Imaging intravitale di assonale Interazioni con Microglia e macrofagi in un mouse Dorsale colonna Crush Injury

Neuroscience
 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital Imaging of Axonal Interactions with Microglia and Macrophages in a Mouse Dorsal Column Crush Injury. J. Vis. Exp. (93), e52228, doi:10.3791/52228 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

La reazione infiammatoria alla malattia o lesioni del sistema nervoso centrale (CNS) è scarsamente compreso, soprattutto per quanto riguarda le interazioni tra cellule immunitarie e residenti nel tessuto. Ricerche di queste interazioni cellulari nel midollo spinale sono di particolare interesse per l'animale vivente. Il tratto sostanza bianca solo facilmente accessibile SNC è nelle colonne dorsali del midollo spinale, rendendo questo un settore importante su cui concentrare gli sforzi sul miglioramento approccio sperimentale fattibile. Queste indagini sono state limitate a causa della difficoltà tecnica di accesso e stabilizzare il CNS per l'imaging. L'imaging dal vivo nel midollo spinale è stato descritto il movimento cellulare precedentemente 1-13, però, pochi studi hanno affrontato in una lesione del midollo spinale al di là di un paio d'ore dopo l'insulto iniziale. La lesione del midollo spinale traumatica è un ambiente complesso, con i neuroni, astrociti, fibroblasti, cellule progenitrici NG2, e cellule immunitarie Including microglia, neutrofili, macrofagi, cellule T, le cellule B e le cellule dendritiche 14,15. I macrofagi sono il sottoinsieme di cellule immunitarie responsabili fagocitosi nella lesione, infiltrazione dalla circolazione. Il ruolo di queste cellule fagocitiche è stato dibattuto, con rapporti che indicano che queste cellule possono assumere entrambi i ruoli dannosi e di protezione del tessuto danneggiato. Questi ruoli vanno dalla crescente moria assonale secondaria dopo un infortunio e di agire in modo fagocitaria 16-22, ad assumere una ferita guarigione fenotipo e diminuendo deficit funzionali in animali feriti 21,23,24.

In precedenza, i tentativi di distinguere macrofagi dalla microglia hanno fatto affidamento soprattutto sulla morfologia in tessuto sano. Tuttavia, microglia e macrofagi attivati ​​esprimono molti degli stessi marcatori e visualizzano morfologia indistinguibili dopo la lesione 25-29, rendendo la separazione delle diverse attività di queste cellule difficili da studiare based a soli 30 questi fattori. Queste cellule possono essere separati mediante espressione differenziale di CD45 usando citometria a flusso 33,34, anche se questo approccio è meno utile nel discriminare questi tipi di cellule in vivo. Espressione differenziale Utilizzando di CCR2 e CX3CR1 in microglia e macrofagi è stato esplorato, anche se i cambiamenti dinamici nella espressione di questi marcatori come monociti differenziano in macrofagi possono complicare l'analisi accurata 35,36. Microglia sono le cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale e derivano da progenitori sacco vitellino durante lo sviluppo fetale, mentre i macrofagi sono derivati ​​da progenitori del midollo osseo ed entrano nel sistema nervoso centrale feriti dopo un insulto 31,32. Un approccio alternativo all'utilizzo morfologia distinguere questi due tipi di cellule è quello di sostituire il midollo osseo con progenitori da un donatore che esprime un marcatore rintracciabile nei macrofagi derivati ​​da progenitori donatori, preservando il residente CNS, recipiente-derivati ​​microglia. Questi modelli chimerici midollo osseo sono comunemente utilizzati in molte altre applicazioni 37-40. Questo metodo ha avvertimenti unici associati con danni alla integrità della barriera ematoencefalica causata da irradiazione o farmaci citotossici utilizzati per l'eradicazione progenitori midollari nell'ospite, limitando così il suo impiego in alcune applicazioni. Recentemente, le distinzioni funzionali tra microglia e macrofagi nel sistema nervoso centrale stanno cominciando a discernere mediante citometria a flusso, analisi serie gene chip e metodi chimerismo 24,26,41-44, che si dimostrerà molto utile in futuro. Anche se la separazione di questi due tipi di cellule rimane difficile, comprendere le loro funzioni uniche è importante nel condurre a trattamenti più mirati di disturbi che coinvolgono sia microglia e macrofagi all'interno del sistema nervoso centrale.

Descrizione di interazioni cellulari all'interno della lesione del midollo spinale è venuto soprattutto da studi che coinvolgono modelli di coltura cellulare. Questo è due alle sfide coinvolti con immagini sia la lesione del midollo spinale e le cellule immunitarie insieme in un animale vivo. Modelli di roditori attuali di lesioni del midollo spinale di varia tipologia e la gravità includono modelli contusione 45,46, lesioni pin-prick 2, lacerazione 47, e la dorsale lesioni della colonna schiacciamento qui 16,18,48 descritto. L'infiammazione delle meningi aumenta con la gravità del danno e pone sfide uniche per l'impianto di finestre o interventi chirurgici per l'imaging di serie. Alcune di queste sfide includono l'infiltrazione di cellule fagocitiche nonché la generazione di tessuto fibroso sul sito chirurgico. Alcuni di questi problemi possono essere superati con la creazione di lesioni più piccole e che copre il midollo spinale esposta con medicazione chirurgica non-immunogenico tra la dura e muscoli paraspinali per consentire la successiva chirurgia riapertura, come avviene qui a studiare la dorsale della colonna lesione da schiacciamento . La capacità di immagine solo la parte dorsale del centrifugaal cavo limita anche la scelta di lesioni, in quanto modelli contusione provocano soprattutto danni al cavo centrale, spesso risparmiando la parte più dorsale delle colonne dorsali, soprattutto in momenti iniziali dopo l'infortunio 45,49. Pertanto, si descrive un modello di lesione semplice che produce un, ripetibile, lesione di forma rettangolare pulito che è utile sia per l'osservazione di movimento cella all'interno della lesione e per una facile quantificazione della posizione assonale rispetto alla lesione.

Protocol

NOTA: Tutti gli animali dovrebbero essere ospitati e utilizzati in conformità con la cura degli animali e l'uso comitato (IACUC) presso l'istituto. Tutte le procedure descritte qui sono approvati dalla Case Western Reserve University IACUC.

1. transgenici animali

  1. Utilizzare disponibili in commercio topi reporter fluorescenti per etichettare assoni (Thy-1 YFP H) 50 e microglia / monociti (CX3CR1 GFP / GFP 51; vedere l'elenco dei materiali). Questi topi devono essere incrociati e mantenuti come singole colonie di riproduzione in base alle politiche di cura degli animali istituzionali.

2. Bone Marrow Chimere

  1. Identificare gli animali che sono almeno 8 settimane di età per l'uso come animali destinatario.
  2. Inserire animali ospiti in una gabbia irraggiamento tiene circolare destinato a trattenere il mouse in grado di assicurare anche, insieme irradiazione.
  3. Situato su un timer di cesio (Cs-137) irradiatore per amministrare un dos radiazioni al corpo interoAll'età di 800-1000 Rads agli animali secondo le istruzioni del produttore (esempi qui riportati sono 980 Rad).
  4. Animali tornare alle loro gabbie a riposare per un minimo di 4 ore.
  5. Scegli animali donatori del genotipo appropriata (vedi Figura 2A) come fonte di cellule progenitrici del midollo.
    NOTA: I donatori adeguati sono animali che esprimono diversi giornalisti specifici lineage fluorescenti dall'host per identificare diverse popolazioni cellulari, o di uno degli stesso genotipo come controlli.
  6. Riempire un piatto di Petri con il 70% di alcol, e un secondo piatto con 10 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media e un filtro 40 micron cella imbevuto nei media. Riempire un tubo da 15 ml con i media RPMI. Tenere i piatti e il tubo sul ghiaccio.
  7. Sacrificare gli animali donatori da CO 2 asfissia secondo le linee guida istituzionali. Pulire la pelle e la pelliccia immergendo l'intero animale con il 70% di etanolo fino a quando tutta la pelliccia è bagnato.
  8. Rimuovere la skdalla metà inferiore di animali tagliando intorno alla parte centrale e tirando la pelle verso il basso sulle zampe posteriori per esporre pienamente i muscoli delle gambe.
  9. Rimuovere la tibia da anterior overextension al ginocchio di dislocare l'osso, poi con pinze e forbici sterili, sbucciare e tagliare muscoli distanza da entrambe le estremità della tibia. Mettere l'osso nella scatola di Petri con alcool fino a 30 sec poi il trasferimento al filtro cella all'interno della capsula di Petri contenente i media.
  10. Dislocare l'anca e staccarsi muscoli aderenti al femore, posto brevemente femore in alcool e poi metterlo nella stessa filtro cella all'interno del piatto.
  11. In una cappa coltura tissutale, utilizzare forbici sterili per tagliare entrambe le estremità delle ossa e inserire un ago calibro 21 su una siringa da 1 ml nell'estremità dell'osso. Lavare il midollo nel conica da 15 ml con i media. Ripetere le procedure per le restanti ossa.
  12. Utilizzando il retro del pistone da una siringa 3 ml, schiacciare ossa termina nella cellafiltro sulla piastra di Petri per estrarre più celle.
  13. Posizionare il filtro in cima ad una provetta conica da 50 ml e trasferire media con cellule aspirati dalla provetta conica da 15 ml. Utilizzare la parte posteriore dello stantuffo per schiacciare il midollo per ottenere una sospensione di cellule singole. Lavare le tubo da 15 ml, frammenti di ossa e il filtro delle cellule con 30 ml di media in una provetta da 50 ml.
  14. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 500 xg a pellet cellule.
  15. Lisare globuli rossi con 2 ml di ammonio-cloruro-Potassio (ACK) Lysis buffer per 2 min. Quench tampone di lisi con 10 ml di supporto contenente siero bovino fetale al 10%. Centrifugare a 500 xg per 5-10 minuti a pellet.
  16. Lavare le cellule una volta in 10 ml di RPMI supporti e due volte in soluzione salina, centrifugazione a 500 xg per 5-10 minuti per sedimentare per ogni lavaggio.
  17. Risospendere le cellule a una concentrazione finale di 3 x 10 6 cellule in 200 microlitri di soluzione salina.
  18. Trasferimento 3 x 10 6 cellule del midollo tramite iniezione coda vena in irrtopi riceventi adiated.
  19. Mettere l'acqua acidificato (pH 3,0) in gabbia destinatario e permettono topi di recuperare.
    NOTA: I topi che falliscono il trapianto di morirà entro 10-14 giorni dopo la procedura.
  20. Dopo 8 settimane, verificare midollo ricostituzione esaminando sangue periferico cellule immunitarie citometria a flusso (Figura 2B-C).

3. Dorsale Colonna Crush Injury

NOTA: Scegliere opportune animali chimera o animali transgenici doppi per la chirurgia sulla base dell'esperimento desiderato. Gli animali con midollo derivate cellule residenti o ossee o etichettati sono stati creati nei passaggi precedenti.

  1. Preparare e autoclave strumenti chirurgici, tra cui rongeurs, Dumont # 4 pinze, forbici, pinze iris per i tessuti che tengono, driver ago e clip ferita.
  2. Preparare i farmaci per amministrare il mouse per il controllo del dolore. Bupernex e Marcaine sono comunemente utilizzati per il controllo del dolore. Usare farmaci appropriati, come richiesto and approvato dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC).
  3. Indurre l'anestesia con il 4% isoflurano e mantenere con 1-2% isoflurano di raggiungere un tasso di respirazione di 60-100 respiri al minuto. Applicare il lubrificante occhio agli occhi dell'animale per prevenire la secchezza in anestesia e confermare la mancanza di risposta a piedi pizzico. Mantenere la temperatura con una piastra elettrica e monitorare la temperatura con una sonda rettale.
  4. Rasatura retro del mouse con un rasoio elettrico sopra il livello del midollo spinale mirata, e poi tamponare la zona tre volte con povidone-iodio seguita da due volte con 70% di alcol. Posizionare l'animale su un telino sterile, e coprire l'animale con un altro telo sterile con un foro tagliato in un luogo appropriato per visualizzare il sito chirurgico. Mantenere tutti gli strumenti teli sterili in tutta la chirurgia.
  5. Tagliare la pelle lungo la linea mediana al livello desiderato con midollo iride forbici per esporre il muscolo sul dorso dell'animale.
  6. Sotto un dissettente microscopio, tagliare i muscoli della schiena, tra cui il trapezio ed i legamenti del gran dorsale lungo la linea mediana dove essi attribuiscono ai processi spinali dorsali, ed esporre la colonna vertebrale.
  7. Rimuovere i muscoli rotatori tra i processi dorsali e trasversali della vertebra per rivelare la lamina della vertebra specifica da rimuovere (T11 in questo caso). Identificare T11 dall'inserimento dell'ultima costola non flottante su questo processo.
  8. Inserire punte del rongeurs nello spazio sopra e sotto processo per essere rimosso e sollevare leggermente per assicurarsi che siano saldamente in posizione intorno alla lamina vertebrale, ma non troppo in profondità per danneggiare la colonna vertebrale. Chiudi rongeurs in un solo movimento per rimuovere la lamina.
  9. Ingrandire la laminectomia, se necessario utilizzando i Rongeurs per rimuovere piccole parti della vertebra rimanente.
  10. Misura 1 mm dalla punta di un # 4 pinze da tenendole contro un righello e la marcatura con un pennarello indelebile. Misura A 1 mm scommessa separazionefra le due denti tenendo la pinza contro il righello e fissare la larghezza massima delle punte e 1 mm facendo scorrere un anello di gomma pinza in posizione sopra l'albero della pinza.
  11. Creare un piccolo foro inserendo un ago da 30 gauge attraverso la dura ai due punti di inserimento per i rebbi della pinza per accedere al midollo spinale.
  12. Inserire i denti pinze ad un angolo di 90 ° rispetto alla dura attraverso i fori alla profondità 1 mm marcati sui lati della pinza, assicurandosi che il marchio è sopra la dura. Pinch chiudere la pinza e tenere premuto per 10 sec. Stampa, e ripetere pinze spremere altre due volte per un totale di tre stive. Rimuovere pinza dal midollo spinale.
  13. Immergere un pezzo di gelatina assorbibile compressa spugna in soluzione salina e posto sopra il luogo di ferita.
  14. Utilizzando un punto in esecuzione, suturare il muscolo in posizione sopra la laminectomia e imbevuta spugna di gelatina con # 4 punti di sutura in nylon non assorbibili sintetici.
  15. Agganciare la pelle al suo posto con 5 millimetri cli feritaps.
  16. Iniettare 10 ml Marcaine (1,0 mg / kg) in 490 ml di soluzione fisiologica per via sottocutanea in tutto il sito di incisione e 5 ml Bupernex (0,1 mg / kg) per via intramuscolare nei muscoli glutei.
  17. Lasciare animali di recuperare su un pad caldo e monitorare per eventuali difficoltà di movimento o segni di paralisi agli arti posteriori. Non lasciare animali incustoditi o in presenza di altri animali fino alla completa guarigione dall'anestesia. Non utilizzare animali che presentano deficit motori osservabili.
    NOTA: Sebbene questa cotta lesione può essere eseguita a qualsiasi livello lungo il midollo spinale, praticamente, T10-L4 pongono meno problemi tecnici per l'imaging rispetto alla respirazione e stabilizzare il movimento del corpo con fascette. Posizionamento morsetto deve essere modificato intorno alla gabbia toracica di immagine a livello toracico.

4. Imaging intravitale

  1. Preparare e autoclave strumenti chirurgici, tra cui Dumont # 4 pinze, forbici iris, pinze per la tenuta del tessuto, ago dfiumi e clip ferita.
  2. Anestetizzare il topo come prima con isoflurano. Indurre l'anestesia al 4-5% e mantenere a 1-2% secondo necessità per mantenere una frequenza respiratoria di 60-100 respiri al minuto e la mancanza di risposta al piede pizzico. Tenete il mouse riscaldato, monitorare la frequenza respiro quando non l'imaging e monitorare la temperatura animale con una sonda rettale.
  3. Pulire la pelle intorno alle clip ferita con Betadine e poi l'alcool e rimuovere le clip ferita secondo le istruzioni del produttore. Una volta clip ferita vengono rimosse, rimuovere i capelli con Nair, se necessario, e pulire il sito di nuovo con alcool povidone-iodio e il 70%.
  4. Riaprire la pelle con le forbici. Rimuovere eventuali suture rimanenti muscolare e tirare il muscolo a parte con una pinza, taglio con le forbici, se necessario.
  5. Sotto un microscopio da dissezione, creare tasche per il midollo spinale morsetti tagliando il muscolo con le forbici a lato dei processi trasversali sulla vertebra un livello vertebrale sopra e sotto la laminectomy.
  6. Posizionare fascette intorno a ciascuna di esse vertebra e stringere. Regolare come necessario per lasciare spazio per obiettivo microscopio per raggiungere il midollo spinale. Assicurarsi che il midollo spinale è parallela alla piattaforma di imaging, e mantenere la stabilità dei tessuti per l'imaging. Se la respirazione artefatto è visto, riaggiustare morsetti di conseguenza per ridurre al minimo il movimento nel campo dell'imaging.
  7. Coprire i morsetti con parafilm.
  8. Rimuovere la gelatina compressa spugna assorbibile dal midollo spinale con una pinza, delicatamente raccogliendo off come molti pezzi possibile, eliminando anche il più tessuto cicatriziale da oltre meningi possibile. Copertina esposto midollo spinale con soluzione salina e spugna nuova, se necessario.
    NOTA: In caso di sanguinamento si verifica dal muscolo circostante, sia convinto con spugna o cauterizzare, se necessario. Tuttavia, fare attenzione a non toccare il midollo spinale con la cauterizzazione. Coprire il midollo spinale o con un pezzo di tessuto inumidita o gelatina compressa spugna quando cauterizzare.
  9. Creare un well per contenere il liquido di immersione dal primo sigillatura pelle e tessuti con Vetbond, e quindi utilizzando acrilico dentale per costruire un pozzo tra i due morsetti del titolare del midollo spinale e fianchi dell'animale. Attendere che le cure acrilici.
  10. Riempire il bene con del liquido cerebro-spinale artificiale (aCSF) e controllare di nuovo per qualsiasi sanguinamento all'interno del sito chirurgico.
  11. Opzionalmente, a questo punto, iniettare coloranti fluorescenti vaso mediante iniezione endovenosa vena della coda per evidenziare i vasi sanguigni durante l'imaging.
    NOTA: dextran fluorescente sopra 70 kDa viene spesso utilizzato, anche se i punti quantici e lectine fluorescente servono anche coloranti nave come utili. 50 ml di 150.000 WM TRITC-destrano è tipicamente iniettato per via endovenosa.
  12. Per ottenere fisiologicamente rilevanti motilità delle cellule immunitarie, la temperatura del mouse deve essere mantenuta a 37 ° C. Muovi il mouse per un ambiente a temperatura controllata sotto il microscopio per l'imaging e controllare l'animale per Anes correttilivello Thesia dal tasso respiro e piede pizzico. Monitorare l'animale di frequente durante l'imaging per determinare la profondità dell'anestesia, con l'obiettivo di raggiungere una frequenza respiratoria di 60 - 100 respiri al minuto.
  13. Individuare il sito di immagini attraverso l'oculare del microscopio.
  14. Regolare il microscopio a scansione laser 2 fotoni per prendere un'immagine z-stack ogni 30-60 secondi per ottenere i dati di imaging dinamico.
  15. Una volta che la sessione di imaging è completata rimuovere l'animale dalla scatola riscaldata.
  16. Allentare i morsetti spinali e rimuovere il mouse dalle fascette. Estrarre l'acrilico ben lontano dalla pelle durante la rimozione dei morsetti.
  17. Se il mouse deve essere ripreso di nuovo, posizionare salina imbevuto di gelatina compressa spugna sul midollo spinale. Chiudere il muscolo e pelle sul sito chirurgico. Non lasciare l'animale incustodita o in presenza di altri animali, mentre il recupero dall'anestesia. Se l'animale mostra segni di deficit neurologico dopo il recupero, l'animale deve essere eutanasia. In caso contrario, l'eutanasiail mouse in una camera di CO 2 prima che emerge dalla anestesia secondo il protocollo eutanasia IACUC approvato.
  18. Analizzare le immagini fluorescenti utilizzando immagine software di analisi seguendo le istruzioni del produttore.

Representative Results

Un diagramma schematico raffigurante dorsale colonna cotta lesione è mostrato nella Figura 1A. Dopo la lesione, l'animale è preparato e stabilizzato per microscopia intravitale utilizzando morsetti spinale (Figura 1B). Un'immagine scattata subito dopo l'infortunio dorsale colonna di schiacciamento mostra una lesione rettangolare ben visibile con una pinza denti punti di inserimento che sono chiaramente identificabili. Gli assoni del sito della lesione vengono interrotti in tutto l'arco di tutta la colonna dorsale (Figura 1C). L'integrità dei vasi sanguigni rimane intatto, e nessuna evidenza di perdite nave tintura è stato rilevato dalla fluorescenza. Per eseguire l'imaging di serie della stessa lesione nel corso di settimane, i muscoli e la pelle possono essere suturati sopra la laminectomia per la successiva ri-esposizione. Simile morfologia della lesione è visto in momenti successivi (figure 1D, E). 5 giorni dopo infortunio, i siti di inserzione pinze sono ancora visibili, ma la lesione ha cominciato ad aumentare di dimensioni due al danno secondario causato da infiammazione. Gli assoni all'estremità caudale della lesione hanno ritirato dal sito iniziale della lesione tramite un processo chiamato "dieback assonale". Gli assoni alla fine rostrale della lesione esposti walleriana simile degenerazione (Figura 1D, E). Tra 5 e 22 giorni dopo la lesione, la dimensione della lesione è stabilizzata. Contemporaneamente, un grande afflusso di + cellule CX3CR1 può essere visto in infiltranti e intorno alla lesione cotta in questi punti di tempo, anche se l'identità di queste cellule microgliali (rispetto macrofagi) non può essere distinto nella preparazione come mostrato in Figura 1.

Per distinguere il comportamento della microglia e dei macrofagi nel microambiente cotta lesione, un modello di radiazione chimera è stata utilizzata (illustrato nella Figura 2A). In primo luogo, le cellule progenitrici del midollo osseo di un CX3CR1 del mouse + / GFP sono sostituiti con cel donatore non fluorescentels, quindi solo GFP microglia CNS residente + sono visibili da immagini fluorescenti. L'efficienza di midollo ricostituzione può essere confermata mediante citofluorimetria esame del sangue periferico 8 settimane dopo il trapianto di midollo (Figura 2B, C). In figura 2B, F4 / 80 e GFP macrofagi positivi, evidenziato in blu, sono rilevati in una CX3CR1 + / GFP → C57BL / 6 chimerico murino, in cui alcune GFP negativi ma F4 / 80 monociti positivi sono anche presenti. Nella Figura 2C, nessun doppio F4 positivo / 80 e le cellule GFP positive sono lasciati dopo la sostituzione di CX3CR1 + / GFP destinatario midollo osseo con il tipo selvatico del midollo osseo. Prima di lesioni, microglia sono equamente distribuite all'interno del midollo spinale, la visualizzazione di un riposo, la morfologia ramificata (Figura 2D). 8 giorni dopo infortunio, solo pochi microglia possono essere rilevati in e intorno alla lesione. Questi microglia mostrano una morfologia ameboide (Figura 2E). In secondo luogo, l'ossocellule progenitrici del midollo in un topo non fluorescente sono sostituite dalle cellule osseo da un topo CX3CR1 + / GFP, pertanto rendendo midollo osseo derivate CX3CR1 + monociti / macrofagi visibili dalla fluorescenza GFP (Figura 2A). Prima di infortunio, l'unico GFP + cellule rilevate sono in gran parte perivascolare, che sono stati segnalati per essere derivate dal midollo osseo e continuamente girare regolarmente 28 (Figura 2F). Dopo una lesione da schiacciamento, cellule + / GFP CX3CR1 sono visibili lungo l'interno dei vasi sanguigni che circondano la lesione (Figura 2H-J), e il centro della lesione è riempito con infiltrazione macrofagi CX3CR1 + / GFP (figura 2G).

Lasso di tempo di imaging delle colonne dorsali può essere effettuata per un massimo di 6 ore. Nella Figura 3, si mostra una CX3CR1 non chimerico + / GFP topo immediatamente dopo la lesione in cui le cellule dalla circolazione possono vederen spostando fuori dal vaso sanguigno verso il nucleo lesione e muoversi all'interno del sito della lesione (Figura 3A, B; supplementare film 1). L'analisi delle immagini utilizzando intensità di fluorescenza per identificare le cellule in grado di monitorare i percorsi dei macrofagi (Figura 3A, B; Supplemental Movie 1). Statistiche derivate dall'analisi di imaging mostrano la motilità media dei macrofagi nella lesione è 3,6 micron / min (Figura 3D). Infine, a 22 giorni dopo la lesione, gli assoni, microglia e macrofagi possono ancora essere individuati all'interno della lesione dimostrando campo dell'imaging è stabile per lunghi periodi di tempo (Movie integrativa 2).

Figura 1
Figura 1: Creazione e immagini sequenziale della lesione dorsale della colonna schiacciamento. (A) La dorsalelesioni colonna schiacciamento viene effettuato rimuovendo il processo dorsale della vertebra al livello di interesse. Forcipe sono inseriti nella colonna dorsale del midollo cablaggio 1 mm l'uno dall'altro e sono poi chiuse 3 volte per produrre la lesione mostrato in viola. (B) L'animale viene quindi posizionata con midollo spinale morsetti avere stabilità per l'imaging intravitale. (C) Immediatamente dopo l'infortunio, le pinze siti di inserzione (ovale rosso) e il volume di lesione da schiacciamento rettangolare (scatola grigia) possono essere chiaramente identificati. Assoni nelle radici dorsali possono essere visti (frecce bianche), così come le estremità feriti degli assoni sul lato caudale della lesione (teste freccia piena). (D) 5 giorni dopo lesione, le pinze siti di inserzione (ovale rosso ), e l'estensione della lesione (casella grigia) può ancora essere facilmente visualizzato. La lesione è aumentata di dimensioni poiché l'insulto iniziale. Gli assoni sottoposti degenerazione walleriana simile può essere visto rostrale alla lesione (punte di freccia aperta) in additia assoni nelle radici dorsali (frecce bianche) e le estremità degli assoni danneggiati (frecce bianche). (E) 22 giorni dopo la lesione, il sito della lesione è ancora identificabile con dimensioni simili al pregiudizio dopo 5 giorni. Notare il gran numero di cellule + CX3CR1 in e intorno al sito feriti. Caratteristiche etichettati sono gli stessi come in (D). Tutti i bar scale = 200 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2: Costruzione di topi chimerici per monitorare CX3CR1 + / GFP esprimere microglia o osseo macrofagi derivate dal midollo CNS residenti nella lesione della colonna dorsale cotta. (A) Un diagramma schematico di generazione topi chimerici sia con CX3CR1 + / GFP esprimere microglia o macrofagi. In primo luogo, Thy-1 YFP H topi sono irradiati e il midollo osseo viene ricostituito con cellule del midollo isolate da un CX3CR1 del mouse + / GFP, risultando in un chimerico murino cui i macrofagi sono GFP +. In secondo luogo, Thy-1 YFP topi H / CX3CR1 + / GFP sono irradiati e il midollo osseo viene ricostituito con cellule del midollo isolate da un topo non fluorescente, producendo un chimerico murino cui microglia sono GFP +. (B) Esempio di citometria a flusso di dati con celle F4 / 80 + e CX3CR1 GFP + nel sangue di un animale chimerico con CX3CR1 + / GFP osseo del donatore trapiantato in un irradiato C57BL / 6 del destinatario. Le cellule derivate da donatori positivi CX3CR1 che sono positivi sia per GFP e F4 / 80 sono mostrati nel blu zona evidenziata. (C) Esempio di citometria a flusso di dati con 80 + e CX3CR1 GFP + cellule / F4 in un animale chimerico con un C57BL6 donatori di midollo trapiantato in un irirradiata CX3CR1 destinatario + / GFP. Si noti la mancanza di doppio positivo CX3CR1 + / GFP e F4 / 80 cellule all'interno della zona blu evidenziata. (D) Un intravitale due fotoni snapshot microscopica di un mouse dal primo schema chimerico, mostrando GFP + microglia con morfologia ramificata all'interno della dorsale Colonna (testa di freccia). Queste cellule si alternano tra assoni (giallo) nella radice dorsale e la colonna dorsale. Bar Scala = 100 micron. (E) l'imaging intravitale dello stesso mouse (B) 8 giorni dopo la lesione della colonna dorsale rivela alcuni CX3CR1 + microglia con corpi di grandi dimensioni e di forma ameboidi cellulari che mancano i processi (testa di freccia). Scala bar = 100 micron. (F) Istantanea di un mouse dal secondo schema chimerico in (A), che mostra scarsa GFP + macrofagi, all'interno del parenchima SNC. Bar Scala = 100 micron. (G) l'imaging intravitale dello stesso mouse (F) 8 giorni dopo dorsale infortunio colonna rivela alarge afflusso di macrofagi in ed intorno alla lesione. Bar Scala = 100 micron. (H) Un quadro maggiore ingrandimento di + sangue cellule derivate CX3CR1 in contatto con le navi l'animale illeso. Barra di scala = 30 micron. (I) Una ricostruzione di cellule CX3CR1 a contatto con il recipiente, visto dall'interno del vaso. Scale bar = 30 micron. (J) Una ricostruzione di cellule CX3CR1 a contatto con il recipiente, vista dall'esterno del recipiente. Bar Scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 3 :. Dati di rilevamento delle cellule di rappresentanza in un CX3CR1 non chimerico + / GFP del mouse subito dopo la colonna dorsale crushlesioni. (A) Uno snapshot CX3CR1 + microglia e macrofagi assoni intorno danneggiati (giallo) da Movie supplementare 1, immediatamente dopo una lesione della colonna dorsale schiacciamento. (B) I percorsi (grigio) adottata dai + cellule CX3CR1 in (A) nel corso di una 110 min sessione di imaging intravitale. (C) Un tempo di rappresentazione codificata delle tracce (B). Le tracce sono (D) Istogramma della motilità complessiva delle cellule + CX3CR1 colorati in base al loro tempo entro l'intero film 110 minuti, come illustrato nella barra di tempo.. Tutte le barre di scala sono 30 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Film supplementare 1: Rappresentante film intravitale subito dopo la lesione della colonna dorsale schiacciamento nel doppio eterozigote Thy-1 YFP / + GFP / + mouse. Imaging intravitale spinale è stata eseguita immediatamente dopo una dorsale colonna di lesione da schiacciamento a livello T11. Pannello di destra mostra il movimento del CX3CR1 + microglia e macrofagi. I percorsi del movimento delle cellule sono mostrati come tracce bianche sul pannello di sinistra. L'infortunio si trova nell'angolo in alto a sinistra. + Cellule CX3CR1 possono essere visti entrando nel sito della lesione lungo queste tracce. Gli assoni sono indicati in giallo. Bar Scala = 40 micron. Tempo totale: 110 min. Velocità di riproduzione: 300x.

Movie integrativa 2:. Movie intravitale Rappresentante a 22 giorni dopo la colonna dorsale schiacciare lesione nel doppio eterozigote Thy-1 YFP / + / CX3CR1 GFP / + topo Indicato qui è un film rappresentativo preso in un topo 22 giorni dopo la colonna dorsale iniziale cotta lesioni a livello T11 spinale. Il injUry si trova in alto a destra della cornice. Gli assoni (giallo) crescente rostralmente vengono visualizzati in basso a destra. I vasi vena dorsale e anima sono etichettati con TRITC-destrano (rosso). CX3CR1 + cellule all'interno movimento lesione a una velocità inferiore rispetto a quelli immediatamente dopo la lesione. Bar Scala = 50 micron. Tempo totale: 90 min. Velocità di riproduzione: 600x.

Discussion

Interazioni Imaging di diversi tipi di cellule nei loro compartimenti nativi durante conseguente patologia in tempo reale ha generato grande interesse. All'interno della rete densa del CNS, contatto cellula-cellula e di segnalazione con celle adiacenti sono essenziali per la funzione normale e per comprendere CNS patologia. Qui, abbiamo descritto l'uso di 2-photon microscopia a scansione laser per l'osservazione di movimento cellulari all'interno di una lesione meccanica nel midollo spinale. Oltre alla qualità della chirurgia e tessuti di preparazione, la stabilità meccanica del tessuto è fondamentale per il successo microscopia time-lapse, soprattutto l'isolamento del midollo spinale di respirare artefatti da movimento. Stabilità può essere valutata, cercando per il movimento del midollo spinale sotto un microscopio da dissezione che corrisponde alla frequenza cardiaca o respiratoria dell'animale. Di stabilità deve essere valutata sia durante l'esecuzione dell'intervento e anche immediatamente prima di iniziare l'imaging. Se l'animal non è stabile, è opportuno adeguare al collocamento e la tenuta dei morsetti del midollo spinale. Cell-tipo modelli specifici fluorescente topo giornalista accoppiato con approcci chimera midollo osseo hanno permesso l'identificazione di cellule monocitiche contro microglia e assoni. Studi precedenti hanno rivelato che sangue derivate monociti e non microglia sono responsabili di danno assonale secondaria dopo un trauma con la metodologia descritta qui 43. Dextran coniugato tintura nave permette di identificazione della nave, sia per fornire punti di riferimento e di rilevare le infrazioni in integrità nave. La scelta del modello di topo reporter fluorescente appropriata è fondamentale per consentire la corretta identificazione dei tipi di cellule desiderati da acquisire.

Sviluppo di modelli fluorescenti mouse che sono appropriati per gli studi intrapresi è anche fondamentale per il successo degli esperimenti. Distinguere tra le due popolazioni fagocitici di CX3CR1 + / GFP 52. Qui abbiamo osservato che il numero di cellule infiltranti nel SNC allo stato stazionario a seguito della generazione di chimera è insignificante in contrasto con la insensibileer di cellule che entrano lesione. Altri modelli alternativi da prendere in considerazione sono indotte da farmaci chimere 52 o modelli parabiotic topo 53.

Qui, abbiamo presentato un modello di lesione piccola specifico, semplice e riproducibile che si traduce in una lesione alla materia bianca dorsale del midollo spinale che è facile da un'immagine utilizzando la microscopia a 2 fotoni. Questo metodo fornisce anche una lesione quantificabile per saggiare il grado di deperimento assonale nelle colonne dorsali che in letteratura è stato accoppiato con complementare tessuto fissato analisi 16,18,43,48,54. In questo modello, gli animali mostrano solo deficit minimi e non richiedono cure particolari dopo l'infortunio. Futuri studi che utilizzano le lesioni della colonna cotta e di imaging tecniche dorsali qui descritte possono essere potenti strumenti di screening per valutare l'efficacia del trattamento per le lesioni del midollo spinale. Questi trattamenti possono includere piccoli inibitori molecolari, farmaci, prodotti cellulari, innesti di tessuto e trattamento combinatorias. L'interazione tra macrofagi, microglia e neuroni sono anche suscettibili di svolgere un ruolo in altri modelli di malattia del midollo spinale, tra cui la sclerosi multipla, tumori, la meningite e la sclerosi laterale amiotrofica, e questa tecnica può essere utile per lo studio di queste malattie, nonché .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CX3CR1 GFP mice Jackson laboratories 5582
Thy-1 YFP H mice Jackson laboratories 3782
Mouse pie cage Braintree Scientific MPC 2 set
60 mm2 Petri dish Corning 430166 For bone marrow isolation
Falcon 40 μm cell filter Fisher Scientific 08-771-1 For bone marrow isolation
1 x 15 ml and 1 x 50 ml conical tube Fisher Scientific For bone marrow isolation
21 gauge needle BD 305177 For bone marrow isolation
1 ml syringe BD 309628 For bone marrow isolation
ACK lysis buffer Gibco A10492-01 For bone marrow isolation
HBSS Corning Cellgro 21-022-CV For bone marrow isolation
RPMI media Sigma R8758 For bone marrow isolation
F4/80 antibody Ebioscience 12-4801 PE For FACS verification of chimeras
30 gauge insulin syringe BD 328280 For tail vein injection
Spinal Cord Clamps Narshinge STS-A For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic powder Lang Dental REF1320 For imaging
Ortho-Jet Dental Acrylic liquid Lang Dental REF1404 For imaging
Gelfoam gelatin sponges Pfizer 9034201 For imaging
4-0 Ethilon sutures Ethilon 1667G For surgery
Reflex Clips, 7 mm Kent Scientific INS750344 For surgery. Sterilize before use
Iris Scissors Fine Science Tools 14061-09 For surgery
45/5 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11251-35 For surgery
Rongeurs Fine Science Tools 16021-14 For surgery
30 gauge needle BD 305106 For making access holes in dura
Forceps Dumont #4 Biology tips Dumont 11242-40 For surgery
Needle Drivers Fine Science Tools 12002-12 For surgery
Michel Wound Clip Forceps Kent Scientific INS700753 For surgery
Wound clip remover Fine Science Tools 12033-00 For surgery
O-rings for Forceps Fine Science Tools 11200-00 For surgery, Often provided with #4 forceps, can also be ordered separately
Cordless Rechargable Animal trimmer Wahl Series 8900 for surgery
Vetbond 3M 1469SB For surgery
Betadine Solution (10% Providine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08 For surgery
Nair Hair remover lotion Church & Dwight Co., Inc. NRSL-22329-05 For surgery
Isoflurane Butler Schein NDC 11695-6776-2 Drugs – for surgery
Marcaine Henry Schein NDC 0409-1587-50 Drugs – for surgery 1.0 mg/kg given subcutaneously
Bupernex Henry Schein 121-7793 Drugs – for surgery buprenorphine 0.1 mg/kg
aCSF Chemicals from Sigma 119 mM NaCl
26.2 mM NaHCO3
2.5 mM KCl
1 mM NaH2PO4
1.3 mM MgCl2
10 mM glucose
For surgery
From Cold Spring Harbor Protocols
TRITC-dextran 150,000 MW Sigma T1287 For intravenous administration to label vasculature

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  2. Kerschensteiner, M., Schwab, M., Lichtman, E., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, (5), 572-577 (2005).
  3. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), 2760 (2012).
  4. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, (1), 1-7 (2008).
  5. Davalos, D., et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci. 8, (6), 752-758 (2005).
  6. Figley, S. A., et al. A spinal cord window chamber model for in vivo longitudinal multimodal optical and acoustic imaging in a murine model. PLoS One. 8, (3), 58081 (2013).
  7. Steffens, H., Nadrigny, F., Kirchhoff, F. In vivo two-photon imaging of neurons and glia in the mouse spinal cord. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (12), (2012).
  8. Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury. Nat Med. 18, (1), 166-171 (2012).
  9. Dibaj, P., et al. In Vivo imaging reveals distinct inflammatory activity of CNS microglia versus PNS macrophages in a mouse model for ALS. PLoS One. 6, (3), (2011).
  10. Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, (9), 1133-1144 (2010).
  11. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, (19), 4895-4902 (2013).
  12. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows). J Physiol. 590, (16), 3665-3675 (2012).
  13. Dray, C., Rougon, G., Debarbieux, F. Quantitative analysis by in vivo imaging of the dynamics of vascular and axonal networks in injured mouse spinal cord). Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (23), 9459-9464 (2009).
  14. Popovich, P. G., Jones, T. B. Manipulating neuroinflammatory reactions in the injured spinal cord: back to basics. Trends Pharmacol Sci. 24, (1), 13-17 (2003).
  15. Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209, (2), 378-388 (2008).
  16. Horn, K. P., Busch, S. A., Hawthorne, A. L., van Rooijen, N., Silver, J. Another barrier to regeneration in the CNS: activated macrophages induce extensive retraction of dystrophic axons through direct physical interactions. J Neurosci. 28, (38), 9330-9341 (2008).
  17. Fitch, M. T., Silver, J. CNS injury, glial scars, and inflammation: Inhibitory extracellular matrices and regeneration failure. Exp Neurol. 209, 294-301 (2008).
  18. Busch, S. A., Horn, K. P., Silver, D. J., Silver, J. Overcoming macrophage-mediated axonal dieback following CNS injury. J Neurosci. 29, (2), 9967-9976 (2009).
  19. Popovich, P. G., van Rooijen, N., Hickey, W. F., Preidis, G., McGaughy, V. Hematogenous macrophages express CD8 and distribute to regions of lesion cavitation after spinal cord injury. Exp Neurol. 182, (2), 275-287 (2003).
  20. Popovich, P. G., et al. Depletion of hematogenous macrophages promotes partial hindlimb recovery and neuroanatomical repair after experimental spinal cord injury. Exp Neurol. 158, (2), 351-365 (1999).
  21. Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. J Neurosci. 29, (43), 13435-13444 (2009).
  22. Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29, (12), 3956-3968 (2009).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38, (3), 555-569 (2013).
  24. Shechter, R., et al. Infiltrating blood-derived macrophages are vital cells playing an anti-inflammatory role in recovery from spinal cord injury in mice. PLoS Med. 6, (7), 1000113 (2009).
  25. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327, (5966), 656-661 (2010).
  26. Popovich, P. G., Hickey, W. F. Bone marrow chimeric rats reveal the unique distribution of resident and recruited macrophages in the contused rat spinal cord. J Neuropathol Exp Neurol. 60, (7), 676-685 (2001).
  27. Ransohoff, R. M. Microglia and monocytes: 'tis plain the twain meet in the brain. Nat Neurosci. 14, (9), 1098-1100 (2011).
  28. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, (7321), 253-262 (2010).
  29. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14, (10), 1227-1235 (2011).
  30. Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol Rev. 91, (2), 461-553 (1152).
  31. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16, (3), 273-280 (2013).
  32. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (6005), 841-845 (2010).
  33. Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, (9), 4309-4321 (1995).
  34. Herber, D. L., et al. Diverse microglial responses after intrahippocampal administration of lipopolysaccharide. Glia. 53, (4), 382-391 (2006).
  35. Saederup, N., et al. Selective chemokine receptor usage by central nervous system myeloid cells in CCR2-red fluorescent protein knock-in mice. PLoS One. 5, (10), 13693 (2010).
  36. Mizutani, M., et al. The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood. J Immunol. 188, (1), 29-36 (2012).
  37. Iwasaki, A. The use of bone marrow-chimeric mice in elucidating immune mechanisms. Methods Mol Med. 127, 281-292 (2006).
  38. Spangrude, G. J. Assessment of lymphocyte development in radiation bone marrow chimeras. Curr Protoc Immunol. 4, (4.6), (2008).
  39. Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48, (1), 11-22 (2009).
  40. Koon, H. W., Ho, S., Cheng, M., Ichikawa, R., Pothoulakis, C. Differentiating functional roles of gene expression from immune and non-immune cells in mouse colitis by bone marrow transplantation. J Vis Exp. e4208. 4208 (2012).
  41. London, A., Cohen, M., Schwartz, M. Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair. Front Cell Neurosci. 7, (2013).
  42. Jung, S., Schwartz, M. Non-identical twins - microglia and monocyte-derived macrophages in acute injury and autoimmune inflammation. Front Immunol. 3, 89 (2012).
  43. Evans, T. A., et al. High-resolution intravital imaging reveals that blood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondary axonal dieback in traumatic spinal cord injury. Exp Neurol. 254, 109-120 (2014).
  44. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nat Neurosci. 17, (1), 131-143 (2014).
  45. Lee, J. H., et al. A contusive model of unilateral cervical spinal cord injury using the infinite horizon impactor. J Vis Exp. 65, 3313-3310 (2012).
  46. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  47. Zhang, Y. P., et al. Controlled cervical laceration injury in mice. J Vis Exp. 75, 50030 (2013).
  48. Shen, Y., et al. PTPsigma is a receptor for chondroitin sulfate proteoglycan, an inhibitor of neural regeneration. Science. 326, (5952), 592-596 (1126).
  49. Ek, C. J., et al. Spatio-temporal progression of grey and white matter damage following contusion injury in rat spinal cord. PLoS One. 5, (8), e12021 (2010).
  50. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  51. Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20, (11), 4106-4114 (2000).
  52. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, (31), 11159-11171 (2011).
  53. Kierdorf, K., Katzmarski, N., Haas, C. A., Bone Prinz, M. marrow cell recruitment to the brain in the absence of irradiation or parabiosis bias. PLoS One. 8, (3), e58544 (2013).
  54. Filous, A. R., Evans, T. A., Lang, B. T., Silver, J. Synaptic-like connections between dystrophic axons and NG2+ cells: Another reason for regeneration failure after spinal cord injury. Neuroscience 2013, Society for Neuroscience. Abstracts. San Diego. (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics