Elektrofore Mobility Shift Assay (EMSA) för studier av RNA-proteininteraktioner: The IRE / IRP Exempel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera RNA / proteininteraktioner. Den elektroforetiska rörligheten shift assay (EMSA) är baserad på den differentiella migreringen av RNA / proteinkomplex och fri RNA under nativ gelelektrofores. Genom att använda en radiomärkt RNA-prob, kan RNA / proteinkomplex visualiseras genom autoradiografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / proteinväxelverkningar är kritiska för post-transkriptionella regulatoriska vägar. Bland de bäst karakteriserade cytosoliska RNA-bindande proteiner är järn reglerande proteiner, IRP1 och IRP2. De binder till järn responsiva element (IRES) inom de oöversatta regionerna (UTR) för flera målgrupper mRNA, därigenom styra mRNA översättning eller stabilitet. IRE / IRP interaktioner har studerats ingående av EMSA. Här beskriver vi EMSA protokoll för att analysera IRE-bindande aktivitet IRP1 och IRP2, vilket kan generaliseras för att bedöma aktiviteten hos andra RNA-bindande proteiner också. Ett råprotein lysat innehållande ett RNA-bindande protein, eller en renad beredning av detta protein, inkuberas med ett överskott av 32 P-märkt RNA-sond, vilket möjliggör komplexbildning. Heparin tillsätts för att utesluta icke-specifikt protein för att sondera bindning. Därefter blandningen analyserades genom icke-denaturerande elektrofores på en polyakrylamidgel. Den fri probvandrar snabbt, medan RNA / protein komplex utställningar efterbliven rörlighet; följaktligen är förfarandet även kallad "gelretardation" eller "bandshift" -analys. Efter fullbordande av elektrofores gelén torkas och RNA / proteinkomplex, liksom fri prob, detekteras genom autoradiografi. Det övergripande målet med protokollet är att detektera och kvantifiera IRE / IRP och andra RNA / proteininteraktioner. Dessutom kan EMSA också användas för att bestämma specificiteten, bindningsaffinitet och stökiometrin av RNA / proteininteraktioner under utredning.

Introduction

Den EMSA utvecklades ursprungligen för att studera sammanslutning av DNA-bindande proteiner med mål-DNA-sekvenser 1,2. Principen är densamma för RNA / proteininteraktioner 3, vilket är i fokus för denna artikel. I korthet RNA negativt laddad och kommer att migrera mot anoden under icke-denaturerande elektrofores i polyakrylamid (eller agaros) geler. Migration i gelén beror på storleken av RNA, som är proportionell mot dess laddning. Specifik bindning av ett protein till RNA förändrar sin rörlighet och de komplexa migrerar långsammare jämfört med den fria RNA. Detta beror främst på en ökning i molekylvikt, men också till förändringar i laddningen och eventuellt konformation. Använda en märkt RNA som sond möjliggör enkel övervakning av "gelretardation" eller "bandshift". Användning av 32 P-märkta RNA-sonder är mycket vanligt och erbjuder hög känslighet. Migreringen av RNA / proteinkomplex och gratis RNA upptäcksgenom autoradiografi. Nackdelar är den korta halveringstiden för 32 P (14,29 dagar), den gradvisa försämringen av kvaliteten på sonden pga strålning, kravet på en radioaktivitet licens och infrastruktur för radioaktivitet arbete, och potentiella biosäkerhet oro. Därför har alternativa icke-isotop metoder för märkning av RNA-sond utvecklats, till exempel med fluoroforer eller biotin, vilket möjliggör detektion av fluorescerande eller kemiluminescerande avbildning 4,5. Begränsningar av dessa metoder är den högre kostnaden och ofta minskad känslighet jämfört med isotopmärkning, och potentialen för icke-isotop etiketter för att störa interaktionen RNA / protein. Icke-denaturerande polyakrylamidgeler är lämplig för de flesta EMSA tillämpningar och används ofta. Ibland kan agarosgeler utgöra ett alternativ för analys av stora komplex.

Den stora fördelen med EMSA är att den kombinerar enkelhet, känslighet och robusthet 4 </ Sup>. Analysen kan slutföras inom ett par timmar och inte kräver sofistikerad instrumentering. RNA / protein-interaktioner kan detekteras genom EMSA vid koncentrationer så låga som 0,1 nM eller mindre, och inom ett brett spektrum av bindningsbetingelser (pH 4,0-9,5, envärda saltkoncentration 1-300 mM, och temperatur 0-60 ° C).

RNA / proteinkomplexbildning kan också studeras genom filterbindningsanalysen. Detta är en enkel, snabb och billig procedur baserad på lagring av RNA / proteinkomplex i en nitrocellulosa filter, medan en fri RNA prob passerar 6. Jämfört med EMSA, är den begränsad i de fall där RNA-sond innehåller flera bindningsställen, eller råextraktet innehåller mer än en RNA-bindande proteiner som binder till sonden på samma plats. Medan flera RNA / proteininteraktioner kommer att undgå upptäckt av filtret-bindande analys, kan de lätt visualiseras genom EMSA. I vissa fall är visualisering even möjlig när två RNA / proteinkomplex co-migrate (till exempel, mänsklig IRP1 / IRE och IRP2 / IRE komplex), genom att lägga till en antikropp mot en av RNA-bindande proteiner till EMSA reaktionen, vilket ger ytterligare retardation på gelen ( "supershift") 7.

EMSA har i stor utsträckning använts för att studera IRP1 och IRP2, vilka är post-transkriptionsregulatorer av järn metabolism 8-10. De fungerar genom att binda till IRES, fylogenetiskt bevarade hårnålsstrukturer inom UTR flera mRNA 11. IRES upptäcktes först i mRNA kodar ferritin 12 och transferrinreceptor 1 (TfR1) 13, proteiner av järn lagring och upptag, respektive. Senare, IRES hittades i erytroid specifika aminolevulinat syntas (ALAS2) 14, mitokondrie aconitase 15, ferroportin 16, tvåvärd metall transportör 1 (DMT1) 17, hypoxi inducerbara faktor 2 18, och andra mRNA 19-21. Prototypen H- och L-ferritin mRNA innehåller en IRE i deras 5 'UTR, medan TfR1 mRNA innehåller flera IRES i sin 3' UTR. IRE / IRP interaktioner hämmar specifikt ferritin mRNA översättning steriskt blockera dess associering av de 43S ribosomala subenheten; dessutom de stabiliserar TfR1 mRNA mot endonukleolytisk klyvning. IRP1 och IRP2 dela omfattande sekvenslikhet och uppvisar hög IRE-bindande aktivitet i järn-svalt celler. I järn fylld celler, IRP1 monterar en cubane Fe-S kluster som omvandlar den till cytosoliska aconitase på bekostnad av dess IRE-bindande aktivitet, medan IRP2 undergår proteasomal nedbrytning. Således IRE / IRP interaktioner beror på den cellulära järnstatus, men är också regleras av andra signaler, som H 2 O 2, kväveoxid (NO) eller hypoxi. Här beskriver vi protokoll för bedömning IRE-bindande aktivitet från rå cell- och vävnadsextrakt från EMSA. Vi använde en 32 P-märkt H-ferritin IRE prob som genererades genom transkription in vitro från en plasmid DNA-mall (I-12.CAT), där IRE-sekvensen introducerades ursprungligen i sense orientering nedströms om T7-RNA-polymeras webbplats genom kloning av glödgad syntetiska oligonukleotider 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Experimentella förfaranden med möss godkändes av Animal Care kommittén McGill University (protokoll 4966).

1. Beredning av proteinextrakt från odlade celler

  1. Tvätta odlade celler två gånger med 10 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Skrapa vidhäftande celler med antingen en gummiskrapa eller en plastcellskrapa i 1 ml iskall PBS, överföring suspension i en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  3. Spin i en mikrocentrifug under 5 minuter vid 700 xg, vid 4 ° C. Aspirera PBS.
  4. Lägg 100 | il iskall cytoplasmatisk lysbuffert (tabell 1) per 10 7 celler, och pipettera upp och ner.
  5. Inkubera på is under 20 min.
  6. Spin under 10 minuter vid full hastighet i en mikrocentrifug vid 4 ° C.
  7. Släng pelleten. Överför supernatanten i ny 1,5 ml mikrocentrifugrör och hålla på is.
  8. Dethermelin proteinkoncentration (vanligtvis 1 - 10 | ig / | il) med användning av Bradford-analysen 23.
  9. Alikvotera och lagra cellextrakt vid -80 ° C fram till användning.

2. Beredning av proteinextrakt från mus lever och mjälte

  1. Euthanize en mus med CO 2 inandning.
  2. Lägg den avlivas djuret på en ren pad över en dissekera ombord. Öppna buken med en sax.
  3. Dissekera levern och mjälten genom användning av sax och pincett, och skölj varje vävnad i cirka 50 ml iskall PBS.
  4. Omedelbart skära vävnader i små bitar med en skalpell (till exempel: ca 1 - 2 mm, 3).
  5. Utan dröjsmål sätta bitar av vävnader i en fräsch cryotube och sedan knäppa frysa dem i flytande kväve. Store snäpp frusna vävnads alikvoter vid -80 ° C fram till användning.
  6. Homogenisera en bit frusen vävnad (ca 1 - 2 mm 3) i 0,25-0,5 mliskall cytoplasma lysbuffert (tabell 1) med en vävnadshomogenisator i 10 sek.
  7. Överför homogenatet till 1,5 ml mikrocentrifugrör och kyla på is under 20 min.
  8. Spin under 10 minuter vid full hastighet i en mikrocentrifug vid 4 ° C.
  9. Kasta pellets och överföring supernatanten i ny 1,5 ml mikrocentrifugrör. Håll på is.
  10. Bestäm proteinkoncentrationen (vanligtvis 1 - 10 | ig / | il) med användning av Bradford-analysen 23.
  11. Alikvotera och lagra cellextrakt vid -80 ° C fram till användning.

3. Beredning av radioaktivt märkt IRE-sond

  1. Linjärisera IRE-innehållande plasmid I-12.CAT 22 genom inkubation vid 37 ° C under 1 h med restriktionsendonukleaset Xbal (1 U per ug plasmid), som klyver nedströms om IRE-sekvensen. Den linjäriserade plasmiden kommer att användas som mall för transkription in vitro.
  2. Sätt upp enn in vitro transkriptionsreaktion i en total volym av 20 | il. Använd lagerlösningar som visas i tabell 2 och lägg: 1 l ariserade plasmiden mall, 4 pl transkriptionsbuffert; 1 pl mix av ATP / CTP / GTP mix, 10 pl [α- 32 P] -UTP, 2 pl ditiotreitol, 1 pl RNas hämmare och 1 pl T7 RNA-polymeras. Blanda genom att pipettera upp och ned.
  3. Inkubera vid 40 ° C under 1 h 24.

4. Rening av radioaktivt märkt IRE-prob

  1. Terminate in vitro transkriptionsreaktion genom tillsats ett pl av 0,5 M EDTA, pH 8. Blanda genom pipettering upp och ned.
  2. Lägg 10 pl av 10 mg / ml tRNA, som bärare för bättre utfällning. Blanda genom att pipettera upp och ned.
  3. Lägg 82.5 pl 3 M ammoniumacetat. Omskakas.
  4. Lägg 273 l etanol. Omskakas.
  5. Låt stå vid RT under 5 min.
  6. Snurra under 10 minuter vid full hastighet i en mikrocentrifug vid RT. Släng supernatanten.
  7. Tvätta pelleten med 100 | il av 70% etanol.
  8. Snurra under 10 minuter vid full hastighet i en mikrocentrifug vid RT. Släng supernatanten.
  9. Lufttorka pelleten i 10 min.
  10. Resuspendera pelleten i 100 | il dubbeldestillerat, tidigare autoklaverat H2O
  11. Kvantifiera radioaktivitet i en vätskescintillationsräknare, alikvot radiomärkt IRE sond och förvara vid -80 ° C fram till användning. Frysta portioner kan användas i upp till 3 veckor.

5. Beredning av en infödd polyakrylamidgel för EMSA

  1. Montera gelen (16 x 16 cm) med hjälp 1.5 mm distanser och kam.
  2. För att förbereda en 6% nativ polyakrylamidgel, använda de beståndslösningar som visas i tabell 3 Blanda 7,5 ml 40% akrylamid:. Bisakrylamid, 5 ml 5x TBE och 37.5 mldubbeldestillerat H2O
  3. Lägg 0,5 ml av 10% nyframställd ammoniumpersulfat (APS) och 25 | il tetrametyletylendiamin (TEMED).
  4. Omedelbart hälla akrylamid lösning på gel och låt den polymeriseras. Vänta ungefär 30 min.
  5. Montera elektroforesapparaten med gelen, fylla tankarna med 0,5x TBE och anslut med strömförsörjningen.

6. Elektrofore Mobility Shift Assay

  1. Späd 25 | ig proteinextrakt från celler eller vävnader med cytoplasmisk lysbuffert (tabell 1) i en total volym av i 10 | il (kan lägre proteinkoncentrationer kan också användas). Håll på is. Om det behövs, tillsätt 1 pl 1: 4 utspätt 2-merkaptoetanol (2-ME) för att aktivera vilande IRP1 (slutlig koncentration: 2%) 25.
  2. Späd den radioaktivt märkta IRE sonden i dubbeldestillerat H2O till 200000 cpm / | il, värmedenaturering vid 95 °C under 1 min och svalna vid rt under minst 5 minuter.
  3. Skapa ett EMSA reaktion genom att tillsätta en pl radiomärkt IRE sond till proteinextraktet.
  4. Inkubera under 20 min vid RT.
  5. Lägg ett pl av 50 mg / ml heparin till reaktionen (för att inhibera icke-specifika proteininteraktioner med sonden 9) och fortsätt inkuberingen under ytterligare 10 minuter. Alikvotera stamlösning av heparin (50 mg / ml) och förvaras vid -80 ° C.
  6. Vid användning av långa radiomärkta prober (> 60 nukleotider), tillsätt 1 pl RNas T1 (1 U / | il) och inkubera under 10 min vid RT för att reducera icke-specifik proteinbindning till sonden, och att medge bättre separation av RNA / protein komplex under elektrofores.
  7. Lägg 3 il laddningsbuffert (80% glycerol + bromofenolblått), blanda och belastning på 6% icke-denaturerande polyakrylamidgel.
  8. Kör gelén under 60 min vid 130 V (5 V / cm).
  9. Tverför gelén på en stor filterpapper och torka.
  10. Utsättas för en film och utveckla autoradiografi. Exponeringstiden kan sträcka sig från 1 timme (eller mindre) upp till O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En radiomärkt IRE prob bereddes enligt beskrivningen i avsnitt 3 och 4 i protokollet. Sekvensen för proben var 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; de fetstil nukleotiderna utgör en oparad C rest och slingan, som är kritiska IRE funktioner. Den specifika radioaktiviteten för proben var 4,5 x 10 9 cpm / ^ g av RNA.

För att utvärdera effekterna av järn störningar på IRE-bindande aktivitet, var murina RAW264.7 makrofager lämnas obehandlad eller behandlad med hemin (järnkälla) eller desferrioxamin (järnkelator). Lysat bereddes och analyserats av EMSA med IRE sonden (8.000 cpm / ^ g protein). Representativa data visas i figur 1, med kortare och längre exponeringar av autoradiogrammen på de vänstra och högra panelerna, respektive. Murina IRE / IRP1 och IRE / IRP2 komplexen uppvisar olika rörlighet och två distinkta bandär synliga i spår 1, motsvarande obehandlade celler. Järnkelatbildningen djupt inducerade de IRE-bindande aktiviteter både IRP1 och IRP2 (spår 2), medan järntillskott minskade dem (spår 3). Förbehandling med 2% 2-ME fullt aktiverad IRP1 (nedre panelen), även i extrakt av järnbehandlade cellerna. Detta visar att järn störningar inte inkräkta på stabiliteten i IRP1 och fungerar som en laddningskontroll också. Däremot den 2-ME förbehandling hämmade IRE-bindande aktivitet IRP2. De snabba vandrande ospecifika band påverkas inte av järn.

Därefter analyserade vi IRE-bindande aktivitet i levern på vildtyp, Irp1 - / - och Irp2 - / - möss, som tidigare matats i en vecka med en standard eller en järnberikad kost (Figur 2). Den Irp1 - / - och Irp2 - / - möss tillhandahölls vänligen av Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). I vildtyp leverextrakt, IRP1 stod för den största delen av IRE-bindande aktivitet och IRE / IRP2 komplexen var knappastsynliga (spår 1, 2), i överenskommelse med tidigare iakttagelser 26. IRP2 uppvisade potent IRE-bindande aktivitet i leverextrakt av Irp1 - / - möss (spår 3, 4). Under dessa betingelser kunde inga IRE / IRP1 komplex observeras. Likaså fanns inga IRE / IRP2 komplex bildas i levern extrakt av Irp2 - / - möss (spår 5, 6). Utfodring möss med en hög järn kost minskade lever IRE-bindande aktivitet både IRP1 och IRP2; Denna effekt var mer dramatisk på IRP2 (spår 7-12). Observera att efter behandling av vildtyp eller Irp2 - / - leverextrakt med 2-ME, IRE-bindande aktivitet IRP1 förhöjdes till en punkt där det skiftade nästan alla IRE sond (detta är tydligt observeras i kortare exponering av autoradiogrammen På den vänstra panelen).

Slutligen utvärderade vi IRE-bindande aktivitet i lever och mjälte från vildtyp och HJV - / - möss (figur 3). Den HJV - / - möss vänligen av Dr. NC Andrews (Duke University, NC). Dessa djur utgör en modellav ärftlig hemokromatos 27, en sjukdom av systemisk järnöverskott, där kraftig järn ackumuleras i parenkymceller, medan retikuloendoteliala makrofager förblir järnbrist 28. Som väntat, lever av HJV - / - möss (med järnbelastade hepatocyter) uppvisade minskade IRE-bindande aktivitet jämfört med vildtypen (banorna 1-4). Omvänt IRE-bindande aktivitet var högre i mjältarna hos HJV - / - möss (innehållande järnfattiga makrofager; lanes 5-8). Igen här, 2-ME behandling främjas nästan fullständig förskjutning av IRE sonden i leverextrakt (se kortare exponering av autoradiogrammen på den vänstra panelen).

Tabell 1. Cytoplasmisk lysbuffert.

1% Triton X 100
25 mM Tris-HCl, pH 7,4
40 mM KCl
  1. Lösningen börautoklaveras och förvaras vid RT.
  2. Proteasinhibitorer, såsom 10 | ig / ml leupeptin och 0,1 mM fenylmetansulfonylfluorid (PMSF) kan tillsättas före användning.
  3. Tillsats av färsk 1 mM dithiotheritol är rekommenderat för detektion av IRP2 aktivitet.

Tabell 2. Stamlösningar för in vitro transkription reaktion.

1 ug / ul lineariserad plasmidmall
5x transkriptionsbuffert (medföljer T7 RNA-polymeras)
20 mM blandning av ATP, CTP och GTP
3000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM ditiotreitol
10 U / ul RNas-inhibitor
20 U / ^ T7 RNA-polymeras


<strong> Tabell 3. Stamlösningar för icke-denaturer polyakrylamidgelelektrofores.

40% akrylamid: bisakrylamid (37,5: 1)
5x TBE (Tris / borat / EDTA)

För framställning av en L av 5x TBE, använd 54 g Tris-bas, 27,5 g borsyra, och 20 ml av 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figur 1
Figur 1. Järn-beroende reglering av IRE-bindande åtgärder i RAW264.7 makrofager. 10 7 celler lämnades antingen obehandlade eller behandlade O / N med 100 iM hemin eller desferrioxamin. Cytoplasmatiska lysat bereddes och analyserades av EMSA med en 32 P-märkt IRE sond i frånvaro (överst) eller närvaro av 2% 2-ME (botten). Positionerna för IRE / IRP1 och IRE / IRP2 komplex, och av fri IRE sond anges med pilar. Stjärnan anger en icke-specifikt band. Kortare och längre exponeringar av autoradiogrammen visas i vänster och höger paneler, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Analys av IRE-bindningsaktiviteter i levrar hos vildtyp (wt), Irp1 - / - och Irp2 - / -. Möss 5 veckor gamla möss (n = 2 för varje genotyp), alla i C57BL / 6 bakgrund 29, placerades på en standard eller en hög-järn diet (innehållande 2% karbonyljäm). Efter en vecka djuren avlivades. Leverproteinextrakt bereddes och analyserades av EMSA med en 32 P-märkt IRE sondi frånvaro (överst) eller närvaro av 2% 2-ME (botten). Positionerna för IRE / IRP1 och IRE / IRP2 komplex, och av fri IRE sond anges med pilar. Stjärnan anger en icke-specifikt band. Kortare och längre exponeringar av autoradiogrammen visas i vänster och höger paneler, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Analys av IRE-bindande aktiviteter i levrar och mjältar av vildtyp (wt) och HJV - / -. Möss 10 veckor gamla möss (n = 2 för varje genotyp), alla i C57BL / 6 bakgrund 30, avlivades. Lever- och mjälten proteinextrakt bereddes och analyserades av EMSA med en 32 P-märkt IRE sond i frånvaro (överst) eller närvaro av2% 2-ME (botten). Positionerna för IRE / IRP1 och IRE / IRP2 komplex, och av fri IRE sond anges med pilar. Stjärnan anger en icke-specifikt band. Kortare och längre exponeringar av autoradiogrammen visas i vänster och höger paneler, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri beskriver vi ett protokoll som har utvecklats för att studera IRE-bindande aktiviteter IRP1 och IRP2, och vi visar representativa uppgifter. Genom att använda olika sonder, kan detta protokoll också justeras för att studera andra RNA-bindande proteiner. Ett kritiskt steg är storleken av sonden. Användning av långa sönder, vilket är vanligt när det exakta bindningsstället är okänt, kan resultera i RNA / proteinkomplex som migrerar inte annorlunda än den fria RNA. I detta fall är det tillrådligt att avlägsna obundet RNA genom behandling med RNAs T1 (steg 6.6). Kvaliteten av sonden är också mycket viktigt. Bästa resultat uppnås med nygjord radiomärkt RNA. Gelrening 10 är inte nödvändigt, men kan förbättra utseendet på EMSA om in vitro transkription reaktion för sond beredning ger förtida uppsägning produkter (och om ingen RNAse T1 matsmältningen steg ingår). Köra infödda gelelektrofores för fort may resultera i överhettning, vilket kan leda till dissociation av RNA / proteinkomplex och resultera i suddiga band.

Kvantitativa resultat kan uppnås genom att analysera intensiteten av de efterblivna band med phosphorimaging. Kvantifieringar gäller endast när RNA-sond är närvarande i överskott och är inte begränsande för RNA-bindning. Affinitet interaktion RNA / protein, företrädd av dissociationskonstanten Kd som är kopplad till den fria energin AG o, kan bedömas under jämviktsförhållanden genom att titrera RNA-bindande aktivitet med minskande mängder av radioaktivt märkt sond 3. Den IRE / IRP1 interaktion har i stor utsträckning präglas fysiokemiskt 9,31. Titrering EMSA experiment med varierande mängder av en RNA-bindande protein kan utföras för att beräkna stökiometri 3. Specificitet för bindning kan lätt valideras av konkurrensexperiment med överskott av omärkt "kallt" competitor RNA 3. Endast specifika konkurrenter bör minska intensiteten i störda radioaktiva bandet. Specificitet kan också övervakas genom att inkludera en antikropp mot RNA-bindande protein i EMSA reaktionen, vilket kommer att ge en "supershift" 7. Detta kan också utnyttjas för att bestämma identiteten av RNA-bindande proteinet. Nej "supershift" bör observeras med icke-specifika antikroppar eller pre-immunserum.

Sammanfattningsvis är EMSA en kraftfull metod för analys av RNA / proteininteraktioner. Det är relativt lätt att utföra och kräver minimal infrastruktur. Det är inte så enkelt som filterbindningsanalysen, men kommer att ge mer informativa och korrekta uppgifter när flera RNA-bindande proteiner interagerar specifikt med sonden (t.ex. IRP1 och IRP2). Det bör noteras att till skillnad från mus, människa IRE / IRP1 och IRE / IRP2 komplex samar migrera i EMSA. Däremot kan de separeras med "supershifts̶1; med specifika antikroppar 7. Det EMSA inte värdefullt för detaljerad kartläggning av RNA / proteininteraktioner; andra tekniker, såsom RNAse skyddsanalys, toeprinting eller tvärbindande 32 är lämpligare. Ändå EMSA är ett utmärkt val för att upptäcka nya RNA / proteininteraktioner, vilket har varit fallet med IRPS 8, men också för bekräftar data som erhållits med beräknings eller hög genomströmning experimentella metoder. Dessutom är EMSA överlägsen för att analysera specificitet och fysikokemiska egenskaperna hos RNA / proteinväxelverkningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics