从诱导多能干得出视网膜色素上皮(RPE)(IPS),由胚体大小不同的细胞

Developmental Biology

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Summary

此报告的目的是描述协议来导出从诱导的多能干(iPS细胞)使用不同尺寸的胚状体的视网膜色素上皮细胞(RPE)。

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Muñiz, A., Ramesh, K. R., Greene, W. A., Choi, J. H., Wang, H. C. Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies. J. Vis. Exp. (96), e52262, doi:10.3791/52262 (2015).

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Abstract

Introduction

诱导多能干细胞(iPS细胞)是由重编程体细胞与外在因素1派生的类型的多能干细胞。与此相反,胚胎干细胞(ESCs),另一种类型的多能干细胞,从胚泡2-3的内细胞团生成。尽管他们的不同的起源,iPS细胞和胚胎干细胞是可比在其无限的容量在体外和在其分化成任何细胞类型的能力4-5进行复制。 iPS细胞的这些特性使其成为理想的候选人在个性化的再生医学应用。最近的研究工作集中在开发健壮的分化协议用 ​​于生产特殊成年细胞包括视网膜色素上皮(RPE)6-11。

于iPS来源的细胞潜在的临床应用中,定向分化为特定的细胞类型是至关重要的。有多种方法公布为胚胎干细胞和iPS细胞定向分化为RPE的良莠不齐的工作效率6-7,12-16。我们仍然不知道有多少,发展和分化过程中执政细胞/组织命运的分子事件。在最近几年,已经作出努力来开发该分化方案,可以模仿的胚胎发育尽可能。在胚泡阶段,干细胞的未提交的人口都一起在三维微环境。因此,采用了不同的策略,使ESC / iPS细胞聚集在一起,在三个维度成长他们。这些干细胞聚集体被称为胚体(EB)。有研究表明,干细胞的分化的EB模仿胚胎发育的早期阶段,并且可以自发地产生原始内胚层在其外表面上。后来,随着EB开发的进展,所有三个胚谱系分化细胞的表型出现17-18。日erefore,胚基分化协议已经吸引了大量的关注在体外分化ESC / iPS细胞,是一个很好的候选人RPE代从多能干细胞13。

胚可以使用多种方法从ESC / iPS细胞进行。最初,胚被刮去附着的菌落,并保持它们在非粘附悬浮培养制成。然而,这种方法产生的EB,导致低再现性的异质群体。悬滴细胞培养和微孔基EBS形成其他流行的技术胚形成而产生定义尺寸的高度重复性的同质胚。另外,微孔的技术可以产生大量的聚集体以较少的努力。

内的EB细胞分化是通过从细胞外和细胞内的微形态线索多路复用调节。与此相反,以分化的纹olayer格式的EB为细胞的复杂的组装和细胞间信号发生17的平台。有趣的是,观察到用来制作个别的EB多能干细胞的数量来影响细胞的命运。例如,在人类胚胎干细胞的造血分化的研究中,观察到500个细胞EB对促进髓系分化,而​​1000细胞EB推向红系20。在另一项研究中,较小的EB青睐定形内胚层分化而促进向神经外胚层分化11,17更大的EB。

这些过去的研究有力地表明,用于制造单个的EB ESC / iPS细胞的数量的影响根据分化成任何细胞类型的胚。然而,据我们所知,有一些已经阐明其倾向胚大小的影响,区分对RPE目前没有研究。这项研究的目的是表征的影响EB大小对诱导多能干细胞(iPS细胞) - 视网膜色素上皮细胞(IPS-RPE)的分化,并确定最佳的细胞数量,使胚的对RPE细胞系定向分化。

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Protocol

1.准备培养试剂和培养皿

  1. 通过加入100ml 5×无血清补充到400毫升干细胞基础培养基的制备无饲养干细胞培养基。该介质是稳定的,在4℃下进行最多2周,并在-20℃下6个月。
  2. 加的Rho相关,卷曲螺旋包含蛋白激酶(岩)抑制剂(Y-27362),以市售胚状体(EB)形成介质10μM的溶液。
  3. 通过加入0.1mMβ巯基乙醇,0.1mM非必需氨基酸,2mM的L-谷氨酰胺,10%敲除血清替代品(KSR)和10微克/毫升庆大霉素到的Dulbecco改良Eagle培养基/营养混合物F-12制备的分化培养基(DMEM / F12)。
  4. 通过添加1×N 1的补充,0.1mM非必需氨基酸,250微克/毫升牛磺酸,13纳克/毫升的三碘左旋甲腺氨酸钠盐,20纳克/ ml氢化可的松,5微克/毫升庆大霉素和15%制备的iPS-RPE介质胎牛血清(FBS)的<SUP> 21到最低基本培养基Eagle(MEM)。将pH调节至7.4。
  5. 制备碘左旋甲腺氨酸钠盐原液。溶解1毫克碘左旋甲腺氨酸钠盐在1N氢氧化钠通过轻轻摇动。添加49毫升的MEM使50毫升20微克/三碘左旋甲腺氨酸钠盐的溶液中。制备等分试样和,直到需要冷冻在-20℃。使用适当的音量,以达到最终的培养液所需浓度。
  6. 制备氢化可的松原液。溶解1毫克的氢化可的松在1ml的100%乙醇通过温和搅拌。添加19毫升MEM,使20ml中为50μg/ ml氢化可的松原液。等分试样并冷冻在-20℃直到需要。使用适当的体积,以达到在最终培养基中的所需浓度。
  7. 制备为1mg / ml,在DMEM / F12分散酶的工作溶液。
  8. 矩阵涂层板的制备
    1. 准备从Engelbreth - 霍尔姆 - 群(EHS)提取蛋白基质亩本身肉瘤细胞在DMEM / F12中,以0.08毫克/毫升。外套一个6孔板用1ml的基质溶液中的各孔中。孵育包被的板在RT 1小时。
    2. 在1小时温育后,吸出过量的DMEM / F12。添加0.5毫升无饲养干细胞培养基,以防止井的干燥。基质包被的板都可以使用。
  9. 制备微孔板,通过用2ml的DMEM / F12的井漂洗每个。除去的DMEM / F12,并添加0.5毫升补充有ROCK抑制剂向每个孔EB形成培养基中。离心板在2000×g离心5分钟以除去任何气泡。
  10. 制备FACS染色缓冲液通过混合2%FBS和0.09%叠氮化钠的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。调节缓冲至pH 7.4。
  11. 通过加入10%胎牛血清,以DMEM / F12制备的胰蛋白酶中和溶液。

2.培养的iPS

  1. 之前的iPS细胞接种,温无饲养干细胞培养基至37℃,并有马TRIX涂层板准备就绪。
  2. 迅速解冻在37℃的水浴的IMR90-1 iPS细胞。然后取出冷冻瓶从水浴擦拭用70%乙醇的小瓶。使用2毫升吸管,以减少细胞团的断裂转移细胞到15ml锥形管中。
  3. 加入5毫升温无饲养干细胞培养基的细胞滴,并轻轻混合。离心细胞,在300×g离心5分钟,在室温,去除上清。
  4. 小心重悬细胞团块在2ml无饲养干细胞培养基和种子的细胞团块在基质被覆的板的孔中。将板放入37℃培养箱中,用5%的CO 2,95%的湿度。
  5. 每天都在变化的iPS细胞培养液中。接种后观察未分化集落五至七天。检查未分化集落的,可用于通过在光学显微镜下(具有致密中心集落)。

3.传代的iPS细胞的

  1. 之前开始到通道中的iPS细胞,温分散酶溶液,DMEM / F12和无饲养干细胞培养基到37℃水浴中。
  2. 前传代iPS细胞,通过刮擦面积和吸出培养基除去分化的任何区域。仔细冲洗iPS细胞用2ml的DMEM / F12。
  3. 加入1毫升1毫克/毫升分散酶至每个孔,并孵育在37℃下7分钟。吸出分散酶,轻轻冲洗细胞菌落用2ml的DMEM / F12两次。漂洗后,加2ml无饲养干细胞培养基到每个孔中。
  4. 使用5毫升吸管轻轻刮板的菌落,以形成细胞团块。转移拆卸的细胞团块到15ml锥形管中。添加足够无饲养干细胞培养基的种子细胞的下一个通道。

4代的EB利用微孔板

  1. iPS细胞的单细胞悬浮液的制备
    1. 取出mediu米的iPS细胞和冲洗iPS细胞用2ml的DMEM / F12的。添加750微升的Accutase到iPS细胞在6孔板的每个孔中。孵育所述细胞在37℃和5%的CO 2,以使细胞从板(约5-10分钟)分离。
    2. 用移液管轻轻地分离任何剩余的细胞并分离任何剩余的细胞中的板表面上。转移细胞到50ml锥形管中。冲洗该板用5ml的DMEM / F12的并与细胞中的锥形管结合的冲洗的DMEM / F12。通过40微米的细胞滤网通过细胞悬浮液,以除去任何可能残留的细胞团块。
    3. 离心细胞,在300×g离心5分钟,在室温以除去的Accutase。重悬在EB形成培养基中的细胞沉淀,以使细胞浓度为约0.5-1.0×10 7个细胞/ ml。
    4. 通过计数细胞与锥虫蓝和血细胞计数器确定存活细胞的数量。
  2. Adjustin在微孔G细胞的密度,形成规模控制的胚
    1. 调节细胞数至微孔板的各孔中以产生期望的EB尺寸。添加细胞在步骤1.9中制备的板的微孔,均匀数倍轻轻吹打细胞分发细胞。
      注:每口井所需的细胞数=所需的每很好微孔EB x个细胞的数量。
    2. 调整补充有ROCK抑制剂在孔至2.0 ml的终体积在EB形成培养基中。轻轻每孔吹打重新分配细胞。离心微孔板在100×g离心3分钟。放置在培养箱板在37℃,5%的CO 2和95%湿度下24小时。
  3. 从微孔板收获胚
    1. 收获的EB从微孔通过在井上下用1毫升移液器以除去大部分的EB的吹打介质。通过倒置40微米的细胞通过EB停牌过滤器上的50毫升锥形管的顶部以去除单细胞。
    2. 1毫升DMEM / F12的洗微孔板5次,除去所有的胚。收集清洗和越过倒细胞过滤。旋转细胞过滤右侧到一个新的50ml锥形管中。通过EB形成培养基清洗收集胚。算的EB,以确定产率。

5.电镀胚和启动分化

  1. 板对蛋白基质涂覆6孔板中的EB(如在步骤1.8.1),在<1000的EB /密度以及在EB形成培养基中加10μM的岩抑制剂。孵育所述胚在37℃,5%的CO 2和95%湿度下24小时。
  2. 24小时EB电镀后,更换分化培养基开始分化。改变一半分化培养基每隔一天,直至细胞被收集用于进一步分析。
  3. 收集在第6天,17,29和60个样品进行的RT-PCR,IMMunocytochemistry和FACS来验证特性RPE基因和蛋白质的表达。

6. RNA提取和PCR

  1. 根据在市售的试剂盒提供的指令从电子束的样品中提取的RNA。通过使用分光光度计测定RNA浓度。
  2. 根据市售的RNA到cDNA的反转录试剂盒100纳克的总RNA进行反转录。
  3. 以10微摩尔/ 10纳克的cDNA的浓度进行PCR用的cDNA的10毫微克使用以下引物( 表1)。设置的PCR如下:DNA变性在95℃下进行5分钟,用35个循环扩增在95℃下15秒,60℃,30秒,72℃1分钟,接着是最终循环的72°下进行10分钟。运行该PCR产物在1%琼脂糖凝胶。

7.免疫细胞化学

  1. 与PBS在RT洗胚两次。固定在胚胎发育RT在4%paraformaldehyde 10分钟。冲洗一次,用PBS于室温。直到用于染色在PBS中在4℃下存储区样品。
  2. 在染色天,治疗固定细胞固定和通透试剂。孵育样品用封闭溶液(10%山羊血清中透化溶液)处理1小时,在室温。
  3. 使用以下主要抗体以所示稀释度在透化溶液中的10%山羊血清进行免疫化学:抗的Pax6(1:10),抗RX(1:200),抗MITF(1:30),和抗ZO1(1:100)。孵育样品与相应抗体O / N在4℃。
  4. 第二天,除去从细胞初级抗体和冲洗样品三次,用PBS。孵育荧光团共轭次级抗体的样品进行1小时,在室温。
  5. 从细胞中取出二次抗体和冲洗样本三次PBS中。安装盖玻片载玻片上含安装中DAPI,并允许样品设置O / N在黑暗的室内。使用荧光显微镜来可视化染色。

8.染色的FACS分析

  1. 在PBS洗培养胚两次。孵育用0.5ml 0.25%胰蛋白酶的胚5-10分钟,使单细胞悬浮液。中和用胰蛋白酶中和溶液中的胰蛋白酶(1毫升/孔)。
  2. 传送单细胞悬液至15ml锥形管中并离心,在600×g离心10分钟。
  3. 弃去上清液,并加入10 mL的DMEM / F12向细胞在管中。轻轻颠倒混合细胞。离心机在600×g的。离心后,弃去上清并将细胞重新悬浮在FACS染色缓冲液中。
  4. 计数细胞的总数。离心在600×g离心10分钟。离心后弃上清。立即通过加入0.5ml的4%的多聚甲醛固定细胞。轻轻旋转混匀。孵育细胞,在4℃进行20分钟。
  5. 离心在600×g离心10分钟,并取出上清。轻轻涡旋破坏细胞沉淀。通过加入1ml的冷却溶液透透化细胞。轻轻涡旋混合并在冰上孵育30分钟。
  6. 离心在600×g离心10分钟并除去上清液。加入3毫升FACS染色缓冲液重悬。重复一次这个步骤。将细胞重悬于FACS染色缓冲液中的5×10 6个细胞/ ml的终浓度。
  7. 转移100微升细胞悬浮液(0.5×10 6个细胞)至各离心管并加入初级抗体的推荐量。对于Pax6的,在100微升细胞悬液加5微升PE防的Pax6的。对于MITF,在100微升细胞悬液加5微升抗MITF的。
  8. 混合并在室温下孵育60分钟。加入3毫升FACS染色缓冲。混合和离心机在600×g离心10分钟。去除上清,额外的两次重复8.16。
  9. 对于MITF染色,孵化细胞二次antiboDY,山羊抗小鼠的Alexa Fluor 488的稀释度为1:2000 1小时,在4℃。对于Pax6的染色,避免这一步。
  10. 用5毫升的FACS染色缓冲液和离心机在600×g离心洗细胞10分钟。重复该过程两次以上。
  11. 将细胞重悬于500微升FACS染色缓冲液并涡旋轻轻以破坏细胞沉淀。样品准备流式细胞仪分析。

9.的iPS-RPE分离和培养

  1. 在第29天,小心地从周围用200μl的移液管尖的培养板中的所选着色菌落切割。传送浮动菌落到15ml锥形管中。离心菌落在600×g离心在室温10分钟,并除去上清液。
  2. 重悬在10ml的DMEM / F12和离心机的细胞集落,在600×g离心10分钟。去除上清。
  3. 通过温育与2ml的0.25%胰蛋白酶的菌落在37℃下为7-10分钟制得单细胞悬浮液。轻轻涡旋细胞悬液分离的殖民地。
  4. 加入2毫升的iPS-RPE介质中和胰蛋白酶。离心在600×g离心10分钟并弃去上清液。重悬在2ml的iPS-RPE介质的单细胞。转移细胞进入一种蛋白质基质包被的6孔板并置于培养箱中在37℃,5%CO 2和95%的湿度。

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Representative Results

在这个实验中,iPS细胞进行培养,分化成从胚的视网膜色素上皮谱系。利用微孔板形成控制大小胚。如从图1可见EB形成为同质的微孔板。这些胚然后收集并接种在6孔板( 图2)。

RPE可以通过经典六角形态,色素沉着,及表达的视网膜色素上皮标志物来鉴定。 12周文化后,200细胞胚制定了星形胶质细胞和成纤维细胞的形态。无色素沉着,观察这些细胞( 图3A)。较大的EB开发的经典RPE形态学和色素沉着的单层( 图3BC)的免疫细胞化学检测的RPE标记,MITF和ZO1揭示共表达这些蛋白质已被来自500细胞和3000细胞的EB的( 图4)

Ë眼字段和RPE基因Xpressions的通过PCR进行监控。 图5示出了神经外胚层,眼场的前体,和RPE标记的大小不同的EB的基因表达谱。重要的是,在特定的RPE标记,RPE65检测开始的第17天。

量化该已分化成视网膜色素上皮细胞谱系细胞的产率,进行FACS分析以检测神经外胚层和RPE前体标记物,分别PAX6和MITF。 图6A示出了在不同尺寸的EB的在不同时间点神经外胚层标记PAX6。约50%的分析细胞呈阳性的Pax6文化的第6天,在3000细胞胚。此外,RPE标记,MITF上多样的EB尺寸的FACS分析显示,细胞的20%表示MITF通过分化60天。

培养的视网膜色素上皮的特征还在于它们失去其颜料和多边形的形态,将获得一个能力成纤维细胞的表型在传代。因此,以确定是否的iPS衍生的RPE具有这些特性,我们机械地分离和传代的细胞。 图7A示出了新近传代的细胞失去色素,并获得成纤维细胞形态。此外,这些细胞增殖和恢复时合流古典多边形的形态( 图7B)。在几个星期内,这些细胞重新获得他们的色素沉着( 图7C)。

TATTTTGC
基因 NICB参考 序列(5'-3') 尺寸(BP)
PAX6 NM_001258465.1 ˚F CGGAGTGAATCAGCT
CGGTG
300
ř
RPE65 NM_000329.2 ˚F GCCCTCCTGCACAAG
TTTGACTTT
259
ř AGTTGGTCTCTGTGC
AAGCGTAGT
RX NM_013435.2 ˚F GAATCTCGAAATCTC
AGCCC
279
ř CTTCACTAARRRGCT
CAGGAC
MITF NM_198178.2 ˚F TTCACGAGCGTCCTG
TATGCAGAT
106
ř TTGCAAAGCAGGATC
CATCAAGCC
GAPDH NM_001256799.1 ˚F ACCACAGTCCATGCC
ATCAC
452
ř TCCACCACCCTGTTG
CTGTA

表1的PCR引物序列为Pax6的,RPE65,RX MITF和GAPDH基因。

图1
图1.形成的EB与微孔板,每个微孔含有(A)100个细胞,(B)的200细胞,(C)的 500个细胞,和(D)3000的细胞。细胞孵育24小时,在37ºC和5%CO 2的胚的形成。 (放大倍数100倍,比例尺= 400微米)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.从胚微孔板收获。(A)200-细胞EB,(B)500细胞EB,(C)3000细胞EB,和(D)15000细胞EB。 (放大倍数200X,比例尺= 200微米)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3的iPS-来自于不同尺寸的EB。的RPE为12周中培养。 (A)200-细胞胚才开发的星形胶质细胞和成纤维细胞形态无色素;而80% - 90%的细胞在500细胞的EB(BC)的开发多角形色素细胞的一个单层。 (A&B:放大倍率100X,比例尺= 400微米; (C):放大倍率200X,比例尺= 200微米), 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
17天后分化图4.共表达MITF和ZO1。500-和3000-细胞胚表达MITF和ZO1。 (放大倍数400倍,比例尺= 20微米)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.基因表达不同大小的EB中的分化的不同时间点的信息。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6
图6.流式细胞仪分析不同的EB大小RPE分化(A)FACS在大小不同的胚的神经外胚层标志PAX6分化过程中的数据。 (B)的RPE标记MITF在不同的EB尺寸的分化60天的FACS分析。 MITF的最高水平达到20%,是EB大小为500,3000,和15,000个细胞之间的恒定。

图7
图7.继续手动隔离RPE的文化。(A)RPE进行继代培养和获得成纤维细胞morpholo通过后GY。 (B&C)电池开发多边形的形态和色素沉着随着时间的推移。 (放大倍数100倍,比例尺= 400微米)。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

为了实现多能干细胞用于细胞疗法的充分承诺,有必要调节其分化以一致和可再现的方式。这份报告描述了协议,形成利用微孔板技术尺寸控制EBS,开始分化为RPE,并确定RPE的蛋白质和基因标记。同步在体外分化,胚的大小均匀已知数字的iPS细胞在微孔板强迫聚集离心的形成。免疫细胞化学和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),用于监视所述表达式的RPE的蛋白质和基因说明。最后,分化的不同尺寸的EB的效率通过FACS分析进行分析。这些技术可以促进iPS细胞分化为RPE为未来的应用程序。

有这几种方法的关键点,必须认真执行到e7.2.4本协议的准确数据和实现的成就。 iPS细胞培养过程中的第一个关键步骤发生。 iPS细胞必须维持在多能状态维持其干性。细胞必须具有每日以维持适当的bFGF的水平和每天仔细检查分化的迹象改变介质。未分化的iPS细胞成长为紧凑的多细胞菌落。所述细胞应该具有高的核对细胞质比和明显的核仁。所述的iPS集落的特征是明显的边界,与在中心几层细胞。分化的迹象包括损失定义菌落边界,非均匀的细胞形态,并且明显的细胞类型,例如神经细胞和成纤维细胞的外观。已分化可以通过分散酶和漂洗去除单个细胞,但是,与这些特性的菌落必须手动从培养22除去。一个单一的iPS细胞悬液FO的制备ř形成胚是下一个关键步骤。它准备,以便准确地递送细胞的期望数量的微孔板和制备所需大小的EB中的悬浮液没有细胞聚集是非常重要的。是RNA制剂用于PCR分析也很重要。不一致RNA的质量是变异性的PCR数据一个显著源。 RNA提取应该产生最小降解的RNA,以取得最佳效果。成功提取RNA将产生的总RNA以最小的降解,无任何污染RNA酶。测定用分光光度法在260nm处的RNA浓度后,将样品的纯度应在230和280nm处进行测定,以检测污染与多糖或蛋白质。 230:260:280的比例进行RNA应为1:2:1,以指示高质量的RNA,无污染23。最后,为了充分地固定细胞用于FACS染色是重要的。在这一固定步骤中,细胞必须分开,以防止结块。 Insufficient细胞悬浮之前通透性会导致细胞聚集和不准确的染色。

我们建议作为说明,但是一些修改如果必要,可以取得的协议来执行。期间的EB的生成,在步骤4中描述,每EB细胞数量500之间的范围内,以3000,实现了高收率的细胞分化成视网膜色素上皮。如果iPS细胞的数目是有限的,500细胞的EB将产生的RPE媲美的3000细胞的EB。格外小心,必须在步骤中描述的RNA提取过程6.样品应一式三份运行,以确保高品质的RNA可以获取服用。期间如在步骤7中所述免疫细胞化学,初级和二级抗体的浓度可以根据需要进行调整,以提高信号强度并减少背景。合适的阳性和阴性对照应包括在测定中。在第8步,FACS分析,如果预期的结果不ACQ染色后uired,染色细胞的一个小样品可以被放置在载玻片上,并用显微镜观察来可视化染色。合适的阳性和阴性对照应包括在测定中。如果细胞不染如预期地,该抗体的浓度可以增加或根据需要减小。

本报告中所描述的技术将导致更高的产率比的RPE自发分化,而无需使用附加的化学品。但是,这种方法的主要限制是,也将有大量产生的非RPE细胞。因此,RPE必须仔细选择出并如步骤9中所述,以确保均匀的人口富集。

这种方法的意义在于,更高的产率的RPE可以由iPS细胞比自发分化的技术来获得。使用小分子对由iPS派生的RPE也有报道,得到高收率的分化的细胞,然而,该技术要复杂得多,并且需要的时间和小分子的浓度被优化以获得所需的结果7,10。另外,在这些方法中使用的小分子具有多效性,可混淆的结果。

所描述的方法可用于制造所需尺寸以高再现性的EB。这种技术产生均一大小的哪个被用于优化iPS细胞向RPE谱系的分化,而无需使用额外的化学品的EB。从胚来源的iPS-RPE细胞可以被进一步用于移植的研究,以确认他们融入到视网膜的职能组织。这些细胞还可以提供一个良好的研究模型,研究在体外各种视网膜色素上皮病的发病机制。这种方法的效用可以被施加到定向分化成许多其他类型的细胞,这取决于所述的EB的尺寸和在体内的起源于胚泡的细胞。外胚层的细胞将产生神经元,表皮,毛发和乳腺细胞;内胚层会引起胃,结肠,肺,肠道细胞;中胚层会引起骨骼肌,心脏,肾脏和结缔组织细胞3,11,19。一旦正确的EB大小已确定,所述分化的细胞只需要由免疫细胞化学或流式细胞仪用于标记蛋白的正确表达进行分析。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
mTeSR1 media + 5x supplement Stem Cell Technologies 5850
Y-27632 (Rock Inhibitor) Stem Cell Technologies 72304
DMEM/F12 Life Technologies 11330-032
2-Mercaptoethanol Sigma M-7154
Non essential amino acids Hyclone(Fisher) SH30853.01
Knockout serum replacement Life Technologies 10828-028
Gentamicin  Life Technologies 15750-060
L-Glutamine Life Technologies 25030-081
MEM media Life Technologies 10370-021
N1 supplement Sigma N-6530-5ML
Taurine Sigma T-8691-25G
Hydrocortisone Sigma H0888-1G
Fetal bovine serum Hyclone(Fisher) SH3008803HI
Triiodo-L-thyronine sodium  salt Sigma T6397
Sodium hydroxide Sigma S5881
Dispase Life Technologies 17105-041
Matrigel BD Biosciences 354277
Phosphate buffered saline Hyclone(Fisher) 10010-023
Aggrewell 400 plate Stem Cell Technologies 27940
AggreWell medium Stem Cell Technologies 5893
Accutase Stem Cell Technologies 7920
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit BD Biosciences 554714
Mouse Anti-PAX6 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank
Rabbit Anti-RX antibody Abcam Ab23340
Mouse  Anti-MITF antibody Thermo Scientific MS-772-P
Rabbit Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 40-2200
RNeasy plus mini kit Qiagen 74134
PCR master mix Promega M7502
High capacity RNA to cDNA kit Life Technologies 4387406

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References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2, (12), 3081-3089 (2007).
  2. Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18, (4), 399-404 (2000).
  3. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  4. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, (4), 663-676 (2006).
  5. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, (5858), 1917-1920 (2007).
  6. Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, (10), 2427-2434 (2009).
  7. Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1, (2), 96-109 (2012).
  8. Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, (22), 3385-3396 (2013).
  9. Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, (2), 327-332 (2011).
  10. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
  11. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26, (9), 2300-2310 (2008).
  12. Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
  13. Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
  14. Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (12), e8152 (2009).
  15. Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, (1), 198-209 (2014).
  16. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (39), 16698-16703 (2009).
  17. Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25, (1), 43-51 (2009).
  18. Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103, (5), 389-398 (2007).
  19. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  20. Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106, (5), 1601-1603 (2005).
  21. Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, (8), 3612-3624 (2006).
  22. Maintenance of hESCs and hiPSCs. mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. Available from: http://www.stemcell.com (2010).
  23. The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm. 260 nm. 280nm.. About Biotechnology. 230, Available from: http://archive.today/0qTh (2013).

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