निकट अवरक्त (NIR) लाइट माउस Vestibular संवेदी उपकला में mitochondrial समारोह के एक मार्कर की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है

1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mitochondrial रोग सेलुलर वार्धक्य की एक बानगी है। इस पत्र में उम्र बढ़ने माउस vestibular संवेदी उपकला में mitochondrial समारोह में सुधार करने के लिए गैर इनवेसिव लगभग अवरक्त (NIR) उपचार का उपयोग करता है।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhang, L., Tung, V. W., Mathews, M., Camp, A. J. Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium. J. Vis. Exp. (97), e52265, doi:10.3791/52265 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

बढ़ती उम्र के साथ संतुलन समारोह में गिरावट attenuating के लिए रणनीतियाँ संतुलन कार्यों और व्यायाम सहित भौतिक चिकित्सा पर मुख्य रूप से ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। हालांकि, इन तरीकों संतुलन गिरावट के पीछे कारणों का पता नहीं है। चूहों का प्रयोग, vestibular संवेदी उपकला में कोशिकाओं के चयापचय पर निकट अवरक्त प्रकाश के प्रभाव (NIR) मूल्यांकन किया गया था। एकत्र आंकड़ों इस सरल और सुरक्षित हस्तक्षेप प्राकृतिक उम्र बढ़ने के हानिकारक प्रभाव से इन चपेट में कोशिकाओं की रक्षा कर सकते हैं कि पता चलता है। mRNA के पृथक परिधीय vestibular संवेदी उपकला (शिखा ampullaris और utricular मैक्युला) से निकाले गए और बाद में एक सीडीएनए लाइब्रेरी में लिखित था। इस पुस्तकालय तो सर्वव्यापी एंटीऑक्सीडेंट (वतन-1) की अभिव्यक्ति के लिए जांच की गई थी। एंटीऑक्सीडेंट जीन अभिव्यक्ति तो सेलुलर चयापचय यों के लिए इस्तेमाल किया गया था। युवा में NIR की Transcranial वितरण (4 सप्ताह) और पुराने का उपयोग करना - 5 डी के लिए (8 9 महीने) चूहों, और एक संक्षिप्त इलाज के शासन (90 सेकंड / दिनays), इस काम vestibular संवेदी उपकला में mitochondrial समारोह में सुधार करने के लिए पर्याप्त हो सकता है अकेले NIR पता चलता है। Vestibular बाल सेल समारोह में सुधार करने के लिए चिकित्सा की कोई उपलब्ध, सस्ती, गैर आक्रामक तरीके वहाँ वर्तमान में कर रहे हैं, बाहरी NIR विकिरण के आवेदन vestibular संवेदी उपकला inthe सेलुलर चयापचय पर उम्र बढ़ने के प्रभाव प्रतिक्रिया करने के लिए एक संभावित रणनीति प्रदान करता है।

Introduction

संतुलन प्रदर्शन घटता है और बाद में गिर जाता है आम हैं, और प्राकृतिक उम्र बढ़ने की एक का दुर्भाग्य से अक्सर परिभाषित करने सुविधाएँ। इस गिरावट का प्रभाव शारीरिक और सामाजिक दोनों हो सकता है, और काफी बड़े लोगों के लिए जीवन की गुणवत्ता को कम कर देता है सकते हैं। जवाब में, भौतिक चिकित्सा और पुनर्वास फॉल्स में अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है, लेकिन दोहराया फॉल्स के प्रसार में लगातार कमी के साथ जुड़े नहीं किया गया है। एक ही समय में, काम परिधीय या केंद्रीय vestibular प्रणाली (संतुलन बनाए रखने के लिए जिम्मेदार प्रणाली) दुर्लभ है, और इन प्रणालियों को लक्षित संभावित चिकित्सीय रणनीतियों में परिवर्तन और सीमित असंतुलन के मूल कारणों की जांच।

उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन 2-4, अल्जाइमर रोग मॉडल 5-8, और पार्किंसंस रोग 9-12 सहित उम्र जुड़े neurodegenerative विकारों पर हाल ही में काम एसआई की न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव से पता चला हैनिकट अवरक्त (NIR) प्रकाश की mple गैर इनवेसिव आवेदन। इसके अलावा, vestibular प्रणाली में, NIR विट्रो 13 में vestibular प्राथमिक अभिवाही न्यूरॉन्स की गतिविधियों को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया है। NIR प्रकाश की व्यवस्था के साथ अच्छी तरह से समझ नहीं है, NIR का उपयोग करते हुए ज्यादातर अध्ययनों NIR सेलुलर चयापचय की सुविधा के लिए माइटोकॉन्ड्रिया जटिल चतुर्थ (साइटोक्रोम ग ओक्सीडेस) 14-17 को उत्तेजित करता है कि सुझाव दिया है। Vestibular संवेदी उपकला में टाइप मैं बालों की कोशिकाओं की subcuticular थाली माइटोकॉन्ड्रिया 18 में घना है और इस तरह के रूप में चिकित्सीय NIR इलाज के लिए कार्रवाई की एक साइट का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं।

इधर, transcranially का एक संक्षिप्त, गैर इनवेसिव उपचार शासन सेलुलर चयापचय को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (और निहितार्थ, mitochondrial समारोह) के द्वारा माउस vestibular संवेदी उपकला में वर्णित है कि NIR आवेदन किया। इसके अलावा चर्चा की vestibular संवेदी उपकला की तैयारी है और यह NIR एक ubiquito की अभिव्यक्ति बढ़ जाती है कि दिखाया गया हैहमें एंटी ऑक्सीडेंट संवेदी उपकला में (superoxide dismutase 1) - पहले से कोक्लीअ बाल सेल अस्तित्व 19 के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

आचार कथन: नीचे उल्लिखित सभी प्रक्रियाओं सिडनी पशु आचार समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. पशु

नोट: एक और 8-9 महीने पुराने चूहों (C57 / BL6) पशु संसाधन केन्द्र (पर्थ, ऑस्ट्रेलिया) से प्राप्त किया गया। चूहे सिडनी विश्वविद्यालय में बॉश कृंतक सुविधा में रखे गए थे।

  1. भोजन और पानी यथेच्छ के उपयोग के साथ एक 12/12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर मानक माउस पिंजरों में सदन चूहों।
  2. निकट अवरक्त में प्रत्येक आयु वर्ग में विभाजित चूहों (NIR) में इलाज, या दिखावा तुलना के लिए (नियंत्रण) समूहों का इलाज किया।

2. पास इन्फ्रारेड (NIR) विकिरण और शाम उपचार

  1. इलाज के शासन के पूरा होने से पहले बालों का त्वरित पुनर्वृद्धि को रोकने के लिए निकट के रूप में संभव के रूप में एक बिजली के रेजर के साथ माउस के सिर और गर्दन क्षेत्र पर फर दाढ़ी। चूहों के रोगज़नक़ मुक्त स्थिति को बनाए रखने के क्रम में, 70% इथेनॉल का उपयोगहजामत बनाने का काम जानवरों और अलग पिंजरों से पशुओं के बीच F10 के पशु चिकित्सा कीटाणुनाशक के बीच उपकरणों को साफ करने के लिए। पशुओं पर संभाला नहीं कर रहे हैं, ताकि इलाज की शुरुआत करने के लिए 3 दिन पहले - इस 2 मत करो।
  2. पूंछ के समीपस्थ अंत धारण करके माउस सीमित रखें और झूठे परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकता है जो तनाव को कम करने के रूप में तो यह एक हाथ या बेंच शीर्ष की हथेली में आराम करने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. एलईडी NIR (670 एनएम) (प्रकाश उत्सर्जक डायोड) 1 डिवाइस पकड़ो - 2 सेमी दूर उजागर (मुंडा) क्षेत्र से और 90 सेकंड (चित्रा 1 ए) के लिए डिवाइस पर स्विच।
    नोट: 90 सेकंड निवेश का एक परिणाम के रूप में तापमान परिवर्तन पानी की 100 मिलीलीटर में 0.2 डिग्री सेल्सियस <रूप में मापा गया था।
  4. पशुओं के कृत्रिम उपचार समूह के लिए 2.3 लेकिन डिवाइस बंद (चित्रा 1 बी) छोड़ - दोहराएँ 2.2 कदम।
  5. जानवरों के NIR अवरुद्ध उपचार समूह के लिए 2.3 लेकिन एल्यूमीनियम पन्नी के साथ डिवाइस को कवर - दोहराएँ 2.2 कदम।
  6. Approximat में दैनिक 2.5 - दोहराएँ 2.2 कदमोंलगातार 5 दिनों के लिए ई 24 घंटा के अंतराल।
  7. पांचवें दिन के बाद इलाज पर दोनों कानों से vestibular संवेदी उपकला (3 cristae और एक utricular मैक्युला) निकाल (नीचे धारा 3 देखें)।

3. ऊतक निष्कर्षण 20

  1. 26 3 NaHCO, 11 ग्लूकोज, 250 ग्लिसरॉल, 2.5 KCl, 1.2 नाह 2 पीओ 4, 1.2 2 MgCl, और 2.5 2 CaCl: (मिमी में) से मिलकर एक ग्लिसरॉल आधारित कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के 300 मिलीलीटर तैयार करें। 2 CaCl के अलावा करने से पहले, 7.4 का पीएच स्थापित करने और कैल्शियम वर्षा (बादल) से बचने के लिए carbogen (95% ओ 2 और 5% सीओ 2) के साथ समाधान गैस। एक बर्फ घोल का गठन किया गया है ताकि 45 मिनट के लिए एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में समाधान टेंशन मत लो।
  2. लेबल वाले पेंच शीर्ष microtubes में शाही सेना अलगाव lysis बफर तैयार करें (lids के पॉपिंग बंद हो जाता है जब फ्रीज और तरल नाइट्रोजन में विगलन के बीच ट्यूब दबाव परिवर्तन) के अनुसारनिर्माता या सामान्य प्रयोगशाला प्रथाओं के निर्देशों के। एक एल्यूमीनियम देवर कुप्पी में तरल नाइट्रोजन के लिए तैयार है।
    नोट: तरल नाइट्रोजन से निपटने जब सुरक्षात्मक कपड़े और eyeware के लिए उपयोग करें। अपनी गैस फार्म की मात्रा लगभग अपने तरल रूप से 700 गुना ज्यादा है और asphyxiation पैदा कर सकता है के रूप में तरल नाइट्रोजन एक अच्छी तरह हवादार कमरे में प्रयोग किया जाता है सुनिश्चित करें।
  3. गहराई से एक अंतर-पेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से ketamine (400 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ चूहों चतनाशून्य। हिन्द-अंग पलटा पूरी तरह से चूहों पूरी तरह से anesthetized हैं कि संकेत के रूप में कम करने के लिए अनुमति दें।
  4. तेज स्टेनलेस स्टील कैंची के साथ चूहों सिर काटना और एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर खोपड़ी के बाण के समान त्वचा के साथ एक चीरा बनाने (# 22 गोल)। इस बिंदु पर है और भर में 3.5 कदम - 3.9, ऊतक से अधिक ठंडा ACSF की नियमित रूप से आवेदन के द्वारा ही संभव के रूप में के रूप में अच्छा कपाल वॉल्ट, मस्तिष्क, और अंतर्निहित वेस्टिब्युलर तंत्र रहते हैं।
  5. एक smal बनाने के मानक स्वरूप कैंची की उठाई हाथ का उपयोगएल लैम्ब्डा पर खोपड़ी में चीरा और बाण के समान सीवन के साथ काटा।
  6. धीरे मस्तिष्क घसीट बिना हड्डी के अवर सतह के लिए संभव के रूप में बंद ब्लेड रखने पार्श्विका हड्डी के नीचे एक उथले Rongeurs के एक हाथ स्लाइड। सुरक्षित और मस्तिष्क सामने आ रहा है जब तक पीछे पार्श्व पार्श्विका हड्डी और पश्चकपाल हड्डी दूर खींच।
  7. एक छोटे से स्टेनलेस स्टील रंग का प्रयोग करें और vestibulocochlear तंत्रिका (सीएन आठवीं) को बेनकाब करने के लिए दूर पूर्वकाल और मध्य कपाल खात से मस्तिष्क उठा। सीधे vestibular बालों की कोशिकाओं अंदर आना कि प्राथमिक अभिवाही एक्सोन पर अनावश्यक तनाव को रोकने के लिए तंत्रिका आड़ा काट।
  8. सीएन आठवीं की transection के बाद पूर्ण में मस्तिष्क निकालें।
  9. कोक्लीअ और मध्य कपाल खात में परिधीय vestibular अंगों से युक्त बोनी भूलभुलैया का निरीक्षण करें। प्रत्येक बोनी भूलभुलैया के पास दो छोटे चीरों बनाओ और पूर्वकाल अर्धवृत्ताकार नहर पकड़ रहा है और बाद में खींच कर पूरे ढांचे को आबकारीसहयोगी।
  10. इसके तत्काल बाद लगातार carbogen साथ perfusing जबकि (3.1 कदम के रूप में वर्णित) ठंडा ACSF समाधान युक्त विदारक डिश में excised लेबिरिंथ विसर्जित कर दिया।
  11. एक stereomicroscope के तहत, कोक्लीअ द्वारा भूलभुलैया नीचे पकड़ और संदंश के साथ पकवान के नीचे करने के लिए इसे सुरक्षित।
    1. पूर्वकाल अर्धवृत्ताकार नहर (एसएससी) कलसा से ऊपर की हड्डी में एक छोटे से खोलने खरोंच करने के लिए सीधे ठीक संदंश का प्रयोग करें।
    2. धीरे तुरंत हड्डी के नीचे तक पहुंच गया और बाहर दूर कलसा से flicking द्वारा इस खोलने बढ़ाना। उद्घाटन में संदंश धक्का और नीचे कमजोर झिल्लीदार भूलभुलैया नुकसान नहीं करने के लिए यहाँ सावधानी बरतें। यूट्रिकल, पूर्वकाल और पार्श्व एम्पुली सब उजागर कर रहे हैं जब तक इस फैशन में जारी है। यदि संभव हो तो भी पीछे कलसा हटा दें।
  12. ठीक संदंश का प्रयोग, धीरे यूट्रिकल उठा और वे पूरी तरह से अलग कर रहे हैं जब तक बोनी भूलभुलैया से दूर एम्पुली। जहां संभव हो, उन्हें पकड़उनके संबद्ध semicircular नहरों द्वारा संवेदी उपकला को नुकसान पहुँचाए से बचने के लिए। कुछ मामलों में, अर्द्धवृत्ताकार झिल्लीदार वाहिनी के समीपस्थ हिस्सा हड्डी से एम्पुली जारी करने के लिए आईरिस कैंची से काट होना पड़ सकता है।
  13. सुरक्षित रूप से 3.2 कदम में पहले तैयार lysis बफर में संदंश की नोक और जगह के बीच vestibular अंगों समझ। धीरे vestibular अंगों संदंश से अलग है सुनिश्चित करने के लिए बफर में चारों ओर संदंश ज़ुल्फ़। इस stereomicroscope के तहत संदंश लाकर मामला है की जाँच करें।
    1. सूक्ष्मनलिका ढक्कन पर पेंच और तुरंत तरल नाइट्रोजन में नमूना फ्रीज।

4. शाही सेना निष्कर्षण और आरटी पीसीआर

  1. निर्माता के निर्देशों या वरीय प्रयोगशाला प्रोटोकॉल के अनुसार मैसेंजर आरएनए (mRNA) निष्कर्षण के मानक तरीकों का पालन करें।
    नोट: mRNA की छोटी पैदावार को अलग-थलग करने में मदद करने के लिए वाहक RNAs उपयोग किया है कि एक वाणिज्यिक किट इस में इस्तेमाल किया गया थाप्रोटोकॉल। लोअर क्षालन संस्करणों mRNA की अंतिम सांद्रता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: नकारात्मक "कोई एंजाइम" नियंत्रण (एनईसीएस) और "कोई डीएनए टेम्पलेट" नियंत्रण (NTCs) भी मनाया प्रभाव की वैधता सुनिश्चित करने के लिए पूरा किया जाना चाहिए।
  2. लक्ष्य जीन 21-23 की पूरक डीएनए (सीडीएनए) और प्रवर्धन के लिए mRNA की रिवर्स प्रतिलेखन के मानक तरीकों को लागू करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

युवा में NIR उपचार के प्रभाव (4 सप्ताह) और पुराने की तुलना करने के लिए - चूहों (8 9 महीने) हम (एन = 20) (एन = 16) युवा में एंटीऑक्सीडेंट superoxide dismutase 1 (वतन-1) की अभिव्यक्ति मापा और पुराने नकली इलाज, NIR इलाज, या NIR-अवरुद्ध किया गया कि चूहों। चित्रा 2 जवान नकली इलाज जानवरों की तुलना में NIR इलाज युवा पशुओं में अधिक से अधिक 2 गुना की β-actin के सामान्यीकृत वतन-एक अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि से पता चलता है (पी <0.01) और युवा NIR अवरुद्ध जानवर (पी <0.01)। पुराने NIR इलाज जानवरों को भी अधिक से अधिक एक अप-विनियमन 2 गुना वतन-1 के पुराने NIR अवरुद्ध जानवर (पी <0.05) के साथ तुलना में जब से पता चला है।

चित्र 1
1. NIR उपचार चित्रा। विकिरण trea में लगातार 5 दिनों के लिए प्रति दिन 90 सेकंड के लिए माउस के सिर पर 2 सेमी मुंडा क्षेत्र के ऊपर - (क) NIR 1 आयोजित डिवाइस एलईडीटेड चूहों। (बी) NIR उसी तरह से है, लेकिन 90 सेकंड की अवधि के लिए बंद कर दिया डिवाइस के साथ नकली इलाज चूहों के ऊपर आयोजित डिवाइस का नेतृत्व किया। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
NIR उपचार के लगातार 5 दिनों के बाद वतन-एक जीन की अभिव्यक्ति की चित्रा 2. विश्लेषण (90 सेकंड / दिन)। Vestibular संवेदी उपकला आरटी पीसीआर प्रयोग करने के लिए जांच की पांचवें दिन और विशिष्ट एंटीऑक्सीडेंट जीन पर काटा गया था। वतन -1 जीन β-actin के लिए ImageJ v1.48 का उपयोग किया आधारभूत और densitometry सामान्यीकृत था। साथ तुलना में जब वतन-एक अभिव्यक्ति की अहम अप-विनियमन (पी <0.01) युवा NIR इलाज पशुओं में मनाया गया दोनों युवा दिखावा इलाज और युवा NIR अवरुद्ध नियंत्रण (4 सप्ताह)। उल्लेखनीय वृद्धि (पी एंड# 60; 9 माह) - पुराने NIR अवरुद्ध जानवर (8 के साथ तुलना में जब वतन-एक अभिव्यक्ति में 0.05) भी NIR इलाज बड़े पशुओं में मनाया गया। सभी रेखांकन युवा नकली इलाज नियंत्रण की तुलना में वतन-एक जीन की अभिव्यक्ति के गुना परिवर्तन दिखा। डाटा एसडी ± मतलब का प्रतिनिधित्व करता है। सभी डेटा एक तरह से एनोवा का उपयोग कर विश्लेषण किया गया और सांख्यिकीय महत्व पद-हॉक परीक्षण Tukey के कई तुलना का उपयोग करके निर्धारित। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहाँ वर्णित प्रतिनिधि परिणाम NIR प्रकाश का संक्षिप्त Transcranial वितरण (5 दिनों के लिए 90 सेकंड / दिन) नकली इलाज चूहों की तुलना में बड़े चूहों में एंटीऑक्सीडेंट अभिव्यक्ति के स्तर को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है कि पता चलता है। NIR द्वारा उत्सर्जित गर्मी की हमारी माप उपकरण <0.2 डिग्री सेल्सियस सेकंड 90 से अधिक था एलईडी, और इस तरह के रूप में पैदा करने के लिए की संभावना नहीं है - उत्सर्जित गर्मी माइटोकॉन्ड्रियल और / या न्यूरोनल सक्रियण के एक स्रोत का प्रतिनिधित्व कर सकता है, जबकि चूहे vestibular के लिए रिपोर्ट के रूप में 24 afferents परिवर्तन यहाँ वर्णित है। रिपोर्ट ऊपर डाला विपरीत इसके अलावा, यहां इस्तेमाल किया, NIR उपचार संवेदी उपकला या vestibular अभिवाही न्यूरॉन्स के लिए सीधे लागू नहीं किया गया था, और इस तरह के रूप में भी थर्मो संवेदनशील चैनलों (उदाहरण के लिए, TRPV4) पर असर की संभावना नहीं है। अंत में, अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में एक ही NIR डिवाइस का उपयोग कर पिछले काम गर्मी मनाया मतभेद 7,9 के स्रोत नहीं था कि सुझाव दिया है।

इन resu जबकिएलटीएस आनुवंशिक स्तर पर उम्र जुड़े oxidative तनाव के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक अप-विनियमन दिखाने के लिए, यह है कि वे चूहों के समग्र संतुलन प्रदर्शन में परिलक्षित होते हैं कि क्या इन परिवर्तनों के आगे, महत्वपूर्ण प्रोटीन के स्तर पर व्यक्त की, या कर रहे हैं कि क्या स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, अप-विनियमन एक भी सर्वव्यापक एंटी ऑक्सीडेंट के लिए दिखाया गया है। यह सेलुलर चयापचय के कई मार्करों इस इलाज के शासन से प्रभावित हैं कि संभावना है। इसके अलावा, mRNA के (यानी, बालों की कोशिकाओं का समर्थन कोशिकाओं, vestibular afferents और उपकला सभी उपस्थित) यह एक विशिष्ट vestibular बालों के लिए NIR प्रकाश उपचार के जवाब में सेलुलर चयापचय में मनाया परिवर्तन से संबंधित करना संभव नहीं है Toto में वेस्टिब्युलर तंत्र से निकाला गया था के बाद से सेल या प्राथमिक अभिवाही प्रकार। महत्वपूर्ण बात है, हालांकि वर्णित तैयारी पर्याप्त mRNA का उपयोग कर सेलुलर चयापचय और संतुलन perfo के व्यवहार विश्लेषण के बीच भविष्य के correlative पढ़ाई की अनुमति के लिए एक माउस से निकाला जा सकता हैrmance।

यहां इस्तेमाल उच्च तीव्रता एलईडी डिवाइस लगभग 5 जम्मू / सेमी 5 दिन से अधिक ऊर्जा की 25 जम्मू कुल 2 सेकंड 90 प्रति उपचार का उत्सर्जन करता है। (Nir सहित) लंबे तरंगदैर्ध्य के प्रकाश के उपयोग का लाभ अंतर्वेधन है, यह NIR प्रकाश की पूर्ण 25 जम्मू vestibular संवेदी उपकला के लिए दिया जाता है कि ग्रहण नहीं किया जा सकता। माउस में, प्रकाश परिधीय vestibular तंत्र और मस्तिष्क की रक्षा कि कोमल ऊतक और हड्डी की परतों के माध्यम से कम से कम 1 मिमी घुसना चाहिए। मनुष्यों में इस सेंटीमीटर तक फैली हुई है। इस प्रकार प्रकाश का अंतर्वेधन नैदानिक ​​सेटिंग में NIR प्रकाश उपचार रणनीतियों के अनुवाद के संबंध में वर्णित तकनीक की एक सीमा का प्रतिनिधित्व करता है। हाल ही में काम हालांकि बेसल ganglia 25, और कोक्लीअ 26 सहित संवेदी अंगों सहित गहरी मस्तिष्क संरचना को NIR प्रकाश देने के लिए ऑप्टिकल फाइबर कार्यरत है। इस के आधार पर करने के लिए और परिधीय vestibular तंत्र के स्थान आसन्नसदृश एक कोक्लीअ प्रत्यारोपण 27 - कोक्लीअ (और कर्णमूल प्रक्रिया के माध्यम से इसे करने के लिए नैदानिक ​​पहुँच), यह मानव में, vestibular संवेदी उपकला के प्रत्यक्ष उत्तेजना एक बाहरी उपकरण से चालू होने वाले एक छोटे से ऑप्टिकल फाइबर के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है सुझाव है कि संभव है ।

कई शर्तों अन्वेषक के हित के लिए अनुकूल करने के लिए ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, तरंग दैर्ध्य यहां इस्तेमाल (670 एनएम) पहले से अन्य संवेदी प्रणाली और पशु मॉडल के रूप में रिपोर्ट अवरक्त रेंज में अब तरंगदैर्य शामिल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। दूसरा, उपचार व्यवस्थाओं भी अल्पकालिक या दीर्घकालिक प्रतिक्रिया प्रश्न में है के आधार पर अलग किया जा सकता है। यहाँ एक बहुत ही संक्षिप्त इलाज के शासन का उपयोग किया गया था, लेकिन इस NIR प्रेरित परिवर्तन की गतिशीलता को मापने के लिए अब durations, या भी कम durations के लिए बढ़ाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के मुख्य चुनौती ऊतक की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए हैऊतक निष्कर्षण के दौरान। बोनी भूलभुलैया को हटा दें और इसे से झिल्लीदार भूलभुलैया आबकारी करने के लिए आवश्यक समय को देखते हुए यह चयापचय टूटने कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंडा aCSF में ऊतक स्नान और carbogen साथ लगातार इस समाधान perfusing द्वारा हासिल की है। इसके अलावा, विच्छेदन प्रक्रिया के अंत में, आगे ऊतक गिरावट निकाले ऊतक फ्रीज फ्लैश करने के लिए तरल नाइट्रोजन का उपयोग के साथ रुका जा सकता है। जब उचित हो, जमे हुए ऊतक thawed और mRNA आगे जीन विश्लेषण के लिए निकाला जा सकता है।

यहाँ वर्णित विधियों vestibular संवेदी उपकला में सेलुलर चयापचय पर NIR प्रकाश उपचार का पूरा प्रभाव का वर्णन नहीं है हालांकि, इस रणनीति के आगे आवेदन mitochondrial समारोह 28,29 और / या सेलुलर चयापचय के अन्य उम्र जुड़े मार्करों शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है ऐसे हाइपोक्सिया के रूप में 30 अपमान। अंततः, क्षमता वी वर्णन करने के लिएएक व्यक्ति माउस के estibular सेलुलर चयापचय प्रोफ़ाइल उम्र बढ़ने के दौरान संतुलन प्रदर्शन और subcellular प्रक्रियाओं के बीच परस्पर संबंधों की जांच, और NIR उपचार सहित चिकित्सा के प्रभाव की अनुमति देगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा।

Acknowledgements

लेखकों mRNA के निष्कर्षण और पीसीआर के साथ उनकी सहायता के लिए डॉ पॉल witting और सुश्री Genevieve फोंग स्वीकार करना चाहते हैं, और समर्थन के लिए गार्नेट गायब हो चुकी है और रॉडने विलियम्स मेमोरियल फाउंडेशन।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantum WARP 10 Quantum Devices 2070N030-A
Screw top microtubules Quality Scientific Plastics 520-GRD-Q
Ketamine Parnell, Alexandria Australia
Standard pattern scissors FST 14001-12
Carbon steel surgical blades #22 Livingstone SBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeurs FST 16221-14
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Dumont #5 SF forceps FST 11252-00
Isolate II RNA Micro Kit Bioline BIO-52075

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agrawal, Y., Carey, J. P., Della Santina,, C, C., Schubert, M. C., Minor, L. B. Disorders of balance and vestibular function in US adults: data from the National Health and Nutrition Examination Survey, 2001-2004. Archives of internal medicine. 169, 938-944 (2009).
  2. Bessho, K., et al. Effect of subthreshold infrared laser treatment for drusen regression on macular autofluorescence in patients with age-related macular degeneration. Retina. 25, 981-988 (2005).
  3. Olk, R. J., et al. Therapeutic benefits of infrared (810-nm) diode laser macular grid photocoagulation in prophylactic treatment of nonexudative age-related macular degeneration: two-year results of a randomized pilot study. Ophthalmology. 106, 2082-2090 (1999).
  4. Rodanant, N., et al. Predictors of drusen reduction after subthreshold infrared (810 nm) diode laser macular grid photocoagulation for nonexudative age-related macular degeneration. American journal of ophthalmology. 134, 577-585 (2002).
  5. De Taboada, L., et al. Transcranial laser therapy attenuates amyloid-beta peptide neuropathology in amyloid-beta protein precursor transgenic mice. Journal of Alzheimer's disease : JAD. 23, 521-535 (2011).
  6. Grillo, S. L., Duggett, N. A., Ennaceur, A., Chazot, P. L. Non-invasive infra-red therapy (1072 nm) reduces beta-amyloid protein levels in the brain of an Alzheimer's disease mouse model. TASTPM. Journal of photochemistry and photobiology. B, Biology. 123, 13-22 (2013).
  7. Purushothuman, S., Johnstone, D. M., Nandasena, C., Mitrofanis, J., Stone, J. Photobiomodulation with near infrared light mitigates Alzheimer's disease-related pathology in cerebral cortex - evidence from two transgenic mouse models. Alzheimer's researc., & therapy. 6, 2 (2014).
  8. Sommer, A. P., et al. 670 nm laser light and EGCG complementarily reduce amyloid-beta aggregates in human neuroblastoma cells: basis for treatment of Alzheimer's disease. Photomedicine and laser surgery. 30, 54-60 (2012).
  9. Moro, C., et al. Photobiomodulation preserves behaviour and midbrain dopaminergic cells from MPTP toxicity: evidence from two mouse strains. BMC neuroscience. 14, 40 (2013).
  10. Peoples, C., et al. Photobiomodulation enhances nigral dopaminergic cell survival in a chronic MPTP mouse model of Parkinson's disease. Parkinsonis., & related. 18, 469-476 (2012).
  11. Shaw, V. E., et al. Neuroprotection of midbrain dopaminergic cells in MPTP-treated mice after near-infrared light treatment. The Journal of comparative neurology. 518, 25-40 (2010).
  12. Ying, R., Liang, H. L., Whelan, H. T., Eells, J. T., Wong-Riley, M. T. Pretreatment with near-infrared light via light-emitting diode provides added benefit against rotenone- and MPP+-induced neurotoxicity. Brain research. 1243, 167-173 (2008).
  13. Rajguru, S. M., et al. Infrared photostimulation of the crista ampullaris. The Journal of physiology. 589, 1283-1294 (2011).
  14. Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
  15. Desmet, K. D., et al. Clinical and experimental applications of NIR-LED photobiomodulation. Photomedicine and laser surgery. 24, 121-128 (2006).
  16. Huang, Y. Y., Chen, A. C., Carroll, J. D., Hamblin, M. R. Biphasic dose response in low level light therapy. Dose-response : a publication of International Hormesis Society. 7, 358-383 (2009).
  17. Rojas, J. C., Gonzalez-Lima, F. Low-level light therapy of the eye and brain. Eye and brain. 3, 49-67 (2011).
  18. Vranceanu, F., et al. Striated organelle, a cytoskeletal structure positioned to modulate hair-cell transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4473-4478 (2012).
  19. Johnson, K. R., et al. Separate and combined effects of Sod1 and Cdh23 mutations on age-related hearing loss and cochlear pathology in C57BL/6J mice. Hearing research. 268, 85-92 (2010).
  20. Tung, V. W., Di Marco, S., Lim, R., Brichta, A. M., Camp, A. J. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. Journal of visualized experiments : JoVE. e50471 (2013).
  21. Kirby, J., Menzies, F. M., Cookson, M. R., Bushby, K., Shaw, P. J. Differential gene expression in a cell culture model of SOD1-related familial motor neurone disease. Human molecular genetics. 11, 2061-2075 (2002).
  22. Parry, S. N., Ellis, N., Li, Z., Maitz, P., Witting, P. K. Myoglobin induces oxidative stress and decreases endocytosis and monolayer permissiveness in cultured kidney epithelial cells without affecting viability. Kidney and Blood Pressure Research. 31, 16-28 (2008).
  23. Saee-Rad, S., et al. Analysis of superoxide dismutase 1, dual-specificity phosphatase 1, and transforming growth factor, beta 1 genes expression in keratoconic and non-keratoconic corneas. Molecular vision. 19, 2501-2507 (2013).
  24. Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. Journal of neurophysiology. 107, 3227-3234 (2012).
  25. Moro, C., et al. Photobiomodulation inside the brain: a novel method of applying near-infrared light intracranially and its impact on dopaminergic cell survival in MPTP-treated mice. Journal of neuroscience. 120, 670-683 (2014).
  26. Moreno, L. E., et al. Infrared neural stimulation: beam path in the guinea pig cochlea. Hearing research. 282, 289-302 (2011).
  27. Curthoys, I. S. A red thread as a guide in the vestibular labyrinth. The Journal of physiology. 589, 1241-1241 (2011).
  28. Chakrabarti, S., et al. Mitochondrial Dysfunction during Brain Aging: Role of Oxidative Stress and Modulation by Antioxidant Supplementation. Aging and disease. 2, 242-256 (2011).
  29. Petrosillo, G., De Benedictis, V., Ruggiero, F. M., Paradies, G. Decline in cytochrome c oxidase activity in rat-brain mitochondria with aging. Role of peroxidized cardiolipin and beneficial effect of melatonin. Journal of bioenergetics and biomembranes. 45, 431-440 (2013).
  30. Zhu, H., Sun, A., Zou, Y., Ge, J. Inducible metabolic adaptation promotes mesenchymal stem cell therapy for ischemia: a hypoxia-induced and glycogen-based energy prestorage strategy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 34, 870-876 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics