Elektroforetisk mobilitet (EMSA) for Studiet af RNA-protein interaktioner: Den IRE / IRP Eksempel

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her præsenterer vi en protokol til at analysere RNA / protein-interaktioner. Den elektroforetiske mobilitet (EMSA) er baseret på forskellen migration af RNA / protein-komplekser og fri RNA under nativ gelelektroforese. Ved anvendelse af en radioaktivt mærket RNA-probe, kan RNA / protein komplekser visualiseret ved autoradiografi.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / protein-interaktioner er kritiske for post-transkriptionelle regulatoriske pathways. Blandt de bedst karakteriserede cytosoliske RNA-bindende proteiner er jern regulatoriske proteiner, IRP1 og IRP2. De binder til jern responsive elementer (IRES) i den utranslaterede regioner (UTR'er) af flere target mRNA'er, og styrer derved mRNA'erne oversættelse eller stabilitet. IRE / IRP interaktioner er ofte blevet studeret af EMSA. Her beskriver vi EMSA protokol for analyse IRE-bindende aktivitet af IRP1 og IRP2, som kan generaliseres til at vurdere aktiviteten af ​​andre RNA-bindende proteiner samt. En råprotein lysat indeholdende et RNA-bindende protein eller et oprenset præparat af dette protein, inkuberes med et overskud af 32 P-mærket RNA-probe, der giver mulighed for kompleksdannelse. Heparin tilsættes til hinder non-specifikt protein til probebinding. Efterfølgende blandingen analyseret ved ikke-denaturerende elektroforese på en polyacrylamidgel. Den frie probevandrer hurtigt, mens RNA / proteinkompleks udstiller retarderede mobilitet; Derfor er fremgangsmåden også kaldet "gelretardering" eller "bandshift" assay. Efter afslutning af elektroforesen, gelen tørres og RNA / protein komplekser, såvel som fri probe, påvises ved autoradiografi. Det overordnede mål med protokollen er at påvise og bestemme IRE / IRP og andre RNA / protein-interaktioner. Desuden kan EMSA også anvendes til at bestemme specificitet, bindingsaffinitet og støkiometrien af ​​RNA / protein-interaktion under undersøgelsen.

Introduction

EMSA blev oprindeligt udviklet til at studere sammenslutning af DNA-bindende proteiner med mål-DNA-sekvenser 1,2. Princippet er ens for RNA / protein-interaktioner 3, som er i fokus i denne artikel. Kort fortalt RNA negativt ladet og vil migrere mod anoden under ikke-denaturerende elektroforese i polyacrylamid (eller agarose) geler. Migration i gelen afhænger af størrelsen af ​​RNA, som er proportional med dens ladning. Specifik binding af et protein til RNA ændrer sin mobilitet, og migrerer langsommere i forhold til den frie RNA. Dette skyldes primært en stigning i den molekylære masse, men også ændringer i ladning og eventuelt konformation. Ved hjælp af en mærket RNA som probe giver nem overvågning af "gelretardering" eller "bandshift". Anvendelse af 32P-mærkede RNA-prober er meget almindelig og giver høj følsomhed. Migrationen af ​​RNA / protein komplekser og fri RNA detekteresved autoradiografi. Ulemper er den korte halveringstid på 32 P (14,29 dage), den gradvise forringelse af kvaliteten af sonden pga radiolyse, kravet om en radioaktivitet licens og infrastruktur til radioaktivitet arbejde, og potentielle biosikkerhed bekymringer. Derfor er der blevet udviklet alternative ikke-isotope metoder til mærkning af RNA-probe, for eksempel med fluorophorer eller biotin, som muliggør detektering af fluorescerende eller kemiluminescerende billeddannelse 4,5. Begrænsninger ved disse metoder er de højere omkostninger og ofte nedsat følsomhed i forhold til isotopisk mærkning, og potentialet af ikke-isotopiske mærker til at interferere med interaktionen RNA / protein. Ikke-denaturerende polyacrylamidgeler er egnet til de fleste EMSA anvendelser og er almindeligt anvendt. Til tider kan agarosegeler udgøre et alternativ til analyse af store komplekser.

Den største fordel ved EMSA er, at det kombinerer enkelhed, følsomhed og robusthed 4 </ Sup>. Assayet kan være afsluttet inden for et par timer og kræver ikke sofistikeret instrumentering. RNA / protein-interaktioner kan detekteres ved EMSA i koncentrationer så lave som 0,1 nM eller mindre, og inden for en bred vifte af bindende betingelser (pH 4,0-9,5, monovalent saltkoncentration 1-300 mM, og temperatur 0-60 ° C).

RNA / protein-kompleks kan også undersøgt af filter-bindingsanalyse. Dette er en enkel, hurtig og billig procedure er baseret på tilbageholdelse af RNA / protein-komplekser i et nitrocellulosefilter, medens en fri RNA-probe passerer gennem 6. Sammenlignet med EMSA, er det begrænset i tilfælde, hvor RNA-probe indeholder flere bindingssteder, eller den rå ekstrakt indeholder mere end et RNA-bindende proteiner, der binder til proben på samme sted. Mens flere RNA / protein-interaktioner vil undslippe opdagelse af filteret-bindingsassay, kan de let visualiseres ved EMSA. I nogle tilfælde, visualisering er even mulig, når to RNA / protein-komplekser co-migrere (for eksempel human IRP1 / IRE og IRP2 / IRE komplekser) ved tilsætning af et antistof mod et af de RNA-bindende proteiner til EMSA reaktionen, hvilket gav yderligere forsinkelse på gelen ( "supershift") 7.

EMSA er blevet bredt anvendt til at undersøge IRP1 og IRP2, som er post-transkriptionelle regulatorer af jern metabolisme 8-10. De fungerer ved at binde til IRES, fylogenetisk konserverede hårnålestrukturer inden UTR'er i flere mRNA'er 11. IRES blev først opdaget i mRNA'erne kodende ferritin 12 og transferrin receptor 1 (TfR1) 13, proteiner af jern lagring og optagelse hhv. Senere blev IRES fundet i erythroid-specifik aminolevulinatsynthaseaktivitet (ALAS2) 14 mitochondrial aconitase 15 ferroportin 16 divalent metal transportør 1 (DMT1) 17, hypoxi inducerbar faktor 2 18, og andre mRNA'er 19-21. Prototypen H- og L-ferritin mRNA'er indeholde et IRE i deres 5'-UTR, mens TfR1 mRNA indeholder flere IRES i sin 3'-UTR. IRE / IRP interaktioner specifikt hæmmer ferritin mRNA oversættelse sterisk blokere dens forening af 43S ribosomale subunit; Desuden har de stabiliserer TfR1 mRNA mod spaltning i kernen. IRP1 og IRP2 andel omfattende sekvens lighed og udviser høj IRE-bindende aktivitet i jern-udsultede celler. I jern-fyldt celler, IRP1 samler en cuban Fe-S klynge, der konverterer det til cytosol aconitase på bekostning af sin IRE-bindende aktivitet, mens IRP2 gennemgår proteasomalaktivitet nedbrydning. Således IRE / IRP interaktioner afhænger af cellulære jernstatus, men er også reguleret af andre signaler, såsom H 2 O 2, nitrogenoxid (NO) eller hypoxi. Her beskriver vi protokollen til vurdering IRE-bindende aktivitet fra rå celler og væv ekstrakter af EMSA. Vi anvendte et 32P-mærket H-ferritin IRE probe, der blev genereret ved in vitro transkription fra et plasmid DNA skabelon (I-12.CAT), hvor IRE sekvens oprindeligt blev indført i sense-orientering nedstrøms for T7 RNA polymerase sted ved kloning af annealede syntetiske oligonukleotider 22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Eksperimentelle procedurer med mus blev godkendt af Animal Care Komité McGill University (protokol 4966).

1. Fremstilling af proteinekstrakter fra dyrkede celler

  1. Vask dyrkede celler to gange med 10 ml iskold phosphatbufret saltvand (PBS).
  2. Skrabes adhærente celler med enten en gummispatel eller en plast celleskraber i 1 ml iskold PBS, overførsel suspension i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  3. Spin i en mikrocentrifuge i 5 minutter ved 700 xg ved 4 ° C. Aspirer PBS.
  4. Tilsæt 100 pi iskold cytoplasmatisk lysepuffer (tabel 1) pr 10 7 celler og pipette op og ned.
  5. Inkuber på is i 20 min.
  6. Spin i 10 minutter ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge ved 4 ° C.
  7. Kassér pellet. Overfør supernatanten til nyt 1,5 ml mikrocentrifugerør og holde på is.
  8. Dethermelin proteinkoncentration (almindeligvis 1 - 10 pg / pl) under anvendelse af Bradford-assay 23.
  9. Alikvote og lagre celleekstrakter ved -80 ° C indtil anvendelse.

2. Fremstilling af proteinekstrakter fra muse lever og milt

  1. Aflive en mus med CO 2 indånding.
  2. Læg aflivet dyr på en ren pad over en dissekere bord. Åbn maven med en saks.
  3. Skær leveren og milten ved hjælp af saks og pincet, og skyl hvert væv i ca. 50 ml iskold PBS.
  4. Umiddelbart skære væv i små stykker med en skalpel (f.eks ca. 1 - 2 mm 3).
  5. Uden forsinkelse, sætte stykker af væv i en frisk kryorør og derefter snap fryse dem i flydende nitrogen. Store lynfrosset væv alikvoter ved -80 ° C indtil anvendelse.
  6. Homogeniseres ét stykke af frosset væv (ca. 1 - 2 mm 3) i 0,25-0,5 mliskold cytoplasmatisk lysepuffer (tabel 1) med en vævshomogenisator i 10 sek.
  7. Overførsel homogenat til 1,5 ml mikrocentrifugerør og chill på is i 20 min.
  8. Spin i 10 minutter ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge ved 4 ° C.
  9. Kassér pellet og overførsel supernatant i ny 1,5 ml mikrocentrifugerør. Hold på is.
  10. Bestem proteinkoncentration (almindeligvis 1 - 10 pg / pl) under anvendelse af Bradford-assay 23.
  11. Alikvote og lagre celleekstrakter ved -80 ° C indtil anvendelse.

3. Forberedelse af radioaktivt mærket IRE-sonde

  1. Linearisere IRE-holdige plasmid I-12.CAT 22 ved inkubering ved 37 ° C i 1 time med restriktionsendonukleasen Xbal (1 U pr ug plasmid), som spalter nedstrøms for IRE-sekvensen. Det lineariserede plasmid vil blive anvendt som template for in vitro transcription.
  2. Opret enn in vitro transkriptionsreaktion i et totalt volumen på 20 pi. Brug stamopløsninger vist i tabel 2 og tilføjer: 1 pi lineariseret plasmid skabelon, 4 pi transskription buffer; 1 pi blanding af ATP / CTP / GTP mix, 10 pi [α- 32P] -UTP, 2 pi dithiothreitol, 1 pi RNase inhibitor og 1 pi T7 RNA-polymerase. Bland ved at pipettere op og ned.
  3. Inkuber ved 40 ° C i 1 time 24.

4. Oprensning af Radioaktivt mærket IRE-probe

  1. Terminate in vitro transcription reaktionen ved tilsætning af 1 pi 0,5 M EDTA, pH 8. blandes ved pipettering op og ned.
  2. Tilsæt 10 pi 10 mg / ml tRNA, som bærer for bedre udfældning. Bland ved at pipettere op og ned.
  3. Tilføj 82,5 pi 3 M ammoniumacetat. Vortexes.
  4. Tilføj 273 pi ethanol. Vortexes.
  5. Lad det stå ved stuetemperatur i 5 min.
  6. Spin i 10 min ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
  7. Wash pellet med 100 pi 70% ethanol.
  8. Spin i 10 min ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres.
  9. Luft tør pille i 10 min.
  10. Resuspender pellet i 100 pi dobbelt destilleret, tidligere autoklaveret H 2 O.
  11. Kvantificer radioaktivitet i en væskescintillationstæller, alikvot radiomærket IRE probe og opbevares ved -80 ° C indtil anvendelse. Frosne alikvoter kan anvendes i op til 3 uger.

5. Udarbejdelse af en indfødt polyacrylamidgel for EMSA

  1. Saml gel (16 x 16 cm) ved hjælp af 1,5 mm afstandsstykker og kam.
  2. For at forberede en 6% indfødt polyacrylamidgel, bruge stamopløsninger vist i tabel 3 Bland 7,5 ml 40% acrylamid:. Bisacrylamid, 5 ml 5x TBE og 37,5 mldobbelt destilleret H2O
  3. Tilsæt 0,5 ml 10% frisk fremstillet ammoniumpersulfat (APS) og 25 pi tetramethylethylendiamin (TEMED).
  4. Umiddelbart hæld acrylamid løsning på gelen og lad den polymerisere. Vent ca. 30 min.
  5. Saml elektroforese apparat med gelen, fylde tankene med 0,5x TBE og forbinde med strømforsyningen.

6. elektroforetiske mobilitet Shift Assay

  1. Fortynd 25 ug protein ekstrakt fra celler eller væv med cytoplasmatisk lysepuffer (tabel 1) i et samlet volumen på 10 pi (lavere proteinkoncentrationer kan også anvendes). Hold på is. Om nødvendigt tilsættes 1 pi af 1: 4 fortyndet 2-mercaptoethanol (2-ME) til at aktivere hvilende IRP1 (slutkoncentration: 2%) 25.
  2. Fortynd den radioaktivt mærkede IRE probe i dobbelt destilleret H2O til 200.000 cpm / pl, varmedenaturere ved 95 °C i 1 min, og afkøle ved stuetemperatur i mindst 5 min.
  3. Opret en EMSA reaktion ved tilsætning af 1 ml af radioaktivt mærket IRE sonde til protein ekstrakt.
  4. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur.
  5. Tilsæt 1 ml 50 mg / ml heparin til reaktionen (for at inhibere ikke-specifikke protein-interaktioner med sonden 9) og fortsætte inkubation i yderligere 10 min. Alikvot stamopløsningen af ​​heparin (50 mg / ml) og opbevares ved -80 ° C.
  6. Ved anvendelse af lange radioaktivt mærkede prober (> 60 nukleotider), tilsættes 1 pi RNase T1 (1 U / pl) og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur for at reducere ikke-specifik proteinbinding til proben, og at muliggøre bedre separation af RNA / protein kompleks under elektroforese.
  7. Tilsæt 3 pi loading buffer (80% glycerol + bromphenolblåt), blandes og belastning på 6% ikke-denaturerende polyacrylamidgel.
  8. Kør gelen i 60 minutter ved 130 V (5 V / cm).
  9. Transfer gelen på en stor filterpapir og tørre.
  10. Udsættes for en film og udvikle autoradiografi. Eksponeringstid kan variere fra 1 time (eller mindre) til O / N.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En radioaktivt mærket IRE probe blev fremstillet som beskrevet i punkt 3 og 4 i protokollen. Sekvensen af proben var 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG C UUCAA C AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 '; de fed skrift nukleotider repræsenterer en uparret C rest og sløjfen, som er kritiske IRE funktioner. Den specifikke radioaktivitet af proben var 4,5 x 10 9 cpm / ug RNA.

For at vurdere virkningerne af jern perturbationer på IRE-bindende aktivitet, blev murine RAW264.7 makrofager ubehandlet eller behandlet med hemin (jern kilde) eller desferrioxamin (jernkelator). Lysater blev fremstillet og analyseret ved EMSA med IRE sonde (8.000 cpm / ug protein). Repræsentative data er vist i figur 1, med kortere og længere engagementer autoradiogrammerne i venstre og højre paneler hhv. Murin IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser udviser forskellig mobilitet og to forskellige bandser synlige i bane 1, svarende til ubehandlede celler. Jernkelations dybt inducerede IRE-bindende aktiviteter både IRP1 og IRP2 (bane 2), mens jerntilskud formindsket dem (bane 3). Forbehandling med 2% 2-ME fuldt aktiveret IRP1 (nederste panel), selv i ekstrakter af jern-behandlede celler. Dette viser, at jern forstyrrelser ikke kolliderer med stabiliteten i IRP1 og fungerer også som en belastning kontrol. Derimod 2-ME forbehandling inhiberede IRE-bindende aktivitet IRP2. De hurtige migrerende uspecifikke bånd påvirkes ikke af jern.

Dernæst analyserede vi IRE-bindende aktivitet i lever fra vildtype Irp1 - / - og Irp2 - / - mus, der tidligere fodret i en uge med en standard eller et jern-beriget kost (figur 2). The Irp1 - / - og Irp2 - / - mus blev venligst stillet til rådighed af Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg). I vildtype lever ekstrakter, IRP1 tegnede sig for den største del af IRE-bindende aktivitet og IRE / IRP2 komplekser var næppesynlige (bane 1, 2) efter aftale med tidligere bemærkninger 26. IRP2 udviste potent IRE-bindende aktivitet i leveren ekstrakter af Irp1 - / - mus (bane 3, 4). Under disse betingelser blev der ikke IRE / IRP1 komplekser observeret. Ligeledes blev der ikke IRE / IRP2 komplekser dannet i leveren ekstrakter af Irp2 - / - mus (bane 5, 6). Fodring mus med en høj jern kost nedsat hepatisk IRE-bindende aktivitet af både IRP1 og IRP2; Denne effekt var mere dramatisk på IRP2 (bane 7-12). Bemærk, at efter behandling af vildtype eller Irp2 - / - lever ekstrakter med 2-ME, IRE-bindende aktivitet af IRP1 blev forbedret til et punkt, hvor det skiftede næsten alle IRE probe (dette er klart observeret i kortere eksponering af autoradiogrammer til venstre panel).

Endelig har vi vurderet IRE-bindende aktivitet i lever og milt fra vildtype og HJV - / - mus (figur 3). The HJV - / - mus blev venligt leveret af Dr. NC Andrews (Duke University, NC). Disse dyr udgør en modelaf arvelig hæmokromatose 27, en sygdom i systemisk jernophobning, hvor overdreven jern ophobes i parenkymceller, mens reticuloendotheliale makrofager forbliver jernmangel 28. Som forventet, lever fra HJV - / - mus (med jern-loaded hepatocytter) udviste nedsat IRE-bindende aktivitet sammenlignet med vildtype (bane 1-4). Omvendt blev IRE-bindende aktivitet højere i milte fra HJV - / - mus (indeholdende jern-deficiente makrofager; bane 5-8). Igen her, den 2-ME behandling fremmes næsten fuldstændig forskydning af IRE sonden i lever ekstrakter (se kortere eksponering af autoradiogrammerne til venstre panel).

Tabel 1. Cytoplasmisk lysisbuffer.

1% Triton X100
25 mM Tris-HCI, pH 7,4
40 mM KCI
  1. Opløsningen skalautoklaveres og opbevares ved stuetemperatur.
  2. Proteasehæmmere, såsom 10 ug / ml leupeptin og 0,1 mM phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) kan tilsættes før brug.
  3. Tilsætning af frisk 1 mM dithiotheritol er Maximum for detektion af IRP2 aktivitet.

Tabel 2. Stamopløsninger for in vitro transcription reaktionen.

1 pg / pl lineariseret plasmidtemplate
5x transcription buffer (leveret med T7-RNA-polymerase)
20 mM blanding af ATP, CTP og GTP
3.000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM dithiothreitol
10 U / pl RNase inhibitor
20 U / pl T7 RNA-polymerase


<strong> Tabel 3. Stamopløsninger til ikke-denaturerende polyacrylamidgelelektroforese.

40% acrylamid: bisacrylamid (37,5: 1)
5x TBE (Tris / borat / EDTA)

Til fremstilling 1 L af 5x TBE bruge 54 g Tris-base, 27,5 g borsyre, og 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0).

Figur 1
Figur 1. Jern-afhængig regulering af IRE-bindende aktiviteter i RAW264.7 makrofager. 10 7 celler enten ubehandlet eller behandlet O / N med 100 uM hæmin eller desferrioxamin. Cytoplasmatiske lysater blev fremstillet og analyseret ved EMSA med en 32P-mærket IRE probe i fravær (øverst) eller nærvær af 2% 2-ME (nederst). Positionerne af IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser og fri IRE probe er angivet med pile. Stjernen angiver en ikke-specifikt bånd. Kortere og længere eksponeringer af autoradiogrammerne er vist i venstre og højre paneler henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Analyse af IRE-bindende aktiviteter lever af vildtype (wt), Irp1 - / - og Irp2 - / -. Mus 5 uger gamle mus (n = 2 for hver genotype), alle i C57BL / 6 baggrund 29 blev anbragt på en standard eller en høj-jern kost (indeholdende 2% carbonyl jern). Efter en uge blev dyrene aflivet. Nedsat protein ekstrakter blev fremstillet og analyseret af EMSA med en 32P-mærket IRE probei fravær (øverst) eller nærvær af 2% 2-ME (nederst). Positionerne af IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser og fri IRE probe er angivet med pile. Stjernen angiver en ikke-specifikt bånd. Kortere og længere eksponeringer af autoradiogrammerne er vist i venstre og højre paneler henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Analyse af IRE-bindende aktiviteter i lever og milt fra vildtype (wt) og HJV - / -. Mus 10 uger gamle mus (n = 2 for hver genotype), alle i C57BL / 6 baggrund 30, blev aflivet. Lever- og milt proteinekstrakter blev fremstillet og analyseret ved EMSA med en 32P-mærket IRE probe i fravær (øverst) eller nærvær af2% 2-ME (nederst). Positionerne af IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser og fri IRE probe er angivet med pile. Stjernen angiver en ikke-specifikt bånd. Kortere og længere eksponeringer af autoradiogrammerne er vist i venstre og højre paneler henholdsvis. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Heri beskriver vi en protokol, der er udviklet til at studere IRE-bindende aktiviteter IRP1 og IRP2, og vi viser repræsentative data. Ved hjælp af forskellige prober, kan denne protokol også justeres til undersøgelse af andre RNA-bindende proteiner. Et kritisk trin er størrelsen af ​​proben. Anvendelse af lange prober, der er fælles, når det nøjagtige bindingssted er ukendt, kan resultere i RNA / protein-komplekser, som ikke migrerer anderledes end det frie RNA. I dette tilfælde er det tilrådeligt at fjerne ubundet RNA ved behandling med RNAse T1 (trin 6.6). Kvaliteten af ​​proben er også meget vigtig. De bedste resultater opnås med frisklavet radiomærket RNA. Geloprensning 10 er ikke nødvendig, men kan forbedre udseendet af EMSA, hvis in vitro transcription reaktion for probe forberedelse giver tidlig terminering produkter (og hvis ingen RNAse T1 fordøjelse trin er inkluderet). Kørsel af native gelelektroforese for hurtigt may resultere i overophedning, hvilket kan føre til dissociation af RNA / protein-komplekser og resultere i fuzzy bands.

Kvantitative resultater kan opnås ved at analysere intensiteten af ​​de retarderede bånd med phosphorafbildning. Kvantificeringer er kun gyldige, når RNA-probe er til stede i overskud og er ikke begrænsende for RNA-binding. Den affinitet af interaktionen RNA / protein, repræsenteret ved dissociationskonstanten Kd, der er knyttet til den frie energi ΔG o, kan vurderes under ligevægtsbetingelser ved titrering RNA-bindende aktivitet med faldende mængder af radioaktivt mærkede probe 3. Interaktion IRE / IRP1 er blevet grundigt karakteriseret fysisk-kemisk 9,31. Titrering EMSA forsøg med varierende mængder af et RNA-bindende protein kan udføres for at beregne støkiometri 3. Specificitet for binding kan let valideres ved kompetitive forsøg med overskud af umærket "kolde" competitor RNA'er 3. Kun specifikke konkurrenter bør reducere intensiteten af ​​den retarderede radioaktive band. Specificitet kan også overvåges ved at inkludere et antistof mod RNA-bindende protein i EMSA reaktion, som vil give et "supershift" 7. Dette kan også udnyttes til at bestemme identiteten af ​​RNA-bindende protein. Nej "supershift" bør iagttages med ikke-specifikke antistoffer eller præ-immunt serum.

Sammenfattende EMSA er en kraftfuld metode til analyse af RNA / protein-interaktioner. Det er relativt let at udføre og kræver minimal infrastruktur. Det er ikke så simpelt som filter-bindingsanalyse, men vil give mere informative og nøjagtige data, når flere RNA-bindende proteiner interagerer specifikt med sonden (såsom IRP1 og IRP2). Det skal bemærkes, at i modsætning til murine, humane IRE / IRP1 og IRE / IRP2 komplekser co-migrerer i EMSA. Imidlertid kan de være adskilt af "supershifts̶1; med specifikke antistoffer 7. EMSA er ikke værdifuld for detaljeret kortlægning af RNA / protein-interaktioner; andre teknikker, såsom RNAse beskyttelse analyse, toeprinting eller tværbinding 32 er mere passende. Alligevel EMSA er et glimrende valg for at opdage nye RNA / protein-interaktioner, som det har været tilfældet med IRPs 8, men også for underbyggende data opnået med beregningsmæssige eller højt gennemløb eksperimentelle tilgange. Desuden EMSA er overlegen til at analysere specificitet og fysisk-kemiske egenskaber af RNA / protein-interaktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics