近红外(NIR)光增加线粒体功能的标志物的表达,在鼠标前庭上皮细胞

1Discipline of Physiology, University of Sydney, 2Discipline of Biomedical Science, University of Sydney
Published 3/14/2015
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Biology

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Summary

线粒体功能障碍是细胞衰老的标志。本文使用的非侵入性的近红外(NIR)处理,以改善在老化小鼠前庭感觉上皮线粒体功能。

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Zhang, L., Tung, V. W., Mathews, M., Camp, A. J. Near Infrared (NIr) Light Increases Expression of a Marker of Mitochondrial Function in the Mouse Vestibular Sensory Epithelium. J. Vis. Exp. (97), e52265, doi:10.3791/52265 (2015).

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Abstract

策略随着年龄的增加衰减下降平衡功能主要是专注于物理疗法,包括平衡工作和锻炼。然而,这些方法没有解决平衡下降的根本原因。使用小鼠,近红外光(NIR)的细胞上,在前庭感觉上皮的代谢的影响进行了评估。收集的数据表明,这种简单和安全的干预可能保护这些脆弱的细胞从自然老化的有害影响。的mRNA从分离的前庭外周感觉上皮(壶腹嵴和椭圆囊斑)萃取,随后转录成cDNA文库。这个库然后探查无处不抗氧化剂(SOD-1)的表达。抗氧化剂的基因表达,然后用于量化细胞代谢。用年轻的经颅交付NIR(4周)及以上(8 - 9个月)小鼠,并简要治疗方案(90秒/天5天AYS),这项工作表明NIR单独可足以改善线粒体功能的前庭感觉上皮。由于目前没有可用的,负担得起的,非侵入性的治疗方法,提高前庭毛细胞功能,外部NIR辐射的应用程序提供,以抵消对细胞在矿井前庭感觉上皮代谢老化的影响,潜在的战略。

Introduction

余额递减性能和后续的瀑布是常见的,而自然老化1的不幸往往定义功能。这种下降的影响,既可以是自然和社会,和显著降低生活质量的老年人。作为回应,物理治疗和康复一直是研究的重点为瀑布,但尚未有一致的减少重复跌倒的发生率有关。与此同时,工作调查在周边或中央前庭系统(负责保持平衡的系统)是稀少,并且针对这些系统的潜在的治疗策略的变化和不平衡有限的根本原因。

在年龄相关的神经变性病症,包括年龄相关性黄斑变性2-4,阿耳茨海默氏病模型5-8,和帕金森氏病9-12最近的工作已经表明SI的神经保护作用mple非侵入性的应用的近红外(NIR)光。另外,在前庭系统,NIR已被用于提高在体外 13前庭初级传入神经 ​​元的活性。而没有很好理解NIR光的机构,利用NIR大多数的研究表明,NIR刺激线粒体复合物IV(细胞色素C氧化酶)14-17,以促进细胞代谢。在前庭感觉上皮I型毛细胞的表皮下板是致密的线粒体18,因此可以代表用于治疗NIR治疗作用的部位。

这里,经颅的简要的,非侵入性的治疗方案应用于NIR可用于测量细胞代谢(和暗示线粒体功能)在小鼠前庭感觉上皮进行说明。还讨论了为制备的前庭感觉上皮和它表明NIR增加一个ubiquito的表达我们的抗氧化剂(超氧化物歧化酶1)中的感觉上皮-先前证明是对耳蜗毛细胞存活19重要。

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Protocol

伦理学声明:下面列出的所有程序批准了悉尼动物伦理委员会的大学。

1.动物

注:1和8 - 9个月大的小鼠(C57 / BL6)是从动物资源中心(珀斯,澳大利亚)中获得。老鼠被安置在博世灭鼠设施,在悉尼大学。

  1. 家鼠在上一个12/12小时亮/暗循环以获得食物和水随意标准鼠标笼中。
  2. 鸿沟小鼠各年龄组为近红外(NIR)治疗,或假处理(对照)组进行比较。

2.近红外(NIR)照射及深水治疗

  1. 剃鼠标的头部和颈部区域的毛皮用电动剃刀尽可能防止头发快速再生完成治疗方案的前。为了保持小鼠的无病原体状态,使用70%的乙醇剃须动物,并从不同的笼子里的动物之间的F10兽用消毒剂清洗之间的乐器。这样做2 - 3天前开始治疗等动物不是过度处理。
  2. 抑制小鼠握住尾部的近端,并允许它在用一只手或台式手掌放松,以便尽量减少应力,这可能会导致错误的结果。
  3. 持有NIR(670 nm)的LED(发光二极管)器件1 - 2厘米的距离暴露(光头)区和开关设备上的90秒( 图1A)。
    注意:温度变化的90秒曝光结果测定为<0.2℃下在100毫升的水中。
  4. 对于假治疗组动物的2.3,但离开该装置关闭( 图1B) -重复步骤2.2。
  5. 重复步骤2.2 - 2.3对NIR阻断治疗组的动物,但覆盖器件有铝箔。
  6. 每天approximat 2.5 - 重复步骤2.2E 24小时的间隔,连续5天。
  7. 提取两个耳朵上的第五天后处理前庭感觉上皮(3嵴和1个椭圆囊斑)(见下文第3节 )。

3.组织提取20

  1. 制备300毫升基于甘油的人工脑脊液(ACSF)的组成(以mM计):26的NaHCO 3,11葡萄糖,250甘油,2.5氯化钾,1.2的NaH 2 PO 4,1.2的MgCl 2,和2.5 氯化钙 。在加入氯化钙 ,燃气与卡波金(95%O 2和5%CO 2)的溶液来建立的pH为7.4,并避免钙沉淀(混浊)。寒意在-80℃冷冻该溶液45分钟,以使冰浆料形成。
  2. 准备在标螺杆顶端微管的RNA分离裂解缓冲液(停止盖子的爆裂时冻结和解冻在液氮之间管压力的变化),根据制造商或通常的做法实验室的指示。有液氮准备在铝杜瓦瓶中。
    注:液氮操作时,使用的防护服和eyeware。确保使用液氮在一个通风良好的房间作为其气体形式的体积大约是700倍,它的液体形式,并可能导致窒息。
  3. 通过腹膜内注射深深地麻醉小鼠用氯胺酮(400毫克/千克)。允许后肢反射完全消退作为指示小鼠完全麻醉。
  4. 杀头的小鼠用锋利的不锈钢剪刀,并沿着用刀片头骨的矢状皮肤切口(四舍五入#22)。在这一点上和整个步骤3.5 - 3.9,保持颅,脑和潜在的前庭器官尽可能凉爽通过在组织常规应用冰冷学联的。
  5. 使用标准模式剪刀尖手臂做出SMaL公司升切口头骨的Lambda和沿矢状缝切割。
  6. 轻轻滑动的浅表骨钳一个臂顶骨保持刀片尽可能接近到骨头的下表面,而不拖动大脑下方。安全和扯远了顶骨横向和枕骨后部,直到大脑暴露。
  7. 用一个不锈钢小铲子和解除大脑远离前部和中颅窝暴露前庭耳蜗神经(CN八)。横切神经以防止在该初级传入轴突直接支配前庭毛细胞不必要的紧张。
  8. CN八横断后取出大脑全盘
  9. 观察含耳蜗和中颅窝周围前庭器官的骨迷路。让两个小切口,每个骨迷路旁边,握住前半规管和后拉切除整个结构盟友。
  10. 立即浸入切除迷宫中含有冰冷ACSF溶液(如在步骤3.1中所述),同时连续地卡波金灌注解剖盘中。
  11. 在立体显微镜下,按住迷宫由耳蜗并将其固定钳盘的底部。
    1. 直接使用细镊子划伤小开在上面的前半规管(SSC)壶腹骨。
    2. 轻轻达到立即骨下方,向外弹离壶腹放大此开幕。谨慎行事这里没有推入钳开放和破坏脆弱的膜迷路下方。继续以这种方式,直到椭圆囊,前部和侧壶腹都暴露出来。如果可能的话删除后壶腹也。
  12. 用细镊子,轻轻抬起囊,并从骨迷路壶腹距离,直到他们完全不沾边。如果可能的话,他们持有由它们相关联的半规管,以避免损坏感觉上皮。在一些情况下,半圆形膜质导管的近端部分可能需要与虹膜剪切以从骨释放壶腹。
  13. 牢固地抓住镊子的顶端和地点之间的前庭器官到先前在步骤3.2中制备的裂解缓冲液。轻轻绕摇动镊子在缓冲,以确保前庭器官已经从钳子脱离。检查,这是通过使钳子的立体显微镜下的情况。
    1. 拧上微管盖,并立即冷冻在液氮中的样品。

4. RNA提取和RT-PCR

  1. 根据制造商的说明或优选的实验方案遵循信使RNA(mRNA)的提取的标准方法。
    注:利用载体分子RNA,以帮助隔离mRNA的小产量商品化试剂盒在此使用协议。低洗脱体积可用于增加最终浓度的mRNA。
    注:负“无酶”的控制(NEC的)和“无DNA模板”对照(NTC却)也必须被完成,以确保观察到的效果的有效性。
  2. 适用的mRNA逆转录,以互补的DNA的靶基因的21-23(cDNA中)和扩增的标准方法。

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Representative Results

比较近红外治疗的年轻年长的影响(4周)和(8 - 9个月)小鼠,我们测得的抗氧化剂超氧化物歧化酶1(SOD-1)的表达年轻的(N = 16)和老年人(N = 20)小鼠是NIR治疗,假治疗,或NIR封; 图2示出了相比于年轻假处理的动物一个显著增加β肌动蛋白标准化的SOD-1的表达超过2倍于年轻NIR处理的动物(P <0.01),年轻的NIR阻断动物(P <0.01)。较旧的NIR处理的动物也显示出超过一个时与旧NIR阻断动物(P <0.05)相比,2倍上调的SOD-1。

图1
图1. NIR治疗。 (A)的 NIR LED保持1个设备- 2厘米剃区域以上对小鼠的头部进行每天90秒,连续5天,在照射TREA特德小鼠(B)的近红外LED上述假治疗的小鼠以同样的方式,但与关闭,以90秒的持续时间的设备保持装置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
SOD-1基因的表达后NIR治疗的连续5天图2.分析(90秒/天)。前庭感觉上皮收获第五天和特定的抗氧化剂基因探查用RT-PCR。在SOD-1基因进行归一化,以β肌动蛋白和基线密度使用ImageJ v1.48进行。 SOD-1的表达显著上调(P <0.01)观察到在年轻NIR处理的动物的情况相比都年轻假治疗和年轻NIR-阻塞控制(4周)。显著增加(P&#60; 9个月) - 0.05)中的SOD-1表达时,与旧的NIR阻断动物(8相比,也观察到在较旧的NIR治疗的动物。所有图表显示的SOD-1基因表达的倍数变化相比年轻假处理的对照。数据代表平均值±SD。使用单因素方差分析所有的数据进行了分析,并使用Tukey多重比较事后检验统计 ​​显着性决定的。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

这里所描述的代表性的结果表明,当与假治疗的小鼠相比较简短颅递送NIR光的(90秒/天5天)足以提高抗氧化剂的表达在老年小鼠的水平。而发射的热可以代表线粒体和/或神经元激活的一个来源,据报道为大鼠前庭传入神经​​24 -我们的热量由NIR发射测量LED器件是<0.2℃,90秒,因此不太可能导致这里描述的变化。此外,与报告所强调以上,这里使用的NIR治疗不直接向感觉上皮或前庭传入神经 ​​元施加的,因此也不可能对热敏感的通道( 例如,TRPV4)的影响。最后,用在其他脑区相同的近红外设备以前的工作表明,热是不是观察到的差异7,9来源。

虽然这些RESULTS示出上调的细胞应答与年龄相关的氧化应激在基因水平上,它是不明确是否这些变化进一步表示在蛋白质水平,或重要的是,它们是否反映在小鼠的整体平衡性能。此外,上调示出了用于一个单一普遍存在的抗氧化剂。很可能是细胞代谢的多个标记都受到这种治疗制度。另外,由于基因从前庭器官提取全盘即,毛细胞,支持细胞,前庭传入和上皮所有存在的),不可能对涉及细胞代谢响应于NIR光治疗观察到的变化,以一特定前庭毛细胞或初级传入类型。重要的是,使用所描述的制备足够的mRNA可以从单个小鼠中提取,以允许细胞代谢和平衡射孔的行为分析之间未来相关研究rmance。

此处所用的高强度LED装置发射大约5J / cm 2的每90秒处理-总计能量为25Ĵ超过5天。虽然使用长波长的光(包括NIR)的优点是显率,它不能被假定NIR光的全部25 J的传递到前庭感觉上皮。在小鼠中,光必须穿过至少1mm通过保护外围前庭器官和脑软组织和骨的层。在人类这个延伸到厘米。因此光的外显率表示所描述的技术在问候的NIR光的治疗策略翻译限制成临床设置。最近的研究却一直采用光纤来提供近红外光脑深部结构,包括基底节25,和感觉器官,包括耳蜗26。在此基础上与周边前庭器官的位置相邻的耳蜗(并且经由乳突临床访问它),这是可行的建议,在人体中,前庭感觉上皮直接刺激可以通过一个小的光纤由外部设备触发来实现-类似于一个耳蜗植入物27

多个条件可以在上述适应研究者的兴趣的协议进行修改。首先,这里所使用的波长(670纳米)可以被扩展到包括较长的波长在红外范围如先前在其它感觉系统和动物模型的报道。第二,治疗方案还可以取决于短期或长期的响应是否是在问题改变。这里非常简短的治疗方案中使用的,但是这可能扩展到更长的持续时间,或甚至更短的持续时间来测量的NIR引起的变化的动态。

此协议的主要挑战是维持组织的生存力期间组织提取。定,除去骨迷路和从它切除膜迷路所需要的时间,这是至关重要的,以减少代谢分解。这是通过沐浴在冰冷ACSF的组织在整个过程和连续灌注该溶液与卡波金实现。此外,在清扫过程结束时,进一步的组织降解,可停止与使用液态氮的闪烁冻结所提取的组织。在适当的时候,将冷冻组织可被解冻和mRNA提取用于进一步基因分析。

尽管这里描述的方法不描述NIR光处理对细胞代谢的前庭感觉上皮的完整的影响,这个策略的进一步应用可以被修改,以包括线粒体功能28,29和/或细胞代谢的其它年龄相关的标记侮辱,如缺氧30。最终,能力描述V个别鼠标estibular细胞代谢轮廓将允许平衡性能和亚细胞过程之间的相关性衰老过程中的调查,和治疗的影响,其中包括近红外治疗。

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的财务权益。

Acknowledgements

笔者要感谢保罗·维悌希博士和吉纳维芙方女士的mRNA的提取和PCR援助,以及加内特凋谢和罗德尼·威廉斯纪念基金会的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Quantum WARP 10 Quantum Devices 2070N030-A
Screw top microtubules Quality Scientific Plastics 520-GRD-Q
Ketamine Parnell, Alexandria Australia
Standard pattern scissors FST 14001-12
Carbon steel surgical blades #22 Livingstone SBLDCL 22
Friedman-Pearson rongeurs FST 16221-14
Stereo microscope Leica Microsystems A60S
Dumont #5 SF forceps FST 11252-00
Isolate II RNA Micro Kit Bioline BIO-52075

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