ロボットマイクロコンタクト印刷(R-μCP)とシーケンシャル求核置換を使用して複雑な培養基材を製造

1Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin, Madison, 2Department of Mechanical Engineering, University of Wisconsin, Madison
* These authors contributed equally
Bioengineering

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Knight, G. T., Klann, T., McNulty, J. D., Ashton, R. S. Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-µCP) and Sequential Nucleophilic Substitution. J. Vis. Exp. (92), e52186, doi:10.3791/52186 (2014).

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Abstract

Introduction

同時に非ファウリング本来の特性を維持しながら、共有結合した生化学的リガンドを表示するために、PEGグラフト化表面の能力は、それらの培養基材1,2,3上のエンジニアリング·カスタムマイクロスケール環境のための理想的な選択肢となっています。リガンドコンジュゲートしたPEGブラシにより媒介される生物特異的相互作用は、個々の細胞の表現型上の生体内組織の微小環境において 、複雑な内に見られる生化学的手がかりの効果の還元主義分析を可能にします。さらに、バイオ直交性の「クリック」化学は、それらが天然のコンフォメーション4-6に示されているように、リガンドの方向性固定化を容易にすることができる。このように、PEGのマイクロスケールの空間パターニングは、固定化された生化学的手がかり6,7により誘導される細胞のシグナル伝達を研究するためにインビトロニッチデザイナーを作成するための汎用性の高いツールですブラシ。

生化学立方の空間パターンを生成するための一般的な方法ESは、PEG共役アルカンチオールのパターンを有するマイクロコンタクト·プリンティング(μCP)金でコーティングされた基材を必要とする。その後、PEG化アルカンチオールの自己組織化単分子膜(SAM)マイクロパターンは、生化学分子の物理吸着を制限例えば、タンパク質基板のみ8,9の非パターン化領域への。しかし、この技術によって生成されたSAMは、長期細胞培養培地中で酸化に敏感である。したがって、SAMは、アルカンチオールμCP'dは、しばしば他の部位の非ファウリングの安定性10を増加させるために表面開始原子移動ラジカル重合(SI-ATRP)を用いて、PEGポリマーブラシをグラフトされる。具体的には、アルカンチオール重合開始剤のμCP、ω-meraptoundecylブロモイソブチレート、ポリSI-ATRP続いて金被覆表面上のポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート(PEGMEMA)モノマー、長期のマイクロパターン安定性、非有する表面を生成するPEGブラシを汚れ。さらに、これらのさらに、多様な化学的部分11を提示するように改変されることが可能である。

この性質を利用して、沙ら。ら 。直交「クリック」化学を提示する多成分PEGMEMAブラシで培養基板を設計する方法を開発した。この方法では、それらは、複数の固定化リガンド6のマイクロパターンを提示する培養基材を作成するために、順次、アジ化ナトリウム、エタノールアミン、プロパルギルアミンと求核置換を散在μCP/ SI-ATRPの一連のステップを使用。新規な培養基質を設計する手動μCPと一緒にそのような化学物質を使用する可能性は計り知れないが、これは、複数のμCPステップが単一の基板上に整列することが可能な精度と正確さによって制限される。精度と高精度、再現これらの多用途の技術を用いてインビトロニッチ複合体製造するために必要とされるであろう。

この制限に対処するためにe_content ">は、いくつかの自動化および半自動μCPシステムが生成されている。チャクラカスタムスタンプはレールシステム上に配置し、使用して金被覆したスライドと等角接触させるμCPシステムを開発コンピュータ制御の空気圧アクチュエータが、この方法は、カスタムスタンプ設計の正確な製造を必要とし、複数のμCP12ステップの実行時 ​​に達成精度のnoレポートを10μmの精度を報告している。最近では、統合されたキネマティックカップリングシステムを利用する方法単一のパターンを使用して、1μm未満の精度を報告したが、正確に13を成形するための金型からのスタンプの特徴の正確な制御の欠如に起因する複数のパターンを位置合わせすることができなかった。また、従来の方法の両方は、基板は、パターン形成工程の間に固定されたままにする必要が、大幅であることができる表面改質の化学的性質の多様性を制限する利用した。切手のデザインと製造における最大の柔軟性を可能にしながらここでは、複数のμCPステップの正確かつ精密な位置合わせが可能な自動化されたR-μCPシステムについて説明します。さらに、パターニングされた基板を繰り返し、それによって連続的な求核置換を含む、多様な基質修飾化学薬品の使用を可能にする、プレス加工の間にシステムから除去することができる。基板は、化学反応を用いて操作達6,147の両方によって以前に細胞培養のために使用されている。したがって、我々は、複雑でマイクロパターン生化学的手がかりと培養基質の製造のためのスケーラブルな方法を開発するR-μCP逐次求核置換反応をマージした。

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Protocol

1.生成エラストマースタンプ

  1. PDMSスタンプのシリコンマスターを生成するには、コンピュータ支援設計ソフトウェアを使用したフォトマスクの特徴パターンを設計します。
    1. 300μmの内径(ID)および1200ミクロンの中心から中心までの間隔が600μmの外径を持つ年輪の20×20のアレイとしての第1のパターンを設計します。
    2. 600μmのIDおよび1200μmの中心から中心までの間隔が900μmの外径を持つ年輪の20×20アレイのような第二のパターンを設計します。
    3. さらに、45°の角度で1200ミクロンの中心から中心までのコーナーパターンから離れ、各アレイ設計のすべての四隅に1×1mm 2の正方形の基準マークを配置。
    4. 他の場所15またはマイクロ流体ファウンドリと共同で詳述標準的なリソグラフィ技術を用いて300μmのフィーチャーの深さに相関する、1アスペクト比:1この実験で使用するための、シリコンマスターを製作。
      注:フィーチャーが100μmの基板表面と接触する前にスタンプの異常変形につながる可能性がより低いと深さ。
      注:このプロトコルは、すでに作成に特殊な装置やクリーンルームを必要とするフォトレジストの記載されたパターンをシリコンマスターを取得したことから始まります。それは、これらのパターン化されたマスターを作成するために製作者や中核施設と相談するのが最善です。
  2. Silanizeシリコンマスター(トリデカフルオロ-1,1,2,2- tetrahydroocty)トリクロロシラン蒸気とのインキュベーションにより、O / N。
    注:シラン蒸気は非常に有毒であり、唯一の化学ドラフト内で処理する必要があります。
  3. PDMSプレポリマーと、60℃でペトリ皿、O / Nでシラン化シリコンのマスターの上に硬化剤PDMSの1の比率:10を硬化させることにより、シリコンの巨匠の逆レプリカを作成します。
  4. シリコンマスターからPDMSスタンプを外し、アクリロニトリル·ブタジエン·スチレンへのスタンプ(ABS)バッキングまたはその他の剛性材料を接合接着剤を使用してね。
    注:選択した材料は、透明または生体適合性である必要はない。しかし、それはロボットのツーリングとPDMSよりも剛性とのインタフェースのための平坦な表面を提供する必要があります。

2.準備カバースライド

  1. 穏やかな窒素気流下エタノールを用いてリンスして乾燥される前に1分間、アセトン、トルエン、メタノールおよび超音波処理で顕微鏡カバースライドをすすぎ(24ミリメートル×50ミリメートル#1)。
    注:唯一の化学ヒュームフード内でトルエンとアセトンを処理します。
  2. 集束電子ビーム蒸着器を用いて、18.0ナノメートルの金(Au)が続く〜3.5 nmのチタン(Ti)と被覆カバースライド。
    注:この手順では、シリコン、ポリスチレンなどの金コーティング、種々の基材と互換性があります。それは、これらはオンサイト生成することが可能であるが、金被覆基材は、商業供給業者を介して入手可能である。
    注:基板上のAu層であるべきままのTi層は、3nm以上厚さでなければならないトン以上厚さ5nmと最終基板16,17の理想的な光学特性に応じて厚さが1ミリメートルにするすべての方法を範囲とすることができる。基板は、製造のための光学的に透明である必要はない。しかしながら、製造された基板の顕微鏡分析を容易にする。
  3. 使用直前に穏やかな窒素下でエタノールとドライと金コートカバースライドをすすぐ。

3. R​​-μCP外環の

  1. 選択的に準拠した多関節ロボットアーム(SCARA)システムとのR-μCPする前に、システムのソフトウェアを使用して、ロボットのツールエフェクターおよび付随するデュアルカメラシステムのキャリブレーションを行います。
    注:これらの用具は、 図1に描かれている。

図1
図1. R-μCPシステムとロボットアームツーリング。 >(A)は、すべてのツールと備品付きのR-μCPシステムの大規模ビュー、(a)は、真空チャック、(b)は、試薬槽、(c)は下向きのカメラ、(d)のスタンプネスティング·フィクスチャ、(e)のロボットツール。 (B)〜(h)のABS担保PDMSスタンプを保持し、(f)は、ダイヤモンド先端エッチングツールと、(g)の空気圧吸引ツールを描いたロボットアーム工具。

  1. 手動で600μmのIDと900μmのODは年輪がスタンプネスト固定具に下向きに突出したPDMSスタンプを置く。手動図1Aに表示された真空チャックの上に新たに洗浄金被覆coverslideを置き、結合ラボ真空を使用して固定する。
  2. ロボットコントロールを使用して、 図2Aに示すように、金被覆coverslideの中心点の上に下向きにカメラを合わせる。
    注:この時点では、最初に目視検査によって定義することができ、PDMSスタンプは非常にラーグであるため、高い精度を必要としない金コートスライドよりえー。
  3. 4つの基準をエッチングするためにロボットアームを指示する "X"の寸法を有する正方形の頂点のマークをロボットアームに取り付けられたダイヤモンド先端エッチングツールを使用して金被覆coverslideを中心に3.8ミリメートル3.8 mmの( 図2Bに描かれ、自動化されたプロセス)
    注:これは、すべての4つの基準マークが下向きにカメラのいずれかの視覚的なフレーム内にあるようにします。
  4. ロボットの空気圧吸引ツールを使用して、アップを拾うと、PDMSは、図2Cのようにスタンプネスティング·フィクスチャ上の1ミリメートルをスタンプ保持する。 (自動プロセス)
  5. 図2DおよびEに描か上向きにカメラとLED照明リングを使用して、スタンプの正方形の基準マークを視覚化し、タイムスタンプの平均値X、Yを決定するために、カメラのソフトウェアで10回、それらを識別し、および角度は、中心からオフセットロボット工具軸。 (自動プロセス)
  6. のように、 注:内部計算が正確に整列させるロボットシステムのソフトウェアによって実行されるスタンプの及び将来のR-μCPステップでカバースリップのX、Yの中心位置および角度オフセット。
  7. 図2Fに示されるように3.8)アルカンチオールATRP開始、ω-カプトブロモイソブチレート(エタノール中の2mM)の浴にスタンプを置きます。 (自動プロセス)
  8. アルカンチオール溶液からスタンプを削除し、 図2Gのように、エタノールを蒸発させるために0.48バール(5 PSI)に加圧し窒素流の上に置きます。 1分後、窒素気流の圧力が均一な乾燥を確実にするために1.03バール(15 PSI)にある増加。 (自動化されたプロセス)
    注:不完全な乾燥は、パターン忠実度の全部または一部が失われます。
  9. 乾燥させた後、金被覆スライドの計算された中心位置の上にスタンプを移動し、 図2Hに示すようにZ軸モータ力を監視しながら、100μmの増分でそれを下げる。
    注:これは、Z軸モータによって経験ロボットガイダンスソフトウェアに表示されてトルクとして伝達される。 (自動プロセス)
  10. 79.2キロパスカルの所定の圧力が達成された後、スタンプを下げ停止し、15秒間、金でコーティングされたスライドとの接触を維持する。 (自動プロセス)
    NOTE:ここで、圧力値は、現在のスタンプの設計及び機能の高さのために最適化される。スタンプの設計は、試行錯誤プロセスによってこれらの相応特に高アスペクト比のスタンプ、チューニングのために、変更された場合。
  11. ゆっくりと金コートスライドからスタンプを削除し、バックスタンプネスティングフィクスチャ内のスタンプを置く。 (自動プロセス)
  12. 4.マイクロパターンカバースライド上PEGMEMAのSI-ATRP

    1. マイクロパターンcoverslideを保持する真空圧力を解放し、50ミリリットルのシュレンクフラスコに移す。シール及び脱気シュレンクは、真空ポンプを用いてフラスコ。
    2. 追加のマクロモノマーPEGMEMA(208.75ミリモル)、水(34.4ミリリットル)、メタノール(43.8ミリリットル)、銅(II)ブロミド(1ミリモル)、及び2 '、2ビピリジン(3ミリモル)を含むATRP反応混合物5.5mlのシュレンクフラスコ。
    3. 反応を開始するために、水中でL-アスコルビン酸ナトリウム(454.3ミリモル)0.5 mlを加え、それが不活性ガス下、RTで16時間続けることができる。
      注: 図3A-Bに示すようにL-アスコルビン酸ナトリウムの添加に続いて、反応の色が暗褐色に光が緑色からシフトする。
      注:反応は16時間を超えて継続することができますが、それはかなりのPEGブラシの長さを増加させることはありません。

    SI-ATRPの開始図3(A)反応およびL-アスコルビン酸ナトリウムを添加した後、(B)以降の色の変化の開始。 SI-ATRP手順に従ってマイクロパターンcoverslide表面の(C)の顕微鏡画像。スケールバー1ミリメートル。

    1. シェンクフラスコからマイクロパターンcoverslideを取り外して、穏やかな窒素気流下エタノール、水、エタノール、乾燥ですすいでください。
      NOTE:SI-ATRPに続いて、表面改質は、目に見えるべきであり、 図3Cのように、顕微鏡下で画像化し、分析することができる。
      注:これは、それが基質を免疫染色する必要がなくなるように裁判の精度をテストするための最も簡単な方法です。

    マイクロパターンPEGMEMA鎖の5アジド官能基化

    1. 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。
    2. N 6 mlを加え反応バイアルを100 mMのアジ化ナトリウムを含有するN-ジメチルホルムアミド(DMF)。 24時間37℃で、この反応を維持する。
      注:唯一の化学ヒュームフード内でDMFを処理します。アジ化ナトリウムを秤量する場合は注意が必要です。
    3. 完了後、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを除去し、窒素気流下エタノールを水と乾燥をすすぐ。

    臭素官能化PEGMEMA鎖の6パッシベーション

    1. 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中の微細化coverslideを置きます。
    2. 100mMのエタノールアミンと反応バイアルに300mMのトリエチルアミンを含有するジメチルスルホキシド(DMSO)を6mlを加える。 24時間40℃で、この反応を開催しています。
      注:唯一の化学ドラフト内で、DMSO、エタノールアミン、トリエチルアミンを処理します。
    3. 完了するとマイクロパターンcoverslを削除反応バイアルからのIDEは、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。

    内環の7、R-μCPとPEGMEMAのSI-ATRP

    1. 3.12300μmのIDと小さな特徴を持つ年輪が以前にマイクロパターン年輪の内側に配置されるように年輪を突出600μmの外径とPDMSスタンプに置き換えて、 - 以前のステップ3.2および3.6で説明したように、R-μCPステップを実行する。
      注:このスタンプ用の圧力閾値が132.0キロパスカルである。前述のように、これらの圧力設定は、この実験で使用されているタイムスタンプ機能のために最適化される。
    2. 4.4 - 以前のステップ4.1で説明したように、SI-ATRPステップを実行。

    マイクロパターンPEGMEMAチェーン8.アセチレン官能基化

    1. 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。
    2. 100 mMのDMSOを含有する6mlのを追加します。反応バイアルにプロパルギルアミン。 24時間室温でこの反応を維持する。
      注:唯一の化学ヒュームフード内でDMSOおよびプロパルギルアミンを処理します。
    3. 完了時に反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを削除し、窒素気流下、エタノール水とドライで洗い流して。

    9.銅触媒」をクリックして "アセチレンのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端

    1. 20ミリリットルのガラス製反応バイアル中でマイクロパターンcoverslideを置きます。
    2. 硫酸銅(15ミリモル)/トリス[(1-ベンジル1 H -1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン(TBTA、30ミリモル)を6ml(1を加える:1(v / v)の水反応バイアルを562μMアジドPEG 4 -Biotinコンジュゲートを含む/ DMF)。反応を初期化するために混合物に、水中のL-アスコルビン酸(0.15ミリモル)1.2 mlを加え。
    3. 10秒間反応液を通してバブル窒素を、パラフィルムでバイアルを密封し、RTで24時間反応させる。
    4. completio時にnは、反応バイアルからマイクロパターンcoverslideを取り除くには、水ですすぎ、12ウェルポリスチレン皿に入れてください。

    ビオチン化アセチレン基の10。免疫蛍光検出

    1. ブロックは、RTで1時間DPBS(10%ロバ血清)でcoverslideを微細化。 RTで2時間DBPSでストレプトアビジン546コンジュゲート(2μg/ ml)を(PBS中3%ロバ血清)とビオチン化アセチレン基用ステイン。
    2. 穏やかに攪拌しながら10分間DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回すすいでください。
      注: 図4Bは、このステップが完了した後、スライドの画像を示している。

    11.銅を含まない」をクリックして "アジのビオチン化はPEGMEMAチェーンを終端

    注:必要に応じて、この基板改質工程は、細胞培養中にその場で行うことができる。

    1. 12ウェルPにマイクロパターンcoverslideを残すDBPS以下olystyrene皿リンス。
    2. 20μMのDBCO-PEG 4 -Biotinを含むDBPS(または細胞培養培地)の2ミリリットルを追加し、この反応は室温で24時間継続することができ(またはインキュベータ内で37℃)。
    3. 完了後、DPBSでマイクロパターンcoverslideを5回リンス(または単にメディア変更を実行する)。

    ビオチン化アジド基の12免疫蛍光検出

    1. RTで2時間2ミリリットルのDPBS中ストレプトアビジン488コンジュゲート(2μg/ ml)を(3%ロバ血清)とビオチン化アジド基用ステイン。
    2. 穏やかに攪拌しながら10分間マイクロパターンcoverslideのDPBS中5回すすいでください。
    3. 画像は、共焦点蛍光顕微鏡を用いてcoverslideマイクロパターン。この工程が完了した後の図4A-Cは 、スライドの画像を示している。
      NOTE:組織培養アッセイのための基質を使用する場合、セクション10と、このプロトコルの12をスキップ。希望degre後に官能化のeは、窒素気流下、100%エタノール及び乾燥両面を洗浄することによって操作coverslideを滅菌する。無菌の生物学的安全キャビネットにスライドを移し、細胞播種と文化を進める前に、PBSで5回のスライドをすすぎます。

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Representative Results

「クリック」化学反応で官能化された直交PEGグラフト化ブラシのアレイと培養基質を設計するための手動アライメントμCP技術の使用は、以前の研究6で実証されている。しかし、これは、パターンの向きの最小の制御を提供し、多くの場合、官能化された領域の重複が生じる。ここでは、小説のR-μCPシステムは、この制限を克服するために使用され、その能力を正確にパターンを300μmIDと600μmのODが600μmの有するPEGブラシ年輪の別々のアレイ内に末端アルキン基を提示するとともに、PEGブラシ年輪の配列末端アジド基を提示するIDと900μmのODは14を示している。 PEGはアジドPEG 3 -BiotinとブラシとPEGを提示アジの反応はDBCO-PEG 4 -Biotinとブラシ提示アルキンの反応に続いて、基板は、蛍光プローブを用いて免疫染色し、共焦点顕微鏡(Fを使用して画像化したigure 4)。 2つのPEGブラシアレイは、サブ10ミクロンの精度で整列させたことを計算されたカスタムMATLABプログラムを使用して、これらの画像の解析、 すなわち、X〜6.4μmで、Y〜1.7ミクロン、θ〜メーカーの引用された限界にある0.02°、私たちのスカラモデル( すなわち 、〜10ミクロン)とR-μCPシステムの事前の性能14の指標の。従って、我々は、このシステム内のハイエンドSCARAsの使用がさらに低く、サブミクロンの解像度を提供すると考えている。これらの結果は、R-μCPシステムを併用すると、連続的な求核置換反応によって有効多目的基板エンジニアリング能力を実証する。直交する表面化学の蛍光標識によって証明最小の交差反応性は、組織工学用途のための複雑な培養基質を生成するための生化学的手がかりを正確に固定化するための本システムの可能性を説明するためのものである。</ pの>

図2
図2. R-μCPプロセスの概略。上向きカメラでPDMSスタンプの基準マークを視覚化- (A)が下方(B)金コートcoverslide上の基準マークをエッチングすること、(C)(E D)は 、スタンプのネスト固定具からPDMSスタンプを除去し、固定化した金被覆スライドを可視カメラが直面、アルカンチオールイニシエータ浴にPDMSスタンプを配置する(F)は、(G)乾燥窒素ストリーム上で溶媒イニシエータアルカンチオールと金被覆coverslideオン(H)スタンピングアルカンチオール被覆したPDMSスタンプ。

図4
マイクロパターンスライドの図4.免疫染色画像。 (A)、アジド及び(B)のアルキン基を提示するように官能銅フリーと銅媒介クリックケミストリーを用いてビオチン化し、それぞれストレプトアビジン488と-546で検出した。 (C)両方の蛍光チャンネルのオーバーレイ。すべてのスケールは500μmでバー。

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Discussion

組織工学のための理想的な基質は、バイオインスパイアードし、それにより、ネイティブの組織内で発見の重要な生理活性リガンドの空間分布を再現することになる。彼らはまた、リガンドの時間的な調整およびそれらが向け組織形態形成および細胞運命の空間的に制限された誘導を可能にするために提示される空間パターンを可能にする動的な特性を有するであろう。このような基板の製造は、基板上の複雑かつ高度に秩序化された向きで、複数の生化学的手がかりの固定化を必要とします。 in vitroでの細胞のニッチのすべての内因性要因をシミュレートすることは無理ですが、ここで説明したR-μCPシステムは、空間的な向きのマイクロスケール制御と直交する生理活性化学の複数の領域の固定化を可能にします。

PEGブラシアレイが固定化リガンドと結合したままこ​​とを考慮すると、これらの基板の有用性をさらに増大させる生体特異的相互作用を誘発することができる、未結合PEGブラシは、タンパク質吸着に耐性のままであり、したがって、細胞接着および移動を制御するために役立つことができる。細胞外マトリックス(ECM)タンパク質またはポリマー-PEGコンジュゲートの受動的吸着マイクロパターンは、細胞接着および移動を制御するための簡単な方法であるが、吸着は可逆過程11であるため、これらの技術は、過渡制御を提供する。また、分子がそれによって生体特異的相互作用の忠実度と制御を制限する予測不可能な向きに、ランダムな濃度で表面に吸着。また、典型的には、ウシ血清アルブミンまたはプルロニックF127などの非ファウリング領域を作成するために使用される化合物は、 その場で変更ポスト吸着を制限するさらなる官能化のために指定された反応性部位を有していない。アルカンチオールのSAMは、追加の表面改質のためのこのような反応性基を生成することができるが、それらはあまりにも組織培養コンディットに限られた耐久性を持っている移植されたPEGによってもたらされる酸化的シールドの欠如に起因するイオンは10,11ブラシ 。逆に、PEG-ブラシ移植とシーケンシャル求核置換反応による当社のR-μCPプラットフォームの合併は、バイオ直交官能基を有する先験的またはその場での修正することができ、耐久性、マイクロスケール細胞非親和性領域と基板を設計する機能を提供します。これは、in vitro組織形態や成長調節することができる生体特異的相互作用のより大きな制御を可能にします。

シーケンシャルマイクロコンタクト印刷物を整列させるための他のシステムに比べて、R-μCPの強みは依然として高いアライメント精度12,13を維持しながら繰り返さスタンピング間のシステムから基板を除去する能力である。これは、その後、イムの濃度を適用することができ、表面の化学的性質の種類に大きな多様性を可能にし、表面改質反応の持続時間は、調整するために変えることができるリガンド6を動員した。したがって、R-μCPは生体特異的相互作用14を媒介生化学的手がかりに焦点濃度勾配を確立することができる。正確に位置と生体特異的相互作用の程度の両方を制御する能力と、R-μCPシステムは、組織形態形成中の生物活性リガンドの役割を調査するためのユニークな方法を提供し、生物学的な手がかりのプレゼンテーションをシミュレー培養基質を生成するための堅牢なシステムを確立するin vivoでのニッチ。

細胞のニッチの重要な側面は、具体的に開発中で、ファクター18シグナル伝達の時空間変調である。可溶性生化学的手がかりを時間的に定義された方法で培養培地に添加することができるが、細胞がこれらの合図が発生したその上に空間的制御が制限される。ここで説明するR-μCPシステムでは、それは末端のfunctionalizにマイクロパターン培養基材を構成することができる培養中の細胞の運命に影響を与えない、アジド官能基を提示するPEGブラシを編アジド基が、アルキン提示分子との銅触媒による「クリック」反応を受けることができるが、これは銅の毒性与えられた培養中の細胞の存在下で行うことができない。しかし、dibenzocyclooctyne(DBCO)のような高ひずみ分子が高度に選択的かつ生体適合性の銅フリーのアジド-アルキン付加環化反応19,20を受ける。 DBCO含有リンカーの共役を通して、マイクロパターン培養基板は、新たな生物学的なリガンド21、その場で修正することができます。細胞親和性細胞非親和性領域をレンダリングまたは多段階のシグナリング手順において使用するための異なる生化学的手がかりを追加することで、この方法で生成された培養基質は、新規な適応能力を有し、従って、インビトロでの組織形態形成を指示するための、より堅牢なシステムを提供する。

巨大な鍋にもかかわらずentialおよびR-μCPプラットフォームの有用性は、いくつかの欠点を持っている。 PEGグラフト化基材を生成するための多数のSI-ATRP工程の使用が大幅にインクジェット印刷またはECMタンパク質の微小液滴の堆積を含む方法に比べて製造時間を増加させる。インクジェット印刷技術の精度は、現在のR-μCPシステムに匹敵する一方で、ECMタンパク質の吸着は、それにより細胞 - タンパク質相互作用の少ない制御を提供する可逆的である。また、インクジェット印刷技術により生成された基材は、それによって空間的にその場で基体の変更22 制限例えば、許容多様な基質修飾の化学的性質、の使用を妨げ、製造中に除去することができない。 R-μCPシステムは非常にベットがあるのに対し、これらの制限に起因するインクジェット技術は、培養短時間主に関する基質、生体分子の静的な配置および細胞型23の急速な生成のために適しているrは、長期的、多様な生物学的リガンドと2Dの両方の空間的および時間的な細胞相互作用を超える動的制御を示すように設計された多面的な基質を生成するのにも最適。

マイクロコンタクト印刷は、大きな表面積にわたってナノツーマイクロ「インク」の機能の急速な堆積を可能にするが、常に堆積「インク」物質の濃度の有意な不均一性があった。これは、 図4で観察することができるようにも、R-μCPプラットフォームの現在の制限です。私たちは、PEGの蛍光変形例における不均一性が全体PDMSスタンプ上の不均一な垂直力のロボットのアプリケーションに起因しているブラシと仮定、そのまた、完全に平坦ではない可能性があります。これにより、アルカンチオール開始剤の不均一な蒸着及びグラフト化PEGブラシのその後の厚さを引き起こし、スタンプと基板のすべての領域の間の不均一な接触圧力をもたらす。でアルカンチオールの偶数堆積し、それにより表面官能基とPEGグラフト化基板を製造するためには、スタンピングツールの設計は、全体PDMSスタンプ上に分散し、均一な垂直力を適用するように最適化される必要がある。これは、スタンプの不完全性のインターフェイス全体の独立した全体の金コートしたスライドとの均一な接触を容易にするであろう。また、 図4Bに、一方は、アジド末端PEGブラシ上のアセチレン基の若干の交差汚染を観察することができる。交差汚染に起因する固定化リガンドの表面密度は、意図されたPEG-ブラシ上のものと比較して最小であるときに予め6実証されるように、これは(セクション6を参照)をエタノールパッシベーション反応の持続時間を増加させることによりほぼゼロにすることができる。

ここで説明するR-μCPシステムの主な用途は、空間的および時間的制御oをを発揮するために使用することができる複雑な組織培養基板を製造するためのものであるfの細胞の運命。しかし、R-μCPプラットフォームの高い精度と正確さは、他の用途のための魅力的な方法となる。以前に不活性、細胞非親和性の領域のその場での修正続く差動リガンドの化学的性質を有するパターン細胞親和性の領域への能力は、それらの空間的な向きを厳しく制御して複数の細胞株の共培養が可能になります。微細化の固有の高スループットの性質と相まってこれは、単一細胞および多細胞の組み合わせ24の両方のハイスループットスクリーニングのための現在の方法に対する代替を提案する。 R-μCPシステムは、生物学の分野に大きな可能性を有するが、それはまた、微小電気機械システム(MEMS)の分野に適用することができる。 MEMSの製造では、大量生産のための高精度かつ正確にMEMSコンポーネントを転送することが望ましい。新規運動スタンピング技術では、ここで説明するR-μCPシステムが効果的にcomponeを印刷するように適合させることができるMEMS 25を生成する際に使用するためのシリコンウェーハ上にシリコンまたは窒化ガリウムのNTS。したがって、R-μCPプラットフォームは、潜在的な広範囲の用途に使用することができる。

結論として、連続的な求核置換反応を用いて直交官能化PEGグラフト化培養基材を生成するためにR-μCPシステムの使用は、潜在的にインビトロでの組織形態および増殖を制御するための理想的なプラットフォームだけでなく提示するが、複数の役割を調査するための優れたシステム細胞の運命上の生理活性リガンド。明確かつ高度に秩序化されたパターンのパターンの複数の生化学的合図する能力は、ミクロンスケールで組織複数の細胞型、組織構造の形成を指示することが可能な培養基材を構築するための基礎を確立する。これは、in situでマイクロパターン基板を変更する機能と相まって、組織形態形成及びCELの比類のない制御を可能にすることができ培養液中のL運命。ここで説明するパターン化技術は、一日のin vitroでの器官の組織構造の合理的かつ再現可能な生産を容易にすることができる培養基板を製造するための汎用性の高いシステムを提供する。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
SCARA  Epson LS3-401ST Higher end models with increased precision are available if desired. 
(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane Gelest SIT8174.0 CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesive Co NC9020938 Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.
24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides Fisher Scientific 48393106 These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.
CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator Telemark SEC-600-RAP Requries specialized training.
EPSON LS3 SCARA EPSON LS3-401ST
ω-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate Prochimia FT 015-m11-0.2 Store at -20 °C. Other ATRP initiators may be used as this R-μCP platform is applicable to all micropatterning modalities. 
Schlenk Tube Flask 50 ml Synthware 60003-078 Requires rubber stoppers with diaphram.
Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate Sigma Aldrich 447943 Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.
Methanol (Certified ACS) Fisher Scientific A412-4 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Copper(II) Bromide Sigma Aldrich 437867 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
2,2'-Bipyridine Sigma Aldrich D216305 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Sodium L-Ascorbate Sigma Aldrich A4034
20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials Fisher Scientific 03-340-4E
Sodium Azide Sigma Aldrich S2002 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
N,N-dimethyformamide Sigma Aldrich 227056 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Ethanolamine Sigma Aldrich 398136 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Triethylamine Sigma Aldrich T0886 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Dimethylsulfoxide Sigma Aldrich 276855 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Propargylamine Sigma Aldrich P50900 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
200 Proof Ethanol University of Wisconsin Material Distribution Services 2292 CAUTION, only handle in chemical fume hood.
Azide-PEG3-Biotin ClickChemistryTools AZ104-100 Solubilized in DMF
Copper(II) Sulfate Sigma Aldrich C1297 CAUTION, limit exposure with surgical mask.
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) Sigma Aldrich 678937
L-Ascorbic Acid Sigma Aldrich A7506
Phosphate Buffer Saline Invitrogen 14190144
Donkey Serum Sigma Aldrich D9663 Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.
12-Well Polystyrene Plate Thermo Scientifit - NUNC 07-200-81 Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.
DBCO-PEG4-Biotin Clickchemistytools A105P4-10 Solubilized in DMF
Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate Life Technologies S-11223 Solubilized in PBS
Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies S-11225 Solubilized in PBS
Nikon A1-R Confocal Microscope Nikon Nikon Eclipse Ti, A1R An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.

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