ОТВЕТСТВЕННОСТЬ пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) клетки по-разному размеры эмбриональных телец

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Цель настоящего доклада состоит в описании протоколов для получения пигментного эпителия сетчатки (НПП) и из индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток, используя различные размеры эмбриональных органов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Индуцированные плюрипотентные стволовые (IPS) клетки типа плюрипотентных стволовых клеток, полученных путем перепрограммирования взрослых клеток с внешними факторами 1. В отличие от этого, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), другой тип плюрипотентных стволовых клеток, которые генерируются из внутренней клеточной массы бластоцисты 2-3. Несмотря на их различное происхождение, плюрипотентных клеток и ЭСК сравнимы по их неограниченной мощности, чтобы воспроизвести в пробирке и в их способности дифференцироваться в любой тип клеток 4-5. Эти характеристики плюрипотентных клеток делает их идеальными кандидатами для применения в персональной регенеративной медицины. Последние научно-исследовательские работы сосредоточены на разработке надежных протоколов дифференциации по производству специализированных взрослых клеток, включая пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) 6-11.

Для потенциальных клинических применений плюрипотентных клеток, полученных, направленной дифференцировки для этого конкретного типа клеток является существенным. Есть различные методыопубликованы направленной дифференцировки обоих ЭСК и плюрипотентных клеток в ПЭС, что сильно варьируется в их эффективности 6-7, 12-16. Мы до сих пор не знаю, что многие из молекулярных событий, которые регулируют судьбу клеток / ткани в процессе развития или дифференциации. В последние годы, были предприняты усилия для разработки протокола дифференцировки, которые могут имитировать эмбрионального развития, как это возможно. В бластоцисты фазе, неизрасходованный население стволовых клеток вместе в трехмерной микросреде. Таким образом, различные стратегии были применены, чтобы сделать клетки ESC / IPS собраны вместе и расти их в трех измерениях. Эти стволовых клеток агрегаты называются эмбриональные органы (EBS). Исследования показали, что EB дифференцировки стволовых клеток имитировать ранней стадии развития эмбриона и могут самопроизвольно привести к примитивной энтодермы на его внешней поверхности. Позже, по мере развития развития Е.Б., дифференцированная клетка фенотипы всех трех зародышевых линий появляются 17-18. Therefore, EBS на основе дифференциации протоколы привлекли много внимания к дифференцировке в пробирке ESC / IPS клетки и хорошим кандидатом для производства НПП из плюрипотентных стволовых клеток 13.

ЭТ можно сделать, используя несколько методов от регулятора / IPS клеток. Первоначально ЭТ были сделаны соскабливания прилипшие колоний и поддержания их в неадгезированных суспензионной культуре. Тем не менее, этот подход дает гетерогенную популяцию ЭТ, что вызывает низкую воспроизводимость. Висячие культуры клеток падение и микролуночный формирование ЭТ основе Другие популярные методы для формирования ЭТ, которые дают однородные ЭТ определенных размеров, которые легко воспроизводимым. Кроме того, этот метод может дать микролуночный большое количество агрегатов с меньшим усилием.

Дифференцирование клеток в ЭТ регулируется мультиплексированием морфогенетических сигналов от внеклеточной и внутриклеточной микросреды. В отличие от дифференциации в Пнolayer формат ЭТ обеспечить платформу для комплексной сборки клеток и межклеточного сигналов, чтобы произойти 17. Интересно, что наблюдалось количество плюрипотентных стволовых клеток, используемых для отдельных ЭТ влиять на судьбу клеток. Например, в кроветворной исследования дифференциации эмбриональных клеток, было отмечено, что 500-клеточной EB стимулирует дифференциацию к миелоидной то время как 1000-клетки EB толкают к эритроидного линии 20. В другом исследовании, меньше ЭТ выступает энтодермы дифференциацию в то время как более крупные ЭТ способствовало к нервно-ктодерму дифференциации 11, 17.

Эти последние исследования убедительно показывают, что число ESC / IPS клеток, используемых для отдельных ЭТ влияют на ЭТ, основанные дифференциацию любых типов клеток. Однако, по нашим сведениям, не существует каких-либо текущих исследований, которые вскрыли влияние размера EBS в своей склонности к дифференциации к ПЭС. Целью данного исследования является описание влиянияEB размер по наведению стебля плюрипотентных (IPS) клеток - пигментный эпителий сетчатки (IPS-РПЭ) дифференциация и определить оптимальное количество клеток, чтобы сделать ЭТ для направленной дифференцировки в сторону НПП линии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка культуры Реагенты и культуральные планшеты

  1. Подготовьте подачи свободной стволовых клеток культуральной среды путем добавления 100 мл 5х бессывороточной дополнение к 400 мл стволовых клеток базальной среде. Носитель является стабильным при 4 ° С в течение до 2-х недель, и при -20 ° С в течение 6 месяцев.
  2. Добавить 10 мкМ раствор ро-ассоциированный, суперспирализованного, содержащий протеин киназы (ROCK) ингибитора (Y-27362) в продаже эмбриоидного тела (EB) образование среды.
  3. Подготовка дифференциации среды путем добавления 0,1 мМ β-меркаптоэтанола, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 2 мМ L-глутамина, 10% замены нокаутом сыворотки (KSR) и 10 мкг / мл гентамицина, чтобы Дульбекко в модификации Дульбекко / питательной смеси F-12 (DMEM / F12).
  4. Подготовка IPS-НПП среды путем добавления 1x N1 добавки, 0,1 мМ заменимых аминокислот, 250 мкг / мл таурин, 13 нг / мл трииодо-L-тиронин соль натрия, 20 нг / мл гидрокортизона, 5 мкг / мл гентамицина и 15% фетальной бычьей сыворотки (FBS), <SUP> 21 минимально необходимой среды Игла (MEM). Доводят рН до 7,4.
  5. Подготовка трииодо-L-тиронина соли запаса натрия. Растворите 1 мг трииодо-L-тиронина натриевой соли в 1 н гидроксида натрия, осторожно вращая. Добавить 49 мл MEM, чтобы 50 мл 20 мкг / мл трииодо-L-тиронина натриевой соли. Подготовка аликвоты и заморозить при -20 ° C до необходимости. Использование соответствующего объема для достижения желаемой концентрации в конечной культуральной среде.
  6. Подготовка гидрокортизон маточного раствора. Солюбилизации 1 мг гидрокортизона в 1 мл 100% -ного этанола при осторожном перемешивании. Добавить 19 мл MEM, чтобы 20 мл 50 мкг / мл гидрокортизона раствор. Аликвоты и заморозить при температуре -20 ° С до использования. Использование соответствующего объема для достижения желаемой концентрации в конечной культуральной среде.
  7. Подготовка рабочего раствора диспазу 1 мг / мл в DMEM / F12.
  8. Подготовка матрицы с покрытием пластин
    1. Подготовка матрицы белка, выделенного из Engelbreth-Холм-рой (EHS) Меморандум о взаимопониманиисаркома SE клетки в DMEM / F12 до 0,08 мг / мл. Шерсть каждую лунку 6-луночного планшета с 1 мл раствора матрицы. Инкубируйте покрытием пластин при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. После 1 ч инкубации аспирации избыточного DMEM / F12. Добавить 0,5 мл фидерных без стволовых клеток культуральной среде, чтобы предотвратить высыхание скважин. Планшеты с покрытием матрицы готовы к использованию.
  9. Подготовка микрострипы пластины, путем промывки в каждую лунку по 2 мл DMEM / F12. Удалить DMEM / F12 и добавить 0,5 мл формирования EB среде с добавлением Rock ингибитора в каждую лунку. Центрифуга пластины при 2000 х г в течение 5 мин, чтобы удалить пузырьки воздуха.
  10. Подготовка FACS буфера окрашивания путем смешивания 2% FBS, и 0,09% азид натрия в фосфатно-солевом буфере (PBS). Регулировка буфер до рН 7,4.
  11. Подготовка трипсин раствор нейтрализующей добавлением 10% FBS, чтобы DMEM / F12.

2. плюрипотентных Культура

  1. Перед IPS посева клеток, теплый питатель, свободной от стволовых клеток культуральной среды до 37 ° С, и имеют маТрикс покрытием пластин готов.
  2. Быстро разморозить клетки IMR90-1 плюрипотентных в C на водяной бане 37 °. Затем снимите крио-флакон из водяной бани и протрите ампулу с 70% этанола. Передача клеток в 15 мл коническую трубку, используя 2 мл пипетку, чтобы свести к минимуму нарушение клеточных комочков.
  3. Добавить 5 мл теплой подачи без стволовых клеток культуральной среды для клеток каплям и осторожно перемешать. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
  4. Тщательно ресуспендирования скопления клеток в 2 мл подачи без стволовых клеток культуральной среды и семенем скопления клеток в лунках матрицы покрытием пластины. Место пластины в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2, 95% влажности.
  5. Изменить среду клеточной культуры IPS ежедневно. Соблюдайте недифференцированных колониям 6:55 дней после посева. Проверьте недифференцированных колоний, которые готовы для прохода (колоний с плотной центра) под световым микроскопом.

3. пассажи из плюрипотентных клеток

  1. До начала и до прохождения клетки IPS, согреть диспазу решение, DMEM / F12 и подачи без стволовых клеток культуральной среде до 37 ° C на водяной бане.
  2. Перед пассажей плюрипотентных клеток, удалите все области дифференциации, очищая территорию и аспирационных среду. Тщательно промойте клетки плюрипотентных с 2 мл DMEM / F12.
  3. Добавить 1 мл 1 мг / мл диспаза в каждую лунку и инкубируют при 37 ° С в течение 7 мин. Аспирируйте диспазу и осторожно промыть клетки колонии с 2 мл DMEM / F12 два раза. После промывки, добавьте 2 мл фидерных без стволовых клеток культуральной среде в каждую лунку.
  4. Использование 5 мл пипетку осторожно очистить колонии пластины с образованием клеточных скоплений. Передача отдельные сгустки клеток в 15 мл коническую трубку. Добавьте достаточное количество подачи без стволовых клеток культуральной среды, чтобы отобрать следующий отрывок клеток.

4. Генерация ЭТ Использование Планшетный

  1. Получение суспензии отдельных клеток из плюрипотентных клеток
    1. Снимите mediuм от плюрипотентных клеток и промыть клетки плюрипотентных 2 мл DMEM / F12. Добавить 750 мкл Accutase для плюрипотентных клеток в каждую лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% CO 2, чтобы клетки, чтобы отсоединить от пластины (примерно 5-10 мин).
    2. Используйте пипетку осторожно отделить все оставшиеся клетки и отделить все оставшиеся клетки на поверхности пластины. Передача клеток в 50 мл коническую трубку. Промыть пластины с 5 мл DMEM / F12, и объединить промыть DMEM / F12 с клетками в конической трубе. Передайте клеточной суспензии через сито 40 мкм клетки, чтобы удалить любые возможные скопления остаточных клеток.
    3. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы удалить Accutase. Ресуспендируют осадок клеток в формировании среды EB таким образом, что концентрация клеток составляет примерно 0,5-1,0 × 10 7 клеток / мл.
    4. Определить количество жизнеспособных клеток путем подсчета клеток с трипановым синим и гемоцитометра.
  2. Adjustinг плотность клеток в лунках, чтобы сформировать контролировали по размеру ЭТ
    1. Регулировка количества клеток в каждую лунку в планшете генерировать желаемые размеры EB. Добавить клеток в лунки пластин, полученного на стадии 1.9, равномерно распределить клетки осторожно пипеткой несколько раз клеткам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек, необходимых на лунку = требуемое количество клеток на EB х количество лунок на лунку.
    2. Регулировка среды пласта ЕВ с добавлением ингибитора Rock в лунках, к конечного объема 2,0 мл. В распространении клетки осторожно пипеткой в ​​каждую лунку. Центрифуга Планшетный на 100 мкг в течение 3 мин. Место пластин в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности в течение 24 ч.
  3. Сбор ЭТ из Планшетный
    1. Урожай ЭТ из лунок с помощью пипетки среды в хорошо вверх и вниз с 1 мл микропипетки для удаления большей части ЭТ. Суспензию пропускали EB через перевернутый 40 мкм ячейкифильтр в верхней части 50 мл коническую трубку, чтобы удалить отдельные клетки.
    2. Вымойте планшете 5 раз 1 мл DMEM / F12, чтобы удалить все EBS. Сбор моет и передать перевернутой ячейки фильтра. Поверните ячейки фильтра лицевой стороной вверх на новый 50 мл коническую трубку. Сбор ЭТ промывкой формирования среды EB. Количество ЭТ для определения выхода.

5. Покрытие ЭТ и начало Дифференциация

  1. Пластина ЭТ на белковой матрицы, покрытой шесть-луночных планшетах (как на этапе 1.8.1) при плотности <1000 ЭТ / лунку в среде формирования EB плюс Rock ингибитора 10 мкМ. Инкубируйте ЭТ при 37 ° С с 5% СО 2 и 95% влажности в течение 24 ч.
  2. 24 ч после EB покрытия, заменить дифференциации среды, чтобы инициировать дифференциацию. Изменение половина дифференцировки среды через день до тех пор, пока клетки собирают для последующего анализа.
  3. Сбор образцов на 6-й день, 17, 29 и 60, чтобы провести RT-PCR, IMMunocytochemistry и FACS для проверки выражение характерных генов и белков ПЭС.

6. Экстракция РНК и ПЦР

  1. Извлечение РНК из образцов EB в соответствии с инструкциями, приведенными в коммерчески доступного набора. Определить концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
  2. Выполнение обратной транскрипции на 100 нг общей РНК в соответствии с коммерчески доступной РНК в кДНК обратной транскрипта комплекта.
  3. Выполнение ПЦР с 10 нг кДНК с использованием следующих праймеров (таблица 1) при концентрации 10 мкмоль / 10 нг кДНК. Установка ПЦР следующим образом: денатурация ДНК при 95 ° С в течение 5 мин, усиливаются с 35 циклами при 95 ° С в течение 15 сек, 60 ° C в течение 30 сек, 72 ° С в течение 1 мин, а затем в последнем цикле на 72 ° С в течение 10 мин. Запуск ПЦР-продукт на 1% агарозном геле.

7. Иммуноцитохимия

  1. Вымойте ЭТ с PBS в два раза при комнатной температуре. Закрепите ЭТ при комнатной температуре в 4% paraformaldehyde в течение 10 мин. Промыть один раз PBS при комнатной температуре. Магазин образцы в PBS при 4 ° С до тех пор, пока используется для окрашивания.
  2. На окрашивания дня гости фиксированные клетки с фиксацией и проницаемости реагентов. Инкубируйте образцы с блокирующим раствором (10% козьей сыворотки в пермеабилизации раствора) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Выполнение иммунохимии в 10% козьей сывороткой в ​​пермеабилизации раствора с использованием следующих первичных антител в указанных разведений: анти-Pax6 (1:10), анти-RX (1: 200), анти-MITF (1:30), а анти- ZO1 (1: 100). Инкубируйте образцы с соответствующими антителами O / N при 4 ° С.
  4. На следующий день, снимите первичное антитело из клеток и промыть образцы три раза PBS. Инкубируйте образцы с флуорофором-конъюгированные вторичные антитела в течение 1 ч при комнатной температуре.
  5. Удалите вторичное антитело из клеток и промыть образцы трижды в PBS. Установите крышку скользит на стеклах с DAPI, содержащей монтажную среду и позволяют образцы, чтобы установить O / N в темной камере.Используйте флуоресцентного микроскопа для визуализации окрашивания.

8. Окрашивание для анализа FACS

  1. Вымойте культурно ЭТ в PBS в два раза. Инкубируйте ЭТ с 0,5 мл 0,25% трипсина в течение 5-10 мин, чтобы суспензии отдельных клеток. Нейтрализовать трипсина трипсином нейтрализующего раствора (1 мл / лунку).
  2. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 10 мин.
  3. Жидкость над осадком сливают и добавляют 10 мл DMEM / F12 с клетками в трубке. Аккуратно переверните, чтобы перемешать клетки. Центрифуга на 600 х г. После центрифугирования, отбросить супернатант и ресуспендирования клеток в FACS буфере окрашивания.
  4. Подсчитайте общее количество клеток. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин. После центрифугирования отбросить супернатант. Зафиксировать клетки немедленно при добавлении 0,5 мл 4% параформальдегида. Все хорошо перемешать, осторожно встряхивая. Инкубируйте клетки при 4 ° С в течение 20 мин.
  5. Центрифуга при 600 мкг в течение 10 мин и снятьсупернатант. Vortex мягко, чтобы сорвать осадок клеток. Клетки проницаемыми добавлением 1 мл охлажденного раствора пермеабилизации. Вихревой аккуратно, чтобы смешать и инкубировать на льду в течение 30 мин.
  6. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин и удалить супернатант. Добавить 3 мл FACS окрашивания буфера и ресуспендируют. Повторите этот шаг для еще один раз. Ресуспендируют клеток в FACS буфере окрашивания в конечной концентрации 5 × 10 6 клеток / мл.
  7. Передача 100 мкл клеточной суспензии (0,5 × 10 6 клеток) в каждую микроцентрифужные пробирки и добавить рекомендуемый объем первичного антитела. Для Рах6, добавить 5 мкл PE анти-Рах6 в 100 мкл клеточной суспензии. Для MITF, добавить 5 мкл анти-MITF в 100 мкл клеточной суспензии.
  8. Тщательно перемешать, инкубировать при комнатной температуре в течение 60 мин. Добавить 3 мл FACS буфера окрашивания. Смешайте и центрифуге при 600 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант и повторите 8,16 в течение двух дополнительных раз.
  9. Для окрашивания MITF, инкубировать клетки в средней antiboду, козы против мышиного Alexa Fluor 488 в разведении 1: 2000 в течение 1 часа при 4 ° С. Для окрашивания Рах6, избежать этого шага.
  10. Промыть клеток с 5 мл FACS буфера и окрашивания центрифуге при 600 х г в течение 10 мин. Повторите этот процесс для еще два раза.
  11. Ресуспендируют клеток в 500 мкл FACS буфера и окрашивания вихря осторожно, чтобы нарушить клеточный осадок. Образцы готовы для анализа проточной цитометрии.

9. IPS-НПП Выделение и культуры

  1. В 29-й день аккуратно вырезать вокруг выделенных пигментных колоний от пластины культуры с использованием пипетки 200 мкл. Передача с плавающей колонии в 15 мл коническую трубку. Центрифуга колоний при 600 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре, и удалить супернатант.
  2. Ресуспендируют клеток колонии в 10 мл DMEM / F12 и центрифуге при 600 х г в течение 10 мин. Удалить супернатант.
  3. Подготовка суспензии отдельных клеток путем инкубации колонии с 2 мл 0,25% трипсина при 37 ° С в течение 7-10 мин, Аккуратно вихрь клеточной суспензии отделить колоний.
  4. Нейтрализовать трипсина путем добавления 2 мл IPS-НПП среды. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин и отбросить супернатант. Ресуспендируют отдельные клетки в 2 мл IPS-НПП среды. Передача клеток в белковой матрице с покрытием 6-луночного планшета и место в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 95% влажности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом эксперименте, плюрипотентных клетки культивировали и дифференцировались в ПЭС линии от EB. ЭТ контролируемых размеров были сформированы с использованием Планшетный. Как видно на рисунке 1 формирования EB была гомогенной в Планшетный. Эти ЭТ затем собирали и высевали на 6-луночные планшеты (рис 2).

НПП могут быть идентифицированы по их классической шестиугольной морфологии, пигментации и выражения ПЭС маркеров. После 12 недель культуры, 200-клеток ЭТ были разработаны астроцитов и фибробластов морфологию. Нет пигментации не было отмечено, в этих клетках (Фигура 3А). Большие ЭТ разработаны монослой классической морфологии НПП и пигментации (фиг.3В и С) Иммуноцитохимическая для обнаружения RPE маркеры, MITF и ZO1 показал взаимодействие экспрессии этих белков, которые были полученных из 500 клеток и клеток-3000 ЭТ (фиг.4) ,

ЕXpressions месторождения глаз и генов ПЭС были проверены с помощью ПЦР. Рисунок 5 показывает гена профиль экспрессии нейроэктодермального прекурсоров полевых глаз, и ПЭС маркеров в различных размеров EB. Важно отметить, что специфический маркер НПП, RPE65 было обнаружено, начиная с 17 дня.

Для количественного выхода клеток, которые дифференцировались в НПП линии, анализ FACS выполняли для обнаружения нейроэктодермальными и НПП-предшественников маркеры, PAX6 и MITF соответственно. показывает нейроэктодермальная маркера PAX6 в различных размеров ЭТ в различные моменты времени. Примерно 50% из проанализированных клеток были положительными на Рах6 на 6-й день культуры в 3000-клеток ЭТ. Кроме того, FACS-анализ НПП маркера, MITF на различных размеров EB показал, что 20% клеток выражали MITF по день 60 дифференцировки.

Искусственный НПП также характеризуются по их способности теряют пигмент и многоугольной морфологии и получитьфибробластов фенотип на пассажей. Поэтому, чтобы определить, если скорость получены НПП обладают этими характеристиками, мы механически изолированы и пассировать клетки. показан только пассированные клетки потеряли пигмент и получил фибробластов морфологию. Кроме того, эти клетки распространились и восстановил классическую многоугольной морфологии на слиянии (7В). В течение нескольких недель, эти клетки восстановили свою пигментацию (7С).

TATTTTGC
Ген NICB ссылки Последовательность (5'-3 ') Размер (BP)
Рах6 NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
R TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

Таблица 1. ПЦР праймеров для Pax6, RPE65, RX, MITF и GAPDH генов.

Рисунок 1
Рисунок 1. Формирование ЭТ с луночных планшетах. Каждую микролунку содержит (А) 100 клеток, (B) 200 клеток, (в) 500 клетки, и (г) 3000 клеток. Клетки инкубировали 24 часов при 37 ° С и 5% СО 2 для образования EB. (Увеличение 100X, масштаб бар = 400 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Фиг.2
Рисунок 2. ЭТ, полученные из луночных планшетах. (A) 200-клеток ЕВ, (В) 500-клеток ЕВ, (С) 3000-клеток ЕВ, и (D), 15000-клеток ЕВ. (Увеличение 200X, масштаб бар = 200 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3
Рисунок 3. IPS-производные RPE из разных размеров EBS. ЭТ культивировали в течение 12 недель. () 200-клеточной ЭТ был только разработан астроцитов и фибробластов морфологию без пигментации; в то время как 80% - 90% клеток в 500-клеточных ЭТ и С) разработали монослой многоугольных пигментных клеток. (& B: Увеличение 100X, масштабная линейка= 400 мкм; (C):. Увеличение 200X, масштаб бар = 200 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Совместная экспрессия MITF и ZO1. 500- и 3000-клетки EBS выразил MITF и ZO1 после 17 суток дифференцировки. (Увеличение 400X, масштаб бар = 20 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5
Рисунок 5. Ген профиль экспрессии различных размеров ЭТ в различные моменты времени дифференциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6
Рисунок 6. FACS анализ разнообразной размера EB для НПП дифференциации. () FACS данных нейроэктодермальную маркера Pax6 в различных размеров ЭТ во время дифференцировки. (B) FACS анализ НПП маркера MITF на различных размеров EB в день 60 дифференцировки. Высокий уровень MITF достиг 20% и был постоянным между EB размера 500, 3000 и 15000 клеток.

Рисунок 7
Рисунок 7. Продолжение культуры изолированных вручную ПЭС. () НПП субкультивировали и приобрел фибробластов morpholoГр после прохождения. (B & C) Клетки разработаны многоугольную морфологию и пигментацию в течение долгого времени. (Увеличение 100X, масштаб бар = 400 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для полной реализации обещание плюрипотентных стволовых клеток для клеточной терапии, необходимо регулировать их дифференцировку в последовательной и воспроизводимой образом. Этот отчет описывает протоколы для формирования контролировали по размеру ЭТ с использованием микролуночные технологии пластины, инициировать дифференциацию к ПЭС и идентификации белковых и генных маркеров ППД. Для синхронизации дифференциации в пробирке, однородные размеры ЭТ были сформированы с помощью известных чисел иПК центрифугировали в Планшетный по принудительной агрегации. Иммуноцитохимия и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (RT-PCR) используются для мониторинга выражения ПЭС белки и гены объяснить. Наконец, эффективность дифференциации в различных размеров ЭТ анализировали с помощью анализа FACS. Эти методы могут облегчить дифференцировку плюрипотентных клеток в RPE для будущих приложений.

Есть несколько важных моментов в этом методе, который должен быть тщательно выполнены на адрес электроннойNsure успех этого протокола и достижения точных данных. Первый ключевой шаг происходит во время культивирования IPS клеток. плюрипотентных клеток должна быть сохранена в плюрипотентных государства для поддержания их стволовости. Клетки должны быть среду меняли ежедневно, чтобы поддерживать соответствующие уровни bFGF и быть тщательно проверены ежедневно на признаки дифференциации. Недифференцированные клетки плюрипотентных расти как компактные многоклеточных колоний. Клетки должны иметь высокую ядерный отношение цитоплазмы и выраженными ядрышками. Колонии плюрипотентных характеризуются отдельной границы, с несколькими слоями клеток в центре. Признаки дифференциации включают потерю определенных границ колонии, неравномерное морфологии клеток и появление явных типов клеток, таких как нейроны и фибробласты. Отдельные клетки, которые дифференцировались могут быть удалены путем промывки и диспаза, однако, колонии с этими характеристиками должны быть вручную удалена из культуры 22. Подготовка единого IPS клеточной суспензии FOR формирования ЭТ является следующий важный шаг. Важно, чтобы приготовить суспензию без клеточных агрегатов, с тем, чтобы точно доставить нужное количество клеток в планшете, и получают нужный размер EB. РНК препараты для ПЦР-анализа, также важны. Непоследовательность качество РНК существенным источником изменчивости в данных ПЦР. Выделение РНК должна дать минимально деградации РНК для достижения наилучших результатов. Успешное извлечение РНК даст полную РНК с минимальными искажениями и без каких-либо загрязняющих РНКаз. После определения концентрации РНК спектрофотометрически при 260 нм, чистота образца должна быть определена на 230 и 280 нм для обнаружения загрязнения с полисахаридами или белка. 230: 260: 280 Соотношение РНК должно быть 1: 2: 1, чтобы указать, высокое качество РНК, не загрязнения 23. И, наконец, важно, чтобы должным образом зафиксировать клетки для окрашивания FACS. В течение этого этапа фиксации, клетки должны быть отделены, чтобы предотвратить слипание. Insufficпригодная клетка ресуспендирование до проницаемости приведет к клеточной слипания и неточной окрашивания.

Мы рекомендуем, чтобы следовать протоколу, как описано, однако несколько модификаций может быть сделано, если это необходимо. При генерации ЭТ описано на стадии 4, число клеток на EB может быть в диапазоне от 500 до 3000, чтобы достичь высокий выход клеток дифференцировались в ПЭС. Если количество плюрипотентных клеток ограничено, 500-клеточные ЭТ будет производить RPE сравнимую с 3000-клеток ЭТ. Особую осторожность должны быть приняты в процессе Экстракция РНК, описанной в шаге 6. Образцы должны быть проложены в трех экземплярах для того, чтобы высокое качество РНК могут быть приобретены. Во иммуноцитохимии как описано в стадии 7, концентрации первичного и вторичного антитела можно регулировать при необходимости, чтобы повысить интенсивность сигнала и уменьшить фон. Соответствующие положительные и отрицательные контроли должны быть включены в анализ. В шаге 8, анализ FACS, если ожидаемые результаты не Acquired после окрашивания, маленький образец из окрашенных клеток может быть помещена на предметное стекло и рассматривается под микроскопом, чтобы визуализировать окрашивание. Соответствующие положительные и отрицательные контроли должны быть включены в анализ. Если клетки не окрашивали, как и ожидалось, концентрации антител может быть увеличена или уменьшена по мере необходимости.

Методика описана в этом докладе приведет к более высоким выходом, чем в ПЭС спонтанной дифференцировки, без использования химических веществ, добавленных. Тем не менее, основным ограничением этого подхода является то, что там также будет большое количество не-РПЭ клеток, полученных. Таким образом, НПП должны быть тщательно отобраны, и обогащенные как описано в шаге 9, чтобы обеспечить однородную популяцию.

Значение этого подхода является то, что более высокий выход ПЭС могут быть получены из плюрипотентных клеток, чем спонтанные методов дифференциации. Использование малых молекул для получения RPE из IPS Сообщалось также, чтобы дать высокий выходдифференцированные клетки, однако, что этот метод является гораздо более сложным и требует времени и концентрации малых молекул, которые будут оптимизированы, чтобы достичь желаемых результатов 7,10. Кроме того, небольшие молекулы, используемые в этих методах должны плейотропные эффекты, которые могут посрамить результаты.

Описанный способ может быть использован, чтобы сделать ЭТ желаемых размеров с высокой воспроизводимостью. Этот метод генерируется ЭТ единых размеров, которые были использованы для оптимизации дифференциации плюрипотентных клеток по отношению к ПЭС линии без использования дополнительных химических веществ. Клетки IPS-РПЭ, полученные из ЭТ, то можно дополнительно использовать в трансплантации исследований, чтобы подтвердить их интеграции в сетчатке в функциональной организации. Эти клетки могут также обеспечить хорошую исследовательскую модель для изучения патогенеза различных ПЭС заболеваний в пробирке. Полезность такого подхода могут быть применены к направленной дифференцировке во многие другие типы клеток, в зависимости отразмер ЭТ и происхождение в естественных условиях клетки в бластоцисты. Клетки эктодермы приведет к нейронов, эпидермиса, волос и клеток молочной железы; эндодермы будет приводить к желудка, толстой кишки, легких и кишечных клеток; мезодерма приведет к скелетных мышц, сердца, почек и клеток соединительной ткани 3,11,19. После того, как правильный размер ЕВ была определена, дифференцированные клетки только должны быть проанализированы с помощью иммуногистохимии или FACS для правильной экспрессии маркерных белков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1, (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26, (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (12), e8152 (2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25, (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics