. Siden da har western blotting metode bliver en fælles bestanddel af molekylærbiologer eksperimentelle repertoire. En overfladisk søgning af PubMed bruge udtrykket "western blot" antyder, at over 220.000 offentliggjorte manuskripter har gjort brug af denne teknik inden år 2014. Det er vigtigt, har de seneste ti år oplevet tekniske billeddiagnostiske fremskridt kombineret med udviklingen af følsomme fluorescensmærker som har forbedret følsomhed og gav endnu større serier af lineær detektion. Resultatet er en nu virkelig kvantificerbare Fluorescens baserede Western Blot (QFWB), der tillader biologer til at foretage sammenlignende udtryk analyse med større følsomhed og præcision end nogensinde før. Mange "optimeret" western blottingDer findes metoder og anvendes i forskellige laboratorier. Disse bevise ofte vanskelige at gennemføre på grund af kravet om subtile men udokumenterede proceduremæssige ændringer. Denne protokol giver en samlet beskrivelse af en etableret og robust QFWB metode, komplet med strategier fejlfinding.

Introduction

Western blotting (WB) er en analytisk teknik, der oprindeligt blev udviklet i slutningen af 1970'erne for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af et protein af interesse i en kompleks biologisk prøve, såsom en vævshomogenat 1. Almindeligvis benævnt proteinet immunoblot, på grund af den centrale antistof-antigen-interaktion, metoden består af 5 forskellige trin: 1) elektroforetisk separation af proteiner ved deres isoelektriske punkt; 2) overførsel til en nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran; 3) mærkning ved hjælp af et primært antistof specifikt for proteinet af interesse; 4) inkubation med et sekundært antistof rettet mod det primære antistof; og 5) visualisering.

Visualisering metode har udviklet sig med tiden for at forbedre sikkerheden og følsomhed. Nogle af de første WBS blev udført under anvendelse af radio- mærkede tags som derefter progredierede til kolorimetrisk og derefter mere udbredt chemilluminescent (ECL) metoder. Radioactivity blev direkte mærket på prober for specifikke antigener henviser kolorimetriske og ECL metoder bruger en indirekte mærkning teknik med et enzym reporter såsom alkalisk phosphatase eller streptavidin peberrods-peroxidase (HRP) 2. Intensiteten af ​​mærkningen af ​​chromagen eller luminescerende produkt måles ved hjælp af densitometri, hvorved signalstyrke, stærk eller svag, angiver mere eller mindre tilstedeværelse af proteinet af interesse i prøven. ECL er mere følsomme og derfor begunstiget metode 2, men alle 3 metoder blev oprindeligt udviklet på røntgenfilm med mere sofistikerede digital billedbehandling teknikker efterfølgende etableret 3. Fremme af digital billeddannelse af WB ikke kun tilladt en forsker til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af deres protein af interesse, men gav også en slutning til niveauet af ekspression af et udvalgt protein, når sammenlignet med andre prøver og kan derfor omtales som "semi-kvantitativ & #8221 ;. For nylig er en virkelig kvantitativ og mere følsomme Western-blotting-teknologi er udviklet, hvorved niveauet af fluorescens måles er direkte relateret til mængden og ekspression af et enkelt protein i en prøve: kvantitativt fluorescerende western blotting (QFWB).

Når man sammenligner QFWB med ECL mærkning, anvendelse af et fluorescerende sekundært antistof genererer en lineær detektering profil 4. Dette er i modsætning til ECL-teknikker hvor signallinearitet generelt sker med lave protein belastninger under 5 ug og signal mætning direkte relateret til protein-ekspression, dvs. med allestedsnærværende udtrykte husholdning gener 5,6. Denne forskel er mest sandsynligt forårsaget af et større antal bindingssteder til rådighed for en avidin ECL-substrat at binde til et biotinyleret sekundært, hvilket resulterer i en højere sandsynlighed for potentielle signal mætning. Dette er en af ​​de vigtigste årsager til ECL basen immunoblotting benævnes only "semi-kvantitativ" 7. Mætningspunkt signal er af afgørende betydning ved måling subtile forskelle i ekspressionsniveauer og kan føre til unøjagtige målinger. I de senere år fremkomsten af udbredte proteomiske teknikker beskriver stadigt stigende følsomhed og identifikation af subtile udtryk forskelle har resulteret i et stadigt stigende afhængighed af virkelig kvantitativ western blotting til validering eksperimenter 8,9. Anvendelsen af ​​følsomme, robuste og virkelig kvantitativ metode er derfor afgørende.

Mange "optimeret" vestlige blotting metoder er blevet anvendt af uafhængige laboratorier, som ofte være vanskeligt at oprette eller kopiere grundet subtile metodiske justeringer, der måske ikke er synlige i formelle dokumenterede protokoller. Dette er en veletableret og robust protokol for QFWB og derudover giver værdifulde strategier til fejlfinding af almindelige problemer that kan opstå under gennemførelsen.

Denne protokol blev oprindelig optimeret til brug med murine hjernehomogenater, men er siden blevet brugt effektivt på tværs af en bred vifte af vævsprøver og arter 4,9,10. Potentielle protokol variationer kræves for fejlfinding specifikke spørgsmål er inkluderet.

Protocol

Denne protokol er blevet optimeret ved hjælp af kommercielt producerede puffere, geler og overførsel stakke for at reducere variabilitet og forbedre sammenhængen. Se Materialer List for en komplet liste over forbrugsmaterialer påkrævet.

Fluorescent WB protokol ved hjælp af I-Blot hurtig overførsel og LI-COR Odyssey imaging system

1. Klargøring af prøven

  1. Buffer udvælgelse / forberedelse
    1. Vælg en passende udvinding buffer for prøve homogenisering og sikre, at bufferen er kompatibel med alle downstream teknikker, der skal anvendes. Udarbejde en ekstraktionspuffer: RIPA-buffer (25 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) indeholdende 5% protease inhibitor cocktail før prøve isolation.
      BEMÆRK: Der er mange forskellige typer af ekstraktionsmidler buffere til rådighed og er valgt afhængigt af placeringen af ​​proteinet af interesse i cellen. Disse indbefatter, men er ikkebegrænset til RIPA buffer (hel celle mitokondriel og nukleare komponenter), NP-40 lysis buffer (hel celle eller membranbundne) og Tris-Triton (cytoplasmatisk skelet bundet). Nogle kemiske rengøringsmidler i ekstraktionsmidler buffere kan dog bidrage til at solubilisere eller endda deaktivere et protein, men kan forstyrre proteinbestemmelse ved anvendelse af et specifikt protein bestemmelse assay, dvs. bicinchoninsyre (BCA) assay. Tjek producentens retningslinjer for kemisk forenelighed med analysen.
  2. Proteinekstraktion / solubilization
    1. Manuelt udblødte vævsprøven med en saks og / eller skalpel efterfulgt af homogenisering ved hjælp af enten en dounce eller en håndholdt elektrisk homogenisator med en spids polypropylen i den forberedte ekstraktionsbuffer på ca. 1:10 vægt / volumen (vævsvægt / buffer volumen), indtil en jævn / ensartet homogenat fremstilles.
      BEMÆRK: For mindre, ædle / vanskeligt at opnå prøver, detergent baserede ekstraktioner can stadig være effektiv ned til 1: 5.
    2. Skrive homogenisering centrifuge prøver ved 20.000 xg i 20 minutter ved 4 ° C. Fjern supernatanten indeholdende de solubiliserede proteiner og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Bevar uopløselige pellets at tillade yderligere strengere udvinding, hvis det kræves senere. Fortsæt til trin proteinbestemmelse 1.3.
  3. Proteinbestemmelse
    1. At bestemme koncentrationen af ​​protein i hver ekstraheret prøve ved hjælp af enten en BCA, Bradford eller lignende assay. Ved beregning af standardkurven, sikre, at koefficienten for forholdet beslutsomhed, R-squared værdi, er større end eller lig med 0,99, som afspejler den mest præcise bestemmelse af protein overflod inden prøverne 15.
      BEMÆRK: Alle prøver sammenlignes med QFWB skal analyseres mod samme standardkurve.
  4. Klargøring af prøven
    1. Planlæg og registrere lastning rækkefølgen af ​​stiger og prøver til 2 identiske gels: gel 1 til overførsel og gel 2 som en belastning kontrol. Indlæse kontrol og "behandlet" prøver sekventielt at undgå enhver skævhed, der kan opstå med dårlig eller utvetydig overførsel.
    2. Beregn den nødvendige mængde protein for hver prøve. En standard protein belastning til at detektere proteiner i neuronale isolater er 15 ug. Gør hver prøve op til 10 pi volumen med dH 2 O. Tilsæt 5 pi loading buffer, vortex og varme ved 98 ° C i 2 min.
    3. Omfatter en positiv kontrol prøve, såsom et rekombinant protein til at hjælpe med identifikation af den korrekte båndet af interesse. Men forberede den positive kontrolprøve korrekt efter producentens retningslinjer for at undgå udvælgelse af de forkerte bands. Se figur 1.

Figur 1
Figur 1. Positive kontrol markering. Tilsætningen af ​​positive kontroller til et eksperiment bekræfter mærkning påvises er reel. Dog skal der udvises forsigtighed for at sikre din kontrol fungerer korrekt, før du bruger eksperimentelle prøver. A) Fusion protein TREM 2 blev læsset på producentens retningslinjer fra 1 mg / ml, men mærkningen observeret ved 110 kDa konflikter med dataarket forudsagt molekylære vægt på 60-70 kDa. B) Efter tilsætning og inkubation med reduktionsmidlet blev fusionsproteinet mærkning påvises ved den forudsagte molekylvægt. Dette betød imidlertid en større protein belastning var nødvendige som reduktionsprocessen faldt signalet af proteinet.

2. elektroforetisk separation af proteiner

  1. Fremstilling af 4-12% Bis / tris gel (1,0 mm)
    BEMÆRK: Gradient geler anvendes til at producere større protein separation over et bredt molekylvægtsområde.
    1. Vælg og forberede MESeller MOPS løbebuffer (1 liter pr tank) ved fortynding med dH 2 O. MES-buffer giver bedre opløsning af proteiner i 3,5 til 160 kDa henviser OFP'erne løbebuffer foretrækkes at detektere højere molekylvægt proteiner over 200 kDa vil dog have dårligere opløsning af lavere molekylvægt proteiner under 15 kDa.
    2. Tag kammen og strimmel af tape, der dækker foden af ​​gelen. Forsigtigt vaske brøndene med løbebuffer anvendelse af en 1 ml pipette. Fyld brøndene med rindende puffer og sikre, at ingen bobler forbliver i gelen.
  2. Gel forberedelse og læsning
    1. Sæt geler ind i tanken og fylde inter gelkammeret med rindende buffer for at sikre, at alle pakninger fungerer effektivt.
    2. Tilsæt 3 pi molekylvægt standard i den første brønd i gel 1 og gel 2. Load 10 pi af hver prøve i efterfølgende brønde.
      BEMÆRK: Med undtagelse af stigerne skal gel 1 & gel 2 være identiske. Det er bydende nødvendigt thpå forhånd farvede molekylvægt standard anvendes til gel 2 er blå og synligt, når anvendelse af et totalt protein plet med henblik på at være synlige i 700 kanal Odyssey imager.
    3. Når begge geler fyldes, fylde tanken med den resterende løbebufferen og fastgør låget.
  3. Elektroforese
    1. "Kør" gelen ved 80 V i 4 min for at sikre prøven ind i polyacrylamidgel matrix på en ensartet måde. Derefter øge spændingen og tiden til 180 V i 50 minutter henholdsvis eller indtil prøven farvestof kan ses ved foden af ​​gelen.
      BEMÆRK: Højere spændinger kan anvendes til at opnå kortere kørselstider. Dog kan dette resultere i "Smiley" geler, hvor de midterste prøver af geler løbe hurtigere end de ydre lane prøver forårsaget af en stigning i temperaturen 14.

3. Total Protein Stain af Loading Kontrol Gel

  1. Frigivelse gel 2 fra kassetten ved hjælp afen gel kniv. Fjern brønde og foden af ​​gelen. Markér gelen at hjælpe orientering.
  2. Dekanteres ca. 30 ml af proteinet pletten i en firkant petriskål (omtrentlige størrelse 12 x 12 cm). Placer gel 2 i proteinet pletten sikre opløsningen dækker hele gel, så omrøre gelen i 1 time minimum ved stuetemperatur til farvning.
  3. Dekanteres protein pletten og vaske gel 3x i destilleret vand før visualisering. Fortsæt til trin 6.3 til at visualisere.

4. Jeg-Blot Semi Dry Fast Protein Transfer

BEMÆRK: Alle reagenser, der er nødvendige for protein overføre ved hjælp af I-Blot maskine er kommercielle produkter specielt designet til I-Blot metode og kan findes i Materials List.

  1. Forbered "bunden" transfer stakken. Fjern folieklap og præ-vådt med løbebuffer direkte fra gelen tank. Pre-vådt filtrerpapir med destilleret vand.
  2. Gentag trin 3.1 og sted gel 1 ontoden forberedte "bunden" transfer stakken.
  3. Læg pre-vådt filterpapir over gel. Rul filtrerpapir og gel for at sikre, at ingen bobler er fanget mellem lagene.
  4. Fjern folielåget fra toppen overførsel stakken og lægge den øverste stabel oven på filtrerpapir og nederste stabel. Rul overførsel stack "sandwich" for at fjerne eventuelle luftbobler.
  5. Sæt svampen fra overførslen stak kit på låget på I-Blot maskine. Placer transfer stak sandwich på dedikerede plads på jeg-Blot maskine luk derefter låget fast. Start I-Blot og overføre til 8,5 min på program 3.
  6. Hvis der er et lavt proteinindhold signal eller ujævne høj: lavmolekylær protein-forhold, skal du teste producentens overførsel gange, når du bruger en semi tør "hurtig" overførselsmetode. Køre en simpel optimering protokol ved hjælp af eksempler gentagelser af samme belastning at bestemme den ideelle transfer kombination af spænding / tid, som det ses i figur 2 .

Figur 2
Figur 2. Optimering af overførsel ved hjælp af I-Blot. A) En enkelt gel fyldt med stige og 15 ug af murine hele hjernehomogenat i tre tandemgentagelser blev skåret i tre sektioner. Én sektion blev ikke overført, var en overført 7,5 min (ifølge producentens retningslinier) og én for 8,5 min. Gel snit blev derefter farvet med Instant Blå protein plet, scannet på en infrarød imager i 680 kanal og kvantificeres. B) Grafisk repræsentation af kvantificering værdier viser forskellen i restprotein indholdet af hver gel efter 0, 7,5 og 8,5 min for overførsel. Bemærk, at yderligere et minut for overførsel tid resulterede i yderligere protein overførsel af ca. 45%.e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

5. Antistof Påvisning af proteiner

  1. Membrane forberedelse og blokering
    1. Fjerne overførsel stak fra I-Blot maskine. Fjern det øverste og filtrerpapirlaget udsætte gelen på bunden transfer stakken.
    2. Skær rundt gelen med en skalpel og sikre, at en trekantet snit til orientering formål er repræsenteret på membranen. Efter membran trimning, protein plette gelen for at kontrollere overførsel effektivitet og / eller kassere.
    3. Hurtigt at bevæge membranen i et rent 50 ml rør (eller tilsvarende beholder) indeholdende 5 ml 1x PBS og placer den på en mekanisk valse (eller orbital platform) for konstant omrøring.
      BEMÆRK: Det er vigtigt, at membranen ikke får lov til at tørre ud. Under halvtør overførsel membranen bliver varm. Vent 2 minutter, før du åbner transfer stakken, da dette vil gøre det muligt it til afkøling og langsom tørretid under stakken dekonstruktion. Anvendelse af en valse og rør til omrøring under vaske og inkubationer giver betydelig reduktion i mængden af ​​løsninger, der kræves.
    4. Vask membranen 3 x 5 min i 1 x PBS. Kassér 1x PBS og blokere membranen med ufortyndet blokerende buffer i mindst 30 minutter ved stuetemperatur.
  2. Primære antistofpræparat.
    1. Forberede det primære antistof i henhold til producentens retningslinjer i 5 ml blokerende buffer med 0,1% Tween 20. Inkuber membranen med den forberedte primære antistof natten over ved 4 ° C med konstant omrøring.
      BEMÆRK: Blokeringsbuffer generelt anvendes ufortyndet, men kan fortyndes op til 1: 4 med PBS, hvis det primære antistof har høj nok specificitet.
    2. Kassér det primære antistof og vaskes membranen 6 gange i 5 min hver med 1x PBS.
  3. Sekundært antistof markering & forberedelse
    1. For secondary kun mærkning vurdering af kontrolhensyn, udelade trin 5.2.1 og 5.2.2 ovenfor, og fortsæt til trin 5.3 til at bestemme prøve specifikke sekundære båndmønstre. Se figur 3.

Figur 3
Figur 3. Optimering af sekundære antistoffer. A) En multi arter sammenligning af sekundær eneste ikke-specifik mærkning af 15 ug af murin (M), Får (O) og Equine (E) nervøse vævshomogenater med forskellige fluorescerende mærkede sekundære antistoffer . L er molekylvægten stigen. Får vævshomogenat var den eneste prøve at krydsreagere med sekundær mærkning, når du bruger æsel anti-ged 800 antistof. B) Det er også vigtigt at konstatere, om ikke-specifik mærkning opstår, når du bruger en anden vævsprøve, dvs murine gastrocnemius muskel (15 _6 g belastning). Denne prøve krydsreagerer med æsel-anti-muse-680 sekundært antistof, men dette er ikke tilfældet, når der anvendes musehjernehomogenat.

  1. Forbered fluorescerende mærkede sekundære antistof 680 eller 800 (rød eller grøn kanal) efter producent anbefalede koncentrationer i blokerende buffer med 0,1% Tween20. Inkuber membranen i mørke med den forberedte sekundært antistof i 90 minutter ved stuetemperatur med konstant omrøring.
  2. Kassér det sekundære antistof og vaskes membranen 6 gange i 5 minutter per vask med 1x PBS. Fortsæt til trin 6 - visualisering.
    1. Hvis ikke som forventet visualisering af markører, eksamen stiger med en række sekundære antistoffer som en egnet ekstra skridt. Ikke alle sekundære antistoffer tillader visualisering af alle markør bånd i alle kommercielt tilgængelige stiger.
    2. Hvis de forventede bands ikke er synlige, skal du bruge en alternativ sekundær vært, dvs donkey anti-kanin versus ged anti-kanin betegner en egnet protokol modifikation. Se figur 4. Host arter anvendes til at rejse et sekundært antistof kan undertiden forårsage et problem med visualisering på grund af manglende specificitet for specifikke primære antistoffer.

Figur 4
Figur 4. fejlfinding sekundært antistof specificitet Western blot af en række af vævsprøver (15 ug protein pr bane) -. Fedt, muskel, lever og knogler - inkuberet med ERK primære antistof og inkuberet med tre forskellige sekundære antistoffer. Top panel: WB mærket med LI-COR gede-anti-kanin 680 sekundært antistof produceret svag mærkning af fedt og knogler og intet signal blev påvist i lever og muskel prøver. Midterste panel: Membrane (fra top panel) blev strippet og ReprObed anvendelse af ECL metodik og gede anti-kanin HRP bundet sekundært. Bands er nu synlige i muskel- og leverprøver og mærkning fremstår mere intens i fedt og knogler prøver. Bundplade: Membrane (fra top og midterste panel) blev strippet og probet under anvendelse af LI-COR Donkey anti-kanin 680 sekundært antistof, der har vist en større affinitet for ERK primære antistof. Mærkning af muskel og lever er nu synlig med øget signal intensitet fra både fedt og knogler prøver. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

6. Visualisering

BEMÆRK: Alle billederne er erhvervet ved hjælp af LI-COR Odyssey Classic imager og tilhørende Image Pro analyse software (version 3.1.4).

  1. Tænd og logge på computeren og imager. Åbn imaging software og oprette en ny fil. Se figur 5.


Figur 5. Visualisering og kvantificering af Western blot. Scan et western blot, der viser murine musculus gastrocnemius (30 ug belastning) probet med Annexin V primære antistof (36 kDa) og gede-anti-kanin 800 sekundært antistof. Membranen blev scannet og visualiseret i 800 kanal. At kvantificere protein (Annexin V) er en rektangulær kasse trukket omkring båndet af interesse fra prøve 1. Denne derefter kopieres og indsættes over de resterende Prøvebaner at sikre måling af det samme område. Baggrund automatisk tegnede sig for omkring formen tegnes, men dette kan blive ændret for at sikre baggrunden målingen er præcist defineret. Tabellen nedenfor viser de kvantificerede målinger af hver figur trukket herunder samlede signal, der opnås, baggrund og signal med baggrund fratrækkes. Denne information kan derefter eksporteres til enregneark til at beregne udtryk nøgletal (som bestemt ved relative fluorescens intensitet) og tillader efterfølgende statistiske analyser, der skal udføres. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

  1. Åbn låget på imager. Hæld en lille mængde af 1x PBS til glasset på den nederste venstre hjørne, og derefter placere membranen på toppen af ​​PBS. Sikre membranen er kvadratisk med aksen på billeddanneren og en 1 cm mellemrum til overs mellem membranen og gitteret akse.
    1. Rul membranen for at sikre ingen bobler er fanget mellem glasset og membranen.
    2. Tæl antallet af kvadrater membranen indtager på x- og y-aksen. Luk låget på imager. Indtast antallet af kvadrater membranen indtager på computersoftware.
    3. Vælge den rigtige kanal til at scanne membranen, som vil afhænge af det fluorescerende tagaf det sekundære antistof, dvs. 700 kanal eller 800 kanal, når en 680 eller 800 fluorescerende mærkede antistof er blevet anvendt hhv. Når dobbelt mærkning udføres, scanning i begge kanaler.
      BEMÆRK: Optimer enkelt protein mærkning før udførelse dobbelt mærkning.
    4. Vælg intensiteten at scanne membranen, hvis en stor overflod protein bruge en lav intensitet scanning. Alternativt, hvis det primære antistof har ringe affinitet for proteinet af interesse vælge en højere intensitet scanning, dvs. niveau 5. Tryk start for at starte scanningen. Fortsæt til trin 6.4.
  2. Visualisering af loading kontrol gel (figur 6).
    Figur 6
    Figur 6. Total protein mærkning og analyse. A) Fotografi af en totalt protein mærket gel indeholdende 20 ug af heste cervikale ganglier homogenat per lane. B) Gel fra Panel Ascannet i 680 kanal. C) Graf over kvantificerede målinger fra det totale protein farvede gel opnået ved hjælp af imaging software. En række målinger bestemmes af molekylvægtmarkører, dvs 30-110 kDa, der træffes for at tilvejebringe et histogram af målinger for at sikre standardafvigelse (SEM) er lav (af de sammenbyggede prøver), hvilket indikerer, at den samlede protein niveauer i hver prøve er ensartede på tværs af gelen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
    1. Følg trin 6.1 og 6.2.
    2. Hæld destilleret vand på glasset i det nederste hjørne af billeddanneren hvor gitteret akse begynder.
    3. Gelen anbringes på toppen af ​​vandet og manøvrere, så banerne er vinkelret på enten x- eller y-aksen af ​​nettet. Efterlad en 1 cm mellemrum mellem y og x-aksen af ​​gitteret og gelen og tælle antallet af kvadrater gelen optager på gitteret akse. Luklåget af billeddanneren.
    4. Indtast antallet af kvadrater gelen optager på computersoftware.
    5. Vælge den kanal 700 til at scanne det totale protein farvede gel.
      BEMÆRK: Blå fluorescerer i 700 kanal.
    6. Indstille intensiteten til 5, og tryk på start.
  3. Kvantificering af scannede billede
    1. Juster lysstyrke og kontrast knapper til at producere den bedste billedkvalitet. Hvis der synes at være høj baggrundsstøj, scanne membranen ved en lavere intensitet og bruge den høje kvalitet scan indstilling.
      BEMÆRK: Eventuelle justeringer vil ikke ændre de fluorescerende data indhentet ved scanning.
    2. Dreje billeder 90 °, 180 ° og 270 °, for at se i den ønskede retning, men ingen ændringer til de indhentede data. Men når de foretager små justeringer af orientering i "fri rotation", med mere end 3 °, kan data indsamlet i pixilation værdier bliver fordrejet og dermed påvirke kvantificeringen resultater.
    3. Vælg en figur fra de former, menu - brug en rektangel i de fleste tilfælde - og trække omkring båndet af interesse (WB) eller hele lane (total protein gel) i prøven bane 1.
    4. Kopier og indsæt formen over til prøve bane 2 bånd af interesse, eller hele lane. Gentag på tværs af hver enkelt bånd af interesse for hver prøve og hver bane for den samlede proteingeler.
    5. Kontrollere, at målingen baggrund ikke optage et signal i den næste bane. Baggrunden kan trækkes automatisk af softwaren og omfatter hele kanten rundt formen trukket eller det kan specificeres til at være top / bund eller venstre og højre side af formen. Alternativt udpege en brugerdefineret baggrund kassen.
    6. Vise signalet for figurer tabel for hver figur tegnet i arbitrære fluorescerende enheder. Baggrunden vil automatisk blive fratrukket signalet.
    7. Eksportere billedet som en TIF-fil for at se i forskellige software. Må ikke eksportere billedet og manipulere USIng non Image Pro software, da dette vil ændre de oprindelige data erhvervet af imager generere falske oplysninger.
    8. Gentag trin 6.4.3-6.4.7 når kvantificerer dobbelt mærkning eller udføre flere målinger på lastning kontrol geler til at generere og indsamle standardfejlværdier data.

7. Indlæg Visualisering

  1. Hold membraner i 1x PBS eller tørre ud for langtidsopbevaring for fremtidig re-sondering og fjernelse af membraner til andre proteiner af interesse.
  2. Stripning og re-sondering af membraner. Se figur 7.
    Figur 7
    Figur 7. Membrane stripning og Fornyet probing. Repræsentative eksempler på membraner Efter forskellige stripping trin scannes med en infrarød billeddannelse system. A. Den første immunpåvisning blev udført med CSP primært antistof (kanin) og scannet ved 700 kanal. B. Først stripning og Fornyet probing med ROCK2 (kanin) med 800 kanal. Orange pil angiver resterende CSP primære antistof til stede efter strimlen og re-probe. Dette ikke påvirke målingen af ROCK2 som båndet er til stede ved en højere molekylvægt (hvid pil). C. Anden stripning og probet med β-spektrin-antistof (ged) og visualiseret i 800 kanal. D. Tredje stripning og Fornyet probing med α-synuclein antistof (kanin). E. Fjerde stripning og Fornyet probing med ubiquitin antistof (mus) med 800 kanal. Der er stadig resterende signal fra den sidste antistof (α-synuclein. Orange pil). F. Femte stripning og Fornyet probing med CALB2 antistof (kanin) afbildet i 700 kanal. Sekundære antistoffer blev anvendt, var: gede-anti-muse 800cw, gede-anti-kanin 680rd, gede-anti-kanin 800cw, æsel-anti-ged 800cw (se Materialer List). Lane etiketter: L - ladder, 1/260 - prøve 1/2. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
    1. Sted membran (r) i et kvadrat petriskål, der indeholder ca. 30 ml Revitablot stripping buffer og inkuberes 5-20 minutter ved stuetemperatur med konstant omrøring.
    2. Vask membranen (s) 3 gange i PBS scanne derefter på billeddanneren at sikre fuldstændig fjernelse af fluorescens er opstået - bør dette trin gentages efter hver strip.
    3. Inkubere membranen (r) i længere perioder, hvis fluorescens forbliver. Scanne membranen efter hver strimmel at bekræfte, at der ikke er nogen sekundære signal tilbage.
      BEMÆRK: Membrane (s) bør kun strippet og probet højst 3 gange for at sikre, at membranens integritet ikke er blevet kompromitteret resulterer i uønsket høj baggrund at signalere ratio.

Representative Results

Som QFWB følsomhed og det lineære område af afsløring er større end konventionel ECL detektion, er der en række af de kontrolforanstaltninger, der er afgørende for at sikre, at nøjagtige data er indsamlet, og dermed medvirken effektiv fortolkning. Første optagelse af positive kontrolprøver som vist i figur 1. For det andet, at optimering af overførsel garanterer tilsvarende bevægelse af høj og lav molekylvægt proteiner fra gelen til membranen som udstilles i figur 2. For det tredje, optimering af antistoffer, især sekundære antistoffer, hvis optimering er ofte overset, men som kan producere ikke-specifik banding kan forstyrre korrekt fortolkning af protein (r) af interesse. Se figur 3. For det fjerde kan det også være tilfældet, at når et protein forekommer målbart, men forventes at være til stede, kan dette også være et sekundært antistof spørgsmål, som kan korrigeres ved blot at bruge en sekundær raised i en anden art vært. Se figur 4. For det femte, total protein mærkning og analyse er en langt mere robust og kvantificerbar metode i forhold til anvendelsen af traditionelle enkelt protein (r), der udtrykkes ubikvitært for interne referencestandarder 3. Mange af disse enkelte proteiner er blevet fundet at være udtrykt forskelligt i modeller for neurodegenerative sygdomme, såvel som mellem forskellige vævsprøver og ensartethed af ekspression kan ændre inden for det samme væv 3. Derfor vil fremstillingen af et loading kontrol gel bekræfte ensartetheden af prøven belastning, når det kombineres med et samlet proteinindhold analyse ved at sammenligne og kvantificere protein belastning i hver bane på forskellige molekylvægte intervaller målt for hver prøve, der indikerer standardafvigelser som vist i figur 6, . Det er vigtigt, alle disse fejlfinding teknikker og kontrol er kun så effektive som følsomhed og konsistens af analysen tREDSKABER der anvendes af operatøren (Figur 5). Endelig denne teknik egner sig til stripning og fornyet sondering af membraner med større fleksibilitet end ECL på grund af faktorer, herunder, men ikke begrænset til, øget følsomhed, reduceres baggrunden, tofarvet påvisning og stabilitet membran under langsigtede opbevaringsbetingelser. Se figur 7.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA Buffer Fisher Scientific UK Ltd 10230544
M Tubes Miltenyi Biotec Inc. 130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular Life Technologies, UK IB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) Life Technologies, UK LC5602 Use in gel 1 for Western blotting
SeeBlue Pre-stained protein standard Life Technologies, UK LC5625  Use in gel 2 Total protein stained gel
NuPAge LDS Sample buffer 4x Life Technologies, UK NP0007
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x) Life Technologies, UK NP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well Life Technologies, UK NP0322BOX
Phosphate buffered saline tablet Sigma-Aldrich, UK P4417-100TAB
Micro BCA, Protein Assay Kit Fisher Scientific UK Ltd 10249133
Odyssey blocking buffer Li-Cor Biosciences P/N 927-40000
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg  Li-Cor Biosciences 926-68072
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences 926-32214
ODYSSEY CL Infra-red imager Li-Cor Biosciences Call for quotation
iBlot 7-Minute Blotting System Life technologies, UK This model is no longer in production
InstantBlue Protein stain Expedeon, UK ISB1L
Revitablot western blot stripping buffer  Rockland Immunochemicals Inc. MB-085-0050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology. 1992, (24), 145-149 (1979).
  2. Walker, J. M. Protein Protocols on CD-ROM. Humana Press Inc. Totowa, NJ, USA. (1998).
  3. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).
  4. Eaton, S. L., et al. Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting. PLoS One. 8, (8), 72457 (2013).
  5. Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots. Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).
  6. Colella, A. D., et al. Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology. Anal Biochem. 430, (2), 108-110 (2012).
  7. Zellner, M., et al. Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples. Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).
  8. Kielar, C., et al. Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease. Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).
  9. Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy. Genome Med. 5, (10), 95 (2013).
  10. Wishart, T. M., et al. Dysregulation of ubiquitin homeostasis and β-catenin signaling promote spinal muscular atrophy. J Clin Invest. 124, (4), 1821-1834 Forthcoming.
  11. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).
  12. Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism. J Neurochem. 93, (5), 1168-1176 (2006).
  13. Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells. Biol Proceed Online. 10, (1), 20-28 (2008).
  14. Wishart, T. M., et al. Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene. Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).
  15. Silva, J. M., McMahon, M. The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis. J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics