שיטה של ​​מבודד * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

Ex-Vivo ריאות זלוף (EVLP) אפשר השתלת ריאות בבני אדם להפוך לזמינה יותר בכך שיאפשר את היכולת להעריך איברים ולהרחיב את המאגר התורם. כאן אנו מתארים את הפיתוח של תכנית EVLP חולדה וחידודים המאפשרים למודל לשחזור להתרחבות עתידית.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מספר ריאות תורם המקובלים זמינות להשתלת ריאה הוא מוגבל מאוד בשל איכות ירודה. Ex-Vivo ריאות זלוף (EVLP) אפשר השתלת ריאות בבני אדם להפוך לזמינה יותר בכך שיאפשר את היכולת להעריך איברים ולהרחיב את המאגר התורם. ככל שטכנולוגיה זו מרחיבה ומשפרת, היכולת הפוטנציאלית להעריך ולשפר את איכות ריאות ירודות לפני ההשתלה הוא צורך קריטי. על מנת להעריך יותר בקפדנות גישות אלה, מודל חיה לשחזור צריך להיות הוקם שיאפשר בדיקה של טכניקות שיפור וניהול של הריאות שנתרמו, כמו גם למקבל ריאות ההשתלה. בנוסף, מודל חיה EVLP של פתולוגיות הקשורות, למשל, פציעת ריאות אוורור מושרה (וילי), תספק שיטה חדשה להערכת טיפולים לפתולוגיות אלה. כאן אנו מתארים את הפיתוח של תכנית עכברוש EVLP ריאות וחידודים לי זהthod המאפשר למודל לשחזור להתרחבות עתידית. אנו גם מתארים את היישום של מערכת EVLP זה מודל וילי בריאות חולדה. המטרה היא לספק לקהילת המחקר עם מידע חשוב ו" פניני חוכמה "/ טכניקות שעלו מהניסוי וטעייה והם קריטיים להקמת מערכת EVLP שהיא חזק ושחזור.

Introduction

רלוונטיות קליני

אין כרגע מיעוט הריאות מתאימות זמינות להשתלה עם רק 19% מריאות להיות מסוגלים להיות מנוצלים ארצי מוביל לעת רשימת ההמתנה ממושכת או חולים הגוססים ממתין להשתלה 1. המחסור יכול להיות בגלל תורמים מבוגרים, טראומה, זיהום, כשל איברים רב מערכתי וריאות תורם לפעמים נפגעו על קציר 2. בנוסף, הריאות היא איבר חלש מחוץ לחלל בית החזה וטכניקות הובלה ושימור סטנדרטיים יכול להוביל להידרדרות ריאות ושאינן ברות-קיימא. לכן, שמירה ושיפור לשעבר vivo כדאיות ריאות הפכה לאחרונה למוקד מרכזי ברפואת השתלת ריאות.

Ex-vivo ריאות זלוף (EVLP)

Ex-vivo זלוף הריאה (EVLP) התפתח לינקב ברציפות איברים נבדקים להשתלה ומאפשר תקופה של הערכה שכלOWS לפוטנציאל של החייאת ריאות או שיפוץ. EVLP יכול להאריך כולל מחוץ לזמן איסכמי איבר הגוף ולאפשר תרומות האיברים לנסוע למרחקים עוד 3. בדרך כלל, הריאות מאווררות ב 50% מכלל קיבולת ריאות או 20 CMH 2 O של לחץ אוויר שיא עם חלק קטן של חמצן נשאף (FiO 2) של 30% עד 50% 4. פתרון שימור הוא perfused ב 40-60 מיליליטר / קילוגרם (כ -40% מתפוקת הלב החזויה של 100 מיליליטר / קילוגרם) בבני אדם ובעלי חיים גדולים 5,6, אבל הוא perfused בכ -20% מתפוקת הלב לחולדות 7. הכללת פתרון Steen אפשרה ריאות אדם לנסוע בסביבות RT ללא פיתוח של בצקת ריאות 9. עבודת חלוצית זו שוכללה על ידי השתלת ריאות אוניברסיטת טורונטו תכנית 10-13 ונבחנת להערכה משופרת של ריאות תורם שוליות להשתלה 14,15. עם זאת, ventilatio האופטימליתנאי n וזלוף צורך להתחדש ריאות שוליות ו / או תת-תקניות להשתלה אינו ידועים, וכיום הוא אזור פעיל של מחקר.

מערכות זלוף הריאה מבודדות כבר בשימוש בבעלי חיים קטנים כדי לגרום לפציעת ריאות, צור מחדש מחלות בדרכי הנשימה, ותנקבנה ריאות עם פתרונות שונים כדי למנוע נזק איסכמי. חוקרים יצרו מודל קטן של בעלי חיים של השתלת ריאות באמצעות מערכת הריאות זלוף המבודדת לחקות את פרוטוקולי EVLP שיכול לשמש בבני אדם ובעלי חיים גדולים יותר 16-18. עם זאת, יש מודל ניסיוני זה אתגרים רבים בכל הקשור לטכניקות השונות ופרמטרים המשמשים לחקות פיזיולוגיה אנושית. בפרט, יש דקויות רבות בשמירה על כדאיות ריאות במהלך EVLP. דקויות אלה יכולים להתעורר עקב הבדלים בטכניקת קציר, הגדרות אוורור לחץ חיוביות, תנאי הרכב וזרימת perfusate וcannulation של הריאה. Therefore, המטרה כאן היא לספק את קהילת המחקר עם מספר תקלות ויישום הטיפים שמצאנו להוביל לשיטה חזקה ליישום EVLP במודל מכרסם.

Protocol

הערה: כל הנהלים בוצעו על פי המדריך-השורות של בעלי החיים המוסדיים הטיפול והמדריך של המועצה הלאומית למחקר לטיפול ההומני והשימוש בחי מעבדה (IACUC) ועבר אישור על ידי ועדת אוהיו IACUC האוניברסיטה.

1. הגדרה ראשונית

  1. להגדיר את מעגל EVLP ויש לי חם (37 מעלות צלזיוס) perfusate הזורם במערכת לפני שילוב הריאה-ניטע לשעבר (איור 1).
  2. הגדר את האמבטיה החמה מים, המשמשת למעייל המאגר perfusate, מחליף חום, ובית חזה מלאכותי, עד 37 מעלות צלזיוס ומחזור (איור 1).
  3. הפעל פתרון דה-חמצון (לדוגמא, 6% O 2, 8% CO 2, 84% N 2) דלפק כיום באמצעות perfusate במסנן הגז כדי להבטיח יש perfusate ~ 6% חמצן מומס לניסוי.
    הערה: perfusate-חומץ de זה מאפשר o ההערכהf תפקוד הריאות על ידי מדידת החמצן המוחדר perfusate, פוסט-האיבר.
  4. פתח את תכנית רכישת נתונים ולחבר את מתמר לחץ בעורק הריאה, מתמר לחץ ההפרש לקנה הנשימה, מתמר לחץ זרימת ההפרש נשימה, מתמר משקל ריאות, ומתמר מהירות משאבה למעגל EVLP ותיבת ממיר נתוני רכישה / אנלוגית לדיגיטלית ( איור 2).
  5. הגדר את שולחן ניתוחים וכלים תפעוליים במעגל EVLP (איור 3).
  6. הגדר את מיכל קטן של חנקן נוזלי ליד מעגל EVLP אם תתקבלנה דגימות.
    הערה: מערכת של המחבר שונתה כדי לאסוף מראש איבר והאיבר perfusate פוסט-בלי להפריע את לחץ זרימת הדינמיקה שעשויה פוטנציאלי לפגוע הריאות.

2. הכנת חומרי ההרדמה והפרין, ההרדמה של חולדה

  1. לשים על ציוד מגן האישי הבא(PPE) לפני טיפול חולדות ורקמת עכברוש: ​​מסכת מנתחים, כפפות מנתחים, ושמלה חד פעמית.
  2. לשקול את העכברוש ולהקליט את המשקל.
  3. הכן 1,200 U / הפרין קילוגרם.
  4. הכן שני 60 מ"ג / קילוגרם קטמין ו5 מ"ג / קילוגרם Xylazine באותו המזרק, הכנת קטמין הראשונה.
  5. Intraperitoneally להזריק התערובת של קטמין וXylazine לחולדה ולאפשר 5 דקות לחולדה למחוסר הכרה.
  6. לאשר הרדמה תקינה על ידי בדיקת רפלקס קמצוץ הבוהן. אם החולדה לא לסגת הבוהן שלו, הוא לא מרגיש כאב.
  7. הזז חולדה לשולחן ניתוחים, לאבטח במצב שכיבה, ולרסס עם אלכוהול לחיטוי.

3. הפקה ואוורור ראשוני של ריאות העכברוש

  1. הכן 4-20 תפרי משי ארוך סנטימטר (3-0 או 4-0 צריך להספיק).
  2. להתחיל בהקלטת נתונים באמצעות תכנית רכישת נתונים.
  3. בדוק לעומק מתאים של הרדמה, באמצעות מספריים כירורגיות להיכנס ca הצפקvity ידי laparotomy קו האמצע ולהזריק הפרין לווריד הנבוב הנחות.
  4. לבצע חתך cranially עבר manubrium לצוואר עד לקנה הנשימה חשופה. לא לקרוע את חלל בית החזה (איור 4 א).
  5. לנתח אחורי לקנה הנשימה בקו האמצע והחלק אחורי תפר משי לקנה הנשימה (איור 4).
  6. הרם את החלק הקדמי של קנה הנשימה ולעשות חתך רוחבי בין טבעות הסחוס, גבוהות בקנה הנשימה. לא לחתוך את החלק האחורי הקרומי של קנה הנשימה בשלב זה (איור 4C).
  7. Cannulate קנה הנשימה עם הצינורית לקנה הנשימה ומאובטחת עם תפר המשי (איור 4D). ודא שמייתר התפר מאובטח בחרוק כדי להקטין הגירה של הצינורית.
  8. חבר את הצינורית לקנה הנשימה למעגל האוורור.
  9. הפעל את המאוורר המכני להתחיל מכאני אוורור luמהה.
    הערה: הגדרות ראשוניות נבחרו להיות נפח של גאות ושפל של 4 מיליליטר / קילוגרם ולחץ הסוף-נשיפה חיובית (PEEP) של 2 CMH 2 O. הגדרות אלה הן ההגדרות הראשוניות ובהתאם לתנאי הניסוי עשוי להיות מותאמות פעם אחת האיברים הוא במערכת זלוף לשעבר vivo.
  10. הזן את חלל בית החזה דרך עצם החזה / xyphoid ולהמשיך cranially לכיוון חריץ suprasternal. תשמור על עצמך כדי להימנע ממגע הריאות.
    הערה: ככל שריאות החולדה היא שבירות, כל מניפולציה שלא במתכוון יכולה להוביל לטראומה ובצקת ריאות (איור 5 א).
  11. באמצעות 2 מפשקים, לחזור בו מחלל בית החזה כדי לחשוף כראוי את האנטומיה (איור 5 א). שוב, דואג כדי להימנע ממגע הריאות.
  12. הסר את התימוס עם העלאה קלה ונתיחה בוטה.
  13. Shift תכולת הבטן לצד לחשוף גם את נחות וריד הנבוב (IVC) או וריד mesenteric (MV).
  14. לחתוך או IVC או MV לexsanguinate החולדה, מתן המתת חסד.
  15. הנח אחורי תפר משי לעורק הריאה ואב העורקים בהכנה להבטחת צינורית עורק הריאה (איור 5).
  16. לעשות חתך 2-3 מ"מ על פני השטח הקדמי של מערכת יצוא החדר ממני ומניח את הצינורית בחתך ולעורק הריאה הראשי ובטוח עם תפר המשי (איור 5 ג).
  17. Transect השיא של הלב כדי לאפשר גישה לחדר השמאלי ולשטוף כל קרישים בתוך כלי דם ריאתי בזורם ~ 15 מיליליטר של K + תמיסת אלקטרוליט נמוכה באמצעות עורק הריאה והחוצה דרך הקודקוד של הלב לתוך חלל החזה ( 5D איור).
  18. חבר את צינורית עורק ריאה (PA) למעגל EVLP. ודא קו הזרימה מגיע מהמעגל לצינורית הרשות דרוך עם perfusate להימנע מכל אוויר שנכנס ללב ולריאות.
  19. הפעלמשאבת peristaltic הראשית ולהגדיר אותו נמוך (~ 2 מיליליטר / דקה) להאיץ כדי לאפשר perfusate לרוץ דרך עורק ריאה ואת החדר השמאלי לתוך חלל החזה. ** שלב קריטי ** ודא לחץ הרשות לא ספייק כ זה סימן של שתי חסימה או cannulation העלוב (איור 6).
  20. כבה את משאבת peristaltic.
  21. מקם תפר משי מאחורי הלב, סביב חדרי המוח (איור 7).
  22. להתחיל בתהליך של cannulating הפרוזדור השמאלי על ידי הוספת זוג קטן של מלקחיים כירורגיים לשיא, דרך שסתום צניפי, ואל מבואת השמאל.
    הערה: זה יהיה להרחיב את שסתום צניפי ולהקל על cannulation. התרחבות אגרסיבית, או התרחבות עמוקה מדי, שלא מדעת יכולה לקרוע את אטריום שמאל טיוח הרכש יעיל.
  23. הסר את המלקחיים מהלב.
  24. הכנס את צינורית אטריום שמאל והכניעה את שיא דרך שסתום צניפי ולשמאל בrium.
  25. לאבטח את צינורית אטריום שמאל עם תפר המשי מאחורי הלב (איור 8).
    הערה: תפר זה יכול להיות "קשור-מראש" כדי להקל על cannulation.
  26. חבר את צינורית עורק הריאה למעגל זלוף הריאה לשעבר vivo (9 א 'איור). אל תחבר את צינורית הפרוזדור השמאלית למעגל EVLP עד בלוק לב-הריאה הוסר לחלוטין מהגוף.
  27. הצמד את הוושט עם hemostat ולחתוך מתחת למהדק (בין המהדק והסרעפת), כך שהוושט יכול לשמש כדי להעלות את cephalad מבני הלב-הריאה.
  28. בבוטות לנתח את הרקמה שמסביב ולחתוך את אב העורקים היורדים וכלי עזר כדי לשחרר את חסימת לב-ריאה בזמן שהוא העלה דרך הוושט (איור 9).
  29. Transect קנה הנשימה cephalad לקנה הנשימה הצינורית ללגמרי בחינם בלוק לב-ריאה.
  30. להסיר את חסימת לב-ריאה ואת המקום בdesiמיקום gnated על מעגל EVLP (איור 9 ג).
  31. חבר את צינורית אטריום שמאל לקו יצוא ולהתחיל את משאבת peristaltic העיקרית (איור 9 ד).

4. Ex Vivo זלוף של הריאות

  1. להסיר במהירות את קו האוורור מהחלק העליון של מכשיר EVLP ולצרף דיור עם חיישני לחץ, לאחר מכן הכנס את קו האוורור בחלק העליון של הדיור בחלק העליון של מכשיר EVLP.
    הערה: זה יאפשר את נתוני האוורור שיירשמו ולחץ במעקב.
  2. ודא מלכודת הבועה מתמלאת בכמות מספקת של perfusate כך שאין בועות אוויר (כלומר, אוויר תסחיפים) הם הציגו לריאות.
  3. לאט לאט לשנות את הגדרות אוורור וזלוף לרמות ניסוי רצויים במהלך 15 דקות הראשונות. בנוסף, בשלב כבש את ראשוני זה, להגדיל את קצב זרימת זלוף לשיעור ו / או לחץ הרצוי.
    הערה: Programming ההנשמה לייצר נשימות אנחה לסירוגין, המאפשרות תנועה של נוזל מתוך חלל הריאות ולכן לעכב את התחלתה של בצקת, מומלץ. אלה יכולים להיות מיוצרים על ידי מאווררים מצוידים בפונקצית האנחה.
  4. להגדיר "זמן 0" כזמן שבו פרמטרים אוורור בהיקף של גאות ושפל של 4 מיליליטר / קילוגרם, PEEP ב -2 סנטימטרים H 2 O, ופרמטרי זלוף נמצאים ברמות הצפויות שלהם ונותר קבוע.
  5. אם יש צורך, לקחת דגימות perfusate מנמל המדגם, פלאש ההקפאה בחנקן נוזלי, ושים לב לזמן של הדגימות.
  6. כאשר הניסוי הושלם, לבודד כל חלקים אנטומיים הנדרשים לאיסוף וגם הקפאת הבזק בחנקן נוזלי או מקום בקביעת פתרון למחקרים נוספים.

Representative Results

נתונים מכאניים בזמן אמת שנאספו במסגרת תכנית רכישת נתונים יכולים בקלות להיות מנותחים לבדוק כל מספר של השערות. לדוגמא, איור 10 א מציג את המשקל הממוצע ריאות באמצעות 60 דקות מ -10 ניסויים בעכברים שבו בעלי חיים היו מאווררים עם נפח של גאות ושפל / PEEP נמוך נמוך של 4 מיליליטר / קילוגרם ו -2 CMH 2 O. למרות שיש עלייה קטנה מאוד במשקל ריאות לאורך כל הניסוי, גידול זה אינו מובהק סטטיסטי (ANOVA, p = 0.92). איור 10 ב מראה את הלחץ ריאתי עורקים הממוצע (PAP) באמצעות 60 דקות מ -12 ניסויים בעכברים. PAP הנמוך בנקודת הזמן 0 דקות הוא תוצאה של הגדרות זרימה ותחלופת אוויר נמוכות בשימוש בתחילת כל הניסויים וPAP נשאר קבוע לאחר זמן נקודה, ללא שינויים משמעותיים מבחינה סטטיסטית זה אחרי t = 10 דקות (ANOVA על שורות, עמ ' = 0.89). איור 10C מציג את ההתנגדות של כלי דם ריאתי (PVR) באמצעות 60 דקות מעכברוש 12ניסויים ולמרות שיש ירידה קטנה בPVR אחרי t = 20 דקות, לא היה הבדל משמעותי מבחינה סטטיסטית בPVR במהלך ניסוי זה (ANOVA על שורות, p = 0.65). בהשוואה לנתונים PVR המוצגים כאן, אל הנודע et. הראה PVR להגדיל מעט לאורך זמן במשך 4 שעות. עם זאת, כותבים אלה לדווח נתונים בPVR מתחילים בשעה 1 במקום תחילת הניסוי ולא ערכי סטיית תקן מסופקים 7. נודע בet al. גם לא מראה נתונים בצקת ריאות ל4 ניסויי שעות ולכן אין השוואה יכולה להתבצע עם הנתונים המוצגים כאן באיור 10 א. הבדלים עיקריים באל הנודע et. הליך בהשוואה למה שמוצג במאמר זה כולל: שימור קר 1 שעה בפתרון LPS לפני EVLP, חולדות בתחילה מאוורר בתערובת גז הכולל isoflurane כדי להבהיר להם לא מודע, פתרון perfusate היה בתוספת 50 מ"ג ו -50 מ"ג methylprednisolone של צפלוספורין, fl הכוללow הוגדר כ-20% מתפוקת הלב מחושבת, דגימות perfusate נלקחו רק לאחר הריאות היו מאווררות על 100% O 2 דקות 5 לפני והניסוי לרוץ במשך 4 שעות.

דגימות שנלקחו במהלך הניסוי מperfusate גם ניתן לנתח למטרות רבות. כדוגמא, באיור 11 אנו מדגימים כיצד בנפח גבוה / אוורור PEEP גבוה של גאות ושפל יכול לגרום לתגובה הפרו דלקתית ב -60 דק '. בניסויים אלה, perfusate מ4 חולדות מאווררות בתנאים פוגעניים, כלומר, נפח של גאות ושפל גבוה של 10 מיליליטר / ק"ג וגבוה PEEP של 8 CMH 2 O, נותחו לסטנדרטי באמצעות ציטוקינים דלקתיים ואנטי-פרו IL1β, TNFα וIL4 טכניקות ELISA. כפי שניתן לראות באיור 11, בהשוואה לרמות ציטוקינים לפני האוורור (0 דקות), 60 דקות של אוורור פוגעני הביאו לעלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בIL-1β וTNFα (ציטוקינים פרו-דלקתיים) nd לא חלה שינוי בIL-4 (ציטוקין אנטי דלקתי) ריכוז. לכן, מערכת EVLP זה היא מסוגלת ליצור פרופילי פציעת ריאות נפוצות שנצפו במהלך אוורור מכאני.

איור 1
איור 1. תרשים ותצלום של מעגל הקטן של בעלי החיים לשעבר vivo זלוף ריאה (EVLP). מכתבים בתרשים מתאימים עם אותיות שבתמונה. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
מתמרים איור 2. כל אופן מאובטח מחוברים לקופסות הבקרה."> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. שולחן ניתוחי העכברוש מוגדר היטב עד סמוך למעגל vivo לשעבר זלוף ריאה (EVLP). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. (א) מבצעת חתך cranially לחשוף את קנה הנשימה. חלל החזה אינו חשוף. תפר משי (B) ממוקם מאחורי קנה הנשימה. (C) קנה הנשימה היא לחתוך באופן חלקי כדי להתכונן לcannulation. (ד) הצינורית לקנה הנשימה ממוקמת לתוך positio n ומאובטח עם תפר משי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. (א) חלל החזה משוך לאחור כדי לאפשר גישה ללב ולריאות. הכנה (B) להצבת תפר מאחורי עורק הריאה. (ג) בעורק הריאה הוא cannulated וקשר עם תפר המשי הוצב בעבר. (D) K + תמיסת אלקטרוליט נמוכה סמוקה דרך עורק ריאה ואת הפרוזדור השמאלי כדי להסיר כל קרישי דם. אנא לחץ כאן לצפייה גדולה יותר גרסה של נתון זה.

lways "> איור 6
איור 6. הגדלת זרימת דם ריאתי עורקים כאשר שטיפת הריאות עלולה לגרום ללחץ דם ריאתי עורקים להגדיל באופן דרמטי. אם cannulation בוצע כראוי ואין חסימה גדולה, הלחץ יורד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

איור 7
תפר 7. משי איור ממוקם סביב כל הלב בהכנה לcannulation הפרוזדור השמאלי. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

n-page = "תמיד"> איור 8
איור 8. צינורית אטריום השמאל היא מאובטחת במקום עם תפר משי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 9
9. (א) צינורית עורק הריאה איור מחוברת ללשעבר vivo מעגל זלוף ריאה. (ב) הוושט הוא הידק ורקמת החיבור היא גזור בצורה בוטה כדי להסיר את גוש לב-ריאה. גוש לב-הריאה (C) הוא להסיר את חלל החזה והניח לתוך לשעבר vivo מעגל זלוף ריאה. אטריום השמאל (D) מחובר ללשעבר vivo מעגל זלוף ריאה. href = היעד "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 10
איור 10. (א) במשקל ריאות של חולדות ספראג Dawley גבריות באמצעות 60 דקות של זלוף vivo לשעבר ריאות (n = 10). לחץ דם ריאתי עורקים של חולדות ספראג Dawley גבריות באמצעות 60 דקות של זלוף vivo לשעבר ריאות (n = 12) (ב). התנגדות כלי דם ריאתי של חולדות ספראג Dawley גבריות באמצעות 60 דקות של vivo לשעבר זלוף ריאה (n = 12) (ג), NS מציין שאין הבדל מובהק סטטיסטי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

</ Html "איור 11" src = /> "/ קבצים / ftp_upload / 52,309 / 52309fig11highres.jpg"
איור 11. השפעת אוורור 1 hr בהיקפים של גאות ושפל גבוהים (10 מיליליטר / קילוגרם) וגבוה PEEP (8 CMH O 2) בריכוזי ציטוקינים דלקתיים ואנטי-פרו בperfusate. N = 4, * מציין הבדל מובהק סטטיסטי עם ביחס למדגם hr 0 (p <0.05). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 12
איור 12. (א) איוורור כראוי ומרוסס ריאה מחוברת למעגל EVLP. לחץ גבוה חיובי הסוף-נשיפה (PEEP) (ב) גורם מדמיע בהסתעפות קנה הנשימה גורם לבועות כדי ליצור בפציעה ולמלא את בית החזה המלאכותי. es / ftp_upload / 52,309 52309fig12large.jpg "target =" / _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 13
איור 13. (א) צינורית עורק ריאה. צינורית זו היא קטנה יותר מצינורית הפרוזדור השמאלית. (ב) צינורית אטריום שמאל. צינורית זו היא הרבה יותר גדולה מצינורית עורק הריאה. צינורית קנה נשימה (C). יש צינורית זה צלעות כדי לסייע באבטחת קנה הנשימה עם תפר משי. הסוף שמוכנס לתוך קנה הנשימה הוא גם ציין מעט כדי לסייע בהחדרת הצינורית לקנה הנשימה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

09fig14highres.jpg "/>
איור 14. (א) לשיא הלב מוחזק על ידי זוג המלקחיים כחדר ממני עומד להיות חרות על מנת cannulate עורק הריאה. (ב) התרחבות של annulus שסתום צניפי עם זוג של טנדרים בוטים הסתיים קטנים עושה את זה קל יותר לדמיין את דרכי לעלייה השמאלית. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מערכת ניטור

איך דברים נראים בעת הניסוי פועל היטב:

ברגע שcannulae הוצב במעגל וריאות אוורור, יש דרכים רבות כדי להבטיח את המערכת פועלת כהלכה. לא צריך להיות שום הדלפות של perfusate לאורך הקו. התנגדות הריאות וכלי הדם (PVR) צריכה להישאר קבועה יחסית (בהנחה שזרם בלתי פוסק). חילופי החמצן צריכים להגדיל פעם ההנשמה פועלת כהלכה והרחבת הריאות לגייס יותר alveoli לחילוף גזים. איור 12 א תערוכות מאווררים כראוי וperfused ריאות מחוברות למעגל EVLP בתוך בית החזה המלאכותי.

איך דברים נראים בעת הניסוי אינו פועל היטב:

יש כמה בעיות נפוצות שיש לי השיעור הגבוה ביותר של התרחשות במהלך השלבים הראשונים של ניסוי EVLP. T הראשון והקל ביותרo תרופה היא דליפה בקו יציאה מהריאות. הדבר בולט בברכה של איגום perfusate תחת חלק מהמעגל והרמה במאגר יורדת ללא הרף. בדקו ולהדק כל מחברים צינור מסביב לאזור הדליפה ולבדוק את הצינור עצמו לדליפה. אם דליפה זה מתרחשת לפני הריאות, זה יכול גם להכניס בועות לתוך הריאות. זה צריך להיות מתוקן במהירות אפשרית כבועות אוויר בperfusate תגרום נזק לרקמות וגורמות לעלייה משמעותית בPVR. כמו כן יכולה להיות דליפה מגיעה מהריאות או אחד מcannulae. זה עשוי להיגרם על ידי אחד הגלישה של צינורית או חסימה בקו היציאה גורמת להצטברות לחץ. בדוק את המצב עבור שני cannulae כדי להבטיח לא חמק או מעוות. גם הלחץ של הרשות הפלסטינית צריך להיות במעקב במהלך תהליך זה, כי עלייה מיידית בלחץ הרשות הפלסטינית הוא סימן ברור שחסימה מסוג כלשהו התרחשה לאחרונה. איור 12 בתערוכות ריאות מקרע שנקרעו בשל לחצים גבוהים. דליפה מהריאה עצמו עשוי להיגרם גם על ידי קרע ברקמה. בעיה זו עשויה או לא עשויה להיות לתקנו, אך מיקום מחדש וretightening cannulae היא האפשרות הטובה ביותר בתרחיש זה.

למידה נקודות / הזדמנויות עיקריות:

משפט ופיתוח שגיאה של מערכת זלוף הריאה לשעבר vivo אפשר לנו לזהות כמה נושאים מרכזיים שאנו מתארים כאן כדי לסייע ליישום יעיל של מערכת EVLP. ראשית, ביחס לרכש, זה חשוב כי טכניקות הרדמה סטנדרטית הן בעקבות להרדים כראוי בעלי החיים (מספיק חומר הרדמה, זריקה לתוך הצפק) והקפדה על כל פוליסות IACUC נדרש. Cannulae (שמוצג באיור 13 A, B, ו- C) צריך להיות סמוק שוב ושוב על מנת להסיר כל קריש ו / או פסולת בתוך vasculat ריאתייור. עם כל כבוד לבחירה של בעלי חיים, אנו ממליצים להשתמש חולדות ספראג Dawley או לואיס במשקל 250-350 g. יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת cannulating חולדות במשקל קרוב ל- 250 גר 'מאז כלי יהיו קטן יותר, ולכן הרבה יותר קשה cannulate מבלי לפגוע בכלי הדם. אם חולדות קטנות יותר, או מודל של עכברים, הוא לשמש, צינורית קטנה יותר ייתכן שתהיה הצורך בשימוש.

cannulation לקנה הנשימה הוא בדרך כלל לא מאתגר כל עוד התפר מאובטח כראוי על ידי העברה הראשונה אחורי תפר משי לקנה הנשימה לאחר לנתח fascia שמסביב ולפני cannulation. בצע את זה עם טבעות לקנה הנשימה חתך 1-2 קדמית מעל התפר לעבור את הצינורית. לקשור קשרים מרובעים בין הטבעות לקנה הנשימה כדי לאבטח אותו בתוך חריץ לאבטחה טובה יותר (איור 4C). Cannulation של עורק הריאה (PA) הוא מאתגר יותר בהשוואה לצינורית לקנה הנשימה. הצעדים הבאים היו בשימוש במחקר זהלהליך זה. ראשית, לתפוס את קודקוד לב עם זוג המלקחיים. תעבור עוד זוג מלקחיים בסינוס הרוחבי וחוט תפר כדי לאבטח את הצינורית ברשות הפרוקסימלי. לחתוך את החדר ממני מייד לפני מערכת יצוא החדר ממני (RVOT) (איור 14 א). לאחר החתך לRVOT, הצינורית תהיה לכוון את מערכת יצוא עורק הריאה. לאחר התפר בעמדה מאחורי עורק / אב העורקים ריאתי לפני ventriculotomy תקין מגביר את יעילות (איור 5 ג). הצינורית צריכה להיות מאובטחת למקום עם התפר כדי למנוע ליפה. סיבוך עיקרי יכול להתרחש אם צינורית הרשות הפלסטינית אינה בכיוון הנכון אנטומיים. הצינורית עשויה להיות מוכנסת רחוקה מדי ורק תנקב סניף אחד או להיות עם פיתול של דגימת לב-ריאה עם ההסרה מחלל חזה מיקום mal. זה בקלות יכול להיות מכוון בחזרה למיקום המקורי כדי לשמור על הזווית הנכונה של anatomiעמדת cal. לבסוף, cannulation שמאל פרוזדורים (לוס אנג'לס) הוא החלק המאתגר ביותר של ההליך. צינורית LA צריכה להיות ממוקמת בתוך הפרוזדור השמאלי. עם הרקמות להיות מאוד פריכים, להיות מודע לא להשתמש בכוח או פיתול משמעותי על מנת למנוע קרע בעורק הריאה ואטריום שמאל שלאחר מכן לבצע את הניסוי unsalvageable. צינורית הרשות הפלסטינית ממוקמת הטוב ביותר לפני צינורית LA. Ventriculotomy שמאל עם הסרת הקודקוד הוכח לשבש את tendinae cordae ולאפשר גישה קלה יותר באמצעות עלוני צניפי. כמו כן, ventriculotomy מקל להתרחב ולדמיין את שסתום צניפי ולהאכיל את הצינורית דרך שסתום צניפי. התרחבות של annulus שסתום צניפי עם זוג של טנדרים בוטים הסתיים קטנים ניתן לעשות על מנת להמחיש את דרכי ללוס אנג'לס (איור 14 ב). תפר צריך להיות ממוקם מאחורי הלב לפני cannulation. ניתן לעשות זאת פשוט על ידי הרמת לבו של דבר באמצעות זוג small הבוטה, הסתיים טנדרים והצבת התפר מתחת ועל פני הלב. LA מוכן לcannulated עכשיו. להאכיל את הצינורית דרך LA הטנדרים כדי להמחיש כראוי את המיקום של הצינורית לתוך הפרוזדור השמאלי. קח טיפול מיוחד שלא לעקור את הצינורית בחזרה לתוך החדר השמאלי. התפר אמור להיות מאובטח היטב לאורך שריר הלב של החדר השמאלי. הבטחת התפר לאטריום השמאל יכול לחסום את כל או חלק מהצינורית.

במהלך ההליך, זה קריטי, כי אין אוויר יישאר בסעיף יבוא של המכשיר. כל אוויר משמעותי יכול לייצר תסחיף אוויר להגדיל את PVR (ביעילות "אוויר-מנעול") אשר יגרום לזרימת perfusate נמוכה בהרבה לחצים נתון. נקודות שונות יכולות לשמש כדי להסיר את האוויר בתוך המערכת. אוויר בתוך סעיף יצוא צפוי ולא צריך להיות שום השפעה מזיקה על הריאות. מודל חזירי ללחץ דם ריאתי כברמוצג לשחזר את הפתולוגיה מכמויות קטנות רציפות של אוויר במשך 8 שבועות. האוויר המוגבר מפחית את כמות הנוכחית זלוף, תוך גרימת דלקת ברקמות המקיפות את 19.

תחילתו של זלוף יכולה להתרחש פעם cannulation הושלם אך לפני הצינור שמגיע מלוס אנג'לס מחוברת לקו EVLP. יש להפעיל perfusate דרך לנקות את כל קרישי דם וperfusate זה יכול לרוקן אותם לקיר החזה ללא כל בעיות. החלפת משאבת perfusate למצב ידני והגדלת קצב הזרימה ל~ 2 מיליליטר לאט / min מאפשר מעקב צמוד של לחץ הרשות הפלסטינית. לחצים על 20-30 CMH 2 O יכולים להצביע על חסימה וצופים לperfusate יציאת LA הוא גם אינדיקטור אבל זה יכול להיות קשה מאוד לראות. אם הלחץ אינו להגדיל ליותר מ 20-30 CMH 2 O, לעצור את המשאבה ולבדוק שוב את שני cannulations. ברגע שהלחץ הוא קבוע סביב 10-20 CMH 2 O לאפשר הperfusate הדואר לרוץ דרך ולתוך חלל החזה למשך 2 דקות. בשלב זה הקו מLA יכול להיות מחובר למעגל EVLP. מהירות משאבת perfusate ניתן להגדיל 5-10 מיליליטר / דקה. כנוזל הראש מתקדם במעגל, יהיה גידול בלחץ הרשות הפלסטינית בשל העלייה בגובה של נוזל הראש ולכן הלחץ הסטטי. אם הנוזל לא יכול לזרום מעל הנקודה הגבוהה ביותר בענף, ייתכן שיהיה צורך לאו להחיל כוח יניקה בצד השני של הקו, או תנסה להוריד את האחוז הגבוה ביותר של הקו. ברגע שהנושא הזה הוא להתגבר, perfusate צריך לזרום ללא כל בעיות.

כמה בעיות צריכים להיות במעקב ביחס למכונת הנשמה. ראשית, פיתול של הסמפונות / קנה נשימה ומיקום לב-ריאה עלול להתרחש כריאות נעשות יותר בצקים ועליות במשקל. זה חשוב לcannulae להישאר בעמדה אנטומיים קרובה יחסית, ולכן שינוי או שניהם הצינוריתדואר עשוי להיות נחוץ. לחץ או מאווררי נפח נשלט וכן אוורור חיובי או שלילי ניתן להשתמש במערכת EVLP זה. למודל של החולדה, שמצאנו באמצעות לחץ חיובי, אוורור נפח מבוקר עובד היטב בהיקפים של גאות ושפל בין 4-10 מיליליטר / ק"ג ובלחצים חיוביים הסוף-נשיפה (PEEP) בין 2-8 CMH 2 O. עם זאת, PEEP של 8 CMH 2 O יכול לגרום לקרע אפשרי בהסתעפות של קנה הנשימה. לאחר כל ניסוי (או קבוצה של ניסויים אם ביצעו גב-אל-גב), קו האוורור המוביל לקנה הנשימה יש לנקות מכל נוזל שטיפת רונכואלוואולרית (BAL) שאולי נסע עד לקנה הנשימה. נוזל זה יקשיח אם נותר ללא שינוי והוא יכול לחסום את קו האוורור לגמרי.

הרכב perfusate הוא קריטי לניסוי EVLP מוצלח. תערובת dextran 5% מאפשרת לזלוף ריאה שקרוב לתנאים פיסיולוגיים, שומרת על לחץ oncotic יציב לנהוג ב נוזלack לכלי הדם כדי למנוע בצקות ומונעים קרישים בתוך כלי ריאתי. חשוב לציין כי כמה מינים של חולדות יכולים להיות אלרגיים לdextran שעלול לגרום לבצקת ריאות 20. התוכן של perfusate היה עקבי בכל קבוצות הניסוי במחקר זה, ולכן התוכן dextran לא צריך להיות גורם מתערב אפשרי. לחץ oncotic הוא משתנה קריטי שיש לו הפוטנציאל לשיפור או לייצר בצקת רקמה. פתרונות זלוף זמינים מסחרי שאינם מותאמים לאחסון סטטי קר או הזלפות normothermic כבר בשימוש במערכת זו כדי להגדיל את כדאיות פעמים ריאות. נציין כי חלק מהפתרונות אלה מכילים אלבומין ודאגה אחת היא האפשרות של אלבומין השור מפעילה תגובה דלקתית בריאות מכרסמים. למרות הרכב perfusate האופטימלי הוא נושא מתמשך של חקירה, perfusate צריך לקחת בחשבון את לחץ oncotic, קיבולת לחץ האוסמוטי וחציצה. Wדואר ממליץ שהפתרון יתבסס על תקשורת פתרון או תרבית תאי קרבס-Henseleit שונה. לחץ oncotic צריך להיות מתוחזק על ידי dextran או אלבומין, בהתאם ליישום. שיעור לחץ זלוף והזרימה משפיע על הפרמטרים זלוף האיבר והעל-פיסיולוגי יכולים להפוך את האיבר נוטה טראומה מכאנית.

מחוונים חזותיים במהלך ניסוי:

יש הרבה רמזים חזותיים כמו גם אינדיקציות מנתונים בזמן אמת, שניתן להשתמש כדי לקבוע אם ניסוי EVLP פועל היטב. הריאות תישאר באותו הגודל ולהוציא את האוויר לאותו הנפח אחרי כל נשימה. יהיה גם לא דולפים מהריאה עצמו. PVR, משקל ריאות, והתאימות יישארו קבועים יחסית. ייצור חמצן יישאר קבוע או להגדיל מעט.

ישנם אינדיקטורים חזותיים רבים, כאשר הריאות הופכת נפגעו במהלך ניסוי. הריאות הופכת לבצקיםnd גדל במהירות בגודל ובמשקל. הצבע של שינויי הריאות (משיזוף-ורוד ללבן) וכיסים של נוזל יכול להיות מזוהה ברקמות. אם קרעי קנה הנשימה או ריאות בארוטראומה או על התנפחות, שם יהיה מבעבע מנקודת פגיעה (איור 12 ב). ייצור חמצן יקטן וPVR ועמידה באופן דרמטי יגדלו גם כן.

הפוטנציאל של שימוש במודל EVLP על בעלי חיים קטנים כמו מכרסמים פותח את הדלת למחקרים עתידיים שיפור הטיפול בהשתלות ריאה. עם זאת, מודל החיה הקטן דורש הבנה טובה יותר באמת לחקות השתלת ריאות. מודל זה עשוי לשמש בעתיד לשיפור טיפולים רפואיים ולהגדיר פרמטרים בסיסיים ללימודי השתלת ריאות בעתיד.

Disclosures

אף אחד

Acknowledgements

המחברים רוצים להכיר הסיוע של הרווארד Apparatus, במיוחד סטפני Pazniokas, MS (פיזיולוגיה מערכות ורפואת רגנרטיבית) על סיועם במעגל הרכבה, שינוי ופתרון בעיות של מעגל זלוף וXVIVO זלוף (דניאל מרטינלי, המפלגה הקומוניסטית הסינית, CTP) ל מתן שימוש לא-קליני plegia ריאתי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics