Derivazione retina epitelio pigmentato (RPE) da pluripotenti indotte (IPS) Stem Cells dalle diverse dimensioni delle corpi embrionali

Developmental Biology

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Summary

L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali.

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Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

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Abstract

Introduction

Staminali pluripotenti (iPS) cellule indotti sono un tipo di cellule staminali pluripotenti derivate riprogrammando cellule adulte con fattori estrinseci 1. Al contrario, le cellule embrionali staminali (ESC), un altro tipo di cellule staminali pluripotenti, sono generati dalla massa cellulare interna della blastocisti 2-3. Nonostante le loro diverse origini, le cellule iPS e CES sono paragonabili nella loro illimitata capacità di replicare in vitro e nella loro capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula 4-5. Queste caratteristiche di cellule iPS li rendono candidati ideali per applicazioni in medicina rigenerativa personalizzata. I recenti sforzi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di protocolli di differenziazione affidabili per la produzione di cellule adulte specializzate, tra epitelio pigmentato retinico (RPE) 6-11.

Per i potenziali applicazioni cliniche delle cellule iPS derivate, una differenziazione diretta di che tipo di cellula specifica indispensabile. Ci sono vari metodipubblicato per la differenziazione diretta di entrambi i CES e iPS cellule in RPE che varia notevolmente nella loro efficienza 6-7, 12-16. Noi ancora non conosciamo molti degli eventi molecolari che governano il destino delle cellule / tessuti durante lo sviluppo o il differenziamento. Negli ultimi anni, sono stati fatti sforzi per sviluppare il protocollo di differenziazione che può imitare lo sviluppo embrionale, per quanto possibile. Durante la fase di blastocisti, la popolazione non impegnati di cellule staminali sono insieme in un microambiente tridimensionale. Così, diverse strategie sono state applicate per rendere le cellule ESC / IPS assemblati insieme e crescere in tre dimensioni. Questi aggregati di cellule staminali sono chiamati corpi embrionali (EBS). Studi hanno dimostrato che EB differenziazione delle cellule staminali imitano fase iniziale di sviluppo dell'embrione e può spontaneamente dar luogo a endoderma primitivo sulla sua superficie esterna. Più tardi, lo sviluppo EB progredisce, fenotipi cellulari differenziate di tutte e tre le linee germinali appaiono 17-18. Therefore, Ebs protocolli di differenziazione basata hanno attirato molta attenzione per la differenziazione in vitro di cellule ESC / IPS e sono un buon candidato per la generazione RPE da cellule staminali pluripotenti 13.

EBs possono essere effettuate utilizzando diversi metodi di cellule / iPS ESC. Inizialmente, EBs sono state fatte da raschiando colonie aderenti e il mantenimento in coltura in sospensione non aderente. Tuttavia, questo approccio produce popolazione eterogenea di EB che provoca scarsa riproducibilità. Hanging coltura cellulare goccia e microwell formazione EBs base sono altre tecniche popolari per la formazione EBs che danno EBs omogenee di dimensioni definite che sono altamente riproducibili. Inoltre, la tecnica micropozzetti può produrre gran numero di aggregati con minor sforzo.

Differenziazione delle cellule all'interno EBS è regolata da un multiplex di spunti morfogenici dal microambiente extracellulare e intracellulare. A differenza di differenziazione in un monFormato olayer, EBs fornire una piattaforma per complesso insieme di cellule e di segnalazione intercellulare a verificarsi 17. È interessante notare, è stato osservato il numero di cellule staminali pluripotenti utilizzati per realizzare singoli EB influenzare il destino di cellule. Ad esempio, in uno studio differenziazione ematopoietica dei CES umani, è stato osservato che 500 cellule EB promosso differenziamento verso linea mieloide che 1.000 celle EB spinto verso lineage eritroide 20. In un altro studio, EBs piccoli favorito differenziazione endoderma mentre EBs grandi promosse verso neuro-ectoderma differenziazione 11, 17.

Questi studi precedenti suggeriscono che il numero di cellule ESC / iPS utilizzati per rendere le singole EB influisce EBS differenziazione in base a qualsiasi tipo di cellule. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono studi in corso che hanno chiarito l'impatto di dimensioni EBs nella sua propensione a differenziare verso RPE. L'obiettivo di questo studio è quello di caratterizzare l'influenzaDimensioni EB su indotte pluripotenti staminali (cellule iPS) - retinico pigmentato (iPS-RPE) differenziazione e di individuare il numero di cellulare ottimale per fare EBS per la differenziazione diretta verso RPE lignaggio.

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Protocol

1. Preparazione dei reagenti Cultura e piastre di coltura

  1. Preparare cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore aggiungendo 100 ml di integratore senza siero 5x a 400 ml di cellule staminali medio basale. Il medium è stabile a 4 ° C per 2 settimane ed a -20 ° C per 6 mesi.
  2. Aggiungere 10 mM soluzione di rho-associata, avvolto-coil contenente la proteina chinasi (Rock) inibitore di disponibile in commercio corpo embrioide (EB) di media formazione (Y-27362).
  3. Preparare medio differenziazione aggiungendo 0,1 mm β-mercaptoetanolo, 0,1 mm aminoacidi non essenziali, 2 mM L-glutammina, il 10% la sostituzione siero knockout (KSR) e 10 mg / ml di gentamicina per Modified Eagle Medium / Nutrient miscela di Dulbecco F-12 (DMEM / F12).
  4. Preparare iPS-RPE medio aggiungendo 1x N1 supplemento, 0,1 mm aminoacidi non indispensabili, 250 mg / ml taurina, 13 ng sale di sodio / ml triiodo-L-thyronine, 20 ng / ml idrocortisone, 5 mg / ml gentamicina, e il 15% siero fetale bovino (FBS) <sup> 21 per Minimum Essential Media Eagle (MEM). Regolare il pH a 7,4.
  5. Preparare sodio sale stock soluzione triiodo-L-thyronine. Sciogliere 1 mg di sale sodico triiodo-L-thyronine in 1 N di idrossido di sodio agitando delicatamente. Aggiungere 49 ml di MEM per fare 50 ml di 20 ug / ml di sale sodico triiodo-L-tironina. Preparare aliquote e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata in terreno di coltura.
  6. Preparare soluzione stock idrocortisone. Solubilizzare 1 mg di idrocortisone in 1 ml di etanolo al 100% agitando. Aggiungere 19 ml di MEM per fare 20 ml di 50 mg / ml di idrocortisone soluzione madre. Aliquotare e congelare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Utilizzare volume appropriato per raggiungere la concentrazione desiderata nel terreno di coltura.
  7. Preparare una soluzione di lavoro di dispasi di 1 mg / ml in DMEM / F12.
  8. Preparazione delle lastre matrici rivestite
    1. Preparare matrice proteina estratta da Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) moucellule di sarcoma di Se in DMEM / F12 a 0,08 mg / ml. Coat ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti con 1 ml di soluzione di matrice. Incubare le piastre rivestite a temperatura ambiente per 1 ora.
    2. Dopo l'incubazione 1 ora, aspirare l'eccesso DMEM / F12. Aggiungere 0,5 ml di staminali mezzo di coltura cellulare senza alimentatore per evitare l'essiccazione dei pozzetti. Le piastre rivestite matrice sono pronte per l'uso.
  9. Preparare micropiastra, sciacquando ogni pozzetto con 2 ml di DMEM / F12. Rimuovere DMEM / F12 e aggiungere 0,5 ml di media formazione EB integrato con inibitore Rock a ciascun bene. Centrifugare la piastra a 2000 xg per 5 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria.
  10. Preparare tampone colorazione FACS mescolando 2% FBS, e il 0,09% di sodio azide in tampone fosfato (PBS). Regolare il buffer a pH 7,4.
  11. Preparare la soluzione neutralizzante tripsina aggiungendo 10% FBS per DMEM / F12.

2. iPS Cultura

  1. Prima della semina delle cellule iPS, caldo staminali coltura cellulare mezzo privo di alimentatore a 37 ° C, e hanno la matrix rivestito piatti pronti.
  2. Scongelare rapidamente le cellule iPS IMR90-1 in un bagno di 37 ° C dell'acqua. Quindi rimuovere la crio-vial dal bagnomaria e pulire il flacone con il 70% di etanolo. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 ml usando una pipetta 2 ml per minimizzare rottura dei grumi di cellule.
  3. Aggiungere 5 ml di caldo cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore per le cellule goccia a goccia e mescolare delicatamente. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
  4. Risospendere attentamente le grumi di cellule in 2 ml di cellule staminali mezzo di coltura privo di alimentatore e seminare i grumi di cellule nei pozzetti della piastra a matrice rivestita. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2, 95% di umidità.
  5. Modificare il terreno di coltura di cellule iPS quotidiana. Osservare colonie indifferenziate cinque a sette giorni dopo la semina. Controllare colonie indifferenziate che sono pronti per il passaggio (colonie con un centro denso) sotto un microscopio ottico.

3. Passaging di cellule iPS

  1. Per il passaggio delle cellule iPS prima di iniziare, scaldare la soluzione dispasi, DMEM / F12 e terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore a 37 ° C a bagnomaria.
  2. Prima passaging cellule iPS, rimuovere le aree di differenziazione raschiando l'area e di aspirazione del mezzo. Lavare accuratamente le cellule iPS con 2 ml DMEM / F12.
  3. Aggiungere 1 ml di 1 mg / ml dispasi a ciascun pozzetto ed incubare a 37 ° C per 7 minuti. Aspirare il dispasi e lavare delicatamente le colonie di cellule con 2 ml di DMEM / F12 due volte. Dopo il risciacquo, aggiungere 2 ml di terreno di coltura di cellule staminali senza alimentatore di ogni bene.
  4. Con una pipetta 5 ml raschiare delicatamente le colonie della piastra per formare grumi di cellule. Trasferire i grumi di cellule staccate di un tubo da 15 ml. Aggiungi staminali sufficienti terreno di coltura cellulare senza alimentatore per seminare il prossimo passaggio di cellule.

4. Generazione di EBs Uso micropiastra

  1. Preparazione di una sospensione di cellule singole cellule iPS
    1. Rimuovere il medium dalle cellule iPS e lavare le cellule iPS con 2 ml di DMEM / F12. Aggiungere 750 ml di accutase alle cellule iPS in ogni pozzetto della piastra 6-bene. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per permettere alle cellule di staccarsi dalla piastra (circa 5-10 min).
    2. Utilizzare una pipetta di dissociare delicatamente eventuali cellule residue e di staccare tutte le cellule residue sulla superficie della piastra. Trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml. Lavare la piastra con 5 ml di DMEM / F12 e combinare la sciacquato DMEM / F12 con le cellule nel tubo conico. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino cella di 40 micron per eliminare eventuali grumi di cellule residue.
    3. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min a temperatura ambiente per rimuovere l'accutase. Risospendere il pellet di cellule in medium formazione EB in modo che la concentrazione cellulare è di circa 0,5-1,0 x 10 7 cellule / ml.
    4. Determinare il numero di cellule vitali contando le cellule con Trypan Blue e un emocitometro.
  2. Adjusting densità delle cellule in pozzetti per formare EB dimensioni controllato
    1. Regolare il numero di cellule in ciascun pozzetto della micropiastra per generare le dimensioni EB desiderati. Aggiungere le cellule nei pozzetti delle piastre preparate in fase 1.9, Distribuire uniformemente le cellule pipettando delicatamente le cellule più volte.
      NOTA: Il numero di cellule necessarie per pozzetto = desiderato numero di celle per EB x numero di pozzetti per pozzetto.
    2. Regolare il medium formazione EB integrato con inibitore Rock in pozzi per un volume finale di 2,0 ml. Ridistribuire le cellule pipettando delicatamente ogni bene. Centrifugare le piastre micropozzetti a 100 xg per 3 min. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore.
  3. EBs raccolta dei micropiastra
    1. Harvest EBs da pozzetti pipettando medie pozzo su e giù con un 1 ml micropipettatore per rimuovere la maggior parte EBS. Passare la sospensione EB attraverso una cella di 40 micron invertitofiltro in cima ad una provetta conica da 50 ml per rimuovere le cellule singole.
    2. Lavare la micropiastra 5 volte con 1 ml di DMEM / F12 per rimuovere tutti i EBs. Raccogliere lavaggi e passare sopra il filtro cellulare invertita. Girare il filtro cella destra fino a un nuovo tubo conico da 50 ml. Raccogliere EBS mediante lavaggio con media formazione EB. Contare EBs per determinare la resa.

5. placcatura EBs e avvio di differenziazione

  1. Piastra EBS sulla matrice proteica rivestito sei pozzetti (come al punto 1.8.1) con una densità di <1.000 EBs / bene in mezzo formazione EB più inibitore della roccia 10 micron. Incubare EBS a 37 ° C con il 5% di CO 2 e il 95% di umidità per 24 ore.
  2. 24 ore dopo la placcatura EB, sostituirlo con il mezzo di differenziazione per avviare la differenziazione. Cambiare metà del terreno di differenziamento a giorni fino a quando le cellule vengono raccolte per ulteriori analisi.
  3. Raccogliere i campioni a giorno 6, 17, 29 e 60 per condurre RT-PCR, immunocytochemistry e FACS di convalidare l'espressione di geni caratteristici RPE e proteine.

6. RNA Estrazione e PCR

  1. Estratto RNA da campioni EB secondo le istruzioni fornite nel kit disponibile in commercio. Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro.
  2. Eseguire la trascrizione inversa a 100 ng di RNA totale secondo disponibile in commercio RNA a cDNA kit trascrizione inversa.
  3. Eseguire PCR con 10 ng di cDNA utilizzando i seguenti primer (tabella 1) ad una concentrazione di 10 mmol / 10 ng di cDNA. Impostare la PCR come segue: denaturare il DNA a 95 ° C per 5 min, amplificare con 35 cicli a 95 ° C per 15 sec, 60 ° C per 30 sec, 72 ° C per 1 min, seguito da un ciclo finale a 72 ° C per 10 min. Eseguire il prodotto di PCR su un gel di agarosio 1%.

7. Immunocitochimica

  1. Lavare EBS con PBS due volte a RT. Fissare EBS a RT in 4% paraformaldehyde per 10 min. Risciacquare una volta con PBS a temperatura ambiente. Conservare i campioni in PBS a 4 ° C fino a quando usati per la colorazione.
  2. Il giorno colorazione, trattare le cellule fissate con fissaggio e permeabilizzazione reagenti. Incubare i campioni con soluzione bloccante (siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione) per 1 ora a RT.
  3. Eseguire immunochimica in siero di capra 10% in soluzione permeabilizzazione utilizzando i seguenti anticorpi primari alle diluizioni indicate: anti-Pax6 (1,10), anti-RX (1: 200), anti-MITF (1,30), e anti- ZO1 (1: 100). Incubare i campioni con corrispondenti anticorpi O / N a 4 ° C.
  4. Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo primario dalle cellule e lavare i campioni tre volte con PBS. Incubare campioni con anticorpi secondari coniugati fluoroforo per 1 ora a RT.
  5. Rimuovere l'anticorpo secondario dalle cellule e lavare i campioni per tre volte in PBS. Montare il coperchio scivola su vetrini con DAPI contenente mezzo di montaggio e lasciare i campioni per impostare O / N in una camera oscura.Utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare la colorazione.

8. colorazione per l'analisi FACS

  1. Lavare le EBs coltivate in PBS due volte. Incubare EBS con 0,5 ml di 0,25% tripsina per 5-10 minuti per fare una sospensione singola cella. Neutralizzare la tripsina con soluzione di tripsina neutralizzante (1 ml / pozzetto).
  2. Trasferire la sospensione singola cella di un tubo da 15 ml e centrifugare a 600 xg per 10 min.
  3. Eliminare il supernatante e aggiungere 10 ml di DMEM / F12 alle cellule nel tubo. Capovolgere delicatamente per mescolare le cellule. Centrifugare a 600 x g. Dopo centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere le cellule in tampone colorazione FACS.
  4. Contare il numero totale di cellule. Centrifugare a 600 xg per 10 min. Dopo centrifugazione scarto surnatante. Fissare le cellule immediatamente aggiungendo 0,5 ml di 4% paraformaldeide. Mescolare bene vortexando gentilmente. Incubare le cellule a 4 ° C per 20 min.
  5. Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere lasurnatante. Vortex delicatamente per disturbare il pellet. Permeabilize le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione di permeabilizzazione raffreddata. Vortex delicatamente per miscelare e incubare in ghiaccio per 30 min.
  6. Centrifugare a 600 xg per 10 min e rimuovere il surnatante. Aggiungere 3 ml di FACS buffer di colorazione e risospendere. Ripetere questo passaggio per un'altra volta. Risospendere le cellule in tampone colorazione FACS ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml.
  7. Trasferire 100 ml di sospensione cellulare (0,5 x 10 6 cellule) per ciascuna tubi microcentrifuga e aggiungere il volume consigliato di anticorpo primario. Per Pax6, aggiungere 5 ml di PE anti-Pax6 in 100 ml di sospensione cellulare. Per MITF, aggiungere 5 ml di anti-MITF in 100 ml di sospensione cellulare.
  8. Mescolare e incubare a temperatura ambiente per 60 min. Aggiungere 3 ml di tampone colorazione FACS. Mescolare e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante e ripetere 8.16 per altre due volte.
  9. Per MITF colorazione, incubare le cellule in Antibo secondariody, capra anti-topo Alexa Fluor 488 a una diluizione di 1: 2.000 per 1 ora a 4 ° C. Per Pax6 colorazione, evitare questo passaggio.
  10. Lavare le cellule con 5 ml di tampone FACS colorazione e centrifugare a 600 xg per 10 min. Ripetere la procedura per altre due volte.
  11. Risospendere le cellule in 500 ml di FACS buffer di colorazione e vortex delicatamente per disturbare il pellet. I campioni sono pronti per l'analisi di citometria di flusso.

Isolation 9. iPS-RPE e Cultura

  1. Al giorno 29, con attenzione tagliare intorno alle colonie pigmentate selezionati dalla piastra di coltura con un puntale 200 microlitri. Trasferire le colonie galleggianti ad un tubo da 15 ml. Centrifugare le colonie a 600 xg per 10 minuti a RT e rimuovere il surnatante.
  2. Risospendere le colonie di cellule in 10 ml di DMEM / F12 e centrifugare a 600 xg per 10 min. Rimuovere il surnatante.
  3. Preparare una sospensione di cellule singole incubando le colonie con 2 ml di 0,25% tripsina a 37 ° C per 7-10 min. Vortice delicatamente la sospensione cellulare dissociare le colonie.
  4. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 2 ml di iPS-RPE medie. Centrifugare a 600 xg per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le singole cellule in 2 ml di IPS-RPE medie. Trasferire le cellule in una matrice proteica rivestito 6 pozzetti e posto in un incubatore a 37 ° C, 5% CO 2 e il 95% di umidità.

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Representative Results

In questo esperimento, le cellule iPS sono state coltivate e differenziate nel lignaggio RPE da EBS. EBs di dimensioni controllati, sono stati formati utilizzando micropiastra. Come si vede nella figura 1 formazione EB era omogeneo nelle micropiastre. Questi EBs stati poi raccolti e piastrate su piastre da 6 pozzetti (Figura 2).

RPE può essere identificato con la loro classica esagonale morfologia, pigmentazione, e l'espressione di marcatori RPE. Dopo 12 settimane di cultura, il 200-celle EBs aveva sviluppato astrociti e la morfologia dei fibroblasti. N pigmentazione è stata osservata in queste cellule (Figura 3A). EBs grandi sviluppato un monostrato di classica morfologia RPE e la pigmentazione (Figura 3B e C) Immunocytochemistry per rilevare marcatori RPE, MITF e ZO1 rivelato co-espressione di queste proteine ​​che erano stati derivati ​​da 500 celle e 3.000 celle EBs (Figura 4) .

EXpressions di campo dell'occhio e geni RPE sono stati monitorati mediante PCR. La Figura 5 mostra il profilo di espressione genica di neuroectodermici, precursori campo dell'occhio, e marcatori RPE in diverse dimensioni di EBS. È importante sottolineare che il marcatore RPE specifico, RPE65 è stato rilevato con inizio alle 17 giorno.

Per quantificare la resa di cellule che erano differenziate in RPE lignaggio, analisi FACS è stata effettuata per individuare i neuroectodermici e RPE precursori marcatori, PAX6 e MITF rispettivamente. Figura 6A mostra marcatore neuroectodermal PAX6 in diverse dimensioni di EBs in diversi momenti. Circa il 50% delle cellule analizzate erano positivi per Pax6 il giorno 6 della cultura in EBS 3.000 cellule. Inoltre, l'analisi FACS di marcatore RPE, MITF su varie dimensioni EB rivelato che il 20% delle cellule espresso MITF dal giorno 60 di differenziazione.

Cultured RPE sono anche caratterizzati dalla loro capacità di perdere pigmento e morfologia poligonale e ottenere unfibroblasti fenotipo su passaging. Pertanto, per stabilire se le iPS derivate RPE possiede queste caratteristiche, si meccanicamente isolati e diversi passaggi delle cellule. La figura 7A mostra le nuove cellule hanno perso diversi passaggi di pigmento e guadagnato fibroblasti morfologia. Inoltre, queste cellule proliferano e riguadagnato la morfologia poligonale classica sulla confluenza (Figura 7B). Nel giro di poche settimane, queste cellule hanno riacquistato la loro pigmentazione (Figura 7C).

TATTTTGC
Gene Riferimento NICB Sequence (5'-3 ') Dimensioni (bp)
Pax6 NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
R TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

Tabella 1. sequenze PCR Primer per Pax6, RPE65, RX, MITF e GAPDH geni.

Figura 1
Figura 1. Formazione di EBs con micropiastra. Ciascun micropozzetto contiene (A) 100 cellule, (B) 200 cellule, (C) 500 cellule, e (D) 3.000 cellule. Le cellule sono state incubate 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2 per la formazione di EBS. (Ingrandimento 100X, scala bar = 400 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. EBs raccolte da micropiastra. (A) 200 celle EB, (B) 500 cellule EB, (C) 3000-cell EB, e (D) 15.000-cell EB. (Ingrandimento 200X, scala bar = 200 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. IPS-derivati ​​RPE da diverse dimensioni di EBS. EBs sono state coltivate per 12 settimane. (A) 200-cell EBs aveva sviluppato solo astrociti e fibroblasti morfologia senza pigmentazione; mentre il 80% - 90% delle cellule nelle EBs 500 cellule (B e C) sviluppato un monostrato di cellule pigmentate poligonali. (A & B: Ingrandimento 100X, barra della scala= 400 micron; (C):. Ingrandimento 200X, scala bar = 200 micron) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. Co-espressione di MITF e ZO1. 500- e 3.000 cellule EBs espresso MITF e ZO1 dopo 17 giorni di differenziazione. (Ingrandimento 400X, scala bar = 20 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. Profilo di espressione genica di diverse dimensioni di EBs in diversi momenti di differenziazione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. FACS analisi di varie dimensioni EB per la differenziazione RPE. (A) FACS dati di marcatore neuroectodermica PAX6 in diverse dimensioni di EBs durante la differenziazione. (B) analisi FACS di marcatore RPE MITF in vari formati EB al giorno 60 di differenziazione. Il più alto livello di MITF raggiunto il 20% ed è stato costante tra dimensioni EB 500, 3.000, e 15.000 cellule.

Figura 7
Figura 7. Continua cultura isolato manualmente RPE. (A) RPE è stato subcoltura e acquisita fibroblasti morpholoGY dopo il passaggio. (B & C) Cellule sviluppate morfologia poligonale e pigmentazione nel tempo. (Ingrandimento 100X, scala bar = 400 micron). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per realizzare pienamente le potenzialità delle cellule staminali pluripotenti per terapia cellulare, è necessario regolare la loro differenziazione in modo coerente e riproducibile. Questo rapporto descrive i protocolli per formare EB dimensioni controllato utilizzando la tecnologia micropiastre, avviare differenziazione verso RPE e identificare proteine ​​e geni marcatori di RPE. Per sincronizzare la differenziazione in vitro, misure omogenee di EBs erano formate da un numero noto di cellule iPS centrifugati in micropiastra di aggregazione forzata. Immunocitochimica e trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (RT-PCR) sono usati per monitorare le proteine ​​espressioni RPE e geni di spiegati. Infine, l'efficienza di differenziazione in diverse dimensioni di EBs stato analizzato mediante analisi FACS. Queste tecniche possono facilitare la differenziazione delle cellule iPS in RPE per applicazioni future.

Ci sono diversi punti cruciali in questo metodo che devono essere attentamente eseguite all'eNsure il successo di questo protocollo e il raggiungimento di dati precisi. Il primo passo fondamentale si verifica durante la coltura delle cellule iPS. cellule iPS devono essere mantenuti in uno stato pluripotente per mantenere la loro staminalità. Le cellule devono avere il mezzo cambiata quotidianamente per mantenere adeguati livelli di bFGF e essere attentamente controllate ogni giorno per i segni di differenziazione. Cellule iPS indifferenziate crescere come colonie multicellulari compatti. Le cellule devono avere un elevato nucleare rapporto citoplasma e nucleoli prominenti. Le colonie iPS sono caratterizzati da un bordo distinto, con diversi strati di cellule al centro. Segni di differenziazione comprendono perdita di confini definiti colonie, morfologia cellulare non uniforme, e la comparsa di tipi cellulari evidenti, come neuroni e fibroblasti. Singole cellule che sono differenziate può essere rimosso dal dispasi e risciacquo, invece, colonie con queste caratteristiche devono essere rimossi manualmente dalla cultura 22. Preparazione di una singola sospensione cellulare iPS for formando EBS è il prossimo passo critico. È importante preparare una sospensione senza aggregati di cellule al fine di fornire con precisione il numero desiderato di cellule alla piastra Elisa e preparare la dimensione desiderata EB. Preparazioni di RNA per l'analisi PCR sono importanti. Incoerente qualità RNA è una significativa fonte di variabilità nei dati PCR. Estrazione di RNA dovrebbe produrre minimamente degradato RNA per i migliori risultati. Estrazione di RNA di successo darà RNA totale con degradazione minima e priva di RNasi contaminanti. Dopo la determinazione della concentrazione di RNA per spettrofotometria a 260 nm, la purezza del campione deve essere determinata a 230 e 280 nm per rivelare la contaminazione con polisaccaridi o proteine. Il 230: 260: rapporto 280 per RNA deve essere 1: 2: 1 per indicare RNA di alta qualità senza contaminazione 23. Infine, è importante fissare adeguatamente le cellule per FACS colorazione. Durante questa fase di fissaggio, le cellule devono essere separati per evitare grumi. Insufficrisospensione delle cellule ient prima permeabilizzazione porterà alla aggregazione delle cellule e colorazione imprecisa.

Si raccomanda che il protocollo da seguire, come descritto, tuttavia alcune modifiche possono essere effettuate, se necessario. Durante la generazione di EBs descritto al punto 4, il numero di cellule per EB può variare tra 500 e 3000 per ottenere un elevato rendimento di cellule differenziate in RPE. Se il numero di cellule iPS è limitata, EBs 500 cellule produrranno RPE paragonabile a EBS 3000 cellule. La cura supplementare deve essere presa durante il processo di estrazione di RNA descritto al punto 6. I campioni devono essere eseguiti in triplice copia al fine di garantire che l'RNA di alta qualità può essere acquisita. Durante immunocitochimica come descritto al punto 7, le concentrazioni di anticorpi primari e secondari possono essere regolati come necessario per migliorare l'intensità del segnale e ridurre sfondo. Gli opportuni controlli positivi e negativi dovrebbero essere inclusi nel saggio. Durante Passo 8, FACS, se i risultati attesi non sono ACQuired dopo colorazione, un piccolo campione delle cellule colorate può essere collocato su un vetrino e visualizzate con un microscopio per visualizzare colorazione. Gli opportuni controlli positivi e negativi dovrebbero essere inclusi nel saggio. Se le cellule non sono colorate come previsto, le concentrazioni di anticorpi possono essere aumentate o diminuite come necessario.

La tecnica descritta in questa relazione si tradurrà in una maggiore resa di RPE di differenziazione spontanea, senza l'uso di prodotti chimici aggiunti. Tuttavia, il principale limite di questo approccio è che ci sarà anche un gran numero di cellule non-RPE generati. Pertanto, l'RPE deve essere attentamente selezionata fuori e arricchito come descritto nel passaggio 9 per garantire una popolazione omogenea.

Il significato di questo approccio è che una maggiore resa di RPE può essere derivata da cellule iPS rispetto alle tecniche di differenziazione spontanee. L'uso di piccole molecole per ricavare RPE da iPS è stata riportata anche per dare un alto rendimento dicellule differenziate, tuttavia, che la tecnica è molto più complessa e richiede tempi e le concentrazioni delle piccole molecole di essere ottimizzato per ottenere i risultati desiderati 7,10. Inoltre, le piccole molecole utilizzati in tali metodi hanno effetti pleiotropici che possono confondere i risultati.

Il metodo descritto può essere usato per fare EB di dimensioni volute con elevata riproducibilità. Questa tecnica generato EBs di dimensioni uniformi che sono stati utilizzati per ottimizzare la differenziazione delle cellule iPS verso lineage RPE senza l'uso di prodotti chimici aggiuntivi. Le cellule iPS-RPE derivati ​​da EBs possono essere ulteriormente utilizzati in studi di trapianto di confermare la loro integrazione nella retina in una organizzazione funzionale. Queste cellule possono anche fornire un buon modello di ricerca per studiare la patogenesi di varie malattie RPE in vitro. L'utilità di questo approccio può essere applicato al differenziamento diretto in molti altri tipi di cellule, a secondala dimensione del EBs e l'origine in vivo della cellula in blastocisti. Cellule del ectoderma daranno luogo ai neuroni, epidermide, capelli e le cellule della ghiandola mammaria; endoderma darà origine a stomaco, colon, polmoni e le cellule intestinali; mesoderma darà origine a muscolo scheletrico, cuore, reni, e le cellule del tessuto connettivo 3,11,19. Una volta che il formato corretto EB è stato determinato, le cellule differenziate devono solo essere analizzati mediante immunocitochimica o FACS per la corretta espressione di proteine ​​marker.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

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