胚様体の異なるサイズによって人工多能性幹(iPS)細胞から網膜色素上皮(RPE)の導出

Developmental Biology

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Summary

このレポートの目的は、胚様体の異なるサイズを使用して人工多能性幹(iPS)細胞から網膜色素上皮(RPE)を導出するためのプロトコルを記述することである。

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Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

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Abstract

Introduction

人工多能性幹(iPS)細胞は、外因性因子1成体細胞を再プログラミングすることによって誘導される多能性幹細胞の一種である。対照的に、胚性幹細胞(ESC)、多能性幹細胞の別の型は、胚盤2-3の内部細胞塊から生成される。それらの異なる起源にもかかわらず、iPS細胞およびESCをインビトロおよび任意の細胞型4-5に分化する能力において複製するそれらの無制限の容量が同程度である。 iPS細胞のこれらの特徴は、彼らにパーソナライズされた再生医療への応用のための理想的な候補を作る。最近の研究努力は、網膜色素上皮(RPE)6-11を含む特殊な成体細胞を製造するための堅牢な分化プロトコールを開発することに焦点を当てている。

のiPS由来細胞の潜在的な臨床用途のために、その特定の細胞型に向かう分化が不可欠である。様々な方法があるその効率6-7、12-16で大きく変化したRPEに両方のESCとのiPS細胞の監督分化のために公開。我々はまだ開発または分化中の細胞/組織の運命を支配する分子事象の多くは知らない。近年では、努力は、できる限り胎生発育を模倣することができる分化プロトコルを開発する試みがなされてきた。胚盤胞段階の間に、幹細胞のコミットされていない集団の三次元微小環境で一緒にいる。そのように、様々な戦略を組み立てESC / iPS細胞を作成し、三次元でそれらを成長させるために適用した。これらの幹細胞集合体は、胚様体(EB)と呼ばれている。研究は、幹細胞のEBの分化は胚発生の初期段階を模倣し、自発的にその外面に原始内胚葉を生じ得ることを示した。 EBの開発が進むにつれてその後、3つのすべての生殖系列の分化細胞の表現型は17-18が表示されます。目erefore、EBをベース分化プロトコルは、ESC / iPS細胞のin vitroでの分化のために多くの注目を集め多能性幹細胞13からRPE生成のための良い候補であるしている。

EBは、ESC / iPS細胞からのいくつかの方法を用いて製造することができる。最初に、EBを付着コロニーを掻き非接着懸濁培養でそれらを維持することによって作製した。しかし、このアプローチは、低い再現性を引き起こすEBの不均一な集団を生じる。ハンギングドロップ細胞培養およびマイクロウェルベースの​​EB形成が非常に再現性が定義された大きさの均一なEBをを得たEB形成のための他の一般的な技術である。さらに、マイクロ技術は少ない労力で凝集体の大多数を得ることができる。

のEB内の細胞の分化は、細胞外および細胞内微小環境から形態形成の合図の多重によって調節される。月における分化とは対照的にフォーマットolayer、EBは、17を発生する細胞と細胞間シグナル伝達の複雑なアセンブリのためのプラットフォームを提供する。興味深いことに、個々のEBを作製するために使用される多能性幹細胞の数は、細胞の運命に影響を与えることが観察された。 1000セルEBは赤血球系統20に向けてプッシュされ、一方、例えば、ヒトESCの造血分化の研究では、500セルEBは骨髄系統への分化を促進したことが観察された。別の研究では、より小さなEBは、神経外胚葉分化11、17に向けて推進し、より大きなEBを、一方、内胚葉分化を支持した。

これらの過去の研究は強く個々のEBを作製するために使用されるESC / iPS細胞の数は、任意の細胞型への分化に基づいたEBに影響を与えることを示唆している。しかし、我々の知る限り、RPEに分化するために、その傾向にEBをサイズの影響を解明した電流の研究はありません。本研究の目的は、影響を特徴付けることである網膜色素上皮(のiPS-RPE)分化およびRPE系統に向かって方向付け分化したEBを作るための最適な細胞数を識別するために - 人工多能性幹(iPS)細胞へのEBの大きさ。

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Protocol

培養試薬および培養プレートの調製

  1. 幹細胞基礎培地400 mlに5倍の無血清補充を100mlを添加することにより無フィーダー幹細胞培養培地を準備する。培地は、最大2週間と6ヶ月間、-20℃で、4℃で安定である。
  2. 市販の胚様体(EB)形成培地にRho関連、コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤(Y-27362)の10μMの溶液を加える。
  3. (ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物F-12に0.1 mMのβメルカプトエタノール、0.1mMの非必​​須アミノ酸、2mM L-グルタミン、10%ノックアウト血清代替物(KSR)および10μg/ mlのゲンタマイシンを添加することによりDMEMを分化培地を調製/ F12)。
  4. 1×N1サプリメント、0.1mMの非必​​須アミノ酸、250 / mlのタウリン、13 / mlのトリヨードLチロニンナトリウム塩、を20ng / mlのヒドロコルチゾン、5μg/ mlのゲンタマイシン、および15%添加したiPS-RPEの培地を調製ウシ胎児血清(FBS)<SUP>最小必須培地イーグル(MEM)に21。 7.4にpHを調整する。
  5. トリヨード-L-チロニンナトリウム塩ストック溶液を準備します。穏やかに回転させることによって1 N水酸化ナトリウムでトリヨード-L-チロニンナトリウム塩1mgを溶解させる。トリヨード-L-チロニンナトリウム塩20μgの/ mlの50ミリリットルを作るために、MEMの49ミリリットルを追加します。アリコートを準備し、必要になるまで-20℃で凍結する。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
  6. ヒドロコルチゾンストック溶液を準備します。穏やかに撹拌し、100%エタノール1ml中ヒドロコルチゾン1mgを可溶化する。 50μg/ mlのヒドロコルチゾンストック溶液20ミリリットルを作るために、MEMの19ミリリットルを追加します。必要になるまで-20℃で小分けして凍結。最終培養培地中の所望の濃度を達成するために適切な容量を使用する。
  7. DMEM / F12中1mg / mLのディスパーゼのワーキング溶液を準備します。
  8. マトリックスコーティングされたプレートの調製
    1. MOUエンゲルブレス·ホルム - スウォーム(EHS)から抽出したタンパク質基質を準備0.08 mg / mlでのDMEM / F12中でそれ自体肉腫細胞。コー​​トマトリックス溶液1mlを6ウェルプレートの各ウェル。室温で1時間コーティングしたプレートをインキュベートします。
    2. 1時間のインキュベーション後、過剰のDMEM / F12を吸引する。ウェルの乾燥を防ぐために無フィーダー幹細胞培養培地0.5mlを加える。マトリックスでコーティングしたプレートを使用する準備ができている。
  9. DMEM / F12の2ミリリットルで、各ウェルをすすぐことによって、マイクロウェルプレートを準備します。 DMEM / F12を除去し、各ウェルにROCK阻害剤を補充したEB形成培地の0.5ミリリットルを追加します。 5分間の気泡を除去するために2,000×gでプレートを遠心する。
  10. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でアジ化ナトリウムを2%FBSを混合することによって、FACS染色緩衝液を調製し、0.09%。 pH7.4にバッファを調整します。
  11. DMEM / F12に10%FBSを添加することによりトリプシン中和溶液を調製する。

2.のiPS文化

  1. iPS細胞播種、3​​7°C​​まで暖かい無フィーダー幹細胞培地に先立ち、及びミリアンペアを持つ準備がコーティングされたプレートをTRIX。
  2. すぐに37℃の水浴中でIMR90-1 iPS細胞を解凍する。水浴からクリオバイアルを除去し、70%エタノールでバイアルを拭く。細胞塊の破壊を最小限にするために2ミリリットルピペットを用いて15ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。
  3. 滴下細胞に暖かい無フィーダー幹細胞培養培地5mlを加え、穏やかに混合する。 RTで5分間300×gで細胞を遠心し、上清を除去します。
  4. 慎重に無フィーダー幹細胞培地2mlの細胞塊を再懸濁し、基質でコーティングされたプレートのウェル中の細胞塊をシード。 5%CO 2、湿度95%で37℃のインキュベーターにプレートを置きます。
  5. 毎日のiPS細胞培養培地を変更します。五から七日播種後の未分化コロニーを観察します。光学顕微鏡下で通過させるための準備ができている未分化コロニー(密集中心としたコロニー)を確認してください。

iPS細胞の3継代

  1. 通路の開始前に、iPS細胞、ディスパーゼ溶液を、DMEM / F12、水浴中で37℃に無フィーダー幹細胞培養培地を温める。
  2. iPS細胞を継代する前に、領域をこすると培地を吸引することによって分化のいずれかの領域を除去する。慎重に2ミリリットルのDMEM / F12でiPS細胞をすすいでください。
  3. / mlのディスパーゼ各ウェルに1 MGの1ミリリットルを加え、7分間37℃でインキュベートする。吸引しディスパーゼ、ゆっくりとDMEM / F12の2ミリリットルで2回細胞コロニーをすすぐ。すすいだ後、各ウェルに無フィーダー幹細胞培養培地2mlを加える。
  4. を5mlのピペットを使用して、穏やかに細胞塊を形成するために、プレートのコロニーをこすり。 15ミリリットルコニカルチューブに取り外した細胞塊を転送します。細胞の次の継代をシードするのに十分な無フィーダー幹細胞培養培地を加える。

マイクロウェルプレートを使用したEBの4世代

  1. iPS細胞の単一細胞懸濁液の調製
    1. mediuを削除iPS細胞からmおよびDMEM / F12の2mlでiPS細胞をすすぐ。 6ウェルプレートの各ウェルでのiPS細胞にACCUTASE750μlのを追加します。細胞がプレート(約5〜10分)から分離することを可能にするために37℃、5%CO 2で細胞をインキュベートする。
    2. 優しく残りの細胞を解離するために、プレート表面に残った細胞を剥離するためにピペットを使用してください。 50ミリリットルコニカルチューブに細胞を移す。 DMEM / F12の5ミリリットルでプレートをすすぎ、コニカルチューブ内の細胞ですすぎDMEM / F12を兼ね備えています。すべての可能な残余の細胞塊を除去するために40μmのセルストレーナーを通して細胞懸濁液を渡します。
    3. ACCUTASEを削除するには、室温で5分間300×gで細胞を遠心します。細胞濃度が約0.5〜1.0×10 7細胞/ mlになるようにEB形成培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
    4. トリパンブルーと血球計数器を用いて細胞を計数することにより生存細胞の数を決定します。
  2. Adjustin整粒したEBを形成するためのマイクロウェル内gの細胞密度
    1. 所望のEBのサイズを生成するためにマイクロウェルプレートの各ウェルに細胞数を調整する。均等に優しく細胞を数回ピペッティングして細胞を配布、ステップ1.9で作成プレートのマイクロウェルに細胞を追加します。
      注:ウェル当たりマイクロウェルのEBのx個当たりのセルのウェルあたり必要な細胞の数=所望の数。
    2. 2.0ミリリットルの最終容量にウェル中のROCK阻害剤を補充したEB形成培地を調整します。静かに各ウェルにピペッティングして細胞を再配布。遠心分離機3分間100×gでマイクロウェルプレートは24時間、5%CO 2、95%湿度で37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
  3. マイクロウェルプレートから収穫したEB
    1. よくEBの大部分を除去するための1ミリリットルピペットで上下に培地をピペットによってマイクロウェルから収穫したEB。反転した40μmのセルを介してのEBサスペンションを渡す単一細胞を除去するために50mlコニカルチューブの上にストレーナー。
    2. すべてのEBを削除するにはDMEM / F12 1mlのマイクロウェルプレートを5回洗浄する。回の洗浄を収集し、反転したセルストレーナーを通過。新しい50ミリリットルコニカルチューブにアップセルストレーナー右サイドに回します。 EB形成培地で洗浄することによりEBを収集します。収量を決定するために、EBをカウント。

5.めっきしたEBと開始分化

  1. タンパク質マトリックス上にプレートEBは、EB形成培地+10μMのROCK阻害剤で千のEB /ウェル<の密度で(ステップ1.8.1のように)6ウェルプレートをコーティングした。 24時間、5%CO 2、95%湿度、37℃でのEBをインキュベートする。
  2. 24時間のEBめっき後、分化を開始するために分化培地と交換してください。細胞は、さらなる分析のために収集されるまで、一日おきに分化培地の半分を変更します。
  3. RT-PCR、immにを実施する日にサンプル6、17、29及び60を収集特徴的なRPE遺伝子およびタンパク質の発現を検証するunocytochemistryおよびFACS。

6. RNA抽出およびPCR

  1. 市販のキットで提供される指示に従って、EBサンプルからRNAを抽出します。分光光度計を使用してRNA濃度を決定します。
  2. cDNAを逆転写キットに市販のRNAによると、全RNA 100ngのに逆転写を行います。
  3. cDNAの10マイクロモル/ 10 NGの濃度でのcDNAの10 ngの以下のプライマーを用いた( 表1)を用いてPCRを行います。次のようにPCRを設定:72℃での最終サイクルに続いて、1分間、30秒間、72℃で、5分間、95℃でDNAを変性15秒間95℃、35サイクルで増幅し、60°C 10分間、C。 1%アガロースゲルでPCR産物を実行します。

7.免疫細胞化学

  1. RTでPBSで2回のEBを洗ってください。 4%paraformaldにRTでのEBを修正10分間ehyde。 RTでPBSで一度すすぐ。 PBSで保管してサンプルを4℃で染色に使用するまで。
  2. 染色日には、固定および透過試薬で固定した細胞を扱う。 RTで1時間(透過処理溶液中の10%ヤギ血清)をブロッキング溶液でサンプルをインキュベートする。
  3. 抗Pax6の(1:10)、抗RX(1:200)で示される希釈度以下の一次抗体を使用して透過処理溶液中の10%ヤギ血清で免疫化学を実行し、抗MITF(1:30)、および抗ZO1(1:100)。 4℃で対応する抗体O / Nを有するサンプルをインキュベートする。
  4. 翌日、細胞からの一次抗体を除去し、PBSでサンプルを3回すすいでください。 RTで1時間フォア結合二次抗体とサンプルをインキュベートする。
  5. 細胞から二次抗体を除去し、PBS中のサンプルを3回すすいでください。カバーが封入剤を含むDAPIをガラススライド上にスリップマウントサンプルは暗室でO / Nを設定することを可能にする。染色を可視化する蛍光顕微鏡を使用してください。

FACS分析のために8染色

  1. PBS中で培養したEBを2回洗浄します。単一細胞懸濁液を作製するために5〜10分間0.25%トリプシンを0.5mlとしたEBをインキュベートする。トリプシン中和溶液(1ml /ウェル)でトリプシンを中和する。
  2. 10分間、600×gでの15mlコニカルチューブと遠心分離機に単一細胞懸濁液を移す。
  3. 上清を捨て、チューブ中の細胞にDMEM / F12の10ミリリットルを追加します。穏やかに細胞を混合することが反転。 600×gで遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、FACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁する。
  4. 細胞の総数を数えます。 10分間600×gで遠心分離する。遠心分離廃棄上清の後。すぐに4%パラホルムアルデヒドの0.5ミリリットルを添加して細胞を固定します。穏やかにボルテックスでよく混ぜる。 20分間、4℃で細胞をインキュベート。
  5. 10分間600×gで遠心分離し、削除する上清。渦穏やかに細胞ペレットを破壊する。冷却された透過化溶液1mlを添加して細胞を透過性。ボルテックスは穏やかに混合し、30分間氷上でインキュベートする。
  6. 10分間600×gで遠心分離し、上清を除去します。 FACS染色バッファーに再懸濁の3ミリリットルを追加します。 1より多くの時間のために、この手順を繰り返します。 5×10 6細胞/ mlの最終濃度でFACS染色緩衝液中で細胞を再懸濁。
  7. 各マイクロチューブに100μlの細胞懸濁液(0.5×10 6細胞)を転送し、一次抗体の推奨されるボリュームを追加。 Pax6のために、細胞懸濁液を100μlのPE抗Pax6のの5μlを添加する。 MITFのために、細胞懸濁液を100μlの抗MITFの5μlを添加する。
  8. 混合し、60分間RTでインキュベートする。 FACS染色バッファーの3ミリリットルを追加します。 10分間600×gで混合し、遠心。上清を除去し、さらに2回のために8.16を繰り返します。
  9. MITF染色のために、二次antiboで細胞をインキュベートdyは、1の希釈でヤギ抗マウスアレクサフルオロ488:4°Cで1時間、2000。 Pax6の染色のために、このステップを回避する。
  10. 10分間600×gでのFACS染色バッファーと遠心機の5ミリリットルで細胞を洗浄。 2回以上のプロセスを繰り返します。
  11. 細胞ペレットを破壊する優しくFACS染色バッファーと渦の500μlの細胞を再懸濁。サンプルは、フローサイトメトリー分析のために準備ができている。

9. IPS-RPEの単離および培養

  1. 29日目に、慎重に200μlのピペットチップを用いて培養プレートから選択着色されたコロニーの周囲に切断した。 15ミリリットルコニカルチューブに浮動コロニーを転送します。 RTで10分間600×gでコロニーを遠心し、上清を除去します。
  2. 10分間600×gでDMEM / F12と遠心機の10ミリリットルで細胞コロニーを懸濁します。上清を取り除きます。
  3. 7-10分間37℃で0.25%トリプシン2mlを有するコロニーをインキュベートすることによって、単一細胞懸濁液を調製。穏やかにコロニーを解離細胞懸濁液をボルテックス。
  4. のiPS-RPE培地2mlを添加することによりトリプシンを中和する。 10分間600×gで遠心分離し、上清を捨てる。のiPS-RPE培地2ml中で単一細胞を再懸濁する。 37℃、5%CO 2および湿度95%のインキュベーター内タンパク質マトリックスコートした6ウェルプレートを所定の位置に細胞を移す。

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Representative Results

この実験では、iPS細胞を培養したEBからRPE細胞系統に分化した。制御されたサイズのEBをマイクロウェルプレートを用いて形成された。 図1 EBの形成に見られるように、マイクロウェルプレート中で均質であった。これらのEBは、次いで( 図2)を回収し、6ウェルプレート上にプレーティングした。

RPEは、古典的な六角形の形態、色素沈着、およびRPEマーカーの発現によって同定することができる。培養12週間後、200細胞EBは、アストロサイトおよび線維芽細胞の形態を開発していた。無色素沈着は、これらの細胞( 図3A)に観察されなかった。大きなEBを古典RPE形態および色素沈着の単層を開発した( 図3B及びC)免疫細胞化学は、RPEのマーカーを検出するために、MITFとZO1 500細胞および3000細胞EBから誘導されたこれらのタンパク質の同時発現を明らかにした( 図4)

E眼フィールドとRPE遺伝子のXPRESSIONS PCRによってモニターした。 図5は、EBの異なる大きさの神経外胚葉、眼フィールド前駆体およびRPEマーカーの遺伝子発現プロファイルを示す 。重要なことは、特定のRPEマーカー、RPE65が17日から始まる検出されました。

RPE細胞系譜に分化した細胞の収率を定量化するために、FACS分析は、神経外胚葉およびRPE前駆体マーカー、それぞれPAX6及びMITFを検出した。 図6Aは、異なる時点でのEBの異なるサイズの神経外胚葉マーカーPAX6を示している。分析した細胞の約50%が3000細胞EBにおける培養6日にPax6のための陽性であった。さらに、RPEマーカーのFACS分析は、様々EBサイズにMITFは、細胞の20%が分化の60日目によりMITFを発現することが明らかになった。

培養されたRPEはまた、それらの顔料、多角形の形態を失い得るそれらの能力によって特徴付けられる継代時の線維芽細胞表現型。したがって、のiPS細胞をRPEは、我々は機械的に孤立し、これらの特性を有する派生し、継代した場合に決定する。 図7(a)は、新たに継代し、細胞が色素を失い、線維芽細胞形態を得ている示しています。さらに、これらの細胞が増殖し、コンフルエント時に古典的な多角形の形態( 図7B)を取り戻した。数週間以内に、これらの細胞は、それらの色素沈着( 図7C)を取り戻した。

TATTTTGC
ジーン NICB参照 配列(5'-3 ') サイズ(BP)
Pax6は NM_001258465.1 F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
R
RPE65 NM_000329.2 F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
R AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
R CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
R TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
R TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

Pax6は、RPE65、RX、MITFおよびGAPDH遺伝子について、表1のPCRプライマー配列。

図1
マイクロウェルプレートとEBの図1の形成はマイクロウェルは、(A)100細胞、(B)200細胞、(C)500細胞、および(D)3000細胞を含有する。細胞は、EBの形成のために37ºCで24時間、5%CO 2でインキュベートた。 (倍率100倍、スケールバー= 400μm)は。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
マイクロウェルプレートから採取し、図2のEB。(A)200細胞EB、(B)500細胞EB、(C)3000、EB細胞、および(D)15000細胞EB。 (倍率200X、スケールバー= 200μm)は。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
図3のiPS由来のEB。EBの異なるサイズからRPE 12週間培養した。 (A)200-セルEBは、唯一の色素沈着のないアストロサイトおよび線維芽細胞の形態を開発していた。 80%つつ- 500細胞のEB(BおよびC)中の細胞の90%が多角色素性細胞の単層を開発した。 (A&B:倍率100X、スケールバー=400μmの。 (C):倍率200X、= 200ミクロンスケールバー)。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
MITFとZO1。500-及び3000-セルEB の図4.共発現は、分化の17日後にMITFとZO1を表明した。 (倍率400倍、スケールバー= 20μm)は。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5
分化の異なる時点でのEBの異なるサイズの、図5の遺伝子発現プロファイル。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6
RPEの分化のための多様なEBサイズ図6. FACS分析 。分化中のEBの異なるサイズで神経外胚葉マーカーPAX6の(A)FACSデータ。 (B)分化の60日目における様々 EBサイズ上のRPEマーカーMITFのFACS分析。 MITFの最高レベルは20%に達し、EBの500のサイズ、3000、15,000細胞間で一定であった。

図7
手動で孤立RPEの図7.継続文化。(A)RPEは継代培養および線維芽細胞morpholoを取得した通過後GY。 (B&C)細胞は、時間の経過とともに、多角形の形態および色素沈着を開発しました。 (倍率100倍、スケールバー= 400μm)は。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

細胞療法のための多能性幹細胞の完全な約束を実現するためには、一貫して再現可能な方法でそれらの分化を調節することが必要である。このレポートでは、マイクロウェルプレート技術を使用してサイズ制御したEBを形成RPEに向かって分化を開始し、RPEのタンパク質と遺伝子マーカーを同定するためのプロトコルについて説明します。 インビトロ分化を同期させるために、EBの均一な大きさは、強制凝集によってマイクロウェルプレート中で遠心iPS細胞の既知の番号を形成した。免疫細胞化学および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を説明した表現のRPEタンパク質および遺伝子をモニターするために使用される。最後に、EBの異なるサイズの分化の効率は、FACS分析により分析した。これらの技術は、将来のアプリケーションのためにRPEにiPS細胞の分化を促進することができる。

慎重にEに実行する必要があり、この方法でいくつかの重要なポイントがあります。正確なデータのこのプロトコル及び達成の成功をnsure。最初の重要なステップは、iPS細胞培養の間に発生します。 iPS細胞は、幹細胞性を維持するために、多能性状態に維持されなければならない。細胞は、bFGFの適切なレベルを維持するために、慎重に分化の徴候について毎日検査するために、毎日交換の媒体を持っている必要があります。未分化iPS細胞は、コンパクトな多細胞コロニーとして成長する。細胞は細胞質比及び顕著な核への高い核を持つべきである。のiPSコロニーが中心での細胞のいくつかの層を、別個のボーダーを特徴とする。分化の兆候は、定義されたコロニーの境界の喪失、不均一な細胞形態、およびそのような神経細胞および線維芽細胞のような明白な細胞型の出現を含む。分化した単一細胞は、ディスパーゼ及びリンスすることにより除去することができるが、これらの特性を有するコロニーを手動で培養22から除去されなければならない。シングルのiPS細胞懸濁液FOの調製R EBを形成することは、次の重要なステップです。正確マイクロウェルプレートへの細胞の所望の数を提供し、所望の大きさEBを調製するために、細胞凝集せずに懸濁液を調製することが重要である。 PCR分析のためのRNA調製物も重要である。矛盾したRNAの質は、PCRデータのばらつきの大きな原因である。 RNA抽出は、最良の結果を得るための最小限の分解されたRNAが得られるはずです。成功したRNA抽出は、最小限の劣化や夾雑RNaseが自由に全RNAが得られます。 260nmでの分光光度法によってRNA濃度を決定した後、サンプルの純度は、多糖類またはタンパク質の混入を検出するために、230および280nmで決定されるべきである。 230:260:いいえ汚染23で高品質のRNAを示すために、1:2:RNAのための280比は1でなければなりません。最後に、適切にFACS染色のために細胞を固定することが重要である。この固定工程の間、細胞は凝集を防止するために分離されなければならない。 Insuffic前透過化へient細胞の再懸濁は、細胞凝集と不正確な染色につながる。

当社は、必要に応じて、しかし、いくつかの変更を行うことができ、説明したようにプロトコルに従うことをお勧めします。 EBの生成中に工程4に記載され、EBあたりの細胞数は、RPEに分化した細胞の高い収率を達成するために、500〜3000の範囲であり得る。 iPS細胞の数が制限されている場合、500細胞EBは、3000細胞のEBに匹敵RPEを生成する。特別な注意が工程に記載のRNA抽出過程中に採取されなければならない。6.サンプルは、高品質のRNAを取得できることを保証するために三回実行されるべきである。ステップ7で説明したように免疫細胞化学の間に、一次および二次抗体の濃度は、信号強度を向上させ、バックグラウンドを減少させるために必要に応じて調整することができる。適切な陽性および陰性対照は、アッセイに含まれるべきである。ステップ8の間に、FACS分析は、期待される結果は、ACQされていない場合染色後uired、染色された細胞の少量の試料をスライド上に置き、染色を可視化する顕微鏡で見ることができる。適切な陽性および陰性対照は、アッセイに含まれるべきである。予想されるように細胞が染色されない場合は、必要に応じて、抗体濃度を増加または減少させることができる。

このレポートに記載された技術は、追加の化学物質を使用せずに、自発的分化よりRPEの高い収率をもたらす。しかし、このアプローチの主な制限は、生成された非RPE細胞の数が多くなることである。そのため、RPEは慎重に選択し、手順9で説明したように均一な集団を確保するために濃縮されなければならない。

このアプローチの重要性は、RPEのより高い収率が自発的分化技術よりもiPS細胞から誘導することができることである。のiPSからRPEを導出する小分子の使用はまた、高い収率を与えることが報告されている分化した細胞が、その技術は、はるかに複雑であり、タイミングを必要とし、小分子の濃度は、所望の結果7,10を達成するために最適化される。また、これらの方法で使用される小分子は、結果を混乱することができ、多面的効果を有する。

記載の方法は、高い再現性で、所望の大きさのEBを作製するために使用することができる。この技術は、追加の化学物質を使用せずにRPE系統に向かってiPS細胞の分化を最適化するために使用された均一なサイズのEBを生成。 EBから派生のiPS-RPE細胞は、さらなる機能的組織の網膜への統合を確認するために移植研究において使用され得る。これらの細胞はまた、インビトロにおける種々 RPE疾患の病因を研究するための優れた研究モデルを提供することができる。このアプローチの有用性に依存して、多くの他の細胞型に向かう分化を適用することができるEBの大きさ及び胚盤胞における細胞のインビボ起源。外胚葉の細胞は、神経細胞、表皮、髪や乳腺細胞を生じさせるでしょう。内胚葉は、胃、結腸、肺、および腸細胞を生じさせる。中胚葉は、骨格筋、心臓、腎臓、および結合組織細胞3,11,19を生じさせる。正しいEBのサイズが決定されると、分化した細胞は、マーカータンパク質の正しい発現について免疫細胞化学またはFACSによって分析するだけでよい。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

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References

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