IRE / IRP Örnek: RNA-protein Etkileşimleri Çalışmaları elektroforetik hareketlilik Shift Testi (EMSA)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada RNA / protein etkileşimleri analiz etmek için bir protokol mevcut. elektroforetik hareketlilik kayma deneyi (EMSA), yerli jel elektroforez sırasında RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA ayırıcı geçiş dayanmaktadır. Bir radyo-etiketli bir RNA probu kullanarak, RNA / protein kompleksleri otoradyografi ile görselleştirilebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Fillebeen, C., Wilkinson, N., Pantopoulos, K. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) for the Study of RNA-Protein Interactions: The IRE/IRP Example. J. Vis. Exp. (94), e52230, doi:10.3791/52230 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

RNA / protein etkileşimleri transkripsiyon sonrası düzenleme yolları için kritik öneme sahiptir. En iyi karakterize edilmiş olan sitosolik, RNA bağlanan proteinler arasında demir düzenleyici proteinler, IRP1 ve IRP2 bulunmaktadır. Onlar böylece mRNA'ları çeviri veya stabilitesini kontrol, çeşitli hedef mRNA'larının çevrilmemiş bölgelerde (UTRs) içinde duyarlı elemanları (İres) demir bağlama. IRE / IRP etkileşimleri yaygın EMSA tarafından incelenmiştir. Burada, biz de diğer RNA bağlayıcı proteinlerin aktivitesini değerlendirmek için jeneralize olabilir IRP1 ve IRP2 ve IRE-bağlanma aktivitesi, analiz için EMSA protokol açıklar. Bir RNA bağlayıcı protein ya da bu proteinin bir saflaştırılmış preparatı ihtiva eden bir ham protein lisatı, kompleks oluşumunu mümkün kılan, 32P-işaretli RNA-uydusuyla fazlası ile inkübe edilir. Heparin bağlayıcı prob, spesifik olmayan protein önlemek için ilave edilir. Daha sonra karışım, bir poliakrilamit jeli üzerinde denatüre elektroforezi ile analiz edilir. ücretsiz probhızlı göç ederken RNA / protein kompleksi sergiler engelli hareketlilik; dolayısıyla, prosedür de "jel retardasyon" veya "bandshift" tahlil denir. Elektroforezin tamamlanmasından sonra, jel kurutulur ve RNA / protein kompleksleri, hem de serbest prob, otoradyografi ile takip edilmiştir. Protokolün genel amacı algılamak ve IRE / IRP ve diğer RNA / protein etkileşimleri ölçümüdür. Ayrıca, EMSA da araştırılmaktadır RNA / protein etkileşiminin özelliğini, bağlanma afinitesini ve stokiyometri belirlemek için kullanılabilir.

Introduction

EMSA başlangıçta, hedef DNA dizileri 1,2 DNA-bağlayıcı proteinler arasındaki ilişkiyi incelemek için geliştirilmiştir. ilkesi, bu makalenin odak noktası RNA / protein etkileşimleri 3 için benzer. Kısaca, RNA, negatif yüklü ve poliakrilamid (ya da agaroz) jelleri içinde denatüre edici olmayan elektroforez sırasında anoda doğru hareket edecektir. Jel içinde göç yüküne orantılı olan RNA, büyüklüğüne bağlıdır. Belirli RNA bir proteinin bağlanması, serbest RNA ile karşılaştırıldığında karmaşık göç eder yavaş hareketliliğinin değiştirir ve. Bu molekül kütlesinde bir artışın, aynı zamanda yük ve muhtemelen konformasyonda değişikler kaynaklanmaktadır. Prob olarak etiketlenmiş RNA kullanımı "jel geriliği" veya "bandshift" kolay izlenmesine olanak sağlar. 32 P-etiketli RNA prob kullanımı çok yaygındır ve yüksek hassasiyeti sunar. RNA / protein kompleksleri ve serbest RNA geçiş tespit edildiğindeOtoradyografi ile. Dezavantajları 32 P (14.29 gün), nedeniyle radyoliz prob kalitesinin kademeli bozulma kısa yarı ömrü vardır, bir radyoaktivite lisansı ve radyoaktivite çalışmaları için altyapı ve potansiyel biyogüvenlik kaygıları gereksinimi. Bu nedenle, bir RNA probu etiketlenmesine alternatif izotopik olmayan yöntemler, flüoresan veya kimyasal olarak ışık veren görüntüleme 4,5 radarından olanak florofor ya da biyotin ile, örneğin, geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin Sınırlamalar yüksek maliyet ve izotopik etiketleme ile karşılaştırıldığında genellikle azalır duyarlılık ve RNA / protein etkileşimi ile müdahale olmayan izotop etiket potansiyeli vardır. Denatüre edici olmayan poliakrilamid jelleri en EMSA uygulama için uygun olan ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Vesileyle, agaroz jelleri büyük kompleksleri analizi için bir alternatif oluşturabilir.

EMSA büyük avantajı basitlik, duyarlılık ve sağlamlığı birleştiren 4 olduğunu </ Sup>. Deney birkaç saat içinde tamamlanabilir ve karmaşık bir cihaz gerektirmez. RNA / protein etkileşimleri 0.1 nM veya daha az gibi düşük konsantrasyonlarda EMSA ile tespit edilebilir ve geniş bir bağlanma koşulları aralığında (pH 4,0-9,5, tek değerli bir tuzu konsantrasyonu 1-300 mM ve sıcaklık 0-60 ° C).

RNA / protein kompleksi oluşumu, filtre bağlama deneyi ile incelenebilir. Serbest bir RNA probu 6 geçerken bu, bir nitroselüloz filtresi RNA / protein kompleksleri tutma dayalı bir basit, hızlı ve ucuz bir yöntemdir. EMSA ile karşılaştırıldığında, bu RNA sistemi birden çok bağlayıcı siteler, veya ham ekstrakt aynı sitede prob bağlanan birden fazla RNA bağlayıcı proteinler içermesi durumunda sınırlıdır. Birden fazla RNA / protein etkileşimleri filtre bağlayıcı tahliliyle tespit kaçış olsa da, onlar kolayca EMSA tarafından görüntülenmiştir olabilir. Bazı durumlarda, görselleştirme arifesidirn, mümkün olduğunca, jeli üzerinde daha fazla geriliği elde EMSA reaksiyonuna, RNA bağlanan proteinlerden biri karşı bir antikor eklenerek birlikte geçirmek (örneğin, insan IRP1 / İRE ve IRP2 / İRE kompleksleri) iki RNA / protein kompleksleri ( "süperkayma") 7.

EMSA yaygın demir metabolizması 8-10 transkripsiyon sonrası düzenleyiciler olan IRP1 ve IRP2, incelemek için kullanılır olmuştur. Onlar birçok mRNA 11 UTRs içinde İres, filogenetik korunmuş firkete yapıları bağlanarak çalışır. IRES ilk ferritin 12 ve transferrin reseptörü 1 (TfR1) 13, sırasıyla, demir depolanması ve alınması, proteinlerini kodlayan mRNA keşfedilmiştir. Daha sonra, İres eritroid özel aminolevulinate sentaz (ALAS2) 14, mitokondriyal akonitaz 15, ferroportin 16, iki değerlikli metal taşıyıcı 1 (DMT1) 17, hipoksi indüklenebilir faktör 2 bulundu 18, ve diğer mRNA'lar 19-21. UTR'de 'TfR1 mRNA onun 3 birden İres içeriyor ise, UTR'de' prototip H ve L-ferritin mRNAlar onların 5 bir IRE'yi içerirler. IRE / IRP etkileşimleri özellikle sterik 43s ribozomal alt birim olan ilişkisini bloke ederek ferritin mRNA çeviri inhibe; Ayrıca, bu endonükleolitik klivaj karşı TfR1 mRNA'nın stabilize eder. IRP1 ve IRP2 payı geniş sekans benzerliği ve demir-aç hücrelerde yüksek İRE bağlayıcı aktivitesi sergiler. IRP2 proteozomal bozulmaya uğrar ise demirin bol olduğu hücrelerde, IRP1 onun İRE bağlama aktivitesi pahasına sitosolik akonitaz dönüştürür bir küban Fe-S, küme bir araya getirmektedir. Bu nedenle, İRE / IRP etkileşimi hücre demir durumuna bağlıdır, fakat aynı zamanda, H2O 2, nitrik oksit (NO) veya hipoksi gibi diğer sinyalleri tarafından düzenlenmektedir. Burada, biz E ham hücre ve doku ekstrelerinden IRE-bağlama aktivitesinin değerlendirilmesi için protokol tarifMSA. Bu İRE dizisi aslında tarafından alt baş T7 RNA polimerazı site sens yönlenmede katılmasının bir plasmid DNA şablonu (I-12.CAT), in vitro transkripsiyonu ile üretilen bir 32 P-etiketli lH-ferritin İRE sonda kullanılan tavlanmış, sentetik oligonükleotidlerin 22 klonlanması.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fareler ile Deneysel işlemler McGill Üniversitesi (protokol 4966) Hayvan Bakım Komitesi tarafından kabul edildi.

Kültürlenmiş Hücrelerde elde edilen protein ekstrelerinin hazırlanması 1.

  1. Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su içinde 10 ml (PBS) ile iki kez kültürlenmiş hücreleri yıkayın.
  2. Kauçuk bir ya da 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine buzla soğutulmuş PBS transfer süspansiyon 1 ml'lik plastik bir hücre kazıyıcı ile ya yapışmış olan hücrelerin Pençe.
  3. 4 ° C'de 700 x g'de 5 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde spin. Aspire PBS.
  4. 10 7 hücre başına buz soğukluğunda sitoplazmik lizis tamponu içinde 100 ul (Tablo 1) ekleyin ve yukarı ve aşağı pipet ve.
  5. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  6. 4 ° C'da bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dk için spin.
  7. Atın pelet. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine süpernatant aktarın ve buz üzerinde tutmak.
  8. DetBradford tahlili kullanılarak 23 - (10 ug / ml, genellikle 1) ermin protein konsantrasyonu.
  9. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım ve mağaza hücre ekstrelerinden oluşabilir.

Fare karaciğer ve dalak elde edilen protein ekstrelerinin 2. Hazırlık

  1. CO 2 inhalasyon ile bir fare Euthanize.
  2. Diseksiyon tahta üzerinde temiz bir pad üzerinde ötenazi hayvan yatırın. Makas ile karın açın.
  3. Makas ve forseps kullanılarak karaciğer ve dalak ayır ve yaklaşık 50 ml buz gibi soğuk PBS içinde, her doku yıkayın.
  4. Hemen bir neşter ile küçük parçalar halinde dokuları kesmek (örneğin: Yaklaşık 1-2 mm 3).
  5. Gecikme olmadan, taze cryotube dokuların parçaları koymak ve daha sonra sıvı azot içinde bunları dondurmak oturtun. Mağaza şekild dondurulmuş doku alikotlan kullanılana kadar -80 ° C'de ilave edildi.
  6. 0.5 ml - 0.25 - (2 ila 3 mm, yaklaşık 1) dondurulmuş dokudan bir parça homojenizebuz soğukluğunda sitoplazmik lizis tamponu (Tablo 1) 10 saniye süreyle bir doku homojenleştirici ile.
  7. 20 dakika boyunca buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü ve soğuk Homojenat aktarın.
  8. 4 ° C'da bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dk için spin.
  9. Yeni 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine pelet ve transfer süpernatant atın. Buz üzerinde tutun.
  10. Bradford tahlili 23 kullanılarak - (10 ug / ul genellikle 1) protein konsantrasyonu belirleyin.
  11. Kullanılana kadar -80 ° C'de kısım ve mağaza hücre ekstrelerinden oluşabilir.

Radyoaktif IRE-prob 3. Hazırlık

  1. Kısıtlama endonükleaz Xbal (plazmid ug başına 1 U) DDE sekansının alt baş ayrıştıran ile 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilerek İRE içeren plazmid I-12.CAT 22 linearize. linearize plazmid, in vitro transkripsiyonu için, şablon olarak kullanılır.
  2. Kurman, in vitro olarak 20 ul bir toplam hacim içinde transkripsiyon reaksiyonu. Tablo 2'de gösterilen stok çözümleri kullanın ve ekleyin: 1 ul çizgiselleştirilmiş plazmid şablonu, 4 ul transkripsiyon tamponu; ATP / TO / GTP karışımı 1 ul karışımı, 10 ul [32 P α-] -UTP, 2 ul ditiyotreitol, 1 ul RNaz inhibitör ve 1 ul, T7 RNA polimeraz ile karıştırıldı. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
  3. 1 saat 24 süreyle 40 ° C'de inkübe edilir.

Radyoaktif IRE-prob 4. saflaştırılması

  1. Yukarı ve aşağı pipetleme 0.5 M EDTA, pH 8 Karışımı 1 ul ekleyerek in vitro transkripsiyon reaksiyonu bitirin.
  2. Daha iyi çökelmesi için taşıyıcı olarak, 10 mg / ml tRNA 10 ul ekle. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın.
  3. 3 M amonyum asetat, 82.5 ul ekleyin. Vorteks ile karıştırın.
  4. Etanol içinde 273 ul ekle. Vorteks ile karıştırın.
  5. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin.
  6. Oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dakika boyunca dönerler. Sil süpernatant.
  7. Yıkama,% 70 etanol içinde 100 ul ile pelet.
  8. Oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde tam hızda 10 dakika boyunca dönerler. Sil süpernatant.
  9. 10 dakika boyunca hava kuru topak.
  10. Iki kez damıtılmış 100 ul içinde süspanse pelet daha önce H 2 O otoklava
  11. Kullanılana kadar -80 ° C 'de bir sıvı sintilasyon sayacı içinde radyoaktivite, kısım radyo-etiketli prob İRE ve mağaza ölçmek. Donmuş madde şişeleri 3 haftaya kadar kullanılabilir.

EMSA için yerli poliakrilamid jeli 5. N-

  1. 1,5 mm ara parçasını ve tarak yardımıyla jel (16 x 16 cm) birleştirin.
  2. Tablo 3'te gösterilen stok çözeltileri kullanmak,% 6 yerli poliakrilamid jel hazırlamak için 7.5 ml% 40 akrilamid karıştırın:. Bisakrilamid, 5x TBE 5 ml ve 37.5 mlçift ​​distile H 2 O
  3. % 10 taze hazırlanmış amonyum persülfat (APS) ve 25 ul tetrametiletilenediamin (TEMED) 0.5 ml ekleyin.
  4. Hemen jel akrilamid çözüm dökün ve polimerize edelim. Yaklaşık 30 dakika boyunca bekleyin.
  5. , Jel ile elektroforez cihazı monte 0.5x TBE ile tanklarını doldurmak ve güç kaynağı ile bağlayın.

6. Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Deneyi

  1. 10 ul bir toplam hacim içinde hücreler ya da sitoplazmik lisiz tamponu (Tablo 1) dokudan elde edilen protein ekstresi, 25 ug seyreltin (düşük protein konsantrasyonları da kullanılabilmektedir). Buz üzerinde tutun. 25: 4 atıl IRP1 (% 2 nihai konsantrasyon) aktif hale getirmek için 2-merkaptoetanol (2-Me) ile seyreltildi: Gerekirse, 1 ve 1 ul ekleyin.
  2. 95 ° çift distile H radyoaktif işaretli IRE probu sulandırmak 2 O 200.000 cpm / ul, ısı doğasını1 dakika için C ve en az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya.
  3. Protein ekstresi Radyoetiketli IRE probu 1 ul ekleyerek bir EMSA reaksiyonu ayarlayın.
  4. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Reaksiyona 50 mg / ml heparin 1 ul ekle (prob 9 ile non-spesifik protein etkileşimlerini inhibe etmek için) ve 10 dakika daha inkübasyona devam etmektedir. -80 ° C de hazır heparin çözeltisi (50 mg / ml) ve mağaza alikosu.
  6. Uzun radyo-etiketli problar (> 60 nükleotid) kullanıldığında, 1 ul RNaz T1 (1 U / ul) ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir sondasına bağlanma, spesifik olmayan protein azaltmak için, RNA / protein daha iyi ayrılmasına izin vermek üzere Elektroforez sırasında kompleksi.
  7. Yükleme tamponu (% 80 gliserol + bromofenol mavi) 3 ul ekleyin, karıştırın ve% 6 denatüre edici olmayan poliakrilamid jeli üzerinde yükü.
  8. 130 V (5 V / cm) 60 dakika süre ile jel çalıştırın.
  9. Transfer büyük bir filtre kağıdı ve kuru üzerine jel.
  10. Bir film ortaya çıkarmak ve otoradyografi gelişir. Uygulama süresi 1 saat (ya da daha az) den O / N 'ye kadar çıkabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bölüm 3 ve protokol 4'te tarif edildiği gibi bir radyo-etiketli prob İRE, elde edilmiştir. prob dizisi 5'-GGGCGAAUUC GAGCUCGGUA CCCGGGGAUC CUG UUCAA Cı AGUGC UUGGA CGGAUCCU-3 'idi; kalın nükleotidler kritik IRE özellikleri bir eşleşmemiş C kalıntısı ve döngü, temsil eder. prob özel radyoaktivite 4.5 x 10 9 cpm / RNA ug idi.

Aktivitesi İRE bağlayıcı demir sıçramaların etkilerini değerlendirmek için, sıçangil RAW264.7 makrofaj tedavi edilmediği veya hemin (demir kaynağı) veya desferrioksamin (demir kenetleme maddesi) ile muamele edildi. Lisatlar hazırlanmış ve İRE prob (8000 cpm / ug protein) EMSA ile analiz edildi. Örnek veriler, sırasıyla, sol ve sağ panellerinde otoradyogramlar arasında daha kısa ve daha uzun maruz kalma ile, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Murin IRE / IRP1 ve IRE / IRP2 kompleksleri, farklı hareketlilik ve iki ayrı bantları gösterirlermuamele edilmemiş hücrelere karşılık gelen, şerit 1 görülebilir. Demir takviyesi onları azalmış ise demir şelasyon derinden, (şeritli 3) IRP1 ve IRP2 (kulvar 2) hem IRE-bağlama faaliyetleri kaynaklı. Hatta demir ile muamele edilmiş hücrelerin ekstrelerinde% 2 2-ME bütünüyle harekete geçirilmiş olarak IRP1 (alt panel) ile ön tedavi,. Bu ütü pertürbasyonlar IRP1 stabilitesi çarpacak olmadığını gösterir ve aynı zamanda, bir yükleme kontrolü olarak görev yapar. Buna 2-ME, ön-muamele IRP2 ire bağlayıcı aktivitesi inhibe etti. Hızlı göç non-spesifik bantlar demir etkilenmez.

Sonra, vahşi tip karaciğerlerinde aktivitesi İRE bağlayıcı analiz Irp1 - / - ve Irp2 - / - daha önce bir standart ya da bir demir bakımından zenginleştirilmiş diyet (Şekil 2), bir hafta boyunca beslenirler fareler. Irp1 - / - ve Irp2 - / - fareler nezaketen Dr. MW Hentze (EMBL, Heidelberg, Almanya) tarafından temin edilmiştir. Vahşi tip karaciğer ekstrelerinde, IRP1 IRE-bağlama aktivitesi ve IRE / IRP2 komplekslerinin büyük kısmı için sorumluydu pek vardıönceki gözlemlerle 26 ile uyumlu olarak görünür (kulvarlar 1, 2). - / - Fareler (kulvarlar 3, 4) IRP2 karaciğer Irp1 özleri kuvvetli İRE bağlayıcı aktivitesi sergiledi. Bu koşullar altında, hiçbir İRE / IRP1 kompleksleri gözlenmiştir. - / - Aynı şekilde, İRE / IRP2 kompleksleri karaciğer Irp2 ekstreleri oluşmuştur fareden (kulvarlar 5, 6). Hem IRP1 ve IRP2 hepatik IRE-bağlanma aktivitesi yüksek demir diyet ile fareler azalmış Besleme; Bu etki IRP2 (kulvarlar 7-12) daha dramatik oldu. Not vahşi tip veya Irp2 muamele edilmesinden sonra - bu açıkça otoradyogramlar kısa maruz kalma gözlenmiştir (2-ME IRP1 ire bağlayıcı aktivitesi, hemen hemen tüm İRE prob kaymış bir noktaya kadar geliştirilmiştir karaciğer ekstrelerinde - / Sol panelde).

- / - Fareler (Şekil 3) Son olarak, karaciğer ve vahşi tip ve HJV dalaklarında İRE bağlayıcı aktivitesi değerlendirildi. HJV - / - fareler nezaketen Dr. Carolina Andrews (Duke Üniversitesi, Kuzey Carolina) tarafından temin edilmiştir. Bu hayvanlar bir model temsilKalıtsal hemokromatozis 27, retiküloendotelyal makrofajlar demir kalırken aşırı demir, parankimal hücrelerde biriken, sistemik demir yükünün, bir hastalık 28 eksiği. Beklendiği gibi, HJV karaciğerleri - / - göstermiştir (demir yüklü hepatositlerle) fareler vahşi tipli (kuşak 1-4) kıyasla, aktivitesi İRE bağlayıcı azalmıştır. Tersine, İRE bağlama aktivitesi HJV dalaklarında yüksekti - / - fareler (demir eksikliği olan makrofajlar, 5-8 kuşak). Yine burada, 2-ME tedavi karaciğer özleri (sol panelde otoradyogramlar kısa pozlama bakınız) IRE prob neredeyse tamamen kaymasını teşvik.

Tablo 1. Sitoplazmik lisis tamponu.

% 1 Triton X100
25 mM Tris-HCI, pH 7.4
40 mM KCI
  1. çözüm gerekirotoklavlanmış ve oda sıcaklığında saklanabilir.
  2. Proteaz inhibitörleri, örneğin, 10 ug / ml löpeptin ve 0.1 mM fenilmetansülfonil florit (PMSF), kullanımdan önce ilave edilebilir.
  3. Taze, 1 mM dithiotheritol eklenmesi IRP2 aktivitesinin tespit edilmesi için tavsiye edilir.

In vitro transkripsiyon reaksiyonu için Tablo 2. stok çözeltileri.

/ Ml linearize plazmid şablonu 1 ug
5x transkripsiyon tamponu (T7 RNA polimerazı ile birlikte)
ATP, CTP ve GTP 20 mM karışımı
3,000 Ci / mmol [α-32P] -UTP
100 mM ditiotreitol
10 U / ul RNaz inhibitör
20 U / ul T7 RNA polimerazı


<poliakrilamid jel elektroforezi denatüre edici olmayan güçlü> Tablo 3. Stok çözümleri.

% 40 akrilamid: bisakrilamid (37.5: 1)
5x TBE (Tris / borat / EDTA)

5x TBE 1 L yapmak için, Tris bazı, 54 g borik asit ve 27,5 g, ve 0.5 M EDTA (pH 8.0) içinde 20 ml kullanılır.

Şekil 1,
RAW264.7 makrofajlar faaliyetleri IRE-bağlama Şekil 1. Demir-bağımlı düzenleme. 10 7 hücre / 100 mcM hemin veya desferoksamin N ya sol işlenmemiş veya işlenmiş O idi. Sitoplazmik lizatları% 2 2-ME (alt yokluğunda (üst) veya varlığında, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır). İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. analizi vahşi tip (wt) 'karaciğerlerinde aktivitelerini İRE bağlayıcı Irp1 - / - ve Irp2 - / -. Fareler 5 haftalık farelerin (n = 2, her bir genotip için), C57BL / 6 arka 29, hepsi standart ya da yüksek demir diyet (% 2 karbonil demir içeren) üzerine yerleştirilmiştir. Bir hafta sonra hayvanlar kurban edilmiştir. Karaciğer protein ekstreleri, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır% 2 2-ME (alt) yokluğunda (üst) veya varlığında gerçekleştirilir. İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
- / -. Karaciğerlerde faaliyetleri ve yabani tip (wt) ve HJV dalak İRE bağlayıcı Şekil 3. Analiz farelerin (her genotip için, n = 2), 10 haftalık fareler, C57BL / 6 arka 30, tüm hayvanlar kurban edilmiştir. Karaciğer ve dalak protein ekstreleri yokluğunda (üst) veya varlığında, bir 32 P-etiketli İRE probu ile EMSA ile analiz edilmek üzere hazırlanmıştır2% 2-ME (alt). İRE / IRP1 ve ücretsiz İRE prob İRE / IRP2 komplekslerinin pozisyonları oklarla gösterilmiştir. Yıldız spesifik olmayan bir bant gösterir. Otoradyogramlar kısa ve uzun poz sol ve sağ paneller gösterilir, sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, IRP1 ve IRP2 ve IRE-bağlama faaliyetleri incelemek için geliştirilmiş bir protokol açıklar, ve biz temsilcisi verileri gösterir. Farklı problar kullanılarak, bu protokol, aynı zamanda, diğer RNA bağlama proteinlerinin çalışma için ayarlanabilir. Kritik bir safha, prob boyutu. Tam bağlanma yeri bilinmediğinde ortak uzun probların kullanımı, serbest RNA daha farklı geçiş olmayan RNA / protein kompleksleri ile sonuçlanabilir. Bu durumda, bu RNAz T1 (adım 6.6) ile muamele etmek suretiyle bağlanmamış RNA'nın çıkması için tavsiye edilir. prob kalitesi de çok önemlidir. En iyi sonuçlar, taze hazırlanmış radyo işaretli RNA ile elde edilir. Jel saflaştırma 10 gerekli değildir, ancak (herhangi bir RNAz T1 sindirim aşaması dahil edildiği takdirde) probu hazırlanması için, in vitro transkripsiyon reaksiyonu erken sonlandırma ürünleri hasıl halinde EMSA görünümünü iyileştirebilir. Yerli jel elektroforezi çok hızlı m KoşuBugün RNA / protein kompleksleri kopmalarına neden ve bulanık bantlar neden olabilir aşırı ısınma ile sonuçlanır.

Kantitatif sonuçlar fosforlu ile, gecikmiş bantlarının yoğunluğunu analizi ile elde edilebilir. RNA probu fazla miktarda mevcut olan ve RNA bağlanma için sınırlayıcı olmadığı zaman sayımsal geçerlidir. serbest enerji ΔG o bağlantılıdır ayrılma sabiti Kd ile temsil edilen RNA / protein etkileşiminin afinitesi, radyo-etiketli prob 3 azalan miktarlarda RNA bağlayıcı aktivitesi titre edilerek denge şartları altında değerlendirilebilir. İRE / IRP1 etkileşimi kapsamlı fizikokimyasal 9,31 karakterize edilmiştir. Bir RNA bağlayıcı proteinin değişen miktarlarda ile titrasyon EMSA deneyleri stokiyometri 3 hesaplamak için gerçekleştirilebilir. Bağlama için Spesifiklik kolayca etiketsiz "soğuk" comp aşan rekabet deneyleri ile doğrulanabiliretitor RNAlar 3. Sadece belirli yarışmacılar engelli radyoaktif bant yoğunluğunu azaltmak gerekir. Özgüllük da 7 "süperkayma" verecektir EMSA reaksiyonunda, RNA bağlanan proteine ​​karşı bir antikor da dahil olmak üzere izlenebilir. Bu RNA bağlayıcı proteinin kimliğini saptamak için kullanılabilir. Hayır "süperkayma" non-spesifik antikorlar veya bağışıklık-öncesi serumu ile takip edilmelidir.

Sonuç olarak, EMSA RNA / protein etkileşimlerinin analizi için güçlü bir yöntemdir. Bu gerçekleştirmek için nispeten kolay ve en az altyapı gerektirmektedir. Bu filtre-bağlayıcı tahlili gibi basit değildir, ancak birden RNA bağlayıcı proteinler (örneğin IRP1 ve IRP2 gibi) prob ile özellikle etkileşime zaman daha bilgilendirici ve doğru veri elde edecek. Bu murin aksine, insan İRE / IRP1 ve İRE / IRP2 komplekslerinin EMSA'da birlikte göç ettiğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, "süper kaymaları ile ayrılabilir1 'dir; spesifik antikorların 7. EMSA RNA / protein etkileşimleri haritalama için yararlı değildir; toeprinting veya 32 çapraz bağlama gibi RNaz koruma deneyi gibi diğer teknikler, daha uygundur. Yine EMSA ırp'leri 8 ile böyle olmuştur, ama aynı zamanda hesaplama veya yüksek verimli deneysel yaklaşımlarla elde edilen verilerin doğrulayan için olduğu gibi, yeni RNA / protein etkileşimleri keşfetmek için mükemmel bir seçimdir. Ayrıca, EMSA RNA / protein etkileşiminin özgünlüğü ve fiziko-kimyasal özellikleri analiz etmek için daha üstündür.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
leupeptin SIGMA L2884
PMSF SIGMA 78830
BioRad Protein Assay BIORAD 500-0006
T7 RNA polymerase Thermoscientific EPO111
RNase Inhibitor Invitrogen 15518-012
UTP [alpha-32P] Perkin-Elmer NEG507H
Scintillation liquid Beckman Coulter 141349
heparin SIGMA H0777
Rnase T1 Thermoscientific EN0541
Name of the Equipment
Tissue Ruptor Qiagen 9001271
Scintillation counter Beckman Coulter LS6500
Protean II xi Cell BIORAD 165-1834
20 wells combs BIORAD 165-1868 1.5 mm thick
1.5 mm spacers BIORAD 165-1849
PowerPac BIORAD 164-5070

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fried, M., Crothers, D. M. Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic Acids Res. 9, 6505-6525 (1981).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9, 3047-3060 (1981).
  3. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  4. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  5. Luscieti, S., et al. Novel mutations in the ferritin-L iron-responsive element that only mildly impair IRP binding cause hereditary hyperferritinaemia cataract syndrome. Orphanet J Rare Dis. 8, 30 (2013).
  6. Rio, D. C. Filter-binding assay for analysis of RNA-protein interactions. 2012, CSHL Press. Cold Spring Harbor, NY. 1078-1081 (2012).
  7. Wang, J., et al. Iron-mediated degradation of IRP2: an unexpected pathway involving a 2-oxoglutarate-dependent oxygenase activity. Mol. Cell. Biol. 24, 954-965 (2004).
  8. Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated regions of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 2171-2175 (1988).
  9. Haile, D. J., Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Regulation of interaction of the iron-responsive element binding protein with iron-responsive RNA elements. Mol. Cell. Biol. 9, 5055-5061 (1989).
  10. Mueller, S., Pantopoulos, K. Activation of iron regulatory protein-1 (IRP1) by oxidative stress. Methods Enzymol. 348, 324-337 (2002).
  11. Wang, J., Pantopoulos, K. Regulation of cellular iron metabolism. Biochem J. 434, 365-381 (2011).
  12. Hentze, M. W., et al. Identification of the iron-responsive element for the translational regulation of human ferritin mRNA. Science. 238, 1570-1573 (1987).
  13. Casey, J. L., et al. Iron-responsive elements: regulatory RNA sequences that control mRNA levels and translation. Science. 240, 924-928 (1988).
  14. Dandekar, T., et al. Identification of a novel iron-responsive element in murine and human erythroid d-aminolevulinic acid synthase mRNA. EMBO J. 10, 1903-1909 (1991).
  15. Gray, N. K., Pantopoulos, K., Dandekar, T., Ackrell, B. A. C., Hentze, M. W. Translational regulation of mammalian and drosophila citric acid cycle enzymes via iron-responsive elements. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 4925-4930 (1996).
  16. McKie, A. T., et al. A novel duodenal iron-regulated transporter IREG1, implicated in the basolateral transfer of iron to the circulation. Mol. Cell. 5, 299-309 (2000).
  17. Gunshin, H., et al. Cloning and characterization of a mammalian protein-coupled metal-ion transporter. Nature. 388, 482-488 (1997).
  18. Sanchez, M., Galy, B., Muckenthaler, M. U., Hentze, M. W. Iron-regulatory proteins limit hypoxia-inducible factor-2alpha expression in iron deficiency. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 420-426 (2007).
  19. Sanchez, M., et al. Iron regulation and the cell cycle: Identification of an iron-responsive element in the 3'-untranslated region of human cell division cycle 14A mRNA by a refined microarray-based screening strategy. J. Biol. Chem. 281, 22865-22874 (2006).
  20. Santos, C. O., et al. An iron responsive element-like stem-loop regulates alpha-hemoglobin-stabilizing protein mRNA. J Biol Chem. 283, 26956-26964 (2008).
  21. Liu, Z., et al. Siderophore-mediated iron trafficking in humans is regulated by iron. J Mol Med (Berl. 90, 1209-1221 (2012).
  22. Gray, N. K., et al. Recombinant iron regulatory factor functions as an iron-responsive element-binding protein, a translational repressor and an aconitase. A functional assay for translational repression and direct demonstration of the iron switch. Eur. J. Biochem. 218, 657-667 (1993).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Testa, U., et al. Differential regulation of iron regulatory element-binding protein(s) in cell extracts of activated lymphocytes versus monocytes-macrophages. J. Biol. Chem. 266, 13925-13930 (1991).
  25. Hentze, M. W., Rouault, T. A., Harford, J. B., Klausner, R. D. Oxidation-reduction and the molecular mechanism of a regulated RNA-protein interaction. Science. 244, 357-359 (1989).
  26. Meyron-Holtz, E. G., et al. Genetic ablations of iron regulatory proteins 1 and 2 reveal why iron regulatory protein 2 dominates iron homeostasis. EMBO J. 23, 386-395 (2004).
  27. Huang, F. W., Pinkus, J. L., Pinkus, G. S., Fleming, M. D., Andrews, N. C. A mouse model of juvenile hemochromatosis. J. Clin. Invest. 115, 2187-2191 (2005).
  28. Sebastiani, G., Pantopoulos, K. Disorders associated with systemic or local iron overload: from pathophysiology to clinical practice. Metallomics. 3, 971-986 (2011).
  29. Galy, B., Ferring, D., Hentze, M. W. Generation of conditional alleles of the murine iron regulatory protein (IRP)-1 and -2 genes. Genesis. 43, 181-188 (2005).
  30. Gkouvatsos, K., et al. Iron-dependent regulation of hepcidin in Hjv-/- mice: Evidence that hemojuvelin is dispensable for sensing body iron levels. PLoS ONE. 9, 85530 (2014).
  31. Goforth, J. B., Anderson, S. A., Nizzi, C. P., Eisenstein, R. S. Multiple determinants within iron-responsive elements dictate iron regulatory protein binding and regulatory hierarchy. RNA. 16, 154-169 (2010).
  32. Gopinath, S. C. Mapping of RNA-protein interactions. Anal Chim Acta. 636, 117-128 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics