Простой метод ДНК флуоресценции
1Department of Biology, University of Rochester, 2W. M. Keck Science Department, Claremont McKenna, Pitzer, and Scripps Colleges

Published 1/06/2015
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation

Larracuente, A. M., Ferree, P. M. Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes. J. Vis. Exp. (95), e52288, doi:10.3791/52288 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Этот подход особенно эффективен при картографических высоко повторяющихся последовательностей в гетерохроматических регионах, где вычислительные подходы сталкиваются с непреодолимыми трудностями. Здесь мы опишем обтекаемый протокол для ДНК ISH, что обходит формамида моет, которые являются стандартными шаги в других протоколах ДНК ISH. Наш протокол оптимизирован для гибридизации с зондами коротких одиночных нитей ДНК, которые несут флуоресцентные красители, которые эффективно отмечают повторяющиеся последовательности ДНК в пределах гетерохроматических участков хромосом в целом ряде различных типов насекомых ткани. Тем не менее, приложения могут быть расширены для использования с большими зондов и визуализации последовательностей одна копия (не повторяющихся) ДНК. Мы демонстрируем этот метод отображения нескольких различных повторяющихся последовательностей раздавленных хромосом дрозофилы нервные клетки и Nasoniavitripennis сперматоциты. Мы показываем образцы гибридизации как для небольших, коммерчески синтезируемых зондов и для большого зонда для сравнения. Эта процедура использует простые лабораторные принадлежности и реагенты, и идеально подходит для исследователей, которые имеют небольшой опыт работы с выполнением ДНК ISH.

Introduction

ДНК гибридизация (ДНК МОГ) является широко используемым методом для отображения последовательности в конкретных регионах хромосом. Зондов для отдельных регионов копию в эухроматином могут быть получены через нескольких подходов, в том числе ник-трансляции или в конце маркировки сортового проката ДНК 1,2 и включение deoxygenin (DIG) -attached нуклеотидов и их признания в рамках широкого спектра Группа-сопряженных антитела 1-3. Визуализация эухроматиновых последовательностей в нескольких или одного числа копий требует использования либо один большой зондов с высокой удельной активностью или коктейль из нескольких меньших зондов, которые в совокупности повышают сигнал.

В отличие от этого, часто повторяющихся последовательностей, обнаруженных в гетерохроматина, такие как спутниковые ДНК, являются легкой мишенью для ДНК ISH, потому что они нормально существовать как десятки и тысячи повторов, сгруппированных в отдельных регионах хромосом называются блоками. Мобильных элементов может бытьнайти в большом числе копий на отдельных хромосомные локусы 2. В этих случаях, одиночные датчики с низкой удельной активностью могут эффективно маркировать гетерохроматиновые последовательности из-за их гибридизации в нескольких местах. Зонды для повторяющихся последовательностей могут быть синтезированы в продаже в виде коротких олигонуклеотидов (30-50 п.н.) и химически конъюгированный с любым из нескольких различных флуоресцентных групп. Отображение повторяющихся последовательностей внутри гетерохроматина с помощью генома секвенирования технологий затруднено из-за проблем, возникших в здании лесов на территории очень повторяющихся спутниковых блоков 4-6,7. В настоящее время ISH выступает в качестве наиболее эффективного способа отображения этих последовательностей на уровне суб-хромосомы. Эта стратегия имеет важное значение для отображения большого числа повторяющихся последовательностей, которые вскрываются в текущих генома и транскриптомный секвенирования исследований.

Эффективность и простота отображения повторяющихся последовательностей на слайд-смонтирован хромосом будет GREатлы усиливается упрощенной протокола ДНК ISH. Например, существующие протоколы для ДНК ISH включать в себя несколько стирок гибридизован- тканей в формамиде решения 2,8, добавляя тем самым существенный вклад в нужном для последовательностей отображения, а также получения больших количеств химических отходов этой дорогостоящей реагента. Здесь мы опишем пересмотренный метод ДНК ISH, что обходит необходимость формамидных моет и использует основную лабораторного оборудования и реагентов. Этот метод был первоначально разработан для быстрого отображения часто повторяющимися последовательностями ДНК в гетерохроматине дрозофилы личинок нейробластах с помощью коммерчески синтезируемых олигонуклеотидов, которые сопряженные с флуоресценции красителей. Тем не менее, этот способ также работает для отображения повторяющихся последовательностей с помощью более крупных зондов, синтезированных с помощью других средств 9,10 и через нескольких различных тканей и хромосомных типов. Кроме того, этот метод может быть использован для отображения эухроматиновые последовательности, используя больше или мнле, коротких зондов в пределах эухроматиновые интерес последовательности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. рассечения тканей и фиксация (60 мин)

  1. Для мозга дрозофилы, место 3-й возрастной стадии личинки в капле 1x PBS (фосфатный буферный солевой раствор). Выберите большой 3-й возрастной стадии личинки, которые активно ползать из флаконах или бутылках, которые не переполнены.
    1. Используйте один ультратонкий пинцет пару, чтобы схватить рот крючки и еще пару пинцет, чтобы захватить 2/3 вниз длины тела (рис 1а, б). Аккуратно потяните рот крючки, чтобы разоблачить мозга, вентральной ганглии, слюнных желез и часть личинок желудочно-кишечного тракта. Используйте пинцет, чтобы отделить мозга и вентральный ганглиев (рис 1а, б) из других тканей и место в капле 1x PBT (фосфатный буферный физиологический раствор, содержащий твин) на пластиковой чашку Петри.
  2. Для Nasonia яичка вскрытия, выберите мужской 3-дневных куколки (желтый тела с красными глазами). Мужчина Nasonia имеют небольшие длины крыла площадку по отношению к Females во время стадии куколки (рис 1в).
    1. Держите куколки в верхней части живота у грудного отдела с одним пинцет пары, и, используя другую пинцет пару, возьмите очень дистальный конец живот и вытащить слезоточивый каплевидные яички (они будут окружены жира орган, который может быть слегка встряхивают прочь; Рисунок 1D). Снять любые внешние части тела от семенников, которые будут препятствовать надлежащей выжимании, и место в капле 1x PBT на пластиковой чашку Петри.
  3. Для каждого слайда, анализировать в общей сложности четыре или пять образцов ткани (т.е.., Drosophila личиночных мозги или Nasonia яичек).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более пяти образцов приведет к перенаселенности ядер и хромосом.
  4. При желании, для достижения некоторого разделения сестринских хроматид в эухроматиновых регионов митотических хромосом, лечения ткани с гипотонического раствора: передать мозги от 1x PBT к падению 0,5% цитрата натрия в течение 5-10 (не более 10) мин.
    Примечание: Колхицин (ингибитор митотической) могут быть полезны для увеличения числа митозов на стадии метафазы 11. Тем не менее, его использование является необходимым, если очень большой здоровый личинки используются, и даже нежелательно, потому что это может негативно повлиять на разрешение хромосом, распространение и морфология.
  5. Поместите каплю (~ 20 мкл) фиксирующего раствора (2,5% параформальдегида в 45% -ной уксусной кислоты) на поверхности чистой Sigmacote обработанной покровным.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, фиксирующий решение свежими каждый день использования. Фиксирующие растворы, начиная от 1.8-3.7% параформальдегида в 45% -ной уксусной кислоты дает наилучшие результаты для рыбы. Использование других мозгов или яички ткани, или адаптации этого протокола для иммуно-FISH может потребовать экспериментировать с различными фиксаторами (для списка различных фиксаторов, см 12).
  6. Тщательно передачи каждого образца ткани из рассекает буфера (1x PBT) в закрепляющего капли с ультрадисперсных пинцетом, минимизациюЗин передачу рассекает буфера в закрепляющего раствора. Поместите образцы ткани таким образом, чтобы они равномерно разнесены друг от друга в пределах фиксирующего капли. Инкубируйте ткани в фиксаторе в течение 4 мин при комнатной температуре.
  7. Осторожно положите поли-лизин покрытием слайд лицевой стороной вниз на ткани и крышкой скольжения. Не давить на данный момент, но вместо того, чтобы позволить два контактировать слегка так, что покровное стекло прилипает на нижней стороне ползуна. Обратить слайд, чтобы покровное сверху.
  8. Бутерброд скольжения слайд / ткани / покрытие внутри сложенный листок фильтровальной бумаги. На ровной поверхности, используя большой палец, нажмите очень твердо вниз на положении непосредственно над покровным. Будьте осторожны, чтобы избежать бокового скольжения покровного стекла (это может привести к размытию ткани).
  9. Погрузитесь слайдов / ткани / крышка скольжения в жидком азоте (см аппарат в фиг.1Е, F), и дайте постоять, пока Азот не прекращает кипеть (больше IS FINE). Удалить слайд и сразу обрывать покровное со свежим лезвием бритвы, щелкая угол покровным в восходящем направлении (не поцарапать фиксированной ткани с бритвой).
    1. Предварительное охлаждение слайд / ткани / покровное на блоке сухого льда, крышка ошибиться, в течение 1-2 мин до погружения в жидкий азот поможет предотвратить слайды из трещин.
  10. Сразу же место слайд с ткани в банку Коплин заполнены на 100% этанола при комнатной температуре и дать постоять в течение не менее 5 мин (это время может быть дольше, если необходимо).
    Примечание: Холодный 100% этанола и может быть использован.
  11. Удалить слайд с тканью, фитиль от избытка этанола с Kimwipe (не касаясь фиксированной ткани), и оставить слайд высохнуть на воздухе в течение 1 часа.
    1. Перейдем непосредственно к шагу 2 или хранения слайдов сухие в условиях низкой влажности воздуха или в высыхании камеры в течение нескольких недель до даже месяцев, прежде чем выполнять гибридизации.


Рисунок 1: () 3-й возрастной стадии Drosophila личинка (справа), с позиций, указанных для того, где захватить рот крючки (обозначается *) и 2/3 пути вниз личинок разбираются мозги; (Слева) схематическое изображение личинки в одной и той же стадии развития, изображающие относительное положение мозга в личиночной головы. (B) мозга и ганглии вентральной рассекали от 3-й возрастной стадии личинки Drosophila (справа) и схематическое изображение этом ткани (слева). (C) 3-дневных Nasonia куколки в желтое тело-красный этапе полета. (D) пара семенников расчлененный от 3-дневного возраста Nasonia мужской куколки (справа) с позиций указывает, где захватить куколки на заднем живота (обозначается *) и на середине тела; (Слева) схематическое изображение мужского и женского пола былр куколки; мужчина куколки можно отличить по крыльев, которые не распространялись за сагиттальной профиля (черная стрелка), в отличие от женщин, у которых крылья, которые расширяют мимо профиля; относительное положение пары семенников показано в мужском куколки. (Е) Устройство-строка скрепки-метода и (F), используемых для погружения слайдов в сосуде с жидким азотом. Несколько строк степлеры могут быть использованы для одновременного погружения несколько слайдов.

2. В гибридизация (30 мин на 1 день, 1 час, 2,5 часа для длинных зондов-2 в день)

  1. Добавить 1 мкл (100 нг) от каждого датчика к 20 мкл буфера для гибридизации 1.1x. Внесите зонд / гибридизации буфер на поверхности неподвижного ткани (не прикасаясь к ткани).
  2. Осторожно положите покровное непосредственно на буфер зонд / гибридизации, убедившись, что покровное сосредоточена непосредственно на ткани. Буфер должен перейти на гоэлектронной внешний край покровного стекла, не оставляя воздушных пузырей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: мелкие пузырьки, которые не контактируют ткани не представляют никаких проблем в порядок. Удалить большие пузыри, осторожно поднимая угол скольжения крышкой и тщательно положив его обратно на слайде.
  3. Поместите листок слайд / ткани / крышка на поверхности блока предварительно нагревают до 95 ° C (крышка ошибиться). Обложка с большой кусок алюминиевой фольги, чтобы предотвратить воздействие света. Пусть слайд инкубировать при 95 ° С в течение 5 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: типичный тепловой блок с отверстиями для труб можно перевернуть, чтобы обеспечить плоскую поверхность, на которой можно разместить слайд / ткань / покровное.
  4. Удалить слайд, позволяя ему немного остыть, пока он не нагреется. Тщательно оберните кусок натянутой парафильмом вокруг покровным, чтобы запечатать жидкость под ним.
  5. Поместите запечатанный слайд внутри камеры влажности и помещают в камеру в инкубатор, предварительно нагретую до 30 ° C. Инкубируют при 30 ° С в течение 4 ч в течение ночи.
    1. Создать камеру влажности из пустого ящика наконечника или закрытой крышкой Tupperware контейнер с влажными Kimwipes или бумажными полотенцами, размещенных в нижней части.
      Примечание: одноцепочечной ДНК олиго зондов были разработаны, чтобы быть 28-33 основы для достижения теоретическую температуру плавления (Т м) 45-47 ° C. Эти длины и т и диапазоны отражают тот факт, что многие повторяющиеся последовательности, что мы изучили находятся на богатых и, следовательно, имеют очень низкое содержание GC. Более длинные зонды, скорее всего, имеют более высокие т значений Т; это может привести к более высокой фоновой гибридизации при стандартной температуре гибридизации 30 ° С. Таким образом, некоторые Устранение неполадок при температуре гибридизации могут быть необходимы для достижения наилучших результатов. Чтобы найти лучший температура гибридизации, увеличение (или уменьшение) температуры на 5 ° С, постепенно.
  6. Осторожно снимите парафильм от понижения, а затем осторожно снимите крышку скольжения, медленно поднимая один угол. ВашингтонSH слайд-три раза за 15 минут каждый Стирать в 0.1x SSC буфера. Накройте банку Коплин с алюминиевой фольгой во время мытья, чтобы свести к минимуму воздействие света.
  7. Если вы не используете длинный биотинили- зонд, перейдите к шагу 2.8.
    1. При использовании долго биотинилированного зонда, высушите область вокруг ткани с Kimwipe, будьте осторожны, чтобы не прикоснуться к самой ткани. Поместите 100 мкл блокирующего раствора на ткани и покрыть осторожно покровное, заботясь, чтобы избежать прилипания пузырьков. Обертка скользить по покровным парафильмом и место при 37 ° С в течение 30 мин.
    2. Осторожно снимите покровное и промокните вокруг ткани с Kimwipe. Внесите 100 мкл родамина-авидин разбавленный 1: 1000 в SBT по ткани и крышка мягко, с покровным, заботясь, чтобы избежать захвата пузырьков. Обертка скользить по покровным парафильмом и место при 37 ° С в течение 30 мин.
    3. Осторожно снимите покровное и мыть Слайд 3 раза в течение 5 минут в каждом из 4-кратным получателями, а затем3 раза по 5 минут в каждом 0.1x SSC.
      Примечание: Слайды можно мыть в течение более длительных периодов времени.
  8. Удалить слайд и пятно вокруг ткани с сухой Kimwipe, чтобы удалить лишнюю буфера (не прикасаясь к ткани). Разместите сторону слайд ткани в темном месте в течение 10-15 мин или до влажности полностью рассеивается.
  9. Внесите 11 мкл Vectashield монтажной среды (с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол-DAPI) на ткани. Аккуратно положите чистую покровным (не обработанный Sigmacote) непосредственно над центром монтажного среды и ткани. Монтажный среда должна мигрируют медленнее наружу по направлению к краям покровным стеклом.
    Примечание: Если монтажные среднего не достигает край покровным стеклом со всех сторон, то дополнительный 1-2 мкл монтажной среды могут быть применены к одной позиции на краю покровного стекла, чтобы заполнить необходимого объема. В этом случае, убедитесь, чтобы вытереть излишки среды из поверхности скольжения доуплотнение.
  10. Печать края покровного стекла с лаком для ногтей. Избегайте красить лак для ногтей по образцу ткани.
  11. Поместите слайд в вертикальном положении в темном месте и не позволяйте лак для ногтей сухой, пока полностью трудно (как правило, 30 мин и более). В этот момент, изображения ткани или хранить при -20 ° С в течение до 1 недели для последующего визуализации.

Буфер / Рецепты Solution

10x PBS

  • 80 г NaCl
  • 2,0 г KCl
  • 14,4 г Na 2 HPO 4
  • 2,4 г KH 2 PO 4
  • рН до 7,4, H 2 O до 1 л

1x PBT

  • 5 мл 10x PBS
  • 45 мл Н 2 О
  • 0,1% Tween 20

20x SSC

  • 175,3 г NaCl
  • 88,2 г цитрата натрия
  • в 800 мл H 2 O
  • рН до 7, H 2 O до 1 л

4x SSCT

  • 200 мл 20x SSC
  • 799 мл H 2
  • 0,1% Tween 20

0,1 x SSC

  • 5 мл 20x SSC
  • 995 мл Н 2 О

Гибридизация смеси (20 мкл; редактировался 11)

  • 10 мкл формамида
  • 4 мкл 50% сульфата декстрана
  • 2 мкл 20x SSC
  • 4 мкл Н 2 О

SBT 8 (10 мл)

  • 2 мл 20x SSC
  • 0,01 г бычьего сывороточного альбумина (БСА)
  • 10 мкл Tween 20
  • 7,9 мл H 2 O

Блокирование раствор 8 (10 мл)

  • 0,3 г BSA
  • 10 мкл Tween 20
  • 2 мл 20x SSC
  • 8 мл H 2 O

Фиксирующий раствор с параформальдегидом (1 мл)

  • 393.75 мкл H 2 O (добавить воду первый)
  • 450 мкл ледяной уксусной кислоты
  • 156.25 мкл 16% параформальдегид

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Чтобы продемонстрировать этот метод, мы гибридизовали набор небольших коммерчески синтезированных олигонуклеотидов, которые были химически модифицированы с люминесцентными конъюгатов (рисунок 2) и больше биотинилированного зонда (производится через нику перевода продукта ПЦР; фиг.2В), чтобы хромосом из нескольких различных тканей типа (таблица 1). Целевые последовательности включены спутниковые повторы, расположенные в прицентромерных (гетерохроматических) областях митотических хромосом D. MELANOGASTER личинок нейробласты (2А-С), и мейоза хромосомы от куколки N. vitripennis яички (рис 2D). В гибридизации в каждом из этих случаев выявлены отдельные набора полос на суб-хромосомы регионах. Один момент, стоит упомянуть, что зонд к D. MELANOGASTER 359 б.п. спутниковое повторите признает как большой мульти-Мегабазе парой блоков на X, и намного меньшей области на хромосоме 3(Фиг.2А). Больше зонд против спутника ответчика также обнаруживает повторяющиеся блоки, состоящие из относительно небольших количествах повторите копирования (~ 700 копий; Рисунок 2В). Таким образом, этот метод позволяет визуализировать очень малых спутников блоков. Чтобы помочь раскрыть структуры хромосом и помощь в идентификации хромосом, это может быть полезным для лечения хромосомы с гипотонического раствора (описанного в пункте 1.5). Ткани по фигурному панели и обрабатывали гипотонического раствора в течение 5 и 10 мин, соответственно. Обратите внимание, разделение сестринских хроматид больше с более длительном лечении (рис 2С).

Фиг.2
Рисунок 2: ДНК гибридизация в () личинки Нейробласт хромосомы D. MELANOGASTER /D. simulans гибриды; (B) и (C) личинки Нейробласт хромосомы D. MELANOGASTER обрабатывали гипотонического раствора (см Разбор и фиксации шаг 1), (D) мейоза хромосомы из куколки ткани яичка Камня осы Nasonia vitripennis. В (А), зеленые стрелки показывают небольшие области спутниковой AATAT на D. simulans 4-й хромосоме, в то время как зеленые Arrowhead указывает на AATAT на D. MELANOGASTER Х-хромосома. Красная стрелка указывает на небольшую область 359 б.п. спутника на D. MELANOGASTER 3-й хромосоме, а красный наконечник стрелы отмечает 359 п.о. последовательности на X. Все спутники в (а) гибридизовали с короткими, флуоресцентно меченных олигонуклеотидов. В (В), зеленый сигнал соответствует спутника AAGAG (синтезирован олиго) и красного сигнала 120 п.о. ответчика спутника (биотинилированный зонд; отмеченныес красными стрелками). (C) же ответчик спутник с коротким флуоресцентно-меченного олигонуклеотида (красные стрелки). В (D), красная стрелка отмечает спутник, который уникально расположен на отцовской Соотношение полов (PSR) хромосомы, которая несущественные, нештатная B-хромосома находится в природных популяциях N. vitripennis 13, в то время как зеленая стрелка указывает на спутник на одной из нормальных хромосом; Этот гибридизацию проводили с использованием коротких флуоресцентно меченных олигонуклеотидов. Все зонды, указанные в таблице 1. Масштабная линейка в панели () является 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Название Probe Тип зонда Олигонуклеотиды
Спутниковое AAGAG Олиго (AAGAG) 7 5 '6-FAM (флуоресцеина)
Спутниковое AATAT Олиго (AATAT) 6 5'-Cy3
359-BP спутник Олиго ТТТ TCC AAA ТТТ CGG TCA TCA AAT AAT CAT 5'-Alexa555
Спутниковое PSR Олиго TGT AAC TGG AAA AGG AAA ATG ТАТ ТАТ TGA 5'-Alexa555
Nasonia аутосомно спутник Олиго AAT ТТТ GTG AAT ТТТ GGT GTC TCC ATC 5'-Alexa633
Ответчик ПЦР F-5 'GGA AAA TCA CCC ATT ТТГ УВД GC Биотин-14-дАТФ
Р-5 'CCG AAT TCA AGT ACC AGA C

Таблица 1: Датчик типы, используемые на рисунке 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ДНК ISH часто используется для отображения специфических последовательностей в хромосомах. Мы описали простой метод ДНК ISH оптимизированный для большое количество копий, гетерохроматических последовательностей. Вместо того чтобы использовать для промывки в растворе формамида, который является требованием в других существующих протоколов ISH ДНК, мы размещаем ткани-слайдов непосредственно на предварительно нагревают блока для денатурации ДНК. Этот метод обходит использование больших количеств формамида. Один важный шаг для получения четких сигналов гибридизации является использование свежеприготовленный фиксирующем растворе; неспособность сделать это (или делает новое решение с параформальдегиде, который был открыт в течение более чем одного месяца) может снизить разрешение сигнала. Ограничение этого метода состоит в том, что, как и для других протоколов ДНК ISH, температура гибридизации может потребовать оптимизации для того, чтобы устранять паразитные гибридизацию офф-последовательностей-мишеней.

Этот протокол является чувствительной короткие, оцДНК зонды, конъюгированные с одной fluoropХор в молекуле может обнаружить блоки повторов с даже относительно небольших количествах повторите копирования (например, ~ 700 Rsp повторяет, рисунок 2в). Сигналы на спутниковых блоков с меньшим количеством повторов может быть визуализированы с короткими оцДНК зондов с помощью высокочувствительного цифровой камеры. Хотя это и не показано здесь, этот метод также эффективен для отображения не-повторяющихся последовательностей в эухроматином 10. Использование длинных, биотинилированных зондов обеспечивает большую гибкость в обнаружении низкие последовательности в количестве копий, как сигнал может быть легко усиливается повторных обработок биотинилированного анти-авидин и родамин-авидин 9. Для визуализации последовательности зеркальной копии, несколько зондов, охватывающих последовательность может быть необходимым. Кроме того, бактериальные искусственные хромосомы (БАС), содержащие последовательность интерес может быть помечен путем перевода ник или случайного праймера для применения в качестве зонда для не-повторяющихся последовательностей 10. Для отображения последовательности на мелком масштабе, датчики ориентации дифферет повторы (каждый с различными флуорофоров) могут быть использованы одновременно с получением указанного в положение последовательностей-мишеней по сравнению с другими повторов и структурных ориентиров на хромосомах. В то время как мы используем здесь два зонда (фиг 2А, В, D), число зондов может быть легко увеличена до трех 10 или более, в зависимости от количества различных фильтров, имеющихся флуоресцентного микроскопа. Этот протокол может быть распространен и на другие ткани, мы убедились, что протокол хорошо работает на кабачки хромосом политенных из слюнных желез. Можно предположить, что этот метод будет в сочетании с иммуно-окрашивания белков хроматина; Однако рекомендуется, чтобы иммуно-окрашивание быть выполнена в качестве первого шага, и с последующим повторным фиксации с параформальдегидом до ДНК ISH, чтобы предотвратить потерю антител во ДНК ISH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used) Sigma Aldrich
Ultrafine tweezers (5 gauge) Dumont
22 x 22 mm cover slips Fisher Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear
Sigmacote Sigma
Filter paper 75 - 150 mm
Paraffin wax paper
Heat block with thermometer
Dry incubator
Razor blades
Humidity chamber empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes
Coplin jars with slide grooves
Aluminum foil
Pasteur pipettes
1.5 ml microfuge tubes
Nail polish clear or colored
P20 micropipette and plastic tips
Paperclips 20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain
Reagents
16% EM grade paraformaldehyde Electron Microscopy Reagents
Acetic acid Sigma
Liquid nitrogen
100% Ethanol, chemical grade
Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos
Long biotinylated probe Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 e.g., nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen
Rhodamine-Avidin Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3 for detection of long biotinylated probe
Hybridization buffer Recipe above
4x SSCT Recipe above saline-sodium citrate + Tween
0.1x SSC Recipe above saline-sodium citrate
Blocking solution Recipe above
SBT Recipe above SSC, bovine serum albumin, Tween
1x PBT Recipe above phosphate-buffered saline + Tween
1x PBS phosphate-buffered saline
Hypotonic solution 0.5% sodium citrate in H2O
Formamide Sigma Aldrich
Vectashield mounting medium with DAPI Vector laboratories

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blattes, R., Kas, E. Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (9), (2009).
  2. Dimitri, P. Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila. Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).
  3. Pardue, M. L. In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, (8), 1003-1006 (2011).
  4. Hoskins, R. A., et al. Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly. Genome Biology. 3, (12), (2002).
  5. Hoskins, R. A., et al. Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin. Science. 316, (58331), 1625-1628 (2007).
  6. Treangen, T. J., Salzberg, S. L. Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions. Nature Reviews Genetics. 13, (1), 36-46 (2012).
  7. He, B., et al. Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster. Genome Research. 22, (12), 2507-2519 (2012).
  8. Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (3), (2010).
  9. Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura. Molecular Biology and Evolution. 27, (7), 1612-1620 (2010).
  10. Ferree, P. M., Barbash, D. A. Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila. PLoS Biology. 7, (10), e1000234 (2009).
  11. Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset. The Journal of Cell Biology. 118, (4), 759-773 (1992).
  12. Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes. Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).
  13. Werren, J. H., Stouthamer, R. PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements. Genetica. 117, (1), 85-101 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats