गुस्सा / IRP उदाहरण: आरएनए प्रोटीन बातचीत के अध्ययन के लिए electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख (EMSA)

Biology

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Summary

यहाँ हम आरएनए / प्रोटीन बातचीत का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) देशी जेल वैद्युतकणसंचलन दौरान शाही सेना / प्रोटीन परिसरों और मुफ्त शाही सेना के अंतर प्रवास पर आधारित है। एक radiolabeled शाही सेना जांच का उपयोग करके, आरएनए / प्रोटीन परिसरों autoradiography द्वारा देखे जा सकते हैं।

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Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

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Abstract

आरएनए / प्रोटीन बातचीत के बाद विनियामक रास्ते के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे अच्छा विशेषता साइटोसोलिक आरएनए बंधनकारी प्रोटीन के अलावा लोहे विनियामक प्रोटीन, IRP1 और IRP2 हैं। वे इस तरह mRNAs अनुवाद या स्थिरता को नियंत्रित करने, कई लक्ष्य mRNAs का ग़ैर-अनुवादित क्षेत्रों (UTRs) के भीतर उत्तरदायी तत्वों (IRES) लोहे करने के लिए बाध्य। गुस्सा / IRP बातचीत का व्यापक रूप से EMSA द्वारा अध्ययन किया गया है। यहाँ, हम के रूप में अच्छी तरह से अन्य शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है जो IRP1 और IRP2 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि, विश्लेषण करने के लिए EMSA प्रोटोकॉल का वर्णन है। एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन, या इस प्रोटीन का एक शुद्ध तैयारी युक्त एक कच्चे प्रोटीन lysate, जटिल गठन के लिए अनुमति देने के लिए, 32 पी लेबल शाही सेना जांच की एक अतिरिक्त के साथ incubated है। हेपरिन बंधन की जांच के लिए गैर विशिष्ट प्रोटीन रोकना करने के लिए जोड़ा गया है। इसके बाद, मिश्रण एक polyacrylamide जेल पर गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन द्वारा विश्लेषण किया है। नि: शुल्क जांच, तेजी से migrates जबकि शाही सेना / प्रोटीन जटिल दर्शाती मंद गतिशीलता; इसलिए, प्रक्रिया भी "जेल मंदता" या "bandshift" परख कहा जाता है। वैद्युतकणसंचलन के पूरा होने के बाद, जेल सूख रहा है और शाही सेना / प्रोटीन परिसरों, साथ ही नि: शुल्क जांच, autoradiography से पता चला रहे हैं। प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य का पता लगाने और गुस्सा / IRP और अन्य आरएनए / प्रोटीन बातचीत यों की है। इसके अलावा, EMSA भी जांच के तहत शाही सेना / प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता, बंधन आत्मीयता, और stoichiometry निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

EMSA मूल लक्ष्य डीएनए दृश्यों 1,2 के साथ डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की एसोसिएशन अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था। सिद्धांत इस लेख का ध्यान केंद्रित है, जो शाही सेना / प्रोटीन बातचीत 3, के लिए समान है। संक्षेप में, आरएनए नकारात्मक आरोप लगाया है और polyacrylamide (या agarose) जैल में गैर denaturing वैद्युतकणसंचलन दौरान एनोड की ओर पलायन होगा। जेल के भीतर प्रवासन अपने आरोप के लिए आनुपातिक है जो शाही सेना, के आकार पर निर्भर करता है। विशिष्ट शाही सेना के लिए एक प्रोटीन के बंधन मुक्त शाही सेना की तुलना में जटिल migrates धीमी अपनी गतिशीलता को बदल देता है, और। इस आणविक जन में वृद्धि करने के लिए, लेकिन यह भी आरोप है और संभवतः रचना में परिवर्तन की वजह से है। जांच के रूप में एक लेबल शाही सेना का उपयोग "जेल मंदता" या "bandshift" की आसान निगरानी की अनुमति देता है। 32 पी लेबल शाही सेना जांच के उपयोग बहुत आम है और उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। आरएनए / प्रोटीन परिसरों और मुफ्त शाही सेना के प्रवास पता चला रहे हैंautoradiography द्वारा। कमियां 32 पी (14.29 दिन) होने के कारण radiolysis करने के लिए जांच की गुणवत्ता का क्रमिक गिरावट से कम आधा जीवन कर रहे हैं, एक रेडियोधर्मिता लाइसेंस और रेडियोधर्मिता के काम के लिए बुनियादी सुविधाओं, और संभावित जैव सुरक्षा चिंताओं की आवश्यकता। इसलिए, शाही सेना जांच लेबलिंग के लिए वैकल्पिक गैर समस्थानिक विधियों फ्लोरोसेंट या chemiluminescent इमेजिंग 4,5 द्वारा पता लगाने के लिए सक्षम है, जो fluorophores या बायोटिन, साथ उदाहरण के लिए विकसित किया गया है। इन तरीकों की सीमाओं उच्च लागत और समस्थानिक लेबलिंग की तुलना में अक्सर कम संवेदनशीलता, और आरएनए / प्रोटीन बातचीत के साथ हस्तक्षेप करने के लिए गैर-समस्थानिक लेबल की क्षमता है। गैर denaturing polyacrylamide जैल सबसे EMSA अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैं और आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है। इस अवसर पर, agarose जैल बड़े परिसरों के विश्लेषण के लिए एक वैकल्पिक खड़ी हो सकती है।

EMSA के प्रमुख लाभ यह सादगी, संवेदनशीलता, और मजबूती 4 जोड़ती है </ Sup>। परख के कुछ ही घंटों के भीतर पूरा किया जा सकता है और परिष्कृत इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता नहीं है। आरएनए / प्रोटीन बातचीत 0.1 एनएम या उससे कम के रूप में के रूप में कम मात्रा में EMSA से पता लगाया जा सकता है और एक व्यापक बाध्यकारी शर्तों की सीमा के भीतर (पीएच 4.0-9.5, monovalent नमक एकाग्रता 1-300 मिमी, और तापमान 0-60 डिग्री सेल्सियस)।

आरएनए / प्रोटीन जटिल गठन भी फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा अध्ययन किया जा सकता है। एक नि: शुल्क शाही सेना जांच 6 से होकर गुजरता है, जबकि यह एक nitrocellulose फिल्टर में शाही सेना / प्रोटीन परिसरों की अवधारण के आधार पर एक सरल, तेज, और कम खर्चीली प्रक्रिया है। EMSA की तुलना में, यह शाही सेना जांच के बंधन, कई साइटों में शामिल है, या कच्चे तेल निकालने में एक ही स्थल पर जांच करने के लिए बाध्य है कि एक से अधिक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन होता है, जहां मामलों में सीमित है। कई आरएनए / प्रोटीन बातचीत फिल्टर बाध्यकारी परख द्वारा पता लगाने से बच जाएगा, वहीं वे आसानी से EMSA द्वारा देखे जा सकते हैं। कुछ मामलों में, दृश्य पूर्व संध्या हैएन संभव है, जब जेल पर आगे मंदता उपज EMSA प्रतिक्रिया के लिए शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन से एक के खिलाफ एक एंटीबॉडी जोड़कर सह पलायन (उदाहरण के लिए, मानव IRP1 / गुस्सा और IRP2 / गुस्सा परिसरों) दो आरएनए / प्रोटीन परिसरों ( "supershift") 7।

EMSA व्यापक रूप से लोहे के चयापचय में 8-10 के बाद के ट्रांसक्रिप्शनल नियामकों हैं जो IRP1 और IRP2, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। वे कई mRNAs 11 UTRs भीतर IRES, जातीवृति के आधार पर संरक्षित बाल के लिये कांटा संरचनाओं के बंधन से कार्य करते हैं। IRES पहले ferritin 12 और transferrin रिसेप्टर 1 (TfR1) 13, क्रमशः लोहे भंडारण और तेज, का प्रोटीन एन्कोडिंग mRNAs में खोज रहे थे। बाद में, IRES एर्य्थ्रोइद-विशिष्ट aminolevulinate सिन्थेज़ (ALAS2) 14, माइटोकॉन्ड्रियल aconitase 15, ferroportin 16, द्विसंयोजक धातु ट्रांसपोर्टर 1 (DMT1) 17, हाइपोक्सिया inducible कारक 2 में पाए गए 18, और अन्य mRNAs 19-21। UTR 'TfR1 mRNA के अपने तीन में कई IRES होता है, जबकि, UTR' प्रोटोटाइप एच और एल ferritin mRNAs उनके 5 में एक गुस्सा होते हैं। गुस्सा / IRP बातचीत विशेष रूप से sterically 43s ribosomal सबयूनिट के अपने सहयोग को अवरुद्ध करके ferritin mRNA के अनुवाद रोकना; इसके अलावा, वे endonucleolytic दरार के खिलाफ TfR1 mRNA के स्थिर। IRP1 और IRP2 शेयर व्यापक अनुक्रम समानता और लोहे की कमी से जूझ कोशिकाओं में उच्च गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि दिखा रहे हैं। IRP2 proteasomal गिरावट undergoes जबकि लौह-भरा पड़ा कोशिकाओं में, IRP1 अपने क्रोध बाध्यकारी गतिविधि की कीमत पर साइटोसोलिक aconitase में धर्मान्तरित कि एक cubane फ़े-एस क्लस्टर assembles। इस प्रकार, गुस्सा / IRP बातचीत सेलुलर लोहे की स्थिति पर निर्भर करता है, लेकिन यह भी इस तरह के एच 22, नाइट्रिक ऑक्साइड (सं) या हाइपोक्सिया के रूप में अन्य संकेतों द्वारा विनियमित रहे हैं। यहाँ, हम ई द्वारा कच्चे तेल की सेल और ऊतक के अर्क से गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णनएमएसए। हम गुस्सा अनुक्रम मूल रूप से नीचे की ओर T7 शाही सेना पोलीमरेज़ साइट की भावना अभिविन्यास में पेश किया गया था जहां एक प्लास्मिड डीएनए टेम्पलेट (I-12.CAT), से इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा उत्पन्न की गई थी कि एक 32 पी लेबल एच ferritin गुस्सा जांच इस्तेमाल किया annealed सिंथेटिक oligonucleotides के 22 की क्लोनिंग।

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Protocol

चूहों के साथ प्रायोगिक प्रक्रिया मैकगिल विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल 4966) के पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

संवर्धित कोशिकाओं से प्रोटीन के अर्क के 1. तैयारी

  1. बर्फ ठंड फॉस्फेट बफर खारा के 10 एमएल (पीबीएस) के साथ दो बार संवर्धित कोशिकाओं को धो लें।
  2. एक रबर पुलिसकर्मी या एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ठंडा पीबीएस, स्थानांतरण निलंबन के 1 मिलीलीटर में एक प्लास्टिक सेल खुरचनी के साथ या तो पक्षपाती कोशिकाओं परिमार्जन।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 700 XG पर 5 मिनट के लिए एक microcentrifuge में स्पिन,। महाप्राण पीबीएस।
  4. 10 7 कोशिकाओं प्रति ठंडा साइटोप्लास्मिक lysis बफर के 100 μl (तालिका 1) जोड़ें, और ऊपर और नीचे पिपेट और।
  5. 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  6. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से 10 मिनट के लिए स्पिन।
  7. त्यागें गोली। नई 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और बर्फ पर रहते हैं।
  8. डेटब्रैडफोर्ड परख 23 का उपयोग कर - (10 माइक्रोग्राम प्रति / μl आमतौर पर 1) एमिन प्रोटीन एकाग्रता।
  9. उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान सेल के अर्क।

माउस जिगर और तिल्ली से प्रोटीन के अर्क के 2. तैयारी

  1. सीओ 2 साँस लेना के साथ एक माउस euthanize।
  2. एक विदारक बोर्ड पर एक साफ पैड पर euthanized पशु निर्धारित करना। कैंची के साथ पेट खोलें।
  3. कैंची और संदंश का उपयोग करके जिगर और तिल्ली काटना, और लगभग 50 मिलीलीटर ठंडा पीबीएस में प्रत्येक ऊतक कुल्ला।
  4. इसके तत्काल बाद एक स्केलपेल के साथ छोटे टुकड़ों में ऊतकों में कटौती (उदाहरण के लिए: लगभग 1-2 मिमी 3)।
  5. देरी के बिना, एक ताजा cryotube में ऊतकों के टुकड़े डाल दिया और फिर तरल नाइट्रोजन में उन्हें रोक तस्वीर। स्टोर तस्वीर जमी ऊतक aliquots उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर।
  6. के 0.5 मिलीलीटर - 0.25 में - (2 मिमी 3 लगभग 1) जमे हुए ऊतक का एक टुकड़ा homogenizeठंडा साइटोप्लास्मिक lysis बफर (तालिका 1) 10 सेकंड के लिए एक ऊतक homogenizer के साथ।
  7. 20 मिनट के लिए बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब और ठंडा करने के लिए homogenate स्थानांतरण।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से 10 मिनट के लिए स्पिन।
  9. नई 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में गोली और स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बर्फ पर रखें।
  10. ब्रैडफोर्ड परख 23 का उपयोग कर - (10 माइक्रोग्राम प्रति / μl आमतौर पर 1) प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।
  11. उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य और दुकान सेल के अर्क।

Radiolabeled गुस्सा जांच की 3. तैयारी

  1. प्रतिबंध endonuclease XbaI (प्लाज्मिड की माइक्रोग्राम प्रति प्रति एक यू), गुस्सा अनुक्रम के बहाव जो cleaves के साथ 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating द्वारा गुस्सा युक्त प्लाज्मिड I-12.CAT 22 linearize। linearized प्लाज्मिड में इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. सेट अप एकn में इन विट्रो 20 μl की कुल मात्रा में प्रतिलेखन प्रतिक्रिया। तालिका 2 में दिखाया स्टॉक समाधान का उपयोग करें और जोड़ें: 1 μl linearized प्लाज्मिड टेम्पलेट, 4 μl प्रतिलेखन बफर; एटीपी / CTP / जीटीपी मिश्रण की एक μl मिश्रण, 10 μl [32 पी α-] -UTP, 2 μl dithiothreitol, 1 μl RNase अवरोध करनेवाला और एक μl T7 शाही सेना पोलीमरेज़। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
  3. 1 घंटा 24 के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।

Radiolabeled गुस्सा जांच की 4. शुद्धीकरण

  1. ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 0.5 एम EDTA, पीएच 8. मिक्स के एक μl जोड़कर इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया को समाप्त।
  2. बेहतर वर्षा के लिए वाहक के रूप में, 10 मिलीग्राम / एमएल tRNA के 10 μl जोड़ें। ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिक्स।
  3. 3 एम अमोनियम एसीटेट के 82.5 μl जोड़ें। Vortexing द्वारा मिक्स।
  4. इथेनॉल के 273 μl जोड़ें। Vortexing द्वारा मिक्स।
  5. 5 मिनट के लिए आरटी पर खड़े हैं।
  6. आरटी पर एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से 10 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  7. धो 70% इथेनॉल के 100 μl के साथ गोली।
  8. आरटी पर एक microcentrifuge में पूरी रफ्तार से 10 मिनट के लिए स्पिन। सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  9. 10 मिनट के लिए शुष्क हवा गोली।
  10. दोहरा आसुत के 100 μl में resuspend गोली, पहले से एच 2 ओ autoclaved
  11. उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक तरल जगमगाहट काउंटर में रेडियोधर्मिता, विभाज्य radiolabeled गुस्सा जांच और दुकान यों। जमे हुए aliquots के ऊपर से 3 सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

EMSA के लिए एक देशी polyacrylamide जेल की 5. तैयारी

  1. 1.5 मिमी spacers और कंघी का उपयोग करके जेल (16 x 16 सेमी) इकट्ठे।
  2. तालिका 3 में दिखाया स्टॉक समाधान का उपयोग करें, एक 6% देशी polyacrylamide जेल तैयार करने के लिए 7.5 मिलीलीटर 40% एक्रिलामाइड मिक्स:। Bisacrylamide, 5x TBE के 5 एमएल और 37.5 मिलीलीटरदोहरा आसुत एच 2
  3. 10% हौसले से तैयार अमोनियम persulfate (ए पी) और 25 μl tetramethylethylenediamine (TEMED) के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें।
  4. इसके तत्काल बाद जेल को acrylamide समाधान डालना और यह भाजन करते हैं। लगभग 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  5. , जेल के साथ वैद्युतकणसंचलन उपकरण इकट्ठे 0.5x TBE के साथ टैंक को भरने और बिजली की आपूर्ति के साथ कनेक्ट।

6. Electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख

  1. 10 μl में की कुल मात्रा में कोशिकाओं या साइटोप्लास्मिक lysis बफर (तालिका 1) के साथ ऊतकों से प्रोटीन निकालने के 25 माइक्रोग्राम प्रति पतला (कम प्रोटीन सांद्रता भी इस्तेमाल किया जा सकता है)। बर्फ पर रखें। 25: 4 निष्क्रिय IRP1 (2% अंतिम एकाग्रता) को सक्रिय करने के लिए 2-मर्केप्टोइथेनाल (2-इ) पतला: यदि आवश्यक हो, एक की एक μl जोड़ें।
  2. 95 डिग्री पर दोहरा आसुत एच में radiolabeled गुस्सा जांच पतला 2 हे 200,000 सीपीएम / μl, गर्मी denatureएक मिनट के लिए सी, और कम से कम 5 मिनट के लिए आरटी पर शांत हो जाओ।
  3. प्रोटीन निकालने के लिए radiolabeled गुस्सा जांच की एक μl जोड़कर एक EMSA प्रतिक्रिया सेट करें।
  4. आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. प्रतिक्रिया के लिए 50 मिलीग्राम / एमएल हेपरिन की एक μl जोड़ें (जांच 9 के साथ गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत को बाधित करने के लिए) और एक और 10 मिनट के लिए ऊष्मायन जारी है। -80 डिग्री सेल्सियस पर शेयर हेपरिन का समाधान (50 मिलीग्राम / एमएल) और दुकान विभाज्य।
  6. लंबे radiolabeled जांच (> 60 न्यूक्लियोटाइड) का उपयोग करते हैं, तो एक μl RNase T1 (1 यू / μl) जोड़ने और आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते जांच के लिए बाध्य गैर विशिष्ट प्रोटीन को कम करने के लिए, और आरएनए / प्रोटीन का बेहतर जुदाई अनुमति देने के लिए वैद्युतकणसंचलन दौरान जटिल।
  7. लोड हो रहा है बफर (80% ग्लिसरॉल + bromophenol नीला) के 3 μl जोड़ें, मिश्रण और 6% गैर denaturing polyacrylamide जेल पर भार।
  8. 130 वी (5 वी / सेमी) पर 60 मिनट के लिए जेल चलाएँ।
  9. टीransfer एक बड़ी फिल्टर पेपर और सूखे पर जेल।
  10. एक फिल्म को बेनकाब और autoradiography का विकास। एक्सपोजर समय एक घंटा (या कम) से हे / एन करने के लिए ऊपर से लेकर कर सकते हैं।

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Representative Results

धारा 3 और प्रोटोकॉल के 4 में वर्णित के रूप में एक radiolabeled गुस्सा जांच, तैयार किया गया था। जांच के अनुक्रम 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC सीयूजी सी UUCAA सी AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 'था; बोल्ड न्यूक्लियोटाइड महत्वपूर्ण गुस्सा विशेषताएं हैं जो एक अयुगल सी अवशेषों और पाश, प्रतिनिधित्व करते हैं। जांच के विशिष्ट रेडियोधर्मिता 4.5 एक्स 10 9 सीपीएम / शाही सेना के माइक्रोग्राम प्रति था।

गतिविधि गुस्सा बाध्यकारी पर लोहे perturbations के प्रभाव का आकलन करने के लिए, murine RAW264.7 मैक्रोफेज अनुपचारित छोड़ दिया, या hemin (लौह स्रोत) या desferrioxamine (लोहा chelator) के साथ इलाज किया गया। Lysates तैयार है और गुस्सा जांच (8000 सीपीएम / माइक्रोग्राम प्रति प्रोटीन) के साथ EMSA द्वारा विश्लेषण किया गया। प्रतिनिधि डेटा क्रमश: छोड़ दिया और सही पैनल पर autoradiograms के छोटे और लंबे समय तक निवेश जोखिम के साथ, चित्र 1 में दिखाया जाता है। Murine गुस्सा / IRP1 और गुस्सा / IRP2 परिसरों अलग गतिशीलता और दो अलग-अलग बैंड का प्रदर्शनअनुपचारित कोशिकाओं के लिए इसी लेन 1 में दिखाई दे रहे हैं। लोहे की पूरकता उन्हें कम है, जबकि आयरन केलेशन गहराई से, (3 लेन) IRP1 और IRP2 (2 लेन) दोनों का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधियों प्रेरित किया। यहां तक ​​कि लोहे के इलाज कोशिकाओं के अर्क में 2% 2-इ पूरी तरह से सक्रिय IRP1 (नीचे पैनल), के साथ pretreatment। इस लोहे perturbations IRP1 की स्थिरता पर टकराना नहीं है कि यह दर्शाता है और यह भी एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में कार्य करता है। इसके विपरीत करके दो-इ pretreatment के IRP2 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि हिचकते। तेजी से पलायन गैर विशिष्ट बैंड लोहे से प्रभावित नहीं हैं।

अगला, हम जंगली प्रकार के यकृत में गतिविधि गुस्सा-बाइंडिंग का विश्लेषण किया है, Irp1 - / - और Irp2 - / - पहले से एक मानक या एक लोहे की समृद्ध आहार (चित्रा 2) के साथ एक सप्ताह के लिए तंग आ चूहों,। Irp1 - / - और Irp2 - / - चूहों कृपया डॉ मेगावाट Hentze (EMBL, हीडलबर्ग) द्वारा प्रदान किया गया। जंगली प्रकार जिगर के अर्क में, IRP1 गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि और गुस्सा / IRP2 परिसरों के प्रमुख अंश के लिए हिसाब शायद ही थेपिछले टिप्पणियों 26 के साथ समझौते में दिखाई (गलियों 1, 2),। / - - चूहों (गलियों 3, 4) IRP2 जिगर Irp1 के अर्क में शक्तिशाली गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि का प्रदर्शन किया। इन शर्तों के तहत, कोई गुस्सा / IRP1 परिसरों मनाया गया। / - - इसी तरह, कोई गुस्सा / IRP2 परिसरों जिगर Irp2 के अर्क में गठन किया गया चूहों (गलियों 5, 6)। दोनों IRP1 और IRP2 के यकृत गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि एक उच्च लोहे के आहार के साथ चूहों में कम दूध पिलाने; इस आशय IRP2 (गलियों 7-12) पर अधिक नाटकीय था। ध्यान दें कि जंगली प्रकार या Irp2 के उपचार के बाद - यह स्पष्ट रूप से autoradiograms के कम जोखिम में मनाया जाता है (2-एमई, IRP1 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि यह लगभग सभी गुस्सा जांच स्थानांतरित कर दिया, जहां एक बिंदु के लिए बढ़ाया गया था के साथ जिगर के अर्क - / बाएं पैनल पर)।

/ - - चूहों (चित्रा 3) के अंत में, हम यकृत और जंगली प्रकार और Hjv की spleens में गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि का मूल्यांकन किया। Hjv - / - चूहों कृपया डॉ नेकां एंड्रयूज (ड्यूक विश्वविद्यालय, नेकां) द्वारा प्रदान किया गया। इन जानवरों को एक मॉडल का प्रतिनिधित्ववंशानुगत रक्तवर्णकता 27, reticuloendothelial मैक्रोफेज लोहे के बने हुए हैं, जबकि अत्यधिक लोहा, parenchymal कोशिकाओं में जम जाता है, जहां प्रणालीगत लोहे अधिभार, की एक बीमारी 28 कमी। जैसी कि उम्मीद थी, Hjv के यकृत - / - का प्रदर्शन (लोहे से भरी हुई हेपाटोसाइट्स) के साथ चूहों जंगली प्रकार (गलियों 1-4) की तुलना में गतिविधि गुस्सा बाध्यकारी कमी हुई। इसके विपरीत, गुस्सा बाध्यकारी गतिविधि Hjv की spleens में अधिक था - / - चूहों (लोहे की कमी मैक्रोफेज युक्त, 5-8 गलियों)। यहाँ फिर से, दो-इ उपचार जिगर के अर्क (बाएं पैनल पर autoradiograms की कम जोखिम देखें) में गुस्सा जांच के लगभग पूर्ण पारी को आगे बढ़ाया।

तालिका 1. cytoplasmic lysis बफर।

1% ट्राइटन X100
25 मिमी Tris-एचसीएल, 7.4 पीएच
40 मिमी KCl
  1. समाधान करना चाहिएautoclaved और आरटी पर संग्रहित किया जाना।
  2. Protease inhibitors, इस तरह के रूप में 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / leupeptin और 0.1 मिमी phenylmethanesulfonyl फ्लोराइड (PMSF) का उपयोग करने से पहले जोड़ा जा सकता है।
  3. ताजा 1 मिमी dithiotheritol के अलावा IRP2 गतिविधि का पता लगाने के लिए सिफारिश की है।

इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए तालिका 2. शेयर समाधान।

/ Μl linearized प्लाज्मिड टेम्पलेट एक माइक्रोग्राम प्रति
5x प्रतिलेखन बफर (T7 शाही सेना पोलीमरेज़ के साथ आपूर्ति)
एटीपी, CTP और जीटीपी की 20 मिमी मिश्रण
3000 ci / mmol [α-32p] -UTP
100 मिमी dithiothreitol
10 यू / μl RNase अवरोध करनेवाला
20 यू / μl T7 शाही सेना पोलीमरेज़


<polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन गैर denaturing के लिए मजबूत> तालिका 3. शेयर समाधान।

40% एक्रिलामाइड: bisacrylamide (37.5: 1)
5x TBE (Tris / borate / EDTA)

5x TBE की एक एल बनाने के लिए, Tris आधार के 54 ग्राम, बोरिक एसिड का 27.5 जी, और 0.5m EDTA (8.0 पीएच) के 20 मिलीलीटर का उपयोग करें।

चित्रा 1
RAW264.7 मैक्रोफेज में गतिविधियों गुस्सा बाध्यकारी चित्रा 1. आयरन निर्भर विनियमन। 10 7 कोशिकाओं / 100 माइक्रोन hemin या desferrioxamine साथ एन या तो छोड़ दिया अनुपचारित या इलाज हे थे। Cytoplasmic lysates 2% 2-इ (नीचे के अभाव (ऊपर) या उपस्थिति में एक 32 पी लेबल गुस्सा जांच के साथ EMSA द्वारा तैयार की और विश्लेषण किया गया)। गुस्सा / IRP1 और, और मुक्त गुस्सा जांच का गुस्सा / IRP2 परिसरों की स्थिति तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। सितारा एक गैर विशिष्ट बैंड इंगित करता है। Autoradiograms के छोटे और लंबे समय तक जोखिम बाएँ और दाएँ पैनलों में दिखाया जाता है, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 2
चित्रा 2 के विश्लेषण से जंगली प्रकार (WT) के यकृत में गतिविधियों गुस्सा बाध्यकारी, Irp1 - / - और Irp2 - / -। चूहों 5 सप्ताह पुरानी चूहों (एन = 2 प्रत्येक जीनोटाइप के लिए), C57BL 6 / पृष्ठभूमि 29 सब में, एक मानक या एक उच्च लोहे आहार (2% लोहे कार्बोनिल युक्त) पर रखा गया था। एक सप्ताह के बाद जानवरों euthanized थे। यकृत प्रोटीन के अर्क एक 32 पी लेबल गुस्सा जांच के साथ EMSA द्वारा तैयार की और विश्लेषण किया गया2% 2-इ (नीचे) की अनुपस्थिति (ऊपर) या उपस्थिति में। गुस्सा / IRP1 और, और मुक्त गुस्सा जांच का गुस्सा / IRP2 परिसरों की स्थिति तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। सितारा एक गैर विशिष्ट बैंड इंगित करता है। Autoradiograms के छोटे और लंबे समय तक जोखिम बाएँ और दाएँ पैनलों में दिखाया जाता है, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
/ - -। यकृत में गतिविधियों और जंगली प्रकार (WT) और Hjv की spleens गुस्सा बाध्यकारी चित्रा 3. विश्लेषण चूहों (प्रत्येक जीनोटाइप के लिए N = 2) 10 सप्ताह पुरानी चूहों, C57BL 6 / पृष्ठभूमि 30 सब में, euthanized थे। यकृत और प्लीहा प्रोटीन अर्क अनुपस्थिति (ऊपर) या की उपस्थिति में एक 32 पी लेबल गुस्सा जांच के साथ EMSA द्वारा तैयार की और विश्लेषण किया गया2% 2-इ (नीचे)। गुस्सा / IRP1 और, और मुक्त गुस्सा जांच का गुस्सा / IRP2 परिसरों की स्थिति तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं। सितारा एक गैर विशिष्ट बैंड इंगित करता है। Autoradiograms के छोटे और लंबे समय तक जोखिम बाएँ और दाएँ पैनलों में दिखाया जाता है, क्रमशः। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस के साथ साथ, हम IRP1 और IRP2 का गुस्सा बाध्यकारी गतिविधियों का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और हम प्रतिनिधि डेटा दिखाने के लिए। विभिन्न जांच का उपयोग करके, इस प्रोटोकॉल भी अन्य शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के अध्ययन के लिए समायोजित किया जा सकता है। एक महत्वपूर्ण कदम जांच के आकार है। सटीक बाध्यकारी साइट अज्ञात है जब आम है, जो लंबे समय से जांच के प्रयोग, मुक्त शाही सेना से अलग विस्थापित नहीं है कि शाही सेना / प्रोटीन परिसरों में परिणाम कर सकते हैं। इस मामले में, यह RNase T1 (कदम 6.6) के साथ इलाज के द्वारा अनबाउंड शाही सेना को हटाने के लिए सलाह दी जाती है। जांच की गुणवत्ता भी बहुत महत्वपूर्ण है। सर्वश्रेष्ठ परिणाम हौसले से तैयार radiolabeled शाही सेना के साथ प्राप्त कर रहे हैं। जेल शुद्धि 10 आवश्यक नहीं है, लेकिन (कोई RNase T1 के पाचन कदम शामिल है और अगर) जांच की तैयारी के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया समयपूर्व समाप्ति उत्पादों पैदावार अगर EMSA की उपस्थिति में सुधार हो सकता है। देशी जेल वैद्युतकणसंचलन भी तेजी एम रनिंगप्र आरएनए / प्रोटीन परिसरों की हदबंदी के लिए नेतृत्व और फजी बैंड में हो सकता है, जो overheating के परिणाम में।

मात्रात्मक परिणाम phosphorimaging साथ मंद बैंड की तीव्रता का विश्लेषण करके प्राप्त किया जा सकता है। शाही सेना जांच के अतिरिक्त में मौजूद है और शाही सेना के बंधन के लिए सीमित नहीं है जब quantifications ही मान्य हैं। मुक्त ऊर्जा ΔG से जुड़ा हुआ है कि हदबंदी निरंतर कश्मीर डी द्वारा प्रतिनिधित्व आरएनए / प्रोटीन बातचीत की आत्मीयता, radiolabeled जांच तीन की मात्रा को कम करने के साथ शाही सेना बाध्यकारी गतिविधि titrating द्वारा संतुलन शर्तों के तहत मूल्यांकन किया जा सकता है। गुस्सा / IRP1 बातचीत बड़े पैमाने पर physicochemically 9,31 विशेषता दिया गया है। एक शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की मात्रा बदलती के साथ अनुमापन EMSA प्रयोगों stoichiometry तीन की गणना करने के लिए किया जा सकता है। बंधन के लिए विशिष्टता आसानी लेबल हटाया गया "ठंड" कंप्यूटर अनुप्रयोग की अतिरिक्त के साथ प्रतिस्पर्धा प्रयोगों द्वारा मान्य किया जा सकता हैetitor RNAs 3। केवल विशिष्ट प्रतियोगियों मंद रेडियोधर्मी बैंड की तीव्रता को कम करना चाहिए। विशिष्टता भी 7 एक "supershift" निकलेगा जो EMSA प्रतिक्रिया में शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी, सहित द्वारा नजर रखी जा सकती है। यह भी शाही सेना बाध्यकारी प्रोटीन की पहचान निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। नहीं "supershift" गैर विशिष्ट एंटीबॉडी या पूर्व प्रतिरक्षा सीरम के साथ मनाया जाना चाहिए।

अंत में, EMSA आरएनए / प्रोटीन बातचीत के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। यह प्रदर्शन करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है और कम से कम बुनियादी ढांचे की आवश्यकता है। यह फिल्टर बाध्यकारी परख के रूप में सरल नहीं है, लेकिन कई आरएनए बंधनकारी प्रोटीन (जैसे IRP1 और IRP2 के रूप में) की जांच के साथ विशेष रूप से जब बातचीत अधिक जानकारीपूर्ण और सटीक डाटा निकलेगा। यह murine के विपरीत, मानव गुस्सा / IRP1 और गुस्सा / IRP2 परिसरों EMSA में सह विस्थापित कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हालांकि, वे "supershifts̶ के द्वारा अलग किया जा सकता है1; विशिष्ट एंटीबॉडी 7 के साथ। EMSA आरएनए / प्रोटीन बातचीत का विस्तृत मानचित्रण के लिए मूल्यवान नहीं है; toeprinting या 32 पार से जोड़ने ऐसे RNase संरक्षण परख के रूप में अन्य तकनीकों, अधिक उपयुक्त हैं। फिर भी EMSA IRPs 8 के साथ इस मामले की गई, लेकिन यह भी कम्प्यूटेशनल या उच्च throughput प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के साथ प्राप्त आंकड़ों की पुष्टि के लिए किया गया है, के रूप में नई शाही सेना / प्रोटीन बातचीत की खोज के लिए एक शानदार विकल्प है। इसके अलावा, EMSA आरएनए / प्रोटीन बातचीत की विशिष्टता और भौतिक गुणों का विश्लेषण करने के लिए बेहतर है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

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References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

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