रोबोट microcontact मुद्रण (आर-μCP) का प्रयोग परिसर संस्कृति substrates और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन fabricating

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

एक साथ निहित गैर-दूषण गुण को बनाए रखते हुए covalently बाध्य जैव रासायनिक ligands के प्रदर्शित करने के लिए खूंटी grafted सतहों की क्षमता उन्हें संस्कृति substrates 1,2,3 पर इंजीनियरिंग कस्टम microscale वातावरण के लिए एक आदर्श विकल्प है. ligand के संयुग्मित खूंटी ब्रश द्वारा मध्यस्थता biospecific बातचीत व्यक्ति सेल phenotypes पर विवो ऊतक microenvironments में परिसर के भीतर पाया जैव रासायनिक संकेतों के प्रभाव के reductionistic विश्लेषण में सक्षम बनाता है. इसके अलावा, जैव ओर्थोगोनल "क्लिक" chemistries वे देशी रचना 4-6 में प्रस्तुत कर रहे हैं कि इतने ligands के दिशात्मक स्थिरीकरण की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रकार, खूंटी के microscale स्थानिक patterning के ब्रश स्थिर जैव रासायनिक संकेतों 6,7 द्वारा प्रेरित सेल संकेतन जांच करने के लिए इन विट्रो आलों में डिजाइनर बनाने के लिए एक बहुमुखी उपकरण है.

जैव रासायनिक घन के स्थानिक पैटर्न पैदा करने के लिए एक आम तरीकातों खूंटी संयुग्मित alkanethiols के पैटर्न के साथ microcontact मुद्रण (μCP) सोने में लिपटे substrates के जरूरत पर जोर देता. फिर, खूंटी ylated alkanethiols की micropatterned आत्म इकट्ठे monolayers (SAMs) केवल सब्सट्रेट 8,9 की गैर नमूनों क्षेत्रों के लिए, जैव रासायनिक अणुओं, जैसे, प्रोटीन की शारीरिक सोखना प्रतिबंधित करता है. हालांकि, इस तकनीक के द्वारा उत्पन्न SAMs दीर्घकालिक सेल संस्कृति मीडिया में ऑक्सीकरण के प्रति संवेदनशील हैं. इस प्रकार, Sams alkanethiol μCP'd अक्सर आगे इस क्षेत्र की गैर-दूषण स्थिरता 10 को बढ़ाने के लिए सतह शुरू की परमाणु हस्तांतरण कट्टरपंथी polymerization (एसआई-ATRP) का उपयोग खूंटी बहुलक ब्रश के साथ grafted रहे हैं. विशेष रूप से, μCP alkanethiol polymerization के सर्जक की, पाली के एसआई-ATRP (इथाइलीन ग्लाइकॉल) मिथाइल ईथर methacrylate (PEGMEMA) मोनोमर्स द्वारा पीछा सोने में लिपटे सतहों पर ω-meraptoundecyl bromoisobutyrate, micropatterned लंबी अवधि, स्थिर, और गैर साथ सतहों उत्पन्न दूषण खूंटी ब्रश. इसके अलावा, इन आगे विविध रासायनिक moieties 11 पेश करने के लिए संशोधित किया जा रहा करने में सक्षम हैं.

इस संपत्ति, शा एट का लाभ ले. अल. ओर्थोगोनल "क्लिक" chemistries पेश multicomponent PEGMEMA ब्रश के साथ संस्कृति substrates इंजीनियर एक विधि विकसित की है. इस विधि में, वे अनुक्रमिक सोडियम azide, ethanolamine साथ interspersed μCP / सी ATRP कदम की एक श्रृंखला का उपयोग, और कई स्थिर ligands के 6 के microscale पैटर्न पेश संस्कृति substrates बनाने के लिए न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन propargylamine. उपन्यास संस्कृति substrates इंजीनियर पुस्तिका μCP के साथ संयोजन के रूप में इस तरह के chemistries का उपयोग करने की क्षमता अपार है, यह कई μCP कदम एक एकल सब्सट्रेट पर गठबंधन किया जा सकता है जिसके साथ सटीक और सटीकता के द्वारा सीमित है. परिशुद्धता और सटीकता की एक उच्च स्तर reproducibly इन बहुमुखी तकनीक का उपयोग कर इन विट्रो आलों में जटिल निर्माण की आवश्यकता होगी.

e_content "> इस सीमा को संबोधित करने के लिए, कई स्वचालित और अर्द्ध स्वचालित μCP सिस्टम अल.. चक्र एट. उत्पन्न कस्टम टिकटें एक रेल प्रणाली पर रखा गया है और उपयोग कर सोने में लिपटे स्लाइड के साथ conformal के संपर्क में लाया जाता है, जिसमें एक μCP प्रणाली विकसित की गई है एक कंप्यूटर नियंत्रित वायवीय actuator. हालांकि, इस विधि कस्टम स्टांप डिजाइन की सटीक निर्माण की आवश्यकता है और कई μCP 12 चरणों का प्रदर्शन जब हासिल की शुद्धता की कोई रिपोर्ट के साथ एक 10 माइक्रोन सटीक रिपोर्ट. अभी हाल ही में एक एकीकृत विज्ञान सम्बन्धी युग्मन प्रणाली का उपयोग एक विधि रिपोर्ट एक ही पैटर्न का उपयोग 1 माइक्रोन से नीचे परिशुद्धता, लेकिन कारण 13 मोल्ड करने के लिए मोल्ड से स्टाम्प सुविधाओं का सटीक नियंत्रण की कमी को सही रूप में कई पैटर्न संरेखित करने में असमर्थ थे. साथ ही, पिछले विधियों के दोनों patterning के चरणों के बीच रहने के लिए निर्धारित सब्सट्रेट की आवश्यकता , जिससे काफी हो सकता है कि सतह संशोधन chemistries की विविधता सीमितका उपयोग किया. स्टाम्प डिजाइन और निर्माण में अधिक से अधिक लचीलेपन की अनुमति है, जबकि यहाँ, हम कई μCP चरणों की सही और सटीक संरेखण के एक स्वचालित आर-μCP प्रणाली सक्षम वर्णन. इसके अलावा, नमूनों substrates के बार बार इस तरह अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन सहित विभिन्न सब्सट्रेट संशोधन chemistries, के उपयोग की अनुमति, स्टांपिंग के बीच प्रणाली से हटाया जा सकता है. ऐसे chemistries का उपयोग कर इंजीनियर substrates दोनों हमें 6,14 और दूसरों 7 से पहले सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रकार, हम जटिल और micropatterned जैव रासायनिक संकेतों के साथ संस्कृति substrates के स्केलेबल निर्माण के लिए एक विधि विकसित करने के लिए आर-μCP और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं विलय कर दिया है.

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Protocol

1. उत्पन्न Elastomeric टिकटें

  1. PDMS स्टांप की सिलिकॉन स्वामी उत्पन्न करने के लिए, कंप्यूटर एडेड डिजाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर photomask की सुविधा पैटर्न डिजाइन.
    1. 300 माइक्रोन भीतरी व्यास (आईडी) और 1,200 मीटर सेंटर के लिए केंद्र रिक्ति के साथ 600 माइक्रोन आयुध डिपो के साथ annuli की एक 20 x 20 सरणी के रूप में पहली बार पैटर्न डिजाइन.
    2. 600 माइक्रोन आईडी और 1,200 माइक्रोन केंद्र के लिए केंद्र रिक्ति के साथ 900 माइक्रोन आयुध डिपो के साथ annuli की एक 20 x 20 सरणी के रूप में दूसरा पैटर्न डिजाइन.
    3. इसके अतिरिक्त, एक 45 डिग्री के कोण पर 1,200 माइक्रोन केंद्र के लिए केंद्र कोने पैटर्न से दूरी पर प्रत्येक सरणी डिजाइन के सभी चार कोनों पर 1 एक्स 1 मिमी 2 वर्ग संदर्भ के निशान जगह है.
    4. एक microfluidic फाउंड्री के साथ कहीं 15 या सहयोग में विस्तृत मानक लिथोग्राफी तकनीक का उपयोग कर एक 300 माइक्रोन सुविधा गहराई तक correlating, 1 पहलू अनुपात: 1 के साथ इस प्रयोग में इस्तेमाल के लिए सिलिकॉन स्वामी बनाना.
      नोट: सुविधा कम से कम 100 माइक्रोन सब्सट्रेट सतहों के साथ संपर्क करने से पहले टिकटों की असामान्य विकृति का कारण बन सकता गहराई.
      नोट: इस प्रोटोकॉल विशेष उपकरणों और बनाने के लिए साफ कमरे की आवश्यकता है जो photoresist की वर्णित पैटर्न, के साथ पहले से ही प्राप्त सिलिकॉन स्वामी होने के साथ शुरू होता है. यह इन नमूनों स्वामी बनाने के लिए एक fabricator या कोर सुविधा के साथ परामर्श करने के लिए सबसे अच्छा है.
  2. Silanize सिलिकॉन स्वामी (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) trichlorosilane वाष्प के साथ ऊष्मायन से ओ / एन.
    नोट: Silane वाष्प बेहद जहरीला है और केवल एक रासायनिक धूआं हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  3. PDMS पूर्व बहुलक और 60 डिग्री सेल्सियस पर एक पेट्री डिश हे / एन में silanized सिलिकॉन मास्टर्स के शीर्ष पर इलाज के एजेंट PDMS की: 1 के अनुपात में एक 10 इलाज से सिलिकॉन स्वामी का उलटा प्रतिकृतियां बनाने के लिए.
  4. सिलिकॉन स्वामी से PDMS टिकटों निकालें, और acrylonitrile butadiene styrene के लिए टिकटों (एबीएस) backings या किसी अन्य कठोर सामग्री बंधनगोंद का उपयोग है.
    नोट: पसंद की सामग्री पारदर्शी या biocompatible नहीं होना चाहिए. हालांकि, यह PDMS से रोबोट टूलींग और उच्च कठोरता के साथ इंटरफेस के लिए एक फ्लैट सतह प्रदान करनी चाहिए.

2. तैयारी Coverslides

  1. कुल्ला माइक्रोस्कोप coverslides (24 मिमी x 50 मिमी # 1) एक सज्जन नाइट्रोजन धारा के तहत इथेनॉल और सुखाने के साथ rinsing से पहले 1 मिनट के लिए एसीटोन में टोल्यूनि, मेथनॉल और sonicate में.
    नोट: केवल एक रासायनिक धूआं हुड में टोल्यूनि और एसीटोन संभाल.
  2. एक केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम बाष्पीकरण का उपयोग 18.0 एनएम सोने (एयू) द्वारा पीछा ~ 3.5 एनएम टाइटेनियम (तिवारी) के साथ कोट coverslides.
    नोट: यह प्रक्रिया सिलिकॉन और polystyrene सहित सोने-लेपित substrates की एक किस्म के साथ संगत है. यह इन साइट पर उत्पन्न करने के लिए संभव है, सोने में लिपटे substrates के भी व्यावसायिक आपूर्तिकर्ताओं के माध्यम से उपलब्ध हैं.
    नोट: substrates पर Au परतें एक होना चाहिए, जबकि तिवारी परतों, कम से कम 3 एनएम मोटी होना चाहिएटी कम से कम 5 एनएम मोटी और अंतिम सब्सट्रेट 16,17 के आदर्श ऑप्टिकल गुणों के आधार पर मोटाई में 1mm के लिए सभी तरह लेकर कर सकते हैं. Substrates निर्माण के लिए ऑप्टिकली स्पष्ट करने की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, यह गढ़े substrates के सूक्ष्म विश्लेषण की सुविधा.
  3. तुरंत उपयोग करने से पहले कोमल नाइट्रोजन के तहत इथेनॉल और शुष्क के साथ सोने में लिपटे coverslides कुल्ला.

3. आर-μCP बाहरी वलय का

  1. चुनिंदा शिकायत व्यक्त रोबोट भुजा (SCARA) प्रणाली के साथ आर-μCP पहले, सिस्टम के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर रोबोट उपकरण प्रभावोत्पादक और साथ दोहरी कैमरा सिस्टम जांचना.
    नोट: ये औजार चित्रा 1 में कल्पना कर रहे हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. आर μCP सिस्टम और रोबोट भुजा टूलींग. (क) सभी टूलींग और जुड़नार के साथ आर-μCP प्रणाली के बड़े पैमाने पर देखने के लिए, (एक) निर्वात चक, (ख) अभिकर्मक स्नान, (ग) नीचे का सामना करना पड़ कैमरा, (घ) के टिकट घोंसले स्थिरता, (ई) रोबोट उपकरण. (बी) रोबोट भुजा टूलींग चित्रण (च) हीरे की इत्तला दे दी नक़्क़ाशी उपकरण और (छ) वायवीय सक्शन उपकरण एक (ज) एबीएस समर्थित PDMS स्टांप पकड़े.

  1. मैन्युअल 600 माइक्रोन आईडी और 900 माइक्रोन आयुध डिपो annuli स्टाम्प घोंसले स्थिरता में चेहरा नीचे फैला हुआ साथ एक PDMS स्टांप जगह है. मैन्युअल चित्रा 1 ए में प्रदर्शित वैक्यूम चक, के शीर्ष पर एक हौसले से साफ सोने में लिपटे coverslide जगह है, और जुड़े प्रयोगशाला निर्वात का उपयोग कर इसे स्थिर.
  2. रोबोट नियंत्रण का प्रयोग, चित्रा 2A में के रूप में, सोने में लिपटे coverslide के केंद्र बिंदु के ऊपर नीचे का सामना करना पड़ कैमरा संरेखित.
    नोट: इस बिंदु शुरू में दृश्य निरीक्षण से परिभाषित किया जा सकता है और काफी सटीकता की आवश्यकता नहीं है, PDMS स्टांप बहुत larg है के रूप मेंसोने में लिपटे स्लाइड से ईआर.
  3. चार संदर्भ खोदना रोबोट भुजा हिदायत "एक्स" आयामों के साथ एक वर्ग के कोने पर निशान रोबोट बांह से जुड़ा हुआ हीरा इत्तला दे दी नक़्क़ाशी उपकरण का उपयोग कर सोने में लिपटे coverslide पर केंद्रित 3.8 मिमी से 3.8 मिमी. (चित्रा 2B में चित्रित, स्वचालित प्रक्रिया)
    नोट: यह सभी चार संदर्भ अंक नीचे का सामना करना पड़ कैमरा के एक दृश्य सीमा के भीतर कर रहे हैं सुनिश्चित करता है.
  4. रोबोट वायवीय सक्शन टूलींग का उपयोग करना,-लेने और PDMS चित्रा -2 में के रूप में दुनिया भर के टिकट घोंसले स्थिरता ऊपर 1 मिमी टिकट पकड़. (स्वचालित प्रक्रिया)
  5. स्टाम्प स्क्वायर संदर्भ अंक कल्पना और टिकट की औसत एक्स, वाई निर्धारित करने के लिए कैमरा सॉफ्टवेयर के साथ 10 बार उन्हें पहचान, और कोणीय के केंद्र से ऑफसेट, चित्रा 2 डी और ई में चित्र ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कैमरा और एलईडी रोशनी अंगूठी का उपयोग रोबोट टूलींग अक्ष. (स्वचालित प्रक्रिया)
  6. के रूप में नोट: कोई आंतरिक गणना ठीक संरेखित करने के लिए रोबोट प्रणाली के सॉफ्टवेयर द्वारा किया जाता है स्टाम्प की और भविष्य आर-μCP चरणों में coverslip के एक्स, वाई केन्द्र स्थानों और कोणीय ऑफसेट.
  7. चित्रा 2 एफ में दर्शाया के रूप में 3.8)) alkanethiol ATRP सर्जक, ω-mercaptoundecyl bromoisobutyrate (इथेनॉल में 2 मिमी की एक स्नान में स्टांप रखें. (स्वचालित प्रक्रिया)
  8. Alkanethiol समाधान से स्टाम्प निकालें और चित्रा 2 जी में के रूप में इथेनॉल लुप्त हो जाना 0.48 बार (5 साई) के लिए दबाव नाइट्रोजन धारा पर यह जगह. 1 मिनट के बाद नाइट्रोजन धारा का दबाव वर्दी सूखापन सुनिश्चित करने के लिए 1.03 बार (15 साई) के लिए है वृद्धि हुई है. (स्वचालित प्रक्रिया)
    नोट: अपूर्ण सुखाने पैटर्न निष्ठा की कुल या आंशिक नुकसान होगा.
  9. सूखने के बाद, सोने में लिपटे स्लाइड की गणना केंद्र स्थिति पर मोहर चाल और चित्रा 2H में दर्शाया के रूप में जेड-धुरी मोटर बल की निगरानी करते हुए 100 माइक्रोन वेतन वृद्धि में यह कम है.
    नोट: इस जेड-धुरी मोटर द्वारा अनुभवी और रोबोट मार्गदर्शन सॉफ्टवेयर में प्रदर्शित टोक़ के रूप में भेजी है. (स्वचालित प्रक्रिया)
  10. 79.2 किलो पास्कल की पूर्व निर्धारित दबाव हासिल किया गया है एक बार डाक टिकट को कम करना बंद करो, और 15 सेकंड के लिए सोने में लिपटे स्लाइड के साथ संपर्क बनाए रखें. (स्वचालित प्रक्रिया)
    नोट: दबाव मूल्यों यहां वर्तमान स्टांप डिजाइन और फीचर ऊंचाई के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. स्टाम्प डिजाइन एक परीक्षण और त्रुटि प्रक्रिया से इन तदनुसार विशेष रूप से उच्च पहलू अनुपात टिकटें, धुन के लिए बदल गया है.
  11. धीरे धीरे सोने में लिपटे स्लाइड से स्टांप हटाने और वापस स्टाम्प घोंसले स्थिरता में स्टाम्प जगह है. (स्वचालित प्रक्रिया)
  12. Micropatterned Coverslides पर PEGMEMA 4. एसआई-ATRP

    1. वैक्यूम दबाव micropatterned coverslide पकड़े जारी है, और एक 50 मिलीलीटर Schlenk फ्लास्क को हस्तांतरण. सील और देगास Schlenk एक वैक्यूम पंप का उपयोग कर फ्लास्क.
    2. जोड़ने के लिए macromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), पानी (34.4 मिलीलीटर), मेथनॉल (43.8 मिलीलीटर), तांबा (द्वितीय) ब्रोमाइड (1 mmol), और 2 ', 2-bipyridine (3 mmol) युक्त ATRP प्रतिक्रिया मिश्रण की 5.5 मिलीलीटर Schlenk कुप्पी.
    3. प्रतिक्रिया आरंभ करने के लिए पानी में एल-सोडियम ascorbate (454.3 मिमी) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें, और यह निष्क्रिय गैस के तहत आरटी पर 16 घंटे के लिए जारी रखने के लिए अनुमति देते हैं.
      नोट: चित्रा 3 ए-बी के रूप में दिखाया एल सोडियम ascorbate के अलावा के बाद, प्रतिक्रिया रंग गहरे भूरे रंग के लिए हल्के हरे रंग से बदलाव होगा.
      नोट: प्रतिक्रिया 16 घंटा से परे जारी रख सकते हैं, लेकिन यह काफी खूंटी ब्रश की लंबाई में वृद्धि नहीं होगी.

    एसआई-ATRP चित्रा 3. शुरूआत. (ए) प्रतिक्रिया और एल सोडियम ascorbate के अलावा के बाद (बी) के बाद रंग बदलने की शुरूआत. एसआई-ATRP प्रक्रिया के बाद micropatterned coverslide सतह (सी) माइक्रोस्कोप छवि. स्केल बार 1 मिमी.

    1. शेंक कुप्पी से micropatterned coverslide निकालें और एक सज्जन नाइट्रोजन धारा के तहत इथेनॉल, पानी, और इथेनॉल और शुष्क से कुल्ला.
      नोट: एसआई-ATRP के बाद, सतह संशोधन आँख को दिखाई जानी चाहिए और चित्रा -3 सी के रूप में एक खुर्दबीन के नीचे imaged और विश्लेषण किया जा सकता है.
      नोट: यह बात substrates के immunostain करने की आवश्यकता पर अनावश्यक रूप परीक्षण की शुद्धता का परीक्षण करने के लिए सबसे आसान तरीका है.

    Micropatterned PEGMEMA चेन 5. अब्द functionalization

    1. एक 20 मिलीलीटर कांच प्रतिक्रिया शीशी में micropatterned coverslide रखें.
    2. एन के 6 मिलीलीटर जोड़ें, प्रतिक्रिया शीशी 100 मिमी सोडियम azide युक्त एन -dimethylformamide (DMF). 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर यह प्रतिक्रिया बनाए रखें.
      नोट: केवल एक रासायनिक धूआं हुड में DMF संभाल. सोडियम azide बाहर वजन जब सावधानी बरतें.
    3. पूरा होने पर, प्रतिक्रिया शीशी से micropatterned coverslide को हटाने और एक नाइट्रोजन धारा के तहत तो इथेनॉल पानी और सूखे से कुल्ला.

    ब्रोमिन Functionalized PEGMEMA चेन 6. Passivation

    1. 20 मिलीलीटर कांच प्रतिक्रिया शीशियों में micropatterned coverslide रखें.
    2. 100 मिमी ethanolamine और प्रतिक्रिया शीशी 300 मिमी triethylamine युक्त डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) के 6 मिलीलीटर जोड़ें. 24 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर यह प्रतिक्रिया पकड़ो.
      नोट: केवल एक रासायनिक धूआं हुड में DMSO के, ethanolamine, और triethylamine संभाल.
    3. पूरा होने पर micropatterned coversl हटानेप्रतिक्रिया शीशी से आईडीई, एक नाइट्रोजन धारा के तहत तो इथेनॉल पानी और सूखे से कुल्ला.

    इनर वलय का 7. आर-μCP और PEGMEMA के एसआई-ATRP

    1. छोटे सुविधाओं के साथ annuli पहले micropatterned annuli के अंदर रखा जाता है कि इस तरह के 300 माइक्रोन आईडी और 600 माइक्रोन आयुध डिपो फैला हुआ annuli, साथ एक PDMS स्टांप प्रतिस्थापन, 3.12 - पहले कदम 3.2 और 3.6 में वर्णित के रूप में आर-μCP कदम बाहर ले.
      नोट: इस डाक टिकट के लिए दबाव सीमा 132.0 kPa है. जैसा कि पहले उल्लेख, इन दबाव सेटिंग्स स्टाम्प सुविधाओं इस प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.
    2. 4.4 - पहले कदम 4.1 में वर्णित के रूप में एसआई-ATRP कदम बाहर ले.

    Micropatterned PEGMEMA चेन 8. एसिटिलीन functionalization

    1. एक 20 मिलीलीटर कांच प्रतिक्रिया शीशी में micropatterned coverslide रखें.
    2. DMSO मिमी 100 युक्त के 6 मिलीलीटर जोड़ेंप्रतिक्रिया शीशी propargylamine. 24 घंटे के लिए आरटी पर यह प्रतिक्रिया बनाए रखें.
      नोट: केवल एक रासायनिक धूआं हुड में DMSO और propargylamine संभाल.
    3. पूरा होने पर प्रतिक्रिया शीशी से micropatterned coverslide को हटाने और एक नाइट्रोजन धारा के तहत तो इथेनॉल पानी और सूखे से कुल्ला.

    9. कॉपर-उत्प्रेरित "क्लिक" एसिटिलीन की Biotinylation PEGMEMA चेन समाप्त

    1. एक 20 मिलीलीटर कांच प्रतिक्रिया शीशी में micropatterned coverslide रखें.
    2. तांबा सल्फेट (15 मिमी) / Tris [(1-लोबान -1 एच -1,2,3-triazol-4-YL) मिथाइल] एमाइन (TBTA, 30 मिमी) के 6 मिलीलीटर (1 जोड़ें: 1 वी / वी पानी प्रतिक्रिया शीशी 562 माइक्रोन azide-खूंटी 4 -Biotin एकत्रित युक्त / DMF). प्रतिक्रिया प्रारंभ करने में मिश्रण को पानी में एल-एस्कॉर्बिक एसिड (0.15 मिमी) की 1.2 मिलीलीटर जोड़ें.
    3. 10 सेकंड के लिए प्रतिक्रिया समाधान के माध्यम से बुलबुला नाइट्रोजन, Parafilm के साथ शीशी सील, और आरटी पर 24 घंटे के लिए प्रतिक्रिया.
    4. Completio परएन, प्रतिक्रिया शीशी से micropatterned coverslide हटाने पानी से कुल्ला और एक 12 अच्छी तरह से योग्य polystyrene पकवान में जगह है.

    Biotinylated एसिटिलीन समूह की 10 Immunofluorescent जांच

    1. आरटी पर 1 घंटे के लिए DPBS (3% गधा सीरम) में micropatterned coverslide ब्लॉक. आरटी पर 2 घंटे के लिए DBPS में Streptavidin-546 साधना (2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) (पीबीएस में 3% गधा सीरम) के साथ biotinylated एसिटिलीन समूहों के लिए दाग.
    2. कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए micropatterned coverslide DPBS के साथ 5 बार कुल्ला.
      नोट: यह चरण पूरा होने के बाद चित्रा 4 बी स्लाइड की एक छवि को दर्शाया गया है.

    11. कॉपर-मुक्त "क्लिक" अब्द की Biotinylation PEGMEMA चेन समाप्त

    नोट: अगर वांछित, इस सब्सट्रेट संशोधन कदम सेल संस्कृति दौरान बगल में किया जा सकता है.

    1. 12 अच्छी तरह से पी में micropatterned coverslide छोड़ दोolystyrene पकवान निम्नलिखित DBPS rinses.
    2. 20 माइक्रोन DBCO-खूंटी 4 -Biotin युक्त DBPS (या सेल संस्कृति मीडिया) के 2 मिलीलीटर जोड़ें, और इस प्रतिक्रिया आरटी पर 24 घंटे के लिए जारी करने की अनुमति (या एक मशीन में 37 डिग्री सेल्सियस).
    3. DPBS के (या बस एक मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन) के साथ पूरा होने पर, micropatterned coverslide 5 बार कुल्ला.

    Biotinylated अब्द समूह की 12 Immunofluorescent जांच

    1. आरटी पर 2 घंटे के लिए 2 मिलीलीटर DPBS में Streptavidin-488 साधना (2 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल) (3% गधा सीरम) के साथ biotinylated azide के समूहों के लिए दाग.
    2. कोमल आंदोलन के साथ 10 मिनट के लिए micropatterned coverslide DPBS में 5 बार कुल्ला.
    3. छवि confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग coverslide micropatterned. इस चरण पूरा होने के बाद चित्रा -4 ए-सी स्लाइड के चित्र दर्शाया गया है.
      नोट: टिशू कल्चर assays के लिए substrates का उपयोग करते समय, वर्गों 10 और इस प्रोटोकॉल के 12 छोड़ें. वांछित degre के बादfunctionalization की ई, एक नाइट्रोजन धारा के तहत 100% इथेनॉल और सुखाने के साथ दोनों पक्षों rinsing द्वारा इंजीनियर coverslide बाँझ. एक बाँझ जैविक सुरक्षा कैबिनेट के लिए स्लाइड स्थानांतरण और सेल बोने और संस्कृति के साथ आगे बढ़ने से पहले पीबीएस के साथ पांच बार स्लाइड कुल्ला.

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Representative Results

पुस्तिका संरेखण μCP तकनीक का उपयोग ओर्थोगोनल साथ क्रियाशील खूंटी grafted ब्रश की सरणियों के साथ संस्कृति substrates इंजीनियर chemistries के पिछले काम 6 में प्रदर्शन किया गया है "क्लिक". हालांकि, इस पद्धति के उन्मुखीकरण के न्यूनतम नियंत्रण प्रदान करता है और अक्सर क्रियाशील क्षेत्रों के ओवरलैप में यह परिणाम है. इधर, एक उपन्यास आर-μCP प्रणाली इस सीमा को पार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और अपनी क्षमता को सही पैटर्न 300 माइक्रोन आईडी और 600 माइक्रोन आयुध डिपो के 600 मीटर के साथ खूंटी ब्रश annuli की एक अलग सरणी के भीतर टर्मिनल alkyne समूहों पेश करने के साथ खूंटी ब्रश annuli की एक सरणी टर्मिनल azide समूहों पेश आईडी और 900 माइक्रोन आयुध डिपो 14 प्रदर्शन किया है. खूंटी पेश alkyne की प्रतिक्रिया के बाद 3 -Biotin अब्द-खूंटी के साथ ब्रश और खूंटी पेश azide की प्रतिक्रिया DBCO-खूंटी 4 -Biotin के साथ ब्रश, सब्सट्रेट एफ (फ्लोरोसेंट जांच के साथ immunostained और एक confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged किया गया थाigure 4). गणना एक कस्टम MATLAB के कार्यक्रम का उपयोग कर इन चित्रों के विश्लेषण दो खूंटी ब्रश सरणियों एक्स ~ 6.4 माइक्रोन, वाई ~ 1.7 माइक्रोन, उप-10 माइक्रोन सटीकता, यानी साथ गठबंधन किया है, और θ ~ 0.02 डिग्री, निर्माता के पर है जो सीमा उद्धृत किया गया है कि हमारे SCARA मॉडल (यानी, ~ 10 माइक्रोन) और आर-μCP प्रणाली की पूर्व प्रदर्शन 14 का संकेत की. इस प्रकार, हम इस प्रणाली में उच्च के अंत SCARAs का उपयोग भी कम, उप माइक्रोन संकल्प प्रदान करेगा कि विश्वास करते हैं. इन परिणामों के आर-μCP प्रणाली और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं का संयुक्त उपयोग से सक्षम बहुमुखी सब्सट्रेट इंजीनियरिंग क्षमताओं का प्रदर्शन. ओर्थोगोनल सतह chemistries की फ्लोरोसेंट लेबलिंग इसका सबूत न्यूनतम पार जेट ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए जटिल संस्कृति substrates उत्पन्न करने के लिए जैव रासायनिक संकेतों का सटीक स्थिरीकरण के लिए इस प्रणाली की क्षमता का वर्णन करने के लिए कार्य करता है. </ P>

चित्रा 2
चित्रा 2. आर μCP प्रक्रिया के योजनाबद्ध. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ कैमरा के साथ PDMS स्टांप संदर्भ अंक visualizing - (क) नीचे कैमरा स्थिर सोने में लिपटे स्लाइड visualizing, स्टाम्प घोंसले स्थिरता से PDMS स्टांप हटाने सोने में लिपटे coverslide पर (बी) नक़्क़ाशी संदर्भ के निशान, (सी), (ई डी) का सामना करना पड़ , alkanethiol सर्जक स्नान में PDMS स्टांप रखने (एफ), (जी) सुखाने नाइट्रोजन धाराओं से अधिक विलायक सर्जक alkanethiol, और सोने में लिपटे coverslide पर (एच) मुद्रांकन alkanethiol लेपित PDMS स्टांप.

चित्रा 4
Micropatterned स्लाइड चित्रा 4. immunostained छवियां. (ए) azide और (बी) alkyne समूहों पेश करने के लिए क्रियाशील तांबा-मुक्त और तांबे की मध्यस्थता क्लिक रसायन शास्त्र का उपयोग biotinylated, और क्रमशः Streptavidin-488 और -546 के साथ पाया. दोनों फ्लोरोसेंट चैनल (सी) ओवरले. सभी पैमाने 500 माइक्रोन सलाखों.

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Discussion

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए आदर्श substrates के bioinspired और इस तरह देशी ऊतकों के भीतर पाया महत्वपूर्ण बायोएक्टिव ligands के स्थानिक वितरण पुनरावृत्ति की जाएगी. उन्होंने यह भी ligands के अस्थायी समायोजन और वे निर्देशित ऊतक morphogenesis की अनुमति के लिए प्रस्तुत किया और स्थानिक सेल भाग्य की प्रेरण प्रतिबंधित कर रहे हैं जिसमें स्थानिक पैटर्न है कि सक्षम गतिशील गुणों के अधिकारी करेंगे. ऐसे substrates के निर्माण substrates पर जटिल और अत्यधिक आदेश दिया झुकाव में कई जैव रासायनिक संकेतों का स्थिरीकरण की आवश्यकता है. इन विट्रो में एक सेल के आला के सभी अंतर्जात कारकों का अनुकरण अनुचित है, यहाँ वर्णित आर-μCP प्रणाली स्थानिक उन्मुखीकरण के microscale नियंत्रण के साथ ओर्थोगोनल बायोएक्टिव chemistries के कई क्षेत्रों के स्थिरीकरण के लिए अनुमति देता है.

इन substrates के बढ़ जाती है की उपयोगिता आगे खूंटी ब्रश सरणियों स्थिर ligands के साथ बंधे हुए हैं, जबकि उस पर जबbiospecific बातचीत बटोर सकते हैं, अपार खूंटी ब्रश प्रोटीन सोखना के लिए प्रतिरोधी रहते हैं और इस प्रकार कोशिका आसंजन और प्रवास नियंत्रित करने के लिए सेवा कर सकते हैं. बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन या बहुलक-खूंटी conjugates के निष्क्रिय, micropatterned सोखना सेल आसंजन और प्रवास को नियंत्रित करने के लिए एक सरल तरीका है हालांकि सोखना एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया 11 के बाद से, इन तकनीक केवल क्षणिक नियंत्रण प्रदान करते हैं. इसके अलावा, अणुओं अप्रत्याशित झुकाव में सतहों के लिए और इस तरह निष्ठा और biospecific बातचीत के नियंत्रण को सीमित यादृच्छिक सांद्रता में सोखना. इसके अलावा, आमतौर पर सीटू संशोधनों में पोस्ट-सोखना सीमित आगे functionalization के लिए नामित प्रतिक्रियाशील साइटों के पास नहीं है, ऐसे गोजातीय सीरम albumin या Pluronic F127 के रूप में गैर-दूषण क्षेत्रों बनाने के लिए इस्तेमाल यौगिकों. Alkanethiols की SAMs अतिरिक्त सतह संशोधन के लिए इस तरह के प्रतिक्रियाशील समूहों के साथ उत्पन्न, लेकिन वे भी टिशू कल्चर Condit में सीमित स्थायित्व है किया जा सकता हैकारण grafted खूंटी द्वारा afforded ऑक्सीडेटिव परिरक्षण की कमी के आयनों 10,11 ब्रश. इसके विपरीत, खूंटी-ब्रश ग्राफ्टिंग और अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं के साथ हमारी आर-μCP प्लेटफार्मों के विलय जैव ओर्थोगोनल functionalities के साथ एक प्राथमिकताओं या बगल में संशोधित किया जा सकता है कि टिकाऊ, microscale cytophobic क्षेत्रों के साथ substrates के लिए इंजीनियर की क्षमता प्रदान करता है. इस विट्रो ऊतक आकृति विज्ञान और विकास में नियंत्रित कर सकते हैं कि biospecific बातचीत की अधिक से अधिक नियंत्रण की अनुमति होगी.

अनुक्रमिक microcontact printings के aligning के लिए अन्य प्रणालियों की तुलना में आर-μCP की एक प्रमुख ताकत अभी भी उच्च संरेखण सटीकता 12,13 बनाए रखते हुए दोहराया स्टांपिंग के बीच प्रणाली से सब्सट्रेट को दूर करने की क्षमता है. यह बाद में आईएम का घनत्व लागू किया जा सकता है कि सतह chemistries के प्रकार में अधिक से अधिक विविधता में सक्षम बनाता है, और सतह संशोधन प्रतिक्रियाओं की अवधि धुन को अलग किया जा सकता हैजुटाए ligands के 6. इस प्रकार, आर-μCP biospecific बातचीत 14 मध्यस्थता कि जैव रासायनिक संकेतों में फोकल एकाग्रता ढ़ाल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ठीक स्थान और biospecific बातचीत की डिग्री दोनों को नियंत्रित करने की क्षमता के साथ, आर-μCP प्रणाली ऊतक morphogenesis में bioactive ligands की भूमिका की जांच के लिए एक अनूठा तरीका प्रदान करता है और जैविक संकेतों की प्रस्तुति में अनुकरण संस्कृति substrates पैदा करने के लिए एक मजबूत प्रणाली स्थापित इन विवो आला.

सेलुलर niches के एक महत्वपूर्ण पहलू है, विशेष रूप से विकास के भीतर, सिगनल के spatiotemporal मॉडुलन 18 कारक है. घुलनशील जैव रासायनिक संकेतों एक अस्थायी परिभाषित ढंग से संस्कृति मीडिया में जोड़ा जा सकता है, कोशिकाओं इन संकेतों मुठभेड़ जिस पर स्थानिक नियंत्रण वहाँ सीमित है. यहाँ वर्णित आर-μCP प्रणाली के साथ, यह टर्मिनली functionaliz साथ micropatterned संस्कृति substrates के निर्माण के लिए संभव हैएड खूंटी संस्कृति में सेल भाग्य पर कोई प्रभाव नहीं है कि azide कार्य समूहों पेश ब्रश. Azide समूहों alkyne पेश अणुओं के साथ तांबा-उत्प्रेरित "क्लिक" प्रतिक्रियाओं के दौर से गुजर करने में सक्षम हो रहे हैं, यह तांबे की विषाक्तता दिया संस्कृति में कोशिकाओं की उपस्थिति में नहीं किया जा सकता. हालांकि, dibenzocyclooctyne जैसे उच्च तनाव अणुओं (DBCO) एक अत्यधिक चयनात्मक और biocompatible तांबा-मुक्त azide-alkyne cycloaddition प्रतिक्रिया 19,20 से गुजरना. DBCO युक्त Linkers के विकार के माध्यम से, micropatterned संस्कृति substrates नई जैविक ligands के 21 के साथ बगल में संशोधित किया जा सकता है. Cytophilic cytophobic क्षेत्रों प्रस्तुत करना या बहु कदम संकेत प्रक्रियाओं में उपयोग के लिए विभिन्न जैव रासायनिक संकेतों को जोड़ने की क्षमता के साथ, इस विधि के साथ उत्पन्न संस्कृति substrates उपन्यास अनुकूली क्षमता है और इस प्रकार इन विट्रो में ऊतक morphogenesis निर्देश के लिए एक और अधिक मजबूत प्रणाली प्रदान करते हैं.

विशाल बर्तन के बावजूदential और आर-μCP मंच की उपयोगिता, यह कुछ कमियां है. खूंटी grafted substrates के उत्पन्न करने के लिए कई एसआई-ATRP चरणों का उपयोग बहुत inkjet मुद्रण या ईसीएम प्रोटीन की microdroplet बयान से जुड़े तरीकों की तुलना में निर्माण के समय बढ़ जाती है. Inkjet मुद्रण तकनीक का सटीक वर्तमान आर-μCP प्रणाली की कि प्रतिद्वंद्वियों जबकि, ईसीएम प्रोटीन की सोखना जिससे सेल प्रोटीन बातचीत की कम नियंत्रण प्रदान प्रतिवर्ती है. इसके अलावा, inkjet मुद्रण तकनीक के माध्यम से उत्पन्न substrates के जिससे स्थानिक सीटू सब्सट्रेट संशोधनों 22 में प्रतिबंधित उदाहरण के लिए परमिट कि विविध सब्सट्रेट संशोधन chemistries, का उपयोग बाधा, निर्माण के दौरान हटाया नहीं जा सकता. आर-μCP प्रणाली बहुत Bette है जबकि कारण इन सीमाओं के इंकजेट तकनीक संस्कृति लघु अवधि के साथ मुख्य रूप से चिंतित हैं substrates, biomolecules के स्थिर व्यवस्था और सेल प्रकार 23 की तेजी पीढ़ी के लिए बेहतर अनुकूल हैंआर लंबी अवधि, विविध जैविक ligands के साथ 2 डी में दोनों स्थानिक और लौकिक सेलुलर बातचीत अधिक गतिशील नियंत्रण का प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन बहुआयामी substrates के सृजन की ओर उपयुक्त है.

Microcontact मुद्रण 'स्याही' बड़े सतह क्षेत्रों से अधिक है, लेकिन हमेशा जमा 'स्याही' पदार्थों की एकाग्रता में महत्वपूर्ण विविधता हुई है नैनो-टू-microscale की तेजी बयान में सक्षम बनाता है. चित्रा 4 में देखा जा सकता है के रूप में यह भी आर-μCP मंच के एक मौजूदा सीमा है. हम खूंटी के फ्लोरोसेंट संशोधन में विविधता है ब्रश कि परिकल्पना की वजह से पूरे PDMS स्टांप पर एक असमान सामान्य बल के रोबोट के आवेदन, जो यह भी संभावना पूरी तरह से फ्लैट नहीं है. इससे alkanethiol सर्जक के असमान बयान और grafted खूंटी ब्रश के बाद मोटाई के कारण स्टांप और सब्सट्रेट के सभी क्षेत्रों के बीच गैर वर्दी संपर्क दबाव में यह परिणाम है. मेंalkanethiols के भी बयान लिए और इस तरह सतह कार्यक्षमता के साथ खूंटी grafted substrates के निर्माण के क्रम, मुद्रांकन उपकरण डिजाइन पूरी PDMS स्टांप पर एक वितरित और वर्दी सामान्य बल लागू करने के लिए अनुकूलित किया जा आवश्यकता होगी. इस डाक टिकट खामियों की पूरी इंटरफ़ेस स्वतंत्र भर में सोने में लिपटे स्लाइड के साथ वर्दी संपर्क की सुविधा होगी. इसके अलावा, चित्रा 4 बी में, एक azide समाप्त खूंटी ब्रश पर एसिटिलीन समूहों की मामूली पार संदूषण का निरीक्षण कर सकते हैं. पहले 6 प्रदर्शन के रूप में पार संदूषण की वजह से स्थिर ligands के सतह घनत्व इरादा खूंटी ब्रश पर कि कम से कम तुलना में है, वहीं इस ethanolamine passivation प्रतिक्रिया की अवधि बढ़ाने के द्वारा शून्य के पास करने के लिए कम किया जा सकता है (धारा 6 देखें).

यहाँ वर्णित आर-μCP प्रणाली के प्राथमिक आवेदन स्थानिक और लौकिक नियंत्रण ओ लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि जटिल टिशू कल्चर substrates के निर्माण के लिए हैएफ सेल भाग्य. हालांकि, आर μCP मंच की उच्च परिशुद्धता और सटीकता के रूप में यह अच्छी तरह से अन्य अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक विधि बनाता है. पहले से अक्रिय, cytophobic क्षेत्रों की सीटू संशोधन में द्वारा पीछा अंतर ligand के chemistries के साथ पैटर्न cytophilic क्षेत्रों करने की क्षमता उनके स्थानिक उन्मुखीकरण पर कड़ा नियंत्रण के साथ कई सेल लाइनों के सह संस्कृति के लिए अनुमति देता है. Micropatterning के निहित उच्च throughput प्रकृति के साथ मिलकर यह एकल कक्षों और बहु सेल संयोजनों 24 दोनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए मौजूदा तरीकों के लिए एक विकल्प प्रस्तुत करते हैं. आर-μCP प्रणाली जीव विज्ञान के दायरे में काफी क्षमता है, वहीं यह भी microelectromechanical सिस्टम (एमईएमएस) के क्षेत्र के लिए लागू किया जा सकता है. एमईएमएस निर्माण में, यह बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए उच्च परिशुद्धता और सटीकता के साथ एमईएमएस घटकों स्थानांतरित करने के लिए वांछनीय है. उपन्यास गतिज मुद्रांकन तकनीक के साथ, यहाँ वर्णित आर-μCP प्रणाली को प्रभावी ढंग से कर घटक मुद्रित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैएमईएमएस 25 पैदा करने में उपयोग के लिए सिलिकॉन वेफर्स पर सिलिकॉन या गैलियम नाइट्राइड के एनटीएस. इस प्रकार, आर-μCP मंच संभावित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

अंत में, आर-μCP प्रणाली का उपयोग orthogonally अनुक्रमिक न्युक्लेओफ़िलिक प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं का उपयोग functionalized संस्कृति substrates खूंटी grafted उत्पन्न करने के लिए प्रस्तुत संभवतः इन विट्रो में ऊतक आकृति विज्ञान और वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए एक आदर्श मंच है, लेकिन कई की भूमिका की जांच के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली न केवल सेल भाग्य पर बायोएक्टिव ligands. विशिष्ट और अत्यधिक आदेश दिया पैटर्न में पैटर्न कई जैव रासायनिक संकेतों की क्षमता माइक्रोन पैमाने पर आयोजित कई प्रकार की कोशिकाओं के साथ ऊतक संरचनाओं के गठन का निर्देश में सक्षम संस्कृति substrates के निर्माण के लिए नींव स्थापित करता है. यह बगल में micropatterned substrates के संशोधित करने की क्षमता के साथ मिलकर, ऊतक morphogenesis और सेल की अद्वितीय नियंत्रण के लिए अनुमति दे सकता हैसंस्कृति में एल भाग्य. यहाँ वर्णित patterning तकनीक एक दिन इन विट्रो में organotypic ऊतक संरचनाओं की तर्कसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उत्पादन सुविधा सकता है कि संस्कृति substrates के निर्माण के लिए एक बहुमुखी प्रणाली प्रदान करते हैं.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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