La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

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Immunology and Infection

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Tabatabaei Shafiei, M., Carvajal Gonczi, C. M., Rahman, M. S., East, A., François, J., Darlington, P. J. Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining. J. Vis. Exp. (94), e52199, doi:10.3791/52199 (2014).

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Abstract

Introduction

Ácido periódico de Schiff (PAS) tinción es una técnica inmunohistoquímica que se utiliza ampliamente en la investigación y diagnóstico muscular. También se utiliza como una herramienta de diagnóstico en muestras de sangre. La técnica funciona mediante la aplicación de una solución de ácido periódico a la muestra, que se oxida unidades dentro de los polisacáridos crear grupos aldehído que reaccionan con el reactivo de Schiff la incoloro produciendo de este modo un producto magenta profundo. Los pasos de este procedimiento se muestran en la Figura 1. La mancha resulta nada con polisacáridos magenta, incluyendo glucógeno, glicoproteínas, glicolípidos, mucinas, u otras moléculas con restos de polisacáridos.

Tinción PAS se utiliza a menudo para medir los niveles de glucógeno en las fibras musculares. Secciones de tejido músculos son ideales para la técnica, ya que se adhieren firmemente a la diapositiva y soportan múltiples etapas de lavado y tinción. El glucógeno es más presente en las fibras musculares de contracción rápida de tipo II, que tienen una gran demandapara la producción de ATP rápido que requiere de glucógeno para el máximo rendimiento de 1,2. El glucógeno es un polímero ramificado de glucosa que se puede dividir en glucosa libre a través de la acción de las enzimas de la glucógeno fosforilasa. En tiempos de descanso y nutricional-suficiencia, el glucógeno se repone a través del proceso de glucogénesis, mientras que en los momentos de alta energía o la insuficiencia de la demanda nutricional; se descompone el glucógeno en glucosa por la glucogenólisis. Ya desde la década de 1950 los científicos clínicos han explorado tinción PAS en muestras de sangre para analizar el contenido de glucógeno en diversas enfermedades 7.3. Por ejemplo, en la enfermedad de Pompe, un almacenamiento de glucógeno de buena fe células blancas de la sangre disease- se acumulan grandes cantidades de glucógeno que difiere significativamente de los controles sanos 8.

Este artículo de vídeo demuestra una versión adaptada de la tinción de PAS para su uso en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre venosa de los sujetos humanos sanos. PBMCs contienen en su mayoría linfocitos de los linfocitos T y las familias de linfocitos B, así como otras células inmunes, tales como células asesinas naturales y monocitos. La primera etapa de purificación elimina los eritrocitos, neutrófilos, granulocitos y otros. Esta técnica proporciona datos sobre una proporción concentrada de linfocitos que permiten para la enumeración más robusta de células PAS positivos en comparación con el uso de enteros frotis de sangre.

Figura 1
Figura 1:. Paso a paso metodología de la tinción PAS en PBMC (A) En primer lugar, el aislamiento de PBMC se logra mediante gradiente de Ficoll, el panel izquierdo muestra la preparación antes de la centrifugación, el panel derecho muestra que después de la centrifugación, donde la capa leucocitaria que contiene la PBMC se observa en el centro del tubo. (B) PBMCs aisladas se fijan sobre el portaobjetos utilizando Solu la adherencia de formalina-etanolción. El portaobjetos se enjuaga suavemente con agua destilada de una botella de lavado de plástico. (C) El portaobjetos se coloca entonces en un vaso de precipitados de 100 ml a mitad de camino lleno de solución amilasa, que se disolverá glucógeno. El portaobjetos se enjuaga suavemente. (D) El portaobjetos se trató con solución de ácido periódico, donde la oxidación de los sacáridos se lleva a cabo. Los portaobjetos se aclararon de forma abundante; se eliminará el exceso de ácido periódico y detener la etapa de oxidación. (E) Cuando se añade el reactivo de Schiff a las diapositivas, es el que reacciona con aldehídos creados durante la etapa de oxidación. Este reactivo incoloro entonces resultar en un producto rojo magenta profundo. Las diapositivas se enjuagan suavemente para eliminar el exceso de reactivo de Schiff.

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Protocol

La investigación con muestras de sangre humana fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 10000618. El trabajo en músculo de ratón fue aprobado por la Universidad Concordia Comité de Ética, número de certificado 2010BERG.

1. Aislamiento de PBMC de sangre entera

NOTA: Esta operación se realizará en un gabinete de bioseguridad mediante una técnica estéril y equipo fabricante esterilizado.

  1. Vierta cuidadosamente 10-15 ml de sangre entera de los tubos (anti-coagulante) de recogida de sangre heparinizados en un tubo cónico estéril de 50 ml. Para derrames sanguíneos menores, limpie con ddH2O y el 70% EtOH utilizando tejido de limpieza.
  2. Diluir la sangre en el tubo cónico a una proporción de 1: 1 con tampón fosfato salino (PBS 1x) pH 7,4. Asegúrese de que el volumen total máximo no exceda de 30 ml.
  3. Mezclar suavemente con una pistola de pipeta serológica evitar burbujas.
    NOTA: No mezclar invirtiendo el tubo para evitar la sangre de unccumulation en la tapa y la posterior filtración durante la centrifugación.
  4. Añadir 13 ml de Ficoll-Paque (ver Materiales y tabla de Equipo), a un nuevo tubo cónico de 50 ml de capacidad. Mantenga el tubo en posición vertical en el bastidor.
  5. Con una pipeta de transferencia, tomar sangre diluida, toque la punta de pipeta de transferencia a la pared interior del tubo cerca de la cima. Con la presión lenta y constante, transferir la sangre a lo largo de la pared interior del tubo que forma una capa de sangre en la parte superior de la capa de sacarosa. Realice este paso varias veces hasta que toda la sangre se ha transferido.
  6. Tapar el tubo herméticamente y se centrifuga el tubo a temperatura ambiente durante 30 min a 700 xg en un rotor de oscilación con el conjunto de aceleración medio a 5, y la deceleración ajustado a cero.
  7. Poco a poco sacar el tubo y sin molestar a las capas, llevarlo de vuelta a la cabina de bioseguridad.
  8. Recoger cuidadosamente la capa leucocitaria (fina capa de color blanco turbio), donde se encuentran las PBMC, colocado entre la PBS / plasma unnd capas Ficoll utilizando una pipeta de transferencia. Evitar recolectar capa sacarosa y no molestar a la capa de glóbulos rojos.
  9. Transferir la capa leucocitaria en un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml. Pueden pasar varias veces de repetición del paso 1.8 para recopilar toda la PBMC.
  10. Añadir PBS pH 7,4 al tubo con la PBMC y rellenar hasta la marca de 45 ml. Agitar el tubo a fondo. No lo hagas vórtice.
  11. Lavar 1: Centrifugar durante 15 min a 480 xg tanto con la máxima aceleración y deceleración configurado a 9. observar la formación de un pellet de PBMC en la parte inferior del tubo cónico.
  12. Desechar el PBS (sobrenadante) en un vaso de precipitados de plástico con 10 ml de lejía.
  13. Afloje sedimento celular suavemente "trasiego" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). No lo hagas vórtice.
  14. Añadir 25 ml de PBS pH 7,4 fresco al tubo. Si se está procesando más de un tubo, agrupar los gránulos juntos en este paso.
  15. Lave 2: Centrifugar el tubo durante 12 minutos a 480 xg with tanto la máxima aceleración y desaceleración ajustado a 9.
  16. Deseche la PBS (sobrenadante) en el vaso de plástico con un poco de lejía.
  17. Suavemente "estante" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). No lo hagas vórtice.
  18. Añadir 25 ml de PBS fresco al tubo.
    1. Sacar 50 l de las células y transferir a un tubo de microcentrífuga para el recuento de viabilidad.
    2. Añadir una cantidad igual (50 l) de azul de tripano (una mancha de viabilidad) y pipeta de arriba y abajo para mezclar suavemente.
  19. Saque 10 l y transferirlo a un hemocitómetro para comprobar la viabilidad de las células por ml. Anote el número de células / ml.
  20. Saque la cantidad deseada de células y centrifugar el tubo durante 12 minutos a 480 xg tanto con la máxima aceleración y desaceleración ajustado a 9.
  21. Deseche la PBS (sobrenadante) en el vaso con lejía.
  22. Suavemente "estante" contra una superficie ondulada (es decir, estante vacío). Añadir 80 l de PBS en el tubo.

2. Hacer el Slide PBMC

  1. Ponga 80 l de las células en un portaobjetos de microscopio. Manchar la gota con la ayuda de otra diapositiva o colocar 2 gotas de 40 l cada uno en ambos extremos de la corredera.
  2. Deja diapositiva en la cabina de seguridad biológica para secar. Etiqueta de la diapositiva con un lápiz en el lado esmerilado.

3. La fijación de las muestras en las diapositivas

  1. Preparar la solución de fijación mediante la mezcla de 0,5 ml de formaldehído al 37% de etanol 4.5 ml de 99%.
  2. Después los portaobjetos se secan, se llevará a cabo 2 ml de la solución de fijación recién hecho y se vierte en la diapositiva de manera que toda la superficie de la corredera está cubierto.
  3. Dejar la solución en el portaobjetos durante 1 min. Enjuague el portaobjetos durante 1 minuto con agua del grifo y dejar que se seque al aire.

4. Hacer la Solución amilasa para el Control Negativo

  1. Tome 0,25 g de polvo de amilasa y se disuelven en 50 ml de diagua calmado. Vierta la solución en un vaso de 100 ml limpio.
  2. Sumergir el portaobjetos en el vaso de precipitados de modo que la mitad de la corredera recibe el tratamiento y la otra mitad permanece sin tratamiento y luego se incuba durante 15 min a temperatura ambiente (Figura 1C).
  3. Tome nota de qué lado de la diapositiva está recibiendo el tratamiento amilasa. Dibujar una línea en la parte posterior de la corredera que indica la frontera entre el tratamiento y control.
  4. Se lavan los portas con ddH2O para eliminar la solución de amilasa y dejar el portaobjetos se seque al aire.

5. Realice ácido periódico de Schiff (PAS) de tinción e Imagen

NOTA: Reactivos de PAS son tóxicos por inhalación y son corrosivos, por lo que los pasos deben realizarse en una campana de humos químicos, y los productos de desecho deben eliminarse de acuerdo con las directrices institucionales.

  1. Colocar la placa en una superficie plana y vierta 1,50 a 2,00 ml de solución de ácido periódico sobre la muestra. Incubate durante 5 min a temperatura ambiente.
  2. Enjuague los portaobjetos en varios cargos de agua destilada.
  3. Verter 1,50-2,00 ml de reactivo de Schiff en la diapositiva y se incuba a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Lavar el portaobjetos con agua destilada durante 5 minutos y dejar que se seque al aire.
  5. Aplicar medio de montaje 10 l en el portaobjetos y cubrir con dos pequeñas cubreobjetos, o aplicar 50 l y utilizar una gran cubreobjetos.
  6. Aplicar esmalte de uñas transparente en los bordes del cubreobjetos, dejar secar durante la noche.

6. Obtener imágenes con la Luz Microscopio Binocular Utilizando el objetivo 100X

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Representative Results

Para validar los reactivos y la técnica básica, la tinción de PAS se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante en secciones de músculo sóleo ratón. La tinción se realizó mismo día que el sacrificio y en el último paso de la tinción, las secciones se fijaron por xileno. El músculo sóleo se sabe que contiene ~ 35% de glucógeno-células positivas 9. Las células musculares teñidas muestran dos gránulos puntiformes Características- PAS positivos distintas dentro de la célula, y una línea continua demarcación de la membrana celular (Figura 2A). La presencia de gránulos puntiformes es consistente con las reservas de glucógeno, y se utilizó para definir una célula muscular positivo. Tratamiento de las muestras con la amilasa elimina los gránulos puntiformes lo cual es consistente con ellos siendo glucógeno (Figura 2B).

Figura 2
Figura 2: PAS- secciones de músculo de ratón teñidos fueron analizados con microscopía de luz. secciones musculares ratón sóleo fueron teñidas con PAS. Algunas muestras se pre-tratados con amilasa. (A) partículas de PAS-positivo eran visibles dentro de las células musculares. Se observaron (B) células positivas Menos PAS cuando las secciones musculares fueron pre-tratados con amilasa. La tinción alrededor de la membrana celular se mantuvo después del tratamiento amilasa (barra de escala = 100 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La señal de tinción de membrana se mantuvo incluso después del tratamiento amilasa. Como era de esperar, el porcentaje de células PAS-positivos en la sección muscular no-amilasa fue del 37%, mientras que las secciones musculares amilasa tratados tenían significativamente menos, aproximadamente un 5% de PAS-positivos células (Figura 3).

"> Figura 3
Figura 3: Cuantificación de las células musculares PAS-positivos La proporción de células musculares que fueron positivos PAS se cuenta a partir de una diapositiva representante sin o con la amilasa de pre-tratamiento.. Como era de esperar, el 37% de las células musculares fueron positivos para glucógeno. Tratamiento Amilasa redujo significativamente la señal PAS a 4% (* p <0,001).

A continuación, PAS-tinción se realizó en PBMC a partir de sangre venosa de los sujetos humanos sanos usando una técnica modificada como se describe en la sección de protocolo, y se ilustra en la Figura 1. El PBMC se adhería bien si se llevaron a cabo con cuidado los pasos de lavado. El PBMCs PAS manchado-muestra una variedad de patrones de tinción. Se observaron fácilmente en las células pequeñas (5 micras) con gránulos. También se observó una proporción de células más grandes con un patrón de tinción difusa (Figura 4A, y la inserción A.1-6 (Figura 4B).

Figura 4
Se realizó ácido periódico de Schiff (PAS) tinción en PBMCs humanos (A) tinción PAS-en PBMCs: Figura 4.. Se observaron dos tipos de células. (A.1-6) las células más pequeñas (a 5 micras) en portaobjetos tratados no mostraron partículas de amilasa magenta consistentes con glucógeno. Estas células podrían ser células en reposo. Las células más grandes (más de 5 micras) en las células tratadas no amilasa tenían tinción PAS-positivo difuso. Estas células pueden ser linfocitos activados. (B) PBMCs fueron tratados con amilasa durante 15 min antes de la tinción, lo que disminuye la señal de PAS. Representante de siete sujetos humanos sanos diferentes. (C) El PAS y hematoxytinción lin realiza en la diapositiva de sangre entera. La flecha muestra una PBMC rodeado de muchos eritrocitos (barra de escala = 10 micras). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La proporción que fue PAS positivo fue del 98% para las células más pequeñas y 40% para las células más grandes. Amilasa tratamiento eliminó la señal de PAS en las células pequeñas (p <0,001) y significativamente disminuida la señal de PAS en las células más grandes a 7% (Figura 5).

Figura 5
Figura 5: Cuantificación de PBMCs PAS-positivos La proporción de PBMCs que fueron positivos PAS se cuenta a partir de una diapositiva representante sin o con la amilasa de pre-tratamiento.. 98% de las células de pequeño tamaño fueron positivas para PAS. 40% de las células eran más grandes positive para PAS. Tratamiento amilasa elimina la señal de PAS en las células pequeñas (p <0,001) y significativamente disminuida la señal PAS en las células mayores al 7% (p <0,001).

Para confirmar que PBMCs poseen glucógeno un segundo método, independiente que también proporciona la cuantificación de la cantidad de glucógeno se utilizó 10,11, y se ha publicado previamente en JoVE en otros tipos de células 12. PBMCs se lisaron en tampón hipotónico y el glucógeno se separó como se describe brevemente en la captación de la Figura 6.

Figura 6
Figura 6: Medición de la glucógeno mediante digestión enzimática con enzimas de hidrólisis. El glucógeno se midió de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, el protocolo implica la lisis hipotónica de 1 x 10 6 PBMCs seguido de granulación de material insolubleque contiene glucógeno. El sedimento se lavó y se digirió con las enzimas de hidrólisis rendimiento de glucosa que se midió por espectrofotometría y se compararon con una curva estándar. El lisado celular se diluyó en las proporciones indicadas con tampón de hidrólisis. Los datos son representativos de tres experimentos. Se detectaron niveles significativos de glucógeno en la dilución 1: 1 (p = 0,02), y esta señal se valora como el lisado se diluyó adicionalmente.

El glucógeno insoluble se lavó varias veces, y luego se digirió usando las enzimas de hidrólisis. La cantidad de glucosa producido a partir de la digestión se midió mediante espectrofotometría y se comparó con una curva estándar. Un millón de PBMC tenían 1,19 g de glucógeno. La señal de glucógeno valorada a medida que el lisado celular se diluyó adicionalmente (Figura 6).

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Discussion

Los pasos críticos de este artículo de vídeo fueron durante el lavado y la amilasa tratamiento de las células. Mientras se lava las diapositivas, el paso clave estaba utilizando una botella de lavado squeezable plástico y dejar que el agua corra suavemente a través de la muestra en la diapositiva y no apuntar directamente contra las muestras. Incluso la más mínima presión de agua directa sería hacer que las células para salir de la diapositiva. Otro paso clave fue utilizar la misma diapositiva durante ± condiciones de amilasa. Después de que los PBMCs se adhirieron a la diapositiva, el portaobjetos se coloca cuidadosamente en un vaso de precipitados de modo que sólo la mitad del frotis se expuso a la solución de amilasa. Este paso proporciona un control robusto porque las células de la sangre son de la misma diapositiva, minimizando así las variables de confusión que pueden ocurrir debido a ligeras variaciones de temporización. Las células pegadas bien con ningún tratamiento, por lo que el costo y el tiempo adicional implicado con poli-L-lisina o polietileno glicol de recubrimiento por ejemplo, no se justificaría.

A través de troubleshooting la actividad óptima de la amilasa se determinó. Para las secciones musculares, se observó que se observó la actividad óptima de la amilasa dentro de 1 h de incubación. A veces más largas secciones musculares se tire lentamente la diapositiva, mientras que en menores tiempos de amilasa no eliminar adecuadamente la señal de PAS. El momento para la incubación de la amilasa para diapositivas PBMC tuvo que ser reducido con respecto a la temporización del músculo de la muestra (que era 1 hr) a sólo 15 min. Tiempos más largos causados ​​PBMCs se salga de la diapositiva, mientras que los tiempos más cortos no afectaron de manera efectiva la señal de PAS. Una modificación en el protocolo estándar de tinción PAS estaba cambiando el método de lavado de las diapositivas. Las instrucciones del fabricante indicadas para este lavado con agua corriente del grifo, lo que provocó que las células se desprenden las diapositivas. La modificación fue para lavar los portaobjetos con la botella de lavado comprimible para preservar las células. Como se describe en la sección pasos críticos, que era muy importante no aplicar directamente aguapresión sobre las células.

Hay algunas limitaciones en esta técnica. La membrana de la célula muscular se tiñó junto con gránulos puntiformes en el citoplasma de la célula muscular. Los gránulos fueron eliminados por tratamiento de amilasa y por lo tanto probable que sea glucógeno, mientras que la tinción de la membrana era insensible a la amilasa. La identidad de las partículas de PAS-positivo en la membrana celular no se conoce. Podría ser la membrana basal del músculo (perimisio). Esta membrana rodea los fascículos musculares y debido a su alto contenido de glicoproteína que es conocido por ser PAS positiva. Otra limitación de la tinción de PAS es que los gránulos de glucógeno deben tener al menos 50 nm de diámetro para ser visible por microscopía de luz convencional. Por lo tanto, los gránulos de glucógeno más pequeños podrían estar presentes en una célula, pero todavía regístrese negativo en una prueba de PAS. El segundo método utilizado supera esta limitación proporcionando detección de glucógeno en un lisado. En combinación con una curva estándar de este se puede utilizar para détérmine la cantidad exacta de glucógeno. Aunque esta técnica es altamente cuantificable y no está limitado por el tamaño de los gránulos, no en sí tienen ciertas limitaciones. Gránulos de glucógeno son estructuras ramificadas complejas con muchas proteínas accesorias y reticulaciones químicas, por lo que es poco probable que las enzimas de hidrólisis se disuelven completamente una molécula de glucógeno entera 13. Así, el enzimática de detección (como la técnica de PAS) puede representar menores de la cantidad real de glucógeno en una muestra. Una forma de manejar esta limitación es con microscopía electrónica que resuelve incluso los gránulos de glucógeno más pequeños 14. Uno tendría que emplear una combinación de estas técnicas, PAS-tinción, digestión enzimática, y microscopía electrónica para la caracterización más completa de glucógeno.

Este artículo y video demuestra la técnica de tinción ácido periódico de Schiff (PAS) adaptado para el uso en PBMCs. La importancia de este estudio se ve en la opción de usarPBMCs más de frotis de sangre, lo que hizo más factible para enumerar los linfocitos. Inicialmente, una técnica de frotis de sangre clásico fue probado, sin embargo, la mayoría de las células en el portaobjetos fuera células rojas de la sangre y, posiblemente, los neutrófilos (Figura 4C). Para concentrar los linfocitos, PBMCs fueron purificados a partir de sangre utilizando la técnica de gradiente de densidad estándar. Usando una técnica similar a un frotis de sangre, la PBMCs adhiere fácilmente durante la duración del procedimiento de PAS, que tiene muchas etapas de lavado vigorosos. La técnica de PAS se ha utilizado durante décadas para determinar los niveles de glucógeno en las biopsias de tejido muscular, que se cortan en secciones delgadas y se adhirieron a las diapositivas. Tinción PAS fue elegido sobre otros productos químicos de tinción de hidratos de carbono debido a su alta fiabilidad y la presencia de los resultados esperados en la literatura. Un ratón (Mus spretus) secciones musculares se utilizó como control positivo y encontraron, como se esperaba, que el 37% de las células eran positivas PAS-9. En términos de costo y tiempo, preparar PBMC es más onerosa que una prueba de sangre, pero hay varias ventajas. En primer lugar, la preparación es más enriquecido en linfocitos, que son las células de interés para los proyectos que se centran en la autoinmunidad. Si se utilizaron frotis de sangre, los linfocitos serían la minoría, por lo que es difícil de encontrar la célula de interés. Habría que preparar y analizar mucho más diapositivas para obtener los mismos números se podrían obtener con algunas diapositivas PBMC. Los investigadores estarían muy interesados ​​en el uso de nuestra nueva técnica óptima en proyectos de autoinmunidad relacionados con la diabetes 1, esclerosis múltiple, lupus, artritis reumatoide, etc. Escriba donde linfocitos T y B y células NK juegan un papel. Por supuesto, para otras aplicaciones en los eritrocitos o neutrófilos son de interés sería recomendable el frotis de sangre. La otra ventaja es que PBMCs se pueden utilizar para el estudio de la biología de linfocitos humanos in vitro.

Una investigación en curso está investigando la fuente de glucógeno en PBMCs. YOn el futuro, está previsto para medir el contenido de glucógeno en el contexto de la esclerosis múltiple, una enfermedad autoinmune T mediada por linfocitos que afecta a unos 2,3 millones de personas en todo el mundo a partir de 2013 15,16. ¿Qué son las células pequeñas y grandes en las muestras de PBMC? Las células en 5 micras son consistentes con el linaje linfoide en su estado de reposo. Linfocitos T, linfocitos B, células asesinas naturales, y otros subconjuntos menores están dentro de este rango de tamaño. Las PBMCs más grandes son probablemente compuestos por linfocitos activados, que crecen más grande a medida que reciben señales inflamatorias del sistema inmune, y los monocitos de linaje mieloide. Se requieren técnicas de clasificación de células avanzadas como fluorescente clasificación de células activadas o clasificación de células magnético activado para perfeccionar el subconjunto que expresa glucógeno.

Se utilizó la tinción de hematoxilina cuando el contador de tinción se realizó en sangre entera. Esto nos ha permitido distinguir los monocitos de los eritrocitos (Figura 4C). Cuando la tinción se realizó en PBMCs, ya que todas las células fueron mononucleares, no hubo necesidad de contrarrestar mancha con hematoxilina para identificar las células. También hematoxilina estaba interfiriendo con la señal de PAS en las células. En resumen, hemos demostrado un procedimiento PAS-tinción adaptado para CMSP. Esta técnica es útil para los científicos y los clínicos que investigan la autoinmunidad, infecciones y alergias.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Periodic Acid Shiff Kit Sigma-Aldrich 395B Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution.
α-Amylase from porcine pancreas Sigma-Aldrich A3176
Binocular Microscope Carl Zeiss Microscopy Axio Lab A0
Glycogen Assay Kit Sigma-Aldrich MAK016
Ficoll-Paque PLUS VWR, GE Healthcare 17-1440-02 Nonionic synthetic polymer of sucrose.
Centrifuge For PBMC isolation, swing buckets were used.

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References

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