배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Developmental Biology

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Summary

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

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Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

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Abstract

Introduction

유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 1 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, 2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) 6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다.

만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 6-7, 12-16으로 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 수 분화 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 배반포 단계에서 줄기 세포의 커밋되지 않은 인구는 세 가지 차원 미세 환경에서 함께합니다. 따라서, 다양한 전략이 함께 조립 ESC / 만능 줄기 세포를 만들어 입체적으로 그들을 성장에 적용되었다. 이러한 줄기 세포 집합체는 배아 체 (사채)이라고합니다. 연구는 줄기 세포의 분화 EB는 배아 발달의 초기 단계를 모사하고 자발적 외면에 원시 내배엽을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. EB 개발이 진행됨에 따라 나중에 세 생식 계통의 분화 된 세포의 표현형은 17 ~ 18이 나타납니다. 목erefore, 사채를 기반으로 차별화 프로토콜은 ESC / 유도 만능 줄기 세포의 체외 분화에 대한 많은 관심을 끌었다 및 다 능성 줄기 세포 (13)에서 RPE 생성을위한 좋은 후보입니다했다.

사채는 ESC / IPS 세포에서 여러 가지 방법을 사용하여 제조 될 수있다. 처음에는 사채가 부착 식민지를 긁어 및 비 부착 서스펜션 문화를 유지함으로써 이루어졌다. 그러나이 방법은 낮은 재현성이 발생 사채의 이기종 인구를 산출한다. 매달려 드롭 세포 배양 및 마이크로 웰 기반 사채 형성은 매우 재현성 정의 크기의 균일 한 사채를 얻을 사채 형성을위한 다른 인기있는 기술이다. 또한, 마이크로 웰 기법은 적은 노력으로 많은 수의 집합체를 얻을 수있다.

사채 내에서 세포의 분화는 세포와 세포 내 미세 환경에서 형태 형성 큐의 멀티 플렉스에 의해 조절된다. 월의 차별화는 대조적으로olayer 형식, 교환 사채는 세포의 복잡한 어셈블리 (17)를 발생하는 세포 간 신호 전달을위한 플랫폼을 제공합니다. 흥미롭게도, 개별 EB를 만드는 데 사용 능성 줄기 세포의 수는 세포의 운명에 영향을 관찰 하였다. 1000 셀 EB는 적혈구 계보 (20)을 향해 밀어 반면 예를 들어, 인간는 ESC의 조혈 분화 연구에서, 그것은 500 셀 EB는 골수 계통으로 분화를 촉진하는 것이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 작은 사채는 신경 외배엽 분화 (11), (17)으로 승진 큰 사채 반면 내배엽 분화를 선호.

이러한 과거의 연구는 개개의 EB를 강하게 만드는 데 사용 ESC / IPS 세포의 수는 임의의 유형의 세포로 분화를 기반에 영향을 사채 제안. 그러나, 우리의 지식, RPE으로 차별화하기 위해 성향에 사채 크기의 영향을 규명 한 전류 연구는 없다. 본 연구의 목표의 영향을 특성화하는 것이다망막 색소 상피 세포 (IPS-RPE) 분화 및 망막 색소 상피 혈통을 지향 차별화 사채을 할 수있는 최적의 세포 수를 확인하는 - 유도 만능 줄기 (IPS) 세포에 EB 크기입니다.

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Protocol

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비

  1. 줄기 세포 기초 배지 400㎖의 5 배의 무 혈청 보충 100 ㎖를 첨가하여 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 준비한다. 매체는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다.
  2. RHO 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (락) 억제제 (Y-27362)에 시중에서 판매하는 배아 체 (EB) 형성 매체의 10 μm의 솔루션을 추가합니다.
  3. (둘 베코 변형 이글 보통 / 영양소 혼합물 F-12 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 교체 (KSR) 및 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 첨가하여 DMEM을 분화 배지를 준비 / F12).
  4. 1X N1 보충제, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ml의 타우린 13 NG / ㎖ triiodo-L-로닌 나트륨 염, 20 NG / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 및 15 %를 첨가하여 만능-RPE 미디어를 준비 소 태아 혈청 (FBS) <SUP> 최소 필수 중간 이글 (MEM) 21. 7.4 pH를 조정합니다.
  5. triiodo-L-티 로닌 나트륨 염 주식 솔루션을 준비합니다. 부드럽게 선회하여 1 N 수산화 나트륨에 triiodo-L-로닌 나트륨 염 1mg을 녹인다. MEM 49 ㎖를 triiodo-L-로닌 나트륨 염을 50ml의 20 ㎍ / mL로. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다.
  6. 하이드로 주식 솔루션을 준비합니다. 교반과 100 % 에탄올 1 ㎖에 1 mg의 하이드로 코르티손을 가용화. MEM 19 ㎖를 20 ㎖ 하이드로 코르티손 원액 ㎍ / ㎖의 (50)을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결이 필요할 때까지. 최종 배양액의 목적하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다.
  7. DMEM / F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다.
  8. 매트릭스 코팅 된 플레이트의 제조
    1. Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS)에서 추출한 단백질 매트릭스 양해 각서 (MOU)를 준비0.08 ㎎ / ㎖에 DMEM / F12에서 자체 육종 세포. 매트릭스 코트 액 1 mL를 6- 웰 플레이트의 각 웰. 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션.
    2. 1 시간 배양 후, 여분의 DMEM / F12를 대기음. 웰의 건조를 방지하기 위하여 피더없는 줄기 세포 배양액 0.5ml를 추가. 매트릭스 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되었습니다.
  9. DMEM / F12 2 ㎖ 잘 각을 세척하여, 마이크로 웰 플레이트를 준비합니다. DMEM / F12를 제거하고 각 잘하는 락 억제제와 보충 EB 형성 매체의 0.5ml를 추가합니다. 5 분 모든 공기 방울을 제거하기 위해 2000 XG에 플레이트를 원심 분리기.
  10. 인산 완충 식염수 (PBS)에 아 지드 화 나트륨을 2 % FBS를 혼합하여 FACS 염색 버퍼를 준비하고, 0.09 %. pH가 7.4로 버퍼를 조정합니다.
  11. DMEM / F12, 10 % FBS를 첨가함으로써 트립신 중화 용액을 준비한다.

2. 만능 문화

  1. 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 따뜻한 공급 장치가없는 줄기 세포 배양 37 ° C 중간, 그리고 엄마가TRIX 판을 준비 코팅.
  2. 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-1 만능 줄기 세포를 해동. 그런 다음 물을 욕조에서 극저온 유리 병을 제거하고 70 % 에탄올로 유리 병을 닦습니다. 세포 덩어리의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다.
  3. 적가 따뜻한 피더 세포에 무 줄기 세포 배양 배지 5 ㎖를 첨가하고 부드럽게 혼합한다. RT에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
  4. 조심 피더없는 줄기 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁하고 덩어리 매트릭스 코팅 플레이트의 웰에 세포 덩어리를 시드. 5 % CO 2, 95 % 습도가 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다.
  5. 매일 만능 줄기 세포 배양 배지를 변경합니다. 파종 후 미분화 식민지에게 5-7일을 준수하십시오. 광학 현미경 아래로 (고밀도 센터와 식민지)에 대한 준비가 미분화 식민지를 확인합니다.

유도 만능 줄기 세포의 3과 Passaging

  1. 처음으로 통과하기 전의 IPS 세포는 수욕 중에서 37 ° C로 디스 파제 용액, DMEM / F12 및 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 가온.
  2. 유도 만능 줄기 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 매체를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 조심스럽게 2 ml의 DMEM / F12와 유도 만능 줄기 세포를 씻어.
  3. / ㎖ 디스 파제 각 웰에 1 mg을 1 ㎖를 추가하고 7 분 37 ° C에서 품어. 디스 파제를 대기음 부드럽게 DME​​M / F12 두 배의 2 ml의 세포 식민지를 씻어. 세척 후, 각 웰에 무 피더 줄기 세포 배양액 2 ㎖를 추가한다.
  4. 5 ㎖의 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 덩어리를 형성하기 위해 판의 식민지를 긁어. 15 ML 원뿔 관에 분리 된 세포 덩어리를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 시드하는 충분한 공급이없는 줄기 세포 배양 배지를 추가합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 사채의 4 세대

  1. IPS 세포의 단일 세포 현탁액의 제조
    1. mediu 제거유도 만능 줄기 세포로부터 m과 DMEM / F12의 2 ml로 유도 만능 줄기 세포를 씻어. 6 웰 플레이트에서 유도 만능 줄기 세포에 accutase 750 μl를 추가합니다. 셀 플레이트 (약 5-10 분)에서 분리 할 수 있도록 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다.
    2. 부드럽게 남아있는 세포를 해리 피펫을 사용하고 플레이트 표면에 남아있는 세포를 분리. 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. DMEM / F12 5 ㎖와 함께 접시를 씻어 원뿔 튜브에 세포를 세척 DMEM / F12을 결합한다. 가능한 잔여 세포 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다.
    3. accutase을 제거하기 위해 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 농도가 약 0.5 내지 1.0 × 10 7 세포 / ㎖가되도록 EB 형성 매질에서 세포 펠렛을 재현 탁.
    4. 트립 판 블루 및 혈구와 세포를 계수하여 생존 세포의 수를 결정한다.
  2. Adjustin마이크로 웰 g의 셀 밀도는 크기 제어 사채를 형성
    1. EB 원하는 크기를 생성하는 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 셀의 수를 조정한다. 균등 부드럽게 세포를 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산 단계에서 제조 된 1.9 마이크로 웰 플레이트에 셀을 추가한다.
      참고 : 잘 당 마이크로 웰의 EB의 X 번호 당 세포의 잘 당 필요한 세포의 수 = 원하는 번호.
    2. 2.0 ml의 최종 부피로 우물에 바위 억제제와 보충 EB 형성 매체를 조정합니다. 부드럽게 각 피펫 팅 잘하여 세포를 재분배. 3 분 동안 100 XG에서 마이크로 웰 플레이트를 원심 분리기. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
  3. 마이크로 웰 플레이트에서 수확 사채
    1. 잘 사채의 대부분을 제거하는 1 ml의 micropipettor와 상하 매체를 피펫 팅 마이크로 웰에서 수확 사채. 역 40 μm의 세포를 통해 EB 서스펜션 전달50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너는 하나의 세포를 제거합니다.
    2. 모든 사채를 제거하는 DMEM / F12의 1 ml의 마이크로 웰 플레이트 5 회 반복한다. 세척을 수집하고 반전 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 새로운 50 ML 원뿔 튜브까지 셀 스트레이너 오른쪽으로 돌립니다. EB 형성 매체로 세척하여 사채를 수집합니다. 수율을 결정하기 위해 사채를 계산합니다.

5. 도금 사채 및 초기화 차별화

  1. <1000 사채 /의 밀도에 잘 EB 형성 매체 플러스 10 μM 바위 억제제 (단계 1.8.1에서와 같이) 여섯 잘 접시를 코팅 단백질 매트릭스에 사채 플레이트. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 사채를 품어.
  2. 24 시간 EB 도금 후, 분화를 시작하기 위해 차별화 매체로 교체합니다. 세포가 추가 분석을 위해 수집 될 때까지 매일 분화 매체의 절반을 변경합니다.
  3. RT-PCR을 수행하기 위해 6 일, 17, 29 및 60 ℃에서 샘플을 수집, IMMunocytochemistry 및 FACS는 특성 RPE 유전자와 단백질의 발현을 확인합니다.

6. RNA 추출 및 PCR

  1. 시중에서 판매되는 키트에 제공된 지침에 따라 EB 샘플에서 RNA를 추출합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정.
  2. cDNA를 역 전사 키트 시판 RNA에 따라 총 RNA 100 NG에 역전사를 수행합니다.
  3. cDNA를 10 μmol / 10 NG의 농도 10ng의 cDNA를 다음의 프라이머를 사용하여 (표 1)로 PCR을 수행한다. 다음과 같이 PCR을 설정 : 5 분 동안 95 ° C에서 DNA를 변성, 72 ℃에서 최종 사이클 뒤에 30 초, 1 분, 72 ° C에 대해 15 초 동안 95 ° C에서 35 사이클과 60 ° C를 증폭 10 분간 C. 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 실행합니다.

7. 면역 세포 화학

  1. RT에서 PBS로 2 회 교환 사채를 씻으십시오. 4 % paraformald에 실온에서 EBS을 (를) 수정10 분 동안 ehyde. RT 한 번 PBS로 씻어. 4 ° C에서 PBS에 보관 샘플 염색에 사용되는 때까지.
  2. 염색 날, 고정 및 투과성으로 시약 고정 된 세포를 취급합니다. RT에서 1 시간 동안 (투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청) 차단 용액과 샘플을 인큐베이션.
  3. 표시된 희석에서 다음 일차 항체를 사용하여 투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청으로 면역 화학을 수행 안티 PAX6을 (1:10), 안티 RX (1 : 200), 안티 MITF (1:30)을 수행하고, 항 - ZO1 (1 : 100). 4 ° C에서 항체 O / N 대응과 샘플을 품어.
  4. 다음날, 세포로부터 차 항체를 제거하고 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. 실온에서 1 시간 동안 형광 접합 된 이차 항체와 샘플을 품어.
  5. 세포에서 차 항체를 제거하고 PBS에서 샘플을 세 번 헹군다. 커버가 장착 매체를 포함 DAPI와 유리 슬라이드에 미끄러 져 마운트 및 샘플 어두운 챔버에서 O / N을 설정할 수 있습니다.염색을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용합니다.

FACS 분석 8. 염색

  1. PBS에 두 번 배양 사채을 씻으십시오. 단일 세포 현탁액을 5 ~ 10 분 동안 0.25 % 트립신 0.5 mL를 사채를 품어. 트립신 중화 용액 트립신 (1 ㎖ / 웰)을 중화.
  2. 10 분 동안 600 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 단일 세포 현탁액을 전송합니다.
  3. 상층 액을 제거하고 튜브에 세포를 DMEM / F12 10 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 세포를 섞어 반전. 600 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후, 상청액을 폐기하고 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁.
  4. 세포의 총 수를 계산. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 원심 분리 폐기 뜨는 후. 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 0.5ml를 첨가하여 세포를 고정. 부드러운 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다. 20 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어.
  5. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 및 제거상층 액. 소용돌이 부드럽게 세포 펠렛을 방해합니다. 냉장 된 투과성으로 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 소용돌이 부드럽게 섞어 30 분 동안 얼음에 품어.
  6. 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. FACS 염색 버퍼에 resuspend 3 ㎖를 추가합니다. 한 번 더에 대해이 단계를 반복합니다. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁.
  7. 각각의 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 (0.5 × 10 6 세포)의 100 μl를 전송하고 차 항체의 권장 용량을 추가 할 수 있습니다. PAX6를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 PE 방지 PAX6의 5 μl를 추가합니다. MITF를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 방지 MITF의 5 μl를 추가합니다.
  8. 혼합하고 60 분 동안 실온에서 배양한다. FACS 염색 버퍼의 3 ML을 추가합니다. 10 분 동안 600 XG에서 혼합하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 두 개의 추가 회 8.16를 반복합니다.
  9. MITF 염색의 경우, 보조 antibo에서 세포를 배양DY, 하나의 희석에 염소 항 - 마우스 알렉사 형석 488 : 4 ° C에서 1 시간 동안 2000. PAX6 염색의 경우,이 단계를 피할 수 있습니다.
  10. 10 분 동안 600 XG에서 FACS 염색 버퍼와 원심 분리기의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 두 번 더에 대해이 과정을 반복합니다.
  11. 세포 펠렛을 방해 부드럽게 FACS 염색 버퍼 및 500 μl의 소용돌이에 세포를 재현 탁. 샘플은 유세포 분석을위한 준비가되어 있습니다.

9. 만능 줄기-RPE의 분리 및 문화

  1. 하루에 29에서주의 깊게 200 μL 피펫 팁을 사용하여 배양 용기에서 선택한 색소 식민지 주위에 잘라. 15 ML 원뿔 튜브에 떠있는 식민지를 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 600 XG에 식민지를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다.
  2. 10 분 동안 600 XG에 DMEM / F12 원심 10ml에 세포를 재현 탁 콜로니. 상층 액을 제거합니다.
  3. 7-10 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신과 2 ml의 콜로니를 배양하여 단일 세포 현탁액을 제조. 조심스럽게 식민지를 해리 세포 현탁액을 소용돌이.
  4. 만능-RPE 배지 2 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 상층 액을 버린다. 만능-RPE 배지 2 ㎖로 단일 세포를 재현 탁. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도 인큐베이터에서 단백질 기질 코팅 6- 웰 플레이트 제자리 세포 이동.

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Representative Results

이 실험에서, 유도 만능 줄기 세포는 배양 및 사채의 망막 색소 상피 계보로 분화. 제어 된 크기의 마이크로 웰 플레이트는 EB를 이용하여 형성 하였다. 도 1 EB 형성에서 보이는 바와 같이 마이크로 웰 플레이트에서 균일했다. 이러한 사채 후 (도 2)를 수집하고, 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다.

RPE는 RPE 마커들은 고전 육각 형태, 착색 및 발현에 의해 식별 될 수있다. 문화 12 주 후, 200 셀 사채는 성상 세포와 섬유 아세포 형태를 개발했다. 어떤 착색이 세포 (도 3A)에서 관찰되지 않았다. 큰 사채 고전 RPE의 형태와 색소 침착의 단층을 개발했다 (그림 3BC) 면역 세포는 망막 색소 상피 마커를 검출하기 위해, MITF와 ZO1 500 셀과 3000 셀 사채에서 파생되었다 단백질의 공동 발현을 밝혔다 (그림 4) .

E눈 필드와 RPE 유전자는 PCR xpressions 의해 모니터링 하였다. 5 사채의 서로 다른 크기의 신경 외배엽, 눈 필드 전구체 및 RPE 마커의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. 중요한 것은, 특정 RPE 마커, RPE65은 하루에 17에서 시작하여 검출되었다.

RPE 계통 분화 한 세포의 수율을 정량화하기 위해, FACS 분석이 신경 외배엽과 RPE 전구체 마커 각각 PAX6 및 MITF를 검출 하였다.도 6A는 서로 다른 시점에서 사채의 크기가 다른 신경 외배엽 마커 PAX6를 나타낸다. 분석 된 세포의 약 50 %는 3,000 셀 EBS의 문화의 날 (6)에 PAX6 양성이었다. 또한, 다양한 EB 크기에 RPE 마커, MITF의 FACS 분석은 세포의 20 %가 차별화의 날 (60)에 의해 MITF를 표명 것으로 나타났다.

배양 RPE들은 또한 안료 및 다각형 형태를 잃고를 획득하는 능력을 특징으로한다계대에 따라 섬유 아세포의 표현형. 따라서, 유도 만능 줄기가 세포를 망막 색소 상피 우리가 기계적으로 고립 된, 이러한 특성을 가지고 파생 계대 여부를 결정합니다. 그림 7a는 새로 계대 세포가 색소를 잃고 섬유 아세포의 형태를 얻었다 보여줍니다. 또한, 이들 세포는 증식하고 합류시 고전 다각형 형태 (도 7B)를 회복. 몇 주 내에서 이러한 세포는 색소 침착 (그림 7C)을 회복했습니다.

TATTTTGC
유전자 NICB 참조 서열 (5'-3 ') 크기 (BP)
PAX6 NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
(300)
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
(106)
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
(452)
R 유해 화학 물질 관리법CCACCCTGTTG
CTGTA

PAX6, RPE65, RX, MITF와 GAPDH 유전자 표 1. PCR 프라이머 시퀀스.

그림 1
마이크로 웰 플레이트 사채의 그림 1. 형성은. 각각의 마이크로 웰은 (A) (100) 세포, (B) (200) 세포, (C) 500 세포 및 (D) 3,000 세포가 포함되어 있습니다. 세포의 형성을 사채 37 ºC에서 24 시간 및 5 % CO 2 항온 배양 하였다. (배율 100 배, 스케일 바 = 400 μm의)가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
마이크로 웰 플레이트에서 수확도 2 사채. (A) 200-EB 세포, (B) 500 세포 EB, (C) 세포 EB-3000, 및 (D) 셀 EB-15000. (배율 200 배, 스케일 바 = 200 μm의는). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 만능 줄기에서 파생 된 사채. 교환 사채의 다른 크기에서 RPE 12 주 동안 배양 하였다. (A) 200 셀 사채는 색소 침착이없는 성상 세포와 섬유 아세포의 형태를 개발했다; 500 세포 사채 (BC)에서 세포의 90 %가 다각형 색소 세포의 단층을 개발 - 80 %있다. (A & B : 배율 100 배, 스케일 바= 400 μm의; (C)는 :. 확대 200X, 스케일 바 = 200 μm의) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
MITF와 ZO1. 500- 3000 셀 사채의 그림 4. 공동 발현은 분화 17 일 이후 MITF와 ZO1를 표명했다. (배율 400 배, 스케일 바 = 20 μm의)가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
분화의 다양한 시점에서 상이한 크기의 EB를 그림 5. 유전자 발현 프로파일. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
망막 색소 상피 차별화를위한 다양한 EB 크기의 그림 6. FACS 분석. 분화 동안 사채의 서로 다른 크기의 신경 외배엽 마커 PAX6의 (A) FACS 데이터. (B) 분화의 날 (60)에서 다양한 EB 크기에 RPE 마커 MITF의 FACS 분석. MITF의 최고 수준의 20 %에 도달 EB의 500의 크기, 3,000, 15,000 셀 간의 일정이었다.

그림 7
그림 7.. 수동으로 고립 된 RPE의 문화를 계속 (A) RPE는 계대 배양 된 섬유 모세포 morpholo를 인수통과 후 GY. (B & C) 세포는 시간이 지남에 다각형 형태와 색소 침착을 개발했다. (배율 100 배, 스케일 바 = 400 μm의)가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플레이트에서 원심 분리 만능 줄기 세포의 알려진 숫자에 의해 형성되었다. 면역 세포 화학 및 역전사 중합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 설명 식 RPE 및 단백질의 유전자를 모니터링하는 데 사용된다. 마지막으로, 서로 다른 크기의 EB를 분화에서의 효율은 FACS 분석에 의해 분석 하였다. 이러한 기술은 미래 애플리케이션 RPE에 만능 줄기 세포의 분화를 촉진 할 수있다.

주의 깊게 이메일에 실행해야합니다이 방법 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다정확한 데이터의이 프로토콜과 달성의 성공을 nsure. 첫 번째 단계는 키 만능 줄기 세포 배양시 발생한다. IPS 세포들은 stemness을 유지할 능성 상태로 유지되어야한다. 세포의 bFGF의 적절한 수준을 유지하고 신중하게 분화 징후를 매일 검사 위해 매일 변경 매체가 있어야합니다. 미분화 만능 줄기 세포는 컴팩트 한 다세포 식민지로 성장한다. 세포는 세포질 비와 눈에 띄는 핵소체에 높은 핵을 가져야한다. 유도 만능 줄기 식민지는 중앙에 세포의 여러 층으로, 뚜렷한 경계선을 특징으로한다. 분화의 징후 정의 콜로니 테두리의 손실, 불균일 세포 형태, 및 신경 및 섬유 아세포와 같은 명백한 세포 유형의 모양을 포함한다. 디스 파제 및 세정에 의해 제거 될 수있는 분화 된 세포는 하나씩 그러나, 이러한 특성을 갖는 콜로니를 배양 수동 (22)로부터 제거되어야한다. 하나의 만능 줄기 세포 현탁액 FO의 준비R 사채를 형성하는 다음 중요한 단계입니다. 정확하게 마이크로 웰 플레이트에 세포의 수를 제공하고 원하는 크기 EB를 제조하기 위하여 세포 집합체없이 현탁액을 제조하는 것이 중요하다. PCR 분석을위한 RNA 제제는 또한 중요하다. 일치하지 않는 RNA 품질은 PCR 데이터의 변화의 중요한 소스입니다. RNA 추출은 최소한으로 최상의 결과를 RNA를 분해 수율해야합니다. 성공적인 RNA 추출은 최소한의 저하 및 오염 RNases 무료로 총 RNA를 얻을 것입니다. 260 nm에서 분광 광도법에 의한 RNA의 농도를 측정 한 후, 시료의 순도는 다당류 나 단백질의 오염을 검출 (230) 및 280 nm에서 결정되어야한다. 230 : 260 : 오염이 없음 (23) 고품질의 RNA를 나타 내기 위해 1 : 2 : RNA 280 비 1. 마지막으로, 적절 FACS 염색 용 세포를 고정하는 것이 중요하다. 이 정착 단계에서, 세포 응집을 방지하기 위해 분리되어야한다. Insuffic이전 투과성으로에 ient 세포 부유 세포 덩어리와 부정확 한 염색으로 이어질 것입니다.

우리는 필요하지만 몇 가지 수정이 이루어질 수, 설명 된대로 프로토콜을 준수하는 것이 좋습니다. 사채의 생성 단계 4에 기재된 동안 EB 당 셀의 수는 RPE 세포 분화의 높은 수율을 달성하기 위해 500 ~ 3000 사이의 범위에있을 수있다. IPS 세포의 수가 제한되어있는 경우, 500 세포는 EB를 3000 세포 사채 필적 RPE를 생성 할 것이다. 특별한주의가 6 샘플 고품질 RNA가 획득 될 수 있도록 중으로 실행되어야 단계에 설명 된 RNA 추출 과정에서주의해야한다. 단계 7에 기재된 바와 같이 면역 세포 중에 일차 및 이차 항체 농도는 신호 강도를 향상시키고 배경을 감소시키기 위해 필요에 따라 조정될 수있다. 적합한 양성 및 음성 대조군을 분석에 포함되어야한다. 8 단계 동안, FACS 분석, 예상되는 결과가되지 않을 경우 ACQ염색 후 uired, 염색 된 세포의 작은 샘플을 슬라이드 상에 배치 될 수 있고, 염색 시각화 현미경으로 볼. 적합한 양성 및 음성 대조군을 분석에 포함되어야한다. 예상대로 세포가 염색되지 않는 경우, 항체의 농도가 증가 될 수 있거나 또는 필요에 따라 감소 하였다.

이 보고서에 기재된 기술을 첨가 약품을 사용하지 않고, 자발적인 분화 RPE의보다 높은 수율을 초래할 것이다. 그러나,이 방법의 주요 제한은 생성 비 RPE 세포의 다수가있을 것이다. 따라서, RPE는주의 깊게 선택되고 균질 집단을 위해 단계 9에 기재된 바와 같이 농축되어야한다.

이 방법의 중요성은 RPE의 높은 수율이 자발적인 분화 기법보다 만능 줄기 세포로부터 유도 될 수 있다는 것이다. IP의 RPE를 유도 소분자의 사용은 또한, 높은 수율을 제공하는 것으로보고되었다분화 세포, 그러나, 그 기술은 훨씬 더 복잡하고 타이밍을 필요로하며, 작은 분자의 농도는 원하는 결과를 달성하기 위해 7,10 최적화한다. 또한, 이러한 방법에 사용되는 소분자 결과 혼란시킬 수다면 발현 성 효과를 갖는다.

설명 된 방법은 높은 재현성으로 원하는 크기의 사채를 제조하는데 사용될 수있다. 이 기술은 추가의 화학 물질의 사용없이 RPE 계통쪽으로 만능 줄기 세포의 분화를 최적화하는 데 사용 된 균일 한 크기의 EB를 생성. 사채로부터 유도 만능-RPE 세포는 상기 조직의 기능성 망막 그들의 통합을 확인하기 위해 이식 연구에 사용될 수있다. 이러한 세포는 시험 관내에서 각종 RPE 질환의 발병 기전을 연구 조사 좋은 모델을 제공 할 수있다. 이 접근 방법의 유용성은 많은 다른 세포 유형으로 분화 지시에 따라 적용 할 수있다사채의 크기와 배반포의 세포의 생체 유래. 외배엽의 세포는 신경 세포, 표피, 머리와 유선 세포를 야기 할 것이다; 내배엽은 위, 대장, 폐, 장내 세포를 야기 할 것이다; 중배엽 골격근, 심장, 신장, 및 결합 조직 세포 3,11,19을 일으킬 것이다. EB 정확한 크기가 결정되면, 분화 세포 만 필요 마커 단백질의 발현을 면역 세포 화학 올바른 또는 FACS에 의해 분석된다.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

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References

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