Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) for studier av RNA-Protein Interaksjoner: The IRE / IRP Eksempel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å analysere RNA / protein interaksjoner. Den elektroforetiske mobilitet skift analyse (EMSA) er basert på differensial migrering av RNA / protein-komplekser og fri RNA under opprinnelig gelelektroforese. Ved å bruke en radioaktivt merket RNA-probe, kan RNA / proteinkomplekser bli visualisert ved autoradiografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / protein interaksjoner er kritiske for post-transkripsjonsregulerende trasé. Blant de best karakterisert cytosoliske RNA-bindende proteiner er jern regulatoriske proteiner, IRP1 og IRP2. De bindes til jern responsive elementer (IRES) innenfor de ikke-translaterte regioner (UTR) av flere mål-mRNA, for derved å styre mRNA oversettelse eller stabilitet. IRE / IRP interaksjoner har blitt mye studert av EMSA. Her beskriver vi EMSA-protokollen for å analysere IRE-bindende aktivitet av IRP1 og IRP2, som kan generaliseres for å vurdere aktiviteten av andre RNA-bindende proteiner i tillegg. En rå protein lysat som inneholder en RNA-bindende protein, eller et renset preparat av dette protein, blir inkubert med et overskudd av 32 P-merket RNA-probe, slik at for kompleksdannelse. Heparin ble tilsatt for å forhindre ikke-spesifikk protein til probe binding. Deretter blir blandingen analysert ved ikke-denaturerende elektroforese på en polyakrylamid-gel. Den frie sondevandrer raskt, mens RNA / protein komplekse utstillinger tilbakestående mobilitet; Derfor er fremgangsmåten også kalt "gel retardasjon" eller "bandshift" assay. Etter fullføring av elektroforese, gelen ble tørket og RNA / proteinkomplekser, så vel som fri probe, blir detektert ved autoradiografi. Det overordnede målet med protokollen er å oppdage og kvantifisere IRE / IRP og andre RNA / protein interaksjoner. Videre kan EMSA også brukes for å bestemme spesifisiteten, bindingsaffinitet, og støkiometri av RNA / protein interaksjon under undersøkelse.

Introduction

EMSA ble opprinnelig utviklet for å studere sammenslutning av DNA-bindende proteiner med target DNA-sekvenser 1,2. Prinsippet er det samme for RNA / protein interaksjoner tre, som er i fokus i denne artikkelen. I korthet, blir RNA negativt ladet og vil migrere mot anoden under ikke-denaturerende elektroforese på polyakrylamid (eller agarose) geler. Migrering innenfor gelen avhenger av størrelsen av RNA, som er proporsjonal med dens kostnader. Spesifikk binding av et protein til RNA forandrer sin bevegelsesfrihet, og den komplekse vandrer langsommere i forhold til den frie RNA. Dette skyldes i hovedsak en økning i molekylvekt, men også til endringer i kostnad og muligens konformasjon. Utnytte en merket RNA som probe gir enkel overvåking av "gelretardasjon" eller "bandshift". Bruk av 32 P-merket RNA prober er svært vanlig, og tilbyr høy følsomhet. Migrasjon av RNA / protein komplekser og gratis RNA oppdagesved autoradiografi. Ulempene er de korte halveringstid på 32 P (14,29 dager), den gradvise forringelse av kvaliteten av sonden på grunn av radio, kravet om et radioaktiviteten lisens og infrastruktur for radioaktivitet arbeid, og for biologisk potensielle bekymringer. Derfor har alternative ikke-isotoper metoder for merking av RNA probe blitt utviklet, for eksempel med fluoroforene eller biotin, som gjør påvisning av fluorescerende eller kjemiluminiscerende bildebehandling 4,5. Begrensninger av disse fremgangsmåter er de høyere kostnader og er ofte redusert sensitivitet sammenlignet med isotopisk merking, og potensialet av ikke-isotop-markører for å interferere med RNA / protein-interaksjon. Ikke-denaturering polyakrylamidgeler er egnet for de fleste EMSA applikasjoner og blir ofte brukt. Av og til kan agarosegel utgjøre et alternativ for analyse av store komplekser.

Den store fordelen med EMSA er at den kombinerer enkelhet, følsomhet og robusthet 4 </ Sup>. Analysen kan være ferdig i løpet av noen timer, og krever ikke avansert instrumentering. RNA / protein interaksjoner kan påvises ved EMSA ved konsentrasjoner så lave som 0,1 nM eller mindre, og innenfor et bredt spekter av bindingsbetingelser (pH 4,0 til 9,5, monovalente saltkonsentrasjon 1-300 mM, og temperatur 0-60 ° C).

RNA / protein-kompleksdannelse kan også bli studert av filterbindingsanalysen. Dette er en enkel, rask og rimelig prosedyre basert på oppbevaring av RNA / protein komplekser i et nitrocellulosefilter, mens en gratis RNA probe går gjennom seks. Sammenlignet med EMSA, er den begrenset i de tilfeller hvor RNA probe inneholder flere bindingsseter, eller det rå ekstrakt inneholder mer enn en RNA-bindende proteiner som bindes til proben på samme sted. Mens flere RNA / protein interaksjoner vil unnslippe deteksjon av filterbindingsanalysen, kan de lett bli visualisert ved EMSA. I noen tilfeller, er visualisering even er mulig når to RNA / proteinkomplekser samvandrer (for eksempel human IRP1 / IRE og IRP2 / IRE komplekser), ved tilsetning av et antistoff mot en av RNA-bindende proteiner til EMSA reaksjonen, noe som ga ytterligere retardasjon på gelen ( "supershift") 7.

EMSA har vært mye brukt til å studere IRP1 og IRP2, som er post-transcriptional regulatorer av jern metabolisme 8-10. De opererer ved å binde seg til Ires, fylogenetisk konserverte hårnål strukturer innenfor UTR av flere mRNA 11. IRES ble først oppdaget i mRNA som koder for ferritin 12 og transferrin reseptor 1 (TfR1) 13, proteiner av jern lagring og opptak, respektivt. Senere Ires ble funnet i erythroid spesifikke aminolevulinat syntase (ALAS2) 14, mitokondrie aconitasen 15, Ferroportin 16, toverdig metal transporter 1 (DMT1) 17, hypoksi induserbar faktor 2 18, og andre mRNAer 19-21. Prototypen H- og L-ferritin mRNAs inneholde en IRE i sin 5 'UTR, mens TfR1 mRNA inneholder flere Ires i sin 3' UTR. IRE / IRP interaksjoner spesifikt hemme ferritin mRNA oversettelse av sterisk blokkere sin tilknytning av 43s ribosomale subenheten; dessuten stabilisere de TfR1 mRNA mot endonucleolytic cleavage. IRP1 og IRP2 aksje omfattende sekvenslikhet og viser høy IRE-bindende aktivitet i jern-sultet celler. I jern fylt celler, samler IRP1 en cubane Fe-S klynge som konverterer det til cytosolisk aconitasen på bekostning av sin IRE-bindende aktivitet, mens IRP2 gjennomgår proteasomal degradering. Således IRE / IRP interaksjoner avhenge av den cellulære jernstatus, men er også regulert av andre signaler, som for eksempel H 2 O 2, nitrogenoksid (NO) eller hypoksi. Her beskriver vi protokollen for å vurdere IRE-bindingsaktivitet fra rått celler og vev ekstrakter av EMSA. Vi brukte en 32 P-merkede H-ferritin IRE probe som ble generert ved in vitro transkripsjon fra en plasmid DNA-templat (I-12.CAT), hvor IRE-sekvensen ble opprinnelig innført i sense-orientering nedstrøms for T7-RNA-polymerase-område ved kloning av glødet syntetiske oligonukleotider 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle prosedyrer med mus ble godkjent av Animal Care komité McGill University (protokoll 4966).

1. Utarbeidelse av proteinekstrakter fra dyrkede celler

  1. Vask dyrkede cellene to ganger med 10 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS).
  2. Skrap adherente celler med enten en gummistav eller en plastcelleskrape i 1 ml iskald PBS, overføre suspensjonen inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  3. Spin i en mikrosentrifuge i 5 minutter ved 700 xg, ved 4 ° C. Aspirer PBS.
  4. Tilsett 100 ul iskald cytoplasmisk lyseringsbuffer (Tabell 1) per 10 7-celler, og pipettere opp og ned.
  5. Inkuber på is i 20 min.
  6. Spinn i 10 minutter med full hastighet i en mikrosentrifuge ved 4 ° C.
  7. Forkast pellet. Overfør supernatanten til ny 1,5 ml mikrosentrifugerør og holde på is.
  8. Detrøyskatt proteinkonsentrasjon (vanligvis 1 - 10 ug / ul) ved anvendelse av Bradford-analysen 23.
  9. Aliquot og lagre celleekstrakter ved -80 ° C inntil bruk.

2. Utarbeidelse av proteinekstrakter fra mus lever og milt

  1. Avlive en mus med CO 2 innånding.
  2. Lå den avlives dyr på en ren pad over en dissekere bord. Åpne buken med en saks.
  3. Dissekere lever og milt ved hjelp av sakser og pinsetter, og skyll hvert vev i ca. 50 ml iskald PBS.
  4. Umiddelbart skjære vev i små biter med en skalpell (for eksempel omtrent 1 - 2 mm 3).
  5. Uten forsinkelse, sette biter av vev i en fersk kryorør og deretter knipse fryse dem i flytende nitrogen. Butikk snap-frosne vev alikvoter ved -80 ° C inntil bruk.
  6. Homogenisere en del av frosne vev (ca. 1 - 2 mm 3) i 0,25 til 0,5 ml aviskald cytoplasmisk lyseringsbuffer (Tabell 1) med en vev-homogenisator i 10 sek.
  7. Overfør homogenat til 1,5 ml mikrosentrifugerør og chill på is i 20 min.
  8. Spinn i 10 minutter med full hastighet i en mikrosentrifuge ved 4 ° C.
  9. Kast pellet og overføring supernatanten til ny 1,5 ml mikro tube. Hold på is.
  10. Bestem proteinkonsentrasjon (vanligvis 1 - 10 ug / ul) ved anvendelse av Bradford-analysen 23.
  11. Aliquot og lagre celleekstrakter ved -80 ° C inntil bruk.

3. Fremstilling av radiomerket IRE-probe

  1. Linearisere IRE-inneholdende plasmid I-12.CAT 22 ved inkubering ved 37 ° C i 1 time med restriksjonsendonukleasen Xbal (1 U pr ug av plasmid), som spalter nedstrøms for IRE-sekvensen. Det lineariserte plasmid blir brukt som templat for in vitro transkripsjon.
  2. Sett opp enn in vitro transkripsjonsreaksjon i et totalvolum på 20 ul. Bruk stamløsninger vist i tabell 2 og legge til: 1 mL linearized plasmid mal, 4 pl transkripsjon buffer; 1 pl blanding av ATP / CTP / GTP blanding, 10 pl [α- 32P] -UTP, 2 ul ditiotreitol, 1 ul RNase inhibitor og 1 ul T7 RNA polymerase. Bland ved å pipettere opp og ned.
  3. Inkuber ved 40 ° C i 1 time 24.

4. Rensing av Radiomerket IRE-sonde

  1. Terminere in vitro transkripsjonsreaksjon ved å tilsette en ul av 0,5 M EDTA, pH 8. Bland ved å pipettere opp og ned.
  2. Tilsett 10 pl av 10 mg / ml tRNA, som bærer for bedre utfelling. Bland ved å pipettere opp og ned.
  3. Legg 82,5 ul av 3 M ammoniumacetat. Bland ved virvling.
  4. Legg 273 ul etanol. Bland ved virvling.
  5. La stå ved RT i 5 min.
  6. Spinne i 10 min i full fart i en mikro ved RT. Kast supernatant.
  7. Vask pellet med 100 mL av 70% etanol.
  8. Spinne i 10 min i full fart i en mikro ved RT. Kast supernatant.
  9. Luft, tørr pellet i 10 min.
  10. Resuspender pellet i 100 ul dobbeltdestillert, på forhånd autoklavert H 2 O.
  11. Kvantifisere radioaktivitet i en væske-scintillasjonsteller, alikvot radiomerket IRE-probe og oppbevar ved -80 ° C inntil bruk. Frosne porsjoner kan brukes i opptil 3 uker.

5. Utarbeidelse av en innfødt polyacrylamidgel for EMSA

  1. Monter gel (16 x 16 cm) ved hjelp av 1,5 mm spacere og kam.
  2. For å fremstille en 6% polyakrylamidgel innebygd, bruke stamløsninger som vist i tabell 3. Bland 7,5 ml av 40% akrylamid.: Bisakrylamid, 5 ml 5 x TBE og 37,5 mldobbelt destillert H 2 O.
  3. Tilsett 0,5 ml 10% nylaget ammoniumpersulfat (APS), og 25 ul tetrametyletylendiamin (TEMED).
  4. Umiddelbart hell akrylamid løsning på gel og la den polymerisere. Vent ca. 30 min.
  5. Montere elektroforeseapparaturen med gel, fylle tankene med 0,5x TBE og kontakt med strømforsyningen.

6. Elektro Mobility Shift-analyse

  1. Fortynn 25 ug av proteinekstrakten fra celler eller vev med cytoplasmisk lyseringsbuffer (tabell 1) i et totalvolum på 10 ul (lavere proteinkonsentrasjoner kan også anvendes). Hold på is. Hvis det er nødvendig, tilsett 1 pl 1: 4 fortynnet 2-merkaptoetanol (2-ME) for å aktivere latent IRP1 (sluttkonsentrasjon: 2%) 25.
  2. Fortynne radiomerket IRE sonde i dobbelt destillert H 2 O til 200 000 kopier / ul, varme denaturering ved 95 °C i 1 minutt, og avkjølt ved romtemperatur i minst 5 min.
  3. Sett opp en EMSA reaksjonen ved å tilsette en ul av radioaktivt merket probe IRE til proteinekstrakt.
  4. Inkuber i 20 min ved RT.
  5. Tilsett 1 pl av 50 mg / ml heparin til reaksjonen (for å hindre ikke-spesifikke proteininteraksjoner med sonden 9) og fortsette inkubering i ytterligere 10 min. Alikvot av stamoppløsning av heparin (50 mg / ml) og oppbevares ved -80 ° C.
  6. Ved bruk av lange radiomerkede prober (> 60 nukleotider), tilsett 1 pl RNase T1 (1 U / pl) og inkuberes i 10 minutter ved RT for å redusere ikke-spesifikk proteinbinding på sonden, og for å tillate bedre separasjon av RNA / protein kompleks under elektroforese.
  7. Tilsett 3 mL av ladningsbuffer (80% glycerol + bromfenolblått), bland og belastningen på 6% ikke-denaturerende polyakrylamidgel.
  8. Kjør gelen i 60 minutter ved 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer gelen på en stor filterpapir og tørk.
  10. Utsettes for en film og utvikle autoradiografi. Eksponeringstiden kan variere fra 1 time (eller mindre) opp til O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En radioaktivt merket probe IRE ble fremstilt, som beskrevet i avsnitt 3 og 4 av protokollen. Sekvensen av sonden var 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; de uthevet nukleotider representerer en uparet C rest og loop, som er kritiske IRE funksjoner. Den spesifikke radioaktiviteten til proben var 4,5 x 10 9 cpm / ug av RNA.

For å vurdere effekten av jern perturbasjoner på IRE-bindende aktivitet, ble murine RAW264.7 makrofager venstre ubehandlet, eller behandlet med hemin (jernkilde) eller desferrioksamin (jernbindende). Lysater ble preparert og analysert ved EMSA med IRE sonden (8000 cpm / ug protein). Representative data er vist i figur 1, med korte og lange eksponeringer av autoradiogrammene på de venstre og høyre panelene, respektivt. Murine IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser vise forskjellig mobilitet og to forskjellige bander synlige i felt 1, tilsvarende ubehandlede celler. Jernkelateringen dypt indusert de IRE-bindende aktiviteter av både IRP1 og IRP2 (kolonne 2), mens jerntilskudd redusert dem (spor 3). Forbehandling med 2% 2-ME fullt aktivert IRP1 (nederst panel), selv i ekstrakter av jern-behandlede celler. Dette viser at jern forstyrrelsene ikke gå utover stabiliteten i IRP1 og fungerer også som en lasting kontroll. I motsetning til 2-ME forbehandling inhiberte IRE-bindende aktivitet av IRP2. De raske trekkende uspesifikke bånd blir ikke påvirket av jern.

Deretter analyserte vi IRE-bindende aktivitet i leveren hos villtype, Irp1 - / - og Irp2 - / - mus, som tidligere matet i en uke med en standard eller en jern-anrikede diett (figur 2). Den Irp1 - / - og Irp2 - / - mus ble vennlig levert av Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). I villtype lever ekstrakter, IRP1 stod for hovedandelen av IRE-bindende aktivitet og IRE / IRP2 komplekser var neppesynlige (baner 1, 2), i enighet med tidligere observasjoner 26. IRP2 oppviste potent IRE-bindingsaktivitet i leverekstrakter Irp1 - / - mus (sporene 3, 4). Under disse forholdene, ble det ikke IRE / IRP1 komplekser observert. Likeledes ble ingen IRE / IRP2 komplekser dannet i leverekstrakter Irp2 - / - mus (sporene 5, 6). Fôring mus med en høy-jern diett redusert lever IRE-bindingsaktivitet av både IRP1 og IRP2; denne effekten var mer dramatisk på IRP2 (baner 7-12). Legg merke til at etter behandling av villtype eller Irp2 - / - leverekstrakter med 2-ME, den IRE-bindende aktivitet av IRP1 ble forbedret til et punkt hvor det forskyves nesten alle IRE probe (dette er tydelig observert i den kortere eksponering av autoradiogrammene på venstre panel).

Til slutt, vi evaluerte IRE-bindende aktivitet i lever og milt av villtype og Hjv - / - mus (figur 3). Den Hjv - / - mus ble vennlig levert av Dr. NC Andrews (Duke University, NC). Disse dyrene representerer en modellav arvelig hemokromatose 27, en sykdom av systemisk jernoverskudd, hvor mye jern akkumulerer i parenkymceller, mens retikuloendoteliale makrofager forbli jern mangel 28. Som forventet, lever av Hjv - / - mus (med jern-lastet hepatocytter) utstilt redusert IRE-bindende aktivitet sammenlignet med villtype (baner 1-4). Omvendt, IRE-bindende aktiviteten var høyere i spleens av Hjv - / - mus (som inneholder jern-mangelmakrofager, baner 5-8). Igjen her, 2-ME behandling forfremmet nesten komplett skift av IRE sonde i lever ekstrakter (se kortere eksponering av autoradiogrammene på venstre panel).

Tabell 1. Cytoplasmatisk lysisbuffer.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCl, pH 7.4
40 mM KCl
  1. Løsningen børbli autoklavert og lagret ved romtemperatur.
  2. Protease-inhibitorer, for eksempel 10 pg / ml leupeptin og 0,1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) kan tilsettes før bruk.
  3. Tilførsel av frisk 1 mM dithiotheritol er anbefalt for påvisning av IRP2 aktivitet.

Tabell 2. Aksje løsninger for in vitro transkripsjon reaksjon.

1 pg / pl linearisert plasmid mal
5x transkripsjon buffer (følger med T7 RNA polymerase)
20 mM blanding av ATP, CTP og GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM dithiothreitol
10 U / mL RNase inhibitor
20 U / pl T7 RNA polymerase


<strong> Tabell 3. Aksje løsningene for ikke-denaturering polyakrylamidgelelektroforese.

40% akrylamid: bisakrylamid (37,5: 1)
5x TBE (Tris / borat / EDTA)

For fremstilling av 1 liter 5 x TBE, bruker 54 g Tris-base, 27,5 g borsyre, og 20 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figur 1
Figur 1. Iron avhengig regulering av IRE-bindende aktiviteter i RAW264.7 makrofager. 10 7 celler var enten venstre ubehandlet eller behandlet O / N med 100 mikrometer hemin eller desferrioksamin. Cytoplasmatiske lysater ble fremstilt og analysert ved EMSA med en 32P-merket probe IRE i fravær (øverst) eller i nærvær av 2% 2-ME (bunn). Posisjonene til IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser, og av fri IRE sonde er indikert med piler. Stjernen angir et ikke-spesifikke bånd. Kortere og lengre eksponeringer av autoradiogrammene er vist i venstre og høyre paneler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Analyse av IRE-bindende aktivitet i leveren hos villtype (wt), Irp1 - / - og Irp2 - / -. Mus 5 uker gamle mus (n = 2 for hver genotype), alt i C57BL / 6 bakgrunn 29 ble plassert på en standard eller en høy-jern diett (inneholdende 2% karbonyl jern). Etter en uke ble dyrene avlivet. Leverproteinekstrakter ble fremstilt og analysert ved EMSA med en 32P-merket probe IREi fravær (øverst) eller i nærvær av 2% 2-ME (nederst). Posisjonene til IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser, og av fri IRE sonde er indikert med piler. Stjernen angir et ikke-spesifikke bånd. Kortere og lengre eksponeringer av autoradiogrammene er vist i venstre og høyre paneler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse av IRE-bindende aktiviteter i lever og milt av villtype (wt) og Hjv - / - mus. 10 uker gamle mus (n = 2 for hver genotype), alt i C57BL / 6 bakgrunn 30, ble avlivet. Lever- og milt-proteinekstrakter ble fremstilt og analysert ved EMSA med en 32P-merket probe IRE i fravær (øverst) eller nærvær av2% 2-ME (nederst). Posisjonene til IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser, og av fri IRE sonde er indikert med piler. Stjernen angir et ikke-spesifikke bånd. Kortere og lengre eksponeringer av autoradiogrammene er vist i venstre og høyre paneler, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri beskriver vi en protokoll som er utviklet for å studere IRE-bindende aktiviteter av IRP1 og IRP2, og vi viser representative data. Ved å bruke forskjellige prober, kan denne protokollen også justeres for studiet av andre RNA-bindende proteiner. Et kritisk punkt er størrelsen av proben. Bruk av lange prober, noe som er vanlig når det nøyaktige bindingssetet er ukjent, kan resultere i RNA / protein-komplekser som ikke migrerer annerledes enn den frie RNA. I dette tilfelle er det tilrådelig å fjerne ubundet RNA ved behandling med RNase T1 (trinn 6.6). Kvaliteten av sonden er også svært viktig. Best resultat oppnås med nylagde radiomerket RNA. Gelrensing 10 er ikke nødvendig, men kan forbedre utseendet av EMSA hvis in vitro transkripsjonsreaksjon for tilberedning probe gir tidlig avslutning produkter (og hvis ingen RNAse T1 digereringstrinnet er inkludert). Kjører den innfødte gel elektroforese for fort may føre til overoppheting, noe som kan føre til dissosiasjon av RNA / protein komplekser og resultere i fuzzy band.

Kvantitative resultater kan oppnås ved å analysere intensiteten av den tilbakestående bånd med phosphorimaging. Kvantifiseringen er bare gyldig når RNA probe er til stede i overkant og er ikke begrensende for RNA bindende. Affiniteten av RNA / protein interaksjon, representert ved dissosiasjonskonstant Kd som er knyttet til den frie energi ΔG o, kan bli vurdert under likevektsbetingelser ved titrering av RNA-bindende aktivitet med avtagende mengder av radioaktivt merket probe 3. Den IRE / IRP1 interaksjon har blitt grundig preget physicochemically 9,31. Titrering EMSA eksperimenter med varierende mengder av en RNA-bindende protein kan utføres for å beregne støkiometri 3. Spesifisitet for binding kan lett validert av konkurranse eksperimenter med overkant av umerket "kald" kompetitor RNA tre. Kun bestemte konkurrenter bør redusere intensiteten av den retarderte radioaktive bånd. Spesifisitet kan også overvåkes ved å ta med et antistoff mot RNA-bindende protein i EMSA reaksjon, som vil gi en "supershift" 7. Dette kan også utnyttes for å bestemme identiteten til den RNA-bindende protein. Nei "supershift" bør observeres med ikke-spesifikke antistoffer eller pre-immune serum.

I konklusjonen, er det EMSA en kraftig metode for analyse av RNA / protein interaksjoner. Det er relativt enkelt å utføre og krever minimal infrastruktur. Det er ikke så enkel som filter-bindingsanalysen, men vil gi en mer omfattende og nøyaktige data når multiple RNA-bindende proteiner som interagere spesifikt med proben (som IRP1 og IRP2). Det bør bemerkes at i motsetning til murin, human IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser ko-migrerer i EMSA. De kan imidlertid separeres ved "supershifts̶1; med spesifikke antistoffer 7. EMSA er ikke verdifull for detaljert kartlegging av RNA / protein interaksjoner; andre teknikker, slik som RNase-beskyttelsestest, toeprinting eller tverrbindings 32 er mer hensiktsmessig. Likevel EMSA er et utmerket valg for å oppdage nye RNA / protein interaksjoner, som har vært tilfelle med IRPs 8, men også for bekreftende data innhentet med beregnings eller høy gjennomstrømning eksperimentelle tilnærminger. Videre er EMSA overlegen for å analysere spesifisitet og fysiokjemiske egenskaper av RNA / protein interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics