制造复杂的栽培基质使用机器人微接触印刷(R-μCP)和顺序亲核取代

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Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

的PEG接枝表面显示共价结合的配体的生化,同时保持固有的不污性能的能力,使他们为工程定制微观环境对培养基质1,2,3的理想选择。通过配体结合的PEG介导刷的生物特异性相互作用使得单个细胞的表型体内组织的微环境中的复杂的生物化学发现线索的作用还原论分析。此外,生物正交的“点击”化学方法可用来促进配体的定向固定化,使得它们在天然构象4-6给出。因此,PEG的微观空间的图案笔刷是一个多功能的工具来创建设计师在体外龛调查引起的固定生化线索6,7细胞信号转导。

产生生化立方米的空间格局的常用方法ES限嗣继承微接触印刷(μCP)镀金基板与PEG结合的烷基硫醇模式。然后,PEG-聚乙二醇化复合链烷硫醇的微图案化的自组装单分子层限制了生化分子, 例如,蛋白质的物理吸附,只在基板8,9的非图案区域。然而,通过这种技术产生的自组装是在长期的细胞培养介质中对氧化敏感。因此,μCP'd硫醇自组装膜通常还采用表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP),以增加该地区的不污稳定性10接枝的PEG聚合物刷。具体地,微接触的烷基硫醇聚合引发剂,ω-meraptoundecyl溴异丁酸乙酯,对金涂覆的表面,随后由SI-ATRP的聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯(PEGMEMA)单体生成具有微图案化的长期,稳定,非表面结垢PEG刷。此外,这些能够被进一步修改,以呈现不同的化学部分11。

以这个属性,沙优势。人 。开发出一种方法来设计培养基质多组分PEGMEMA画笔呈现直角“点击”化学物质。在该方法中,他们使用了一系列的穿插顺序叠氮化钠,乙醇胺微接触/ SI-ATRP的步骤,和炔丙基胺的亲核取代来创建培养基材呈现多种固定化配体6的微型图案。而使用这样的化学品在与人工微接触结合来设计新的培养基材的电位是巨大的,它是由精度和准确度与多个微接触的步骤可以在一个单一的基片对齐的限制。将需要的精度和准确度水平高可再现地制造复杂使用这些通用的技术体外龛。

e_content“>为了解决此限制,几个自动化和半自动化的微接触系统已经生成。轮穴等人开发出了微接触系统,其中定制邮票被放置在轨道系统和进入共形接触以使用金包被的载玻片一个计算机控制的气动致动器,然而,这种方法需要的定制邮票设计的精确制造,并报告有10微米的精度与执行多个微接触步骤12,当所取得的精确度的报告。最近,利用集成的运动耦合系统的方法小于1微米的精度报告使用单个图案,但是无法准确地对准多个图案由于缺少精确控制从模具印模特征到模具13上 。另外,两者的以前的方法所需要的基底图案形成步骤之间保持固定从而显著限制性的表面改性化学,可以是分集利用。在这里,我们描述了一种自动化的R-微接触系统能够对多个微接触步骤,准确和精确的对准,同时允许在邮票的设计和制造的灵活性最大。此外,图案化衬底可以重复从冲压件之间的体系中除去,从而允许使用各种不同的底物改性化学品,包括顺序的亲核取代。衬底使用这样的化学工程已被用于预先细胞培养由我们两人6,14和其他7。因此,我们已经合并的R-微接触和连续的亲核取代反应来开发用于培养基材的复杂和微图案化的生化线索可伸缩的制造方法。

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Protocol

1.生成弹性邮票

  1. 要生成PDMS印章的硅大师,采用计算机辅助设计软件设计的光罩的功能模式。
    1. 设计的第一图案为20×20阵列的环的具有300μm的内径(ID)和600微米的外径与1200微米的中心到中心的间距。
    2. 设计第二图案作为20×20阵列的环带600微米的ID和900微米外径与1200微米的中心到中心的间距。
    3. 此外,将1×1 平方毫米平方的参考标记在所有四个角的每个阵列的设计间隔1200微米的中心到中心的距离的角图案中的45°角。
    4. 制造硅的主人用于本实验中,用1:1的长宽比,使用与微流体铸造别处15或协作详述标准光刻技术关联到一个300微米的特征深度。
      注:功能深度小于100微米的可导致与基材表面接触之前,邮票异常变形。
      注:此协议首先在已经得到的硅大师与光致抗蚀剂的叙述模式,这需要专门的设备和洁净室创建。这是最好的一个制作者或核心设备来创建这些图案高手请教。
  2. Silanize硅大师O / N通过孵育(十三-1,1,2,2-tetrahydroocty)三氯硅烷的蒸气。
    注:硅烷的蒸气有剧毒,只应在通风橱处理。
  3. 1比率的PDMS预聚物和PDMS在60℃下固化的硅烷化硅的主人的顶部剂在培养皿中O / N的:通过固化10创建的硅主人的逆复制品。
  4. 从硅主人除去PDMS压模,并粘接邮票到丙烯腈 - 丁二烯 - 苯乙烯(ABS)的背衬或任何其他刚性材料S使用胶水。
    注意:选择的材料不需要是透明的或生物相容的。但是,它必须与所述机器人的工具和更高的刚性比PDMS的接口提供一个平坦的表面。

2.准备Coverslides

  1. 漂洗显微镜coverslides在甲苯,甲醇和超声处理在丙酮中为下一个温和的氮气流中,用乙醇冲洗并干燥前1分钟(1 24毫米×50毫米#)。
    注:只有在通风橱处理甲苯和丙酮。
  2. 外套coverslides以〜3.5 nm的钛(Ti),然后通过使用聚焦的电子束蒸发器18.0纳米的金(Au)。
    注:此步骤是用各种金涂覆的基材包括硅和聚苯乙烯兼容。而有可能在现场产生这些,金涂覆的基材也可通过商业供应商。
    注:钛层至少应为3纳米厚,而在衬底上的Au层应该是一个吨至少5纳米厚和范围可以全部在厚度为1mm取决于最终衬底16,17的理想的光学特性的方式。衬底不需要是用于制造光学透明的;然而,它便于制造基板的微观分析。
  3. 在即将使用前冲洗镀金coverslides温和氮气下乙醇和干燥。

3. R​​-μCP外环的

  1. R-μCP与选择标准的多关节机器人臂(SCARA)系统之前,校准使用系统软件的机器人工具效应和相应的双摄像头系统。
    注意:这些工具被描绘在图1中。

图1
图1. R-μCP系统和机械臂工具。 >(A)R-μCP系统的所有工装夹具大型看法,(一)真空吸盘,(二)试剂槽,(三)朝下的摄像头,(四)邮票嵌套夹具,(E)的机器人工具。 (B)中的机器人臂的工具描绘(六)金刚石尖蚀刻工具和(g)气动吸尘工具保持将a(h)的ABS支持的PDMS压模。

  1. 手动将600微米的ID和900微米OD突出的环在邮票嵌套夹具朝下一个PDMS印章。手动放置一个刚清洗干净的金涂覆coverslide上的真空吸盘,在图1A中显示的顶部,并使用该连接的实验室真空固定它。
  2. 使用机械手的控制,对准朝下的相机在镀金coverslide的中心点,如在图2A中
    注:此点最初可通过目视检查而定义的,并不需要很高的精度,由于PDMS压模得多LARG尔比的涂覆金的滑动。
  3. 指示机器人臂以蚀刻四个参考的“X”标记,在一个正方形的尺寸为顶点3.8毫米由3.8毫米集中在使用连接到机器人臂的金刚石尖蚀刻工具的镀金coverslide。 (示于图2B;自动化的过程)
    注:这将确保所有四个参考点都在朝下的摄像头之一的视觉框架。
  4. 使用机器人气动吸工装,接机,并保持PDMS印章1毫米上面的邮票嵌套夹具, 如图2C。 (自动化过程)
  5. 利用朝上的摄像头和LED照明环描绘在图2D和E,可视化的印模的正方形的参考标记,并确定它们与照相机软件10倍,以确定所述时间戳的平均的X,Y,和从该中心的角度偏移机器人工装轴。 (自动化过程)
  6. 作为注意:一个内部计算由所述机器人系统的软件进行精确地对准印模的和盖玻片的X,Y中心位置和角度偏移量中的未来的R-微接触的步骤。
  7. 3.8)放置在链烷烃硫醇的ATRP引发剂,ω-mercaptoundecyl溴异丁酸乙酯(2毫摩尔的乙醇浴中的邮票),如在图2F中描绘。 (自动化过程)
  8. 从链烷醇溶液除去印模,并将其放置在加压到0.48巴(5 psi)的氮气流中蒸发乙醇, 如图2G。 1分钟后增加的氮气流的压力为1.03巴(15磅),以确保均匀的干燥。 (自动化流程)
    注:不完全干燥会导致图案逼真的全部或部分损失。
  9. 干燥后,将印模在镀金滑动的所计算出的中心位置,并降低其在100微米为增量,同时监测Z轴马达力, 如图2H所描绘。
    注意:此连通的扭矩通过Z轴电机经历和在所述机器人指导软件显示。 (自动化过程)
  10. 停止降低一次的79.2千帕的预定压力已经达到印模,并保持与镀金的滑动,持续15秒的接触。 (自动化过程)
    注:该压力值以下是目前邮票的设计和功能的高度优化。如果印模设计改变,特别为高纵横比的邮票,调整这些相应地通过尝试和错误的过程。
  11. 慢慢地除去从镀金滑动印模和放置印章背面的印章嵌套夹具。 (自动化过程)
  12. PEGMEMA对微模式Coverslides 4 SI-ATRP

    1. 释放真空压力保持在微图案化coverslide,并将其转移到50毫升的Schlenk烧瓶中。用真空泵密封和脱气的Schlenk烧瓶中。
    2. 添加5.5含大分子单体PEGMEMA(208.75毫摩尔),水(34.4毫升),甲醇(43.8毫升),铜(II)溴化物(1毫摩尔),和2',2-联吡啶(3毫摩尔)的原子转移自由基聚合反应混合物中的溶液在Schlenk烧瓶中。
    3. 加入0.5毫升的L-抗坏血酸钠(454.3毫摩尔)的水,使反应开始,并允许它继续16小时,在室温下惰性气体。
      注:在加入的L-抗坏血酸钠,反应颜色由浅绿色转变为暗棕色, 如图3A-B中。
      注意:该反应可以继续超越16小时,但它不会显著增加的PEG刷子的长度。

    图3.启动SI-ATRP的。(A)的反应和(B)以后的颜色变化如下添加L-抗坏血酸钠的启动。微图案化coverslide表面以下的SI-ATRP过程中(C)显微图像。比例尺1mm以下。

    1. 从申克烧瓶中取出微图案coverslide并用乙醇,水,以及乙醇和干燥下温和氮气流冲洗。
      注:下面的SI-ATRP,表面修饰应肉眼可见的,并在显微镜下进行成像和分析, 如图3C所示
      注:这是测试试验的精确度,因为它省却了免疫染色基板的最简单的方法。

    的微模式PEGMEMA链5.叠氮化物官能

    1. 放置在20毫升玻璃反应管形瓶中的微图案化coverslide。
    2. 加入6毫升N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中含有100mM氮化钠的反应小瓶。保持该反应在37℃下放置24小时。
      注:只有在通风橱处理DMF。称出叠氮化钠时请务必小心。
    3. 完成后,除去从反应小瓶的微图案化coverslide和冲洗用在氮气流中的乙醇,然后用水和干燥。

    6.钝化溴官能PEGMEMA链

    1. 放置在20毫升玻璃反应瓶微图案coverslide。
    2. 加入6毫升含有100毫乙醇胺和300mM的三乙胺的反应小瓶二甲亚砜(DMSO)中的。保持该反应在40℃下放置24小时。
      注意:只有在化学通风橱中处理的DMSO,乙醇胺,三乙胺等。
    3. 完成后删除该微图案化coversl从反应小瓶的ide,冲洗用在氮气流中的乙醇,然后用水和干燥。

    7. R-μCP内环和PEGMEMA的SI-ATRP

    1. 开展R-μCP步骤如前面步骤3.2和3.6描述 - 3.12,与300微米的ID和600微米OD突出的环,使得具有较小的特点的环都放在前面微图案的环内代以PDMS印章。
      注:此邮票的压力阈值是132.0千帕。如前面所提到的,这些压力设置为在该实验中所使用的印模特征优化。
    2. 开展SI-ATRP步骤如前面的步骤描述4.1 - 4.4。

    的微模式PEGMEMA链8.乙炔官能

    1. 放置微图案coverslide在20毫升玻璃反应瓶中。
    2. 加6毫升DMSO含100毫米炔丙基胺的反应小瓶。保持此反应混合物在室温放置24小时。
      注:仅在通风橱处理DMSO和炔丙基胺。
    3. 完成后除去从反应小瓶的微图案化coverslide和冲洗用在氮气流中的乙醇,然后用水和干燥。

    9.铜催化的“点击”乙炔的生物素化终止PEGMEMA链

    1. 放置微图案coverslide在20毫升玻璃反应瓶中。
    2. 添加6毫升硫酸铜(15毫摩尔)/三[(1-苄 -1H- 1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA,30毫摩尔)的(1:1体积/体积的水/ DMF)中含有562μM的叠氮基的PEG 4 -生物素偶联物的反应小瓶。在水中添加加入1.2ml L-抗坏血酸(0.15毫摩尔)至混合物中,以初始化该反应。
    3. 通过10秒的反应液中的氮泡,用封口膜密封的小瓶,并24小时在室温下反应。
    4. 当completion个反应瓶中取出微图案化coverslide,用清水冲洗干净,并放置在一个12孔聚苯乙烯菜。

    10.免疫荧光检测生物素化乙炔组

    1. 1小时在室温块DPBS(3%驴血清)微图案化coverslide。染色为生物素化的乙炔基团与链霉亲和546结合物(2微克/毫升)在DBPS(3%驴血清的PBS中)处理2小时,在室温。
    2. 冲洗微图案coverslide 5次用DPBS 10分钟,温和搅拌。
      注: 图4B中示出了滑动的图像后,此步骤就完成了。

    11.无铜“,点击”叠氮的生物素化终止PEGMEMA链

    注:如果需要的话,该底物修饰步骤可以在原位细胞培养过程中进行的。

    1. 离开微图案化coverslide在12孔Polystyrene盘以下DBPS​​冲洗。
    2. 加2 ml DBPS(或细胞培养基)中含有20μM的DBCO-PEG 4 -生物素,并且允许该反应继续进行24小时,在室温(或37℃的培养箱)。
    3. 完成后,冲洗微图案化coverslide 5次DPBS(或者干脆进行媒体的变化)。

    12.免疫荧光检测生物素标记的叠氮基团的

    1. 染色为生物素化的叠氮基团与链霉亲和488结合物(2微克/毫升)在2毫升的DPBS(3%驴血清)培养2小时,在室温。
    2. 冲洗微图案coverslide 5倍于DPBS中10分钟,温和搅拌。
    3. 图象微图案coverslide使用共聚焦荧光显微镜。 图4A-C示出了该幻灯片的图片在此步骤之后完成。
      注意:当进行组织培养试验用基板,跳过第10及该协议第12条。所需degre后ê官能化,通过在氮气流下漂洗两面用100%乙醇和烘干消毒工程coverslide。幻灯片转移到无菌的生物安全柜,并继续进行细胞接种和培养前冲洗幻灯片,用PBS五倍。

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Representative Results

使用手动调整μCP技术工程师培养基质与功能化正交PEG接枝画笔数组“点击”化学品已被证明在以往的工作6。然而,这提供的图案取向最小控制和通常导致功能化区域的重叠。这里,一个新颖的R-微接触系统被用于克服此限制,并且它能够准确图案的聚乙二醇刷的环用300微米的ID和600μm的外径呈现末端炔基的聚乙二醇刷的环单独的阵列中与600微米的阵列ID和900微米OD呈现终端叠氮基团被证实14。以下炔呈递PEG的反应刷与叠氮化-PEG 3 -生物素和叠氮化物的呈递的PEG反应用刷子DBCO-PEG 4 -生物素,将基板进行免疫染色用荧光探针,并用共聚焦显微镜成像六igure 4)。使用计算出的一个自定义的MATLAB程序,这些图像的分析,这两个PEG刷阵列分别对准子10微米的精度, 即X〜6.4微米,y〜1.7微米,θ〜0.02°,这是在制造商的引用极限我们的SCARA模型( 约10微米),并指示R-μCP系统的性能前14。因此,我们认为,在本系统中使用的较高端的SCARA机器人将提供甚至更低,亚微米的分辨率。这些结果表明通过对R-微接触系统和连续的亲核取代反应的结合使用使多功能衬底工程能力。最小的交叉反应性通过正交的表面化学的荧光标记证明用于说明本系统中进行的生化线索的精确固定化,以产生复杂的培养基质用于组织工程应用的潜力。</ P>

图2
图2. R-μCP过程的示意图。 (A)中的向下面对镜头可视化固定化的涂覆金的滑动,上镀金coverslide(B)中蚀刻基准标记;(C)从邮票嵌套夹具去除PDMS压模,(D - E)的可视化的PDMS压模基准标记与面向上的照相机,(F),将PDMS压模中硫醇引发剂浴中,(G)的干燥硫醇引发剂溶剂在氮气流中,和(H)的冲压硫醇涂布的PDMS上镀金coverslide邮票。

图4
微图案化幻灯片图4.免疫染色图像。 的叠氮化物和(B)的炔基,用无铜和铜-介导的点击化学生物素化,并分别与链霉亲和488和-546检测。这两个荧光通道(C)覆盖。所有比例尺为500μm。

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Discussion

理想的基质用于组织工程将仿生并由此概括的天然组织中发现的关键的生物活性配体的空间分布。他们也将具有动态属性,使配体的时间调整,并且在它们出现,以允许定向组织形态发生和空间上的限制诱导细胞命运的分布模式。这种基材的制造需要在衬底上复杂和高度有序取向多种生化线索的固定。虽然模拟细胞的小生境所有的内源性因素在体外是不合理的,这里所描述的R-μCP系统允许的正交生物活性化学物质与空间定位的微观控制多个区域的固定化。

这些底物的增加的效用进一步考虑到,而PEG画笔数组绑定固定配时能够引起生物特异性相互作用,未结合的PEG电刷保持抗蛋白质吸附,因而可用于控​​制细胞的粘附和迁移。虽然细胞外基质(ECM)蛋白或聚合物-PEG偶联物的被动,微图案化的吸附是控制细胞粘附和迁移更简单的方法,这些技术只提供短暂控制,因为吸附是一个可逆的过程11。此外,分子吸附在不可预知的方向的表面和随意的浓度,从而限制了保真度和生物特异性相互作用的控制。此外,化合物通常用于创建不污的区域,如牛血清白蛋白或的Pluronic F127,不具有指定的反应位点为进一步官能限制性吸附后原位修饰。可以用额外的表面改性等活性基团生成烷基硫醇的自组装膜,但他们也有在组织培养康迪特有限的耐用性离子由于缺乏氧化屏蔽由接枝的PEG,得到刷10,11。相反,我们的R-微接触平台用PEG-刷接枝和顺序的亲核取代反应中的合并提供了工程师基材与可修改的先验就地与生物正交功能耐用,微尺度的斥细胞区的能力。这将允许更大的控制,可以在体外组织的形态和生长调节生物特异性相互作用。

R-微接触的其它系统相比,用于对准连续微接触印刷一个主要优势是,从系统中移除重复的冲压件之间的衬底,同时仍保持高的对准精度12,13的能力。这使得更大的多样性,可以应用表面化学性质的类型,和表面改性的反应的持续时间可以变化,以调整随后即时的密度动员配6。因此,R-微接触可以用来建立联络的浓度梯度在该介导生物特异性相互作用14生化线索。以精确地控制的位置和生物特异性相互作用的程度的容量,则R-微接触系统提供了独特的方法用于研究在组织形态发生的生物活性配体的作用,并建立了一个强大的系统,用于产生培养基材模拟生物线索的演示文稿中的体内的利基。

细胞小生境的一个重要方面,特别是在发展的,是信号的时空调制系数18。虽然可溶性生化线索可被添加到培养介质中在时间上限定的方式,所限定的空间控制在其上的细胞遇到这些线索。与这里所描述的R-微接触系统,它能够构建微图案化培养基材与末端functionaliz编辑PEG刷呈现那些在文化上的细胞命运没有影响叠氮官能团。而叠氮化物基团是能够进行铜催化的“点击”的反应与炔呈递分子,这不能在细胞培养中存在的给定的铜的毒性进行。然而,高应变分子如dibenzocyclooctyne(DBCO)经受一种高选择性和生物相容的无铜的叠氮化物-炔环加成反应19,20。通过含有DBCO-接头的结合,微图案化培养基质可在原地与新的生物配体21进行修改。与呈现斥细胞区嗜细胞或可用于多步信令规程使用添加不同的生化线索的能力,用这种方法生成的培养基材具有新颖的适应能力,从而提供了更鲁棒的系统,用于指示组织形态发生在体外

尽管巨大的锅无穷区间以及R-微接触平台的效用,但它具有某些缺点。使用大量的SI-ATRP步骤生成的PEG接枝的基片大大地增加了制造时间相比,涉及喷墨​​印刷或ECM蛋白的微滴沉积方法。而喷墨印刷技术的精度相媲美,当前的R-微接触系统,ECM蛋白的吸附是可逆的,从而提供较少控制的细胞蛋白质的相互作用。此外,通过喷墨印刷技术产生的衬底不能在制造过程中除去,从而妨碍了使用各种不同的底物修饰的化学,其允许,例如,在空间上限制在原位衬底修改22。由于这些限制,喷墨技术更适合于快速代培养基材主要关心的短持续时间,生物分子的静态安排和细胞类型23,而R-微接触系统是多的照ř适于向着生成旨在显示出长期的,动态地控制空间和时间的细胞相互作用在2D与不同的生物配体的多面性的底物。

微接触印刷使纳米到微米的快速沉积“墨水”功能在大面积,但一直存在着显著的异质性沉积'墨'物质的浓度。这也是对R-微接触平台的当前限制,可以在图4中观察到。我们假设,在PEG的荧光修饰的异质刷是由于不均匀的法向力的机器人的应用在整个PDMS压模,其也有可能不是完全平坦的。这导致印模和衬底的所有区域之间的非均匀的接触压力,从而使所述链烷硫醇引发剂的不均匀沉积和接枝的PEG刷的后续厚度。在为了制造的PEG接枝的基片与偶沉积链烷硫醇,并由此面功能性,冲压工具设计将需要被优化以适用于分布式和均匀的法向力在整个PDMS压模。这将有利于与金包被的载玻片在整个界面独立邮票缺陷的均匀接触。另外,在图4B中 ,可以观察到轻微的交叉污染对叠氮封端的PEG刷乙炔基。而由于交叉污染固定化配体的表面密度是最小的相比,基于预期的PEG-刷,这可以通过增加乙醇胺钝化反应的持续时间被减少到接近零(参见第6节),为先前6证明。

此处所描述的R-微接触系统的主要应用是用于制造可用于施加空间和时间控制O复合组织培养基材˚F细胞的命运。然而,高精确度和准确度的R微接触平台,使之成为有吸引力的方法,对于其它应用也是如此。的能力,以图案嗜细胞区域具有差分配位体的化学随后先前的惰性,斥细胞区的原位改性可用于共培养的多个细胞系的严格控制它们的空间取向。这再加上图案化的固有的高通量性质提出一种替代目前的方法为单细胞和多细胞的组合24的高通量筛选。而R-微接触系统具有巨大的潜力在生物学领域,它也可以被应用到微机电系统(MEMS)领域。在MEMS制造中,希望转移MEMS元件具有较高的精密度和准确度进行大批量生产。用新颖的动能冲压技术,这里所描述的R-微接触系统可适于有效地打印COMPONE硅氮化镓上硅晶片的使用中产生的MEMS 25个核苷酸。因此,R-微接触平台,可用于范围广泛的潜在应用。

总之,使用对R-微接触系统以产生聚乙二醇接枝的培养基材使用顺序的亲核取代反应的正交官能呈现不仅用于潜在控制组织的形态和生长在体外的理想平台,但优良的系统,用于研究多种的作用生物活性配体对细胞的命运。在独特和高度有序的模式的能力,格局多种生化线索确立了基础建设能够指示形成的组织结构与在微米尺度举办多种类型的细胞培养基质。再加上修改原位微图案化基板的能力,可以允许组织形态和CEL无与伦比的控制升命运的文化。这里所描述的图案化技术制造的文化底,可能有一天便于合理的和可重复的生产器官的组织结构在体外提供一个多功能的系统。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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References

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