고립의 방법 * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

생체 외 관류 폐 (EVLP)은 인간의 폐 이식 더욱 쉽게 이용할 공여체 풀 장기를 평가하고 확장 할 수 있도록함으로써 될 수있다. 여기서는 쥐 EVLP 프로그램 및 미래의 확장을위한 재현성있는 모델을 허용 세목의 개발을 기술한다.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

폐 이식 가능한 허용되는 도너 폐의 수는 열악한 품질을 심각하게 제한한다. 생체 외 폐 관류 (EVLP)은 인간의 폐 이식 더욱 쉽게 이용할 공여체 풀 장기를 평가하고 확장 할 수 있도록함으로써이 될 수있다. 이 기술은 확장되고, 잠재적으로 평가하고, 종래에 미달 폐 이식의 품질을 개선 할 수있는 능력을 향상 등이 중요한 필요성이있다. 더 엄밀하게 이러한 접근을 평가하기 위하여, 재생 가능한 동물 모델은 기부 폐의 개선 된 기술 및 관리의 테스트뿐만 아니라 폐 이식받는 사람에게 허용하는 것을 확립 할 필요가있다. 또한, 예를 들면 관련 병증, EVLP의 동물 모델은 환기 유도 폐 손상 (VILI)는,이 병변에 대한 치료를 평가하는 신규 한 방법을 제공하는 것이다. 여기, 우리는이 나에게 쥐 EVLP 폐 프로그램과 개선의 발전을 설명미래의 확장을위한 재생 가능한 모델을 허용 THOD. 우리는 또한이 EVLP 시스템의 응용 프로그램이 쥐의 폐에 VILI을 모델로 설명합니다. 목표는 키 정보와 "지혜의 진주"시행 착오에서 일어나 강력하고 재현 EVLP 시스템 구축에 중요한 / 기술과 연구 커뮤니티를 제공하는 것입니다.

Introduction

임상 관련성

이식 1을 기다리고 죽어가는 장기화 대기 목록 시간에 이르는 전국적으로 활용 될 수있는 폐 또는 환자의 단지 19 %와 이식 가능한 적절한 폐의 소수 현재 있습니다. 부족은 이전 기증자, 외상, 감염, 멀티 시스템 장기 부전 및 수확 2시 때때로 부상 기증자의 폐에 기인 할 수있다. 또한, 폐 흉강 및 표준 전송 및 보존 기술 외부 연약한 장기 열화가 아닌 폐 생존을 초래할 수있다. 따라서, 유지 및 폐 생존 ​​전 생체을 개선하는 것은 최근 폐 이식 의학의 주요 초점이되었다.

전 생체 폐 관류 (EVLP)

전 생체 폐 관류 (EVLP)는 지속적으로 이식에 대한 평가되는 기관을 관류하는 발전해 왔으며, 모든 평가의 기간을 수있다폐 소생술 또는 재조정의 잠재력에 대한 OWS. EVLP는 신체 기관 허혈 시간이 총을 연장하고 기증 된 장기가 더 거리 (3)를 여행 할 수 있습니다. 일반적으로, 폐는 50 % 4 30 % 50 총 폐활량 % 또는 영감 산소 피크 분획기도 압 20 CMH 2 O (FIO 2)에 통풍된다. 보존 용액은 인간과 동물 큰 5,6- 40-60 ㎖ / kg (100 ㎖ / kg의 예측 된 심 박출량의 약 40 %)에서 관류하지만 쥐 7 심 박출량의 약 20 %로 관류시켰다. STEEN 솔루션의 포함은 인간의 폐는 폐 부종 9의 개발없이 RT 환경에서 여행 할 수있다. 이 선구적인 작품은 토론토 대학의 폐 이식 프로그램 10-13으로 정제 된 이식 (14, 15)에 대한 한계 공여 폐의 개선 평가를 위해 평가되고있다. 그러나, 최적의 환기 시스템이식 한계 및 / 또는 표준 이하의 폐를 재생하는 데 필요한 n 및 관류 조건은 알려진 현재 연구의 활성 영역입니다하지 않습니다.

격리 폐 관류 시스템은 폐 손상, 호흡기 질환을 다시 작성 일으키는 작은 동물에 사용 허혈성 손상을 방지하기 위해 상이한 솔루션 폐를 관류되었다. 연구자들은 인간과 동물 큰 16-18에서 사용될 수 EVLP 프로토콜을 모방 격리 폐 관류 시스템을 사용하여 폐 이식의 작은 동물 모델을 만들었다. 그러나,이 실험 모델은 인간 생리학을 모방하기 위해 사용 된 다양한 파라미터에 대한 기술과 관련하여 다수의 문제점을 갖는다. 특히, EVLP 동안 폐 생존 능력을 유지하는데 많은 미묘한 차이가있다. 이러한 미묘함 때문에 수확 기술 양압 통풍 설정 관류 조성물 및 유동 조건으로 폐 삽관의 차이에 따라 발생할 수있다. 거기는는 efore, 여기에 목표는 우리가 설치류 모델에서 EVLP를 구현하기위한 강력한 방법에 리드를 발견, 문제 해결 및 구현 팁의 번호와 연구 커뮤니티를 제공하는 것입니다.

Protocol

참고 : 모든 절차는 동물 애호 실험실 동물의 관리 및 사용 (IACUC)의 기관 동물 관리 및 국가 연구위원회의 가이드의 가이드 라인에 따라 수행하고 오하이오 주립 대학 IACUC위원회의 승인을 겪고있다.

1. 초기 설정

  1. EVLP 회로를 설정하고 따뜻한 (37 ° C) 관류 전에 전 심어 폐를 통합하여 시스템을 통해 순환 (그림 1)이있다.
  2. 따뜻한 물 37 ° C에 재킷 관류 탱크, 열교환 기, 인공 흉부에 사용 목욕, 및 순환 (그림 1)을 설정합니다.
  3. 탈 산소 솔루션을 실행합니다 (예를 들어, 6 % O 2, 8 % CO 2, 84 % N 2) 현재 가스 필터의 관류를 통해 관류 실험을 위해 ~ 6 % 용존 산소가 확인하기 카운터.
    참고 :이 탈 산소 관류는 평가 O를 할 수 있습니다관류, 사후 장기 내에 도입 산소를 측정하여 폐 기능 F.
  4. (EVLP 회로 및 데이터 수집 / 아날로그 - 디지털 컨버터 박스, 기관 차동 압력 변환기, 호흡 유량 차동 압력 변환기, 폐 중량 변환기 및 펌프 속도 변환기를 데이터 취득 프로그램을 열고 폐동맥압 변환기를 연결할 그림 2).
  5. EVLP 회로 (그림 3)에서 운영 테이블 및 운영 도구를 설정합니다.
  6. 샘플을 얻을 수있는 경우 EVLP 회로에 액체 질소의 작은 컨테이너를 설정합니다.
    참고 : 저자의 시스템은 잠재적으로 폐를 손상 할 수있다 압력 흐름 역학을 중단하지 않고 사전 기관 및 사후 장기 관류를 수집하도록 수정되었습니다.

마취제 및 헤파린, 쥐의 마취 2. 준비

  1. 다음과 같은 개인 보호 장비를 착용 할 것수술 마스크, 수술 장갑, 일회용 가운 : 쥐와 쥐의 조직을 취급하기 전에 (PPE).
  2. 쥐 무게와 무게를 기록한다.
  3. 1200 U / kg 헤파린을 준비합니다.
  4. 먼저 케타민을 제조, 같은 주사기에 60 ㎎ / ㎏의 케타민 (ketamine)과 5 ㎎ / ㎏ 크 실라 모두를 준비합니다.
  5. 복강 쥐에 케타민 (ketamine)과 자일 라진 혼합물을 주입 한 쥐에 대한 5 분 의식이 될 수 있습니다.
  6. 발가락 핀치 반사를 확인하여 적절한 마취를 확인합니다. 쥐가 발가락을 철회하지 않을 경우, 그것은 고통을 느끼고 있지 않습니다.
  7. 운영 테이블에 쥐를 이동 앙와위에서 확보하고, 살균 알코올 스프레이.

3. 추출 및 쥐 폐의 초기 환기

  1. 4-20cm 긴 실크 봉합사 (충분하다 3-0 또는 4-0)를 준비합니다.
  2. 데이터 획득 프로그램을 사용하여 데이터를 기록하기 시작한다.
  3. 수술 가위 복막 캘리포니아를 입력하여, 마취의 적절한 깊이를 확인중간 선 개복술 vity과 하대 정맥에 헤파린을 주입.
  4. 기관이 노출 될 때까지 목에 두개쪽으로지나 흉골 절개를 운반. 흉강 (그림 4A)를 파열하지 마십시오.
  5. 중간 선에서 기관에 후방을 해부 및 기관 (그림 4B)에 실크 봉합 후방을 밀어 넣습니다.
  6. 기관의 앞쪽 부분을 올리고 기관에 높은 연골 고리 사이의 횡 절개를합니다. 이 지점 (그림 4C)에서 기관의 후방 막의 부분을 절단하지 마십시오.
  7. 실크 봉합사 (그림 4D)와 기관 캐뉼라 및 보안과 기관을 Cannulate. 봉합 합자 캐 뉼러의 마이그레이션을 완화하기 위해 격차에 고정되어 있는지 확인합니다.
  8. 환기 회로에 기관 정맥을 연결합니다.
  9. 루 환기를 기계적으로 시작하기 위해 인공 호흡기를 켜십시오NGS.
    참고 : 초기 설정은 O. CMH 2 2 4 ㎖ / ㎏과 기말 양압 (PEEP)의 호흡량로 선택했다 이러한 설정은 초기 설정하고 기관이 생체 외 관류 시스템에 있으면 실험 조건에 따라서 조절 될 수있다.
  10. 흉골 / xyphoid을 통해 흉강을 입력하고 흉골 노치를 향해 두개쪽으로 계속합니다. 폐에 손이 닿지 않도록주의하십시오.
    참고 : 쥐의 폐는 깨지기 쉬운이기 때문에, 어떤 실수로 조작 외상 및 폐부종 (그림 5A)로 이어질 수 있습니다.
  11. 2 견인기를 사용하여 제대로 해부학 (그림 5A)을 노출 흉강을 철회. 다시 한번, 폐에 손이 닿지 않도록주의하십시오.
  12. 약간의 상승과 무딘 절개와 흉선을 제거합니다.
  13. 하대 정맥 (IVC) 또는 장간막 정맥 (MV)를 노출 측에 복부 된 내용을 이동.
  14. IV 중 하나를 절개C 또는 MV는 안락사를 제공하는 쥐에게서 피를 뽑다합니다.
  15. 폐동맥 정맥 (그림 5B)를 확보하기위한 준비 폐동맥과 대동맥에 실크 봉합 후방 배치합니다.
  16. 우심실 유출 관의 앞쪽 표면에 2 ~ 3 밀리미터 절개를 절개되고 주 폐동맥에 캐 뉼러를 배치하고 실크 봉합사 (그림 5C)로 고정.
  17. (좌심실에 대한 액세스를 허용하는 심장의 정점 횡단면 및 폐동맥 통해 밖으로 흉강으로 심장의 정점 통해 ~ 흐르게함으로써 낮은 K + 전해질 용액 15 mL로 폐 혈관 내의 혈전 플러시 그림 5D).
  18. EVLP 회로에 폐동맥 (PA) 정맥을 연결합니다. PA 정맥에 회로에서 나오는 유입 라인이 심장과 폐에 들어가는 공기를 방지하기 위해 관류와 준비가 끝났다 확인합니다.
  19. 켭니다주요 연동 펌프 및 관류 액이 폐동맥을 통해 흉강으로 좌심실에서 실행할 수 있도록 속도 (2 ㎖ / 분 ~) 저로 설정합니다. ** 중요한 단계 **로 스파이크하지 않는 PA 압력을 확인 이 막힘 또는 가난한 삽관 (그림 6) 중 하나의 표시이다.
  20. 연동 펌프의 전원을 끄십시오.
  21. 심실 (그림 7) 주위에 심장 뒤에 실크 봉합사를 놓습니다.
  22. 승모판 통해 정점으로 수술 집게의 작은 쌍을 삽입하여 좌심방을 cannulating의 프로세스를 시작하고, 좌심방으로.
    주 :이 승모판을 넓히고 삽관을 촉진 할 것이다. 적극적인 팽창, 또는 너무 깊이 팽창은, 실수로 효과 조달 렌더링 좌심방을 괴롭히다 수 있습니다.
  23. 마음에서 집게를 제거합니다.
  24. 승모판을 통해에서 왼쪽으로 정점에 좌심방의 캐뉼라를 삽입rium.
  25. 심장 뒤에 실크 봉합사 (그림 8)과 좌심방 정맥을 고정합니다.
    참고 :이 봉합 삽관을 촉진하기 위해 "사전 연결"할 수 있습니다.
  26. 전 생체 폐 관류 회로 (그림 9A)에 폐동맥 정맥을 연결합니다. 심장 - 폐 블록이 완전히 몸에서 제거 될 때까지 EVLP 회로에 좌심방 정맥을 연결하지 마십시오.
  27. 지혈과 식도를 클램프 식도 심폐 구조물 cephalad를 발생하는 데 사용될 수 있도록 (클램프와 다이어프램 사이) 클램프 이하 잘라.
  28. 퉁명스럽게 주위 조직을 해부가 식도 (그림 9B)를 통해 제기됨에 따라 심폐 블록을 확보하기 위해 하행 대동맥 및 보조 혈관을 잘라.
  29. 기관 캐뉼라에 완전 무료 심장 - 폐 블록에 cephalad 기관을 가로로 쪼개다.
  30. 심장 - 폐 블록을 제거하고 DESI에 배치EVLP 회로 (그림 9C)에 gnated 위치.
  31. 유출 라인에 좌심방 정맥을 연결하고 메인 연동 펌프 (그림 9D)를 시작합니다.

폐 4. 생체 외 관류

  1. 신속 EVLP 장치의 상단에서 환기 라인을 제거하고 압력 센서를 하우징에 부착하고 EVLP 장치의 상부에 상기 하우징의 상단에 환기 라인을 삽입한다.
    주 :이 환기 데이터를 기록 및 압력 모니터링 할 수있게 할 것이다.
  2. 기포 (즉, 공기 색전)가 폐에 도입되지 않도록 기포 트랩이 관류 액의 적당량으로 가득 확인.
  3. 천천히 초기 15 분 동안 원하는 실험적인 수준으로 환기 및 관류 설정을 변경합니다. 또한,이 초기 램프 업 (ramp-up) 단계 동안, 원하는 속도 및 / 또는 압력에 관류 유량을 증가시킨다.
    참고 : programm에폐 공간이 부족 유체의 이동을 용이하게 단속 한숨 호흡을 생산하기 때문에 부종의 발병을 지연시키는 인공 호흡기를 보내고, 좋습니다. 이들은 한숨 기능 부착 송풍기에 의해 제조 될 수있다.
  4. 환기 매개 변수가 2cm의 H 2 O에서 4 ㎖ / ㎏, PEEP의 호흡량에있을 때의 시간으로 "시간 0"을 정의하고 관류 매개 변수는 기대 수준이 일정한 나머지.
  5. 필요한 경우, 액체 질소의 샘플 포트, 플래시 동결 관류 액 샘플을 채취하고, 샘플의 시간을주의한다.
  6. 실험이 완료되면, 추가 연구에 대한 솔루션을 고정 액체 질소 또는 장소에 수집 및 중 플래시 동결 필요한 해부학 적 조각을 격리 할 것.

Representative Results

데이터 취득 프로그램을 통해 수집 된 실시간 데이터를 쉽게 기계적 가설 임의의 수를 테스트하기 위해 분석 될 수있다. 예를 들어, 그림 10A 동물 4 ㎖ / ㎏과 2의 낮은 호흡량 / 낮은 PEEP CMH 2 O와 통풍이 된 60 분 10 쥐 실험을 통해 평균 폐 무게를 보여줍니다 전체 실험에서 폐 중량의 매우 작은 증가가 있지만, 이러한 증가는 통계적으로 유의하지 않다 (ANOVA는, p는 = 0.92).도 10b는 12 쥐 실험에서 60 분 내지 평균 폐동맥압 (PAP)을 나타낸다. t가 순위에서 10 분 (ANOVA를 = 후 0 분 시점에서 하부 PAP는 모든 실험 및 PAP의 시작 부분에 사용되는 소유량 환기 설정 결과 유의 한 변화가이 시점까지 일정하게 유지 P = 0.89). 그림 10C (12) 쥐에서 60 분을 통해 폐 혈관 저항 (PVR)를 보여줍니다실험은 t = 20 분 후에 PVR의 작은 감소가 존재하지만, PVR에서 통계적으로 유의 한 차이는이 실험 중에 없었다 (ANOVA 계급에, p = 0.65). 여기에 표시된 PVR 데이터와 비교, 노다 등 알. 4 시간 동안 시간이 지남에 따라 약간 증가 할 수있는 PVR을 보여 주었다. 그러나, 이들 저자들은 대신 한 실험의 시작 시간과 표준 편차 값이 7 제공되지에서 시작 PVR에 데이터를보고한다. 노다 등. 또한 그래서 비교도 10a에 여기에 제시된 데이터로 수행 할 수 없습니다 4 시간의 실험 폐부종 데이터를 표시하지 않습니다. 노다 동부 등 주요 차이. 이 논문에 표시됩니다 것과 비교 절차는 다음과 같습니다 EVLP 전에 LPS 솔루션에서 1 시간 저온 보존이, 쥐가 처음 그들을 의식이 렌더링 이소 플루 란을 포함하는 가스 혼합물로 환기하고, 관류 솔루션은 메틸 프레드니솔론 50mg을 50 mg을 보충했다 세 팔로 스포린의 총 FL계산 된 심 박출량의 20 %가, 관류 샘플 폐는 5 분 이전에 대한 100 % O 2에 통풍이되었고 실험 4 시간 동안 실행 된 후에 만 찍은으로 흐름 정의 하였다.

관류에서 실험시 사용하는 샘플은 많은 목적에 대해 분석 할 수있다. 예를 들어, 그림 11에서 우리는 60 분에서 프로 염증 반응을 유도 할 수있는 방법 높은 호흡량 / 높은 PEEP 환기 보여줍니다. 이 실험에서, 쥐 4 마리의 관류는 유해한 조건, 즉, 10 ㎖ / ㎏ 8의 높은 PEEP CMH 2 O의 높은 호흡량에 따라 통풍, 프로와 항 염증성 사이토 카인 IL1β, TNFα 및 IL4 사용하여 표준 분석 하였다 ELISA 기법. 싸이토카인 환기 전 (0 분)에 비해,도 11에 도시 된 바와 같이, 유해한 배기 60 분의 IL-1β 및 TNFα (염증 유발 성 사이토 카인)의 통계적으로 유의 한 증가를 초래 ND IL-4의 변화없이 (항 염증 사이토 카인) 농도. 따라서,이 시스템은 EVLP 일반적 기계 환기 동안 관찰 폐 손상 프로파일을 생성 할 수있다.

그림 1
그림 1. 다이어그램 및 작은 동물 생체 외 폐 관류 (EVLP) 회로의 사진. 그림의 편지는 사진에 문자와 일치합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
그림 2. 모든 트랜스 듀서는 안전하게 컨트롤 박스에 연결되어 있습니다.">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 쥐 운영 표는 안전하게 생체 폐 관류 (EVLP) 회로에 인접하여 설정되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
도 4 (A) 기관 절개를 노출 두개쪽으로 이루어진다. 흉강는 노출되지 않습니다. (B) 실크 봉합사 기관 뒤에 배치됩니다. (C)은 부분적 기관 삽관을 준비하기 위해 절단된다. (D) 기관 캐뉼라를하여 위치 될에 배치됩니다 n 및 실크 봉합사로 고정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5
그림 5. (A) 흉강은 심장과 폐에 액세스 할 수 있도록 다시 뽑아입니다. 폐동맥 뒤에 봉합을 배치하는 (B) 준비. (C) 폐동맥이 유관과 이전에 배치 실크 봉합사로 연결됩니다. (D) 낮은 K + 전해질 용액은 혈전을 제거하는 폐동맥을 통해 좌심방에서 플러시됩니다. 더 큰 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림의 버전입니다.

> "법이지 그림 6
삽관이 제대로 수행되고 더 큰 막힘이없는 경우 폐 플러시. 극적으로 증가 폐동맥 압력이 발생할 수 있습니다 때 폐 동맥의 흐름을 증가 그림 6. 감소한다 압력이. 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다 .

그림 7
그림 7. 실크 봉합사 좌심방 삽관에 대비하여 전체 심장 주위에 배치되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

N-페이지 = "항상"> 그림 8
좌심방 정맥은 실크 봉합사와 장소에 고정 그림 8. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9
그림 9. (A) 폐동맥 정맥은 전 생체 폐 관류 회로에 연결되어 있습니다. (B)는 클램프된다 식도 및 결합 조직은 직설적 심폐 블록을 제거하기 위해 해부된다. (C) 심장 - 폐 블록은 흉강에서 제거 전 생체 폐 관류 회로에 배치됩니다. (D) 좌심방은 생체 외 관류 폐 회로에 접속된다. = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg"대상 = "_ 빈"HREF>이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10
그림 생체 폐 관류 (N = 10)의 60 분을 통해 남성 스프 라그 돌리 쥐의 10 (A) 폐 무게. (B) 생체 폐관 (N ​​= 12)의 60 분 내지 수컷 스프 라그 돌리 래트의 폐동맥압. (C) 생체 폐 관류 (N = 12)의 60 분을 통해 남성 스프 라그 돌리 쥐의 폐 혈관 저항이, NS는 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

</ HTML "그림 11"SRC = "/ 파일 / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg"/>
그림 11. 효과 관류에서 프로와 항 염증성 사이토 카인의 농도에 1 시간 높은 호흡량에 환기 (10 ㎖ / ㎏)과 높은 PEEP (8 CMH 2 O)의. N = 4, *는 통계적으로 유의 한 차이를 나타냅니다 존경 0 시간 샘플 (P <0.05)로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12
그림 12. (A)이 제대로 환기 및 EVLP 회로에 접속 폐 관류. (B) 높은 기말 양압 (PEEP)는 부상에서 형성 인공 가슴을 채우기 위해 거품을 일으키는 기관 분기점에서 눈물을 발생합니다. ES / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 13
그림 13. (A) 폐 동맥 정맥. 이 캐 뉼러는 캐 뉼러 좌심방보다 작다. (B)는 심방 정맥을 왼쪽. 이 정맥은 폐 동맥 정맥보다 훨씬 더 크다. (C) 기관지 정맥. 이 정맥은 실크 봉합사와 기관을 확보에 도움이 갈비뼈가 있습니다. 기관에 삽입 끝은 약간 기관에 캐뉼라를 삽입에 도움이 지적되고있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

09fig14highres.jpg "/>
도 14 (A)는 심장 에이펙스 우심실은 폐동맥 cannulate을 위해 절개 되려고 같이 포셉 쌍에 의해 유지된다. (B)는 작은 무딘 종단 픽업 한 쌍의 승모판 륜의 팽창이 쉽게 좌심방에 기관을 시각화 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

시스템 모니터링

어떤 일이 실험이 잘 실행되고있을 때 같이 :

캐 뉼러가 회로에 배치되어 있고 폐 환기되면 제대로 작동하는 시스템을 보장하기 위해 여러 가지 방법이 있습니다. 라인 전체에 관류 액의 누출이 없어야합니다. 폐 혈관 저항 (PVR)은 (일정한 흐름을 가정 할 때) 상대적으로 일정하게 유지해야한다. 산소 교환은 인공 호흡기가 제대로 작동하고 가스 교환에 대한 더 많은 폐포 모집 폐를 확장되면 증가한다. 그림 12a는 제대로 인공 흉부 내부의 EVLP 회로에 접속 폐 환기와 관류를 보여줍니다.

어떤 일이 실험이 잘 실행되지 않을 때처럼 :

EVLP 실험의 시작 단계 동안 발생의 가장 높은 비율을 가지고있는 몇 가지 일반적인 문제가 있습니다. 첫 번째 쉬운 t오 치료는 폐에서 배출되는 라인에 누수가있다. 이 회로 지속적으로 감소 저수지 수준의 부분에서 관류 풀링의 수영장에서 눈에 띈다. 확인하고 누출 지역 주변에있는 튜브 커넥터를 조여 누수 관 자체를 검사합니다. 이 누설이 발생하면 폐 전에, 또한 폐에 기포를 도입 할 수있다. 관류에서 기포가 조직 손상 및 PVR의 상당한 증가를 야기하므로 이는 가능한 신속하게 해결 될 것이다. 또한 폐 또는 캐 뉼러 중 하나에서 오는 누수가있을 수 있습니다. 이 정맥 중 하나 미끄러짐 또는 압력 상승을 유발 종료 라인에 장애물로 인해 발생할 수 있습니다. 모두 캐 뉼러가 없도록하는 어느 쪽도 하락 또는 꼬의 위치를​​ 검사합니다. PA 압력의 순간적인 증가가 어떤 종류의 폐색 최근 발생했음을 명백히 부호이기 때문에 PA 압력은이 프로세스 동안 모니터링해야한다.도 12B때문에 높은 압력에 파열 파열 된 폐를 보여줍니다. 폐 자체에서 누수 또한 조직의 눈물로 인해 발생할 수 있습니다. 이 문제는 또는 수선 할 수있는하지만 재배치하고 캐 뉼러의 보강은이 시나리오에서 최선의 선택되지 않을 수 있습니다.

주요 학습 포인트 / 기회 :

시행 전 생체 폐 관류 시스템의 오류 개발은 우리가 EVLP 시스템의 효율적인 구현을 용이하게하기 위해 여기에 윤곽을 몇 가지 주요 문제를 식별 할 수있다. 첫째, 조달과 관련하여,이 표준 마취 기술이 제대로 필요한 모든 IACUC 정책을 동물 (복막에 충분한 마취, 주사)과 준수를 마취에 따르는 것이 중요하다. (도 13 A, BC에 도시)을 캐 뉼러를 반복적 vasculat 내의 폐 혈전 및 / 또는 부스러기를 제거하기 위해 플러싱되어야올바. 동물의 선택과 관련하여, 우리는 250-350g의 무게 스프 라그 또는 루이스 쥐를 사용하는 것이 좋습니다. 혈관을 손상없이 cannulate 더 작은 때문에 훨씬 더 어려울 것이다 혈관 때문에 가까운 250g에 무게 쥐를 cannulating 때 특별한주의가 필요합니다. 작은 쥐 또는 마우스 모델이 사용되는 경우, 작은 캐 뉼러가 사용될 필요가있다.

봉합이 먼저 주변 근막 전에 삽관에 해부 한 후 기관에 실크 봉합 후방을 전달하여 제대로 확보로 기관 삽관은 일반적으로 한 도전되지 않습니다. 정맥을 통과 봉합 위의 전방 절개 1-2 기관 반지와 함께이 따릅니다. 더 나은 보안 (그림 4C)을위한 홈 내에 확보를 위해 기관 반지 사이에 사각 매듭을 묶어. 폐동맥 (PA)의 캐 뉼러 기관 캐뉼라에 비해 더 도전입니다. 다음 단계는이 연구에 사용 된이 절차. 우선, 겸자 쌍 심장 에이펙스 파악. 횡 정맥동에 포셉 또 한 쌍을 통과하고 근위 PA의 정맥을 확보하기 위해 봉합 스레드. 우심실 유출 관 (우심실 유출로) (그림 14A) 직전 우심실을 절개. 우심실 유출로 절개 한 후, 캐 뉼러는 폐동맥 유출 관으로 안내됩니다. 오른쪽 심실 전에 폐동맥 / 대동맥 뒤에 위치에서 봉합을 갖는 것은 (그림 5C)의 효율을 증가시킨다. 캐 뉼러는 탈락을 방지하기 위해 제자리에 봉합사로 고정되어야한다. PA 정맥 정확한 해부학 적 방향이 아닌 경우 주요 합병증이 발생할 수 있습니다. 정맥은 너무 멀리 삽입 단 하나의 지점을 관류 또는 부주의 위치 흉강에서 분리 한 심장 - 폐 시편의 꼬임이 될 수있다. 이것은 쉽게 anatomi의 적절한 각도를 유지하기 위해 원래의 위치로 다시 지향 할 수있다학적 위치. 마지막으로, 좌심방 (LA) 삽관 절차의 가장 어려운 부분이다. LA 정맥은 좌심방 내에 배치 될 필요가있다. 조직이 매우 부서지기 쉬운 존재로, 다음 실험을 수선 할 수 있도록 할 것 폐정맥 및 좌심방 내 눈물을 방지하기 위해 상당한 힘이나 비틀림을 사용하지 염두. PA 정맥이 가장 LA 정맥 앞에 위치합니다. 정점의 제거와 좌심실은 cordae의 tendinae을 방해하고 승모판 전단지를 통해 쉽게 액세스 할 수 있도록하는 것으로 나타났다. 또한, 심실은 쉽게 팽창과 승모판을 시각화하고 승모판을 통해 캐 뉼러를 공급 할 수 있습니다. 작은 무딘 종단 픽업 한 쌍의 승모판 륜의 팽창은 LA (그림 14B)에 관을 시각화하기 위해 수행 할 수 있습니다. 봉합사는 삽관 전에 마음의 뒤에 배치해야합니다. 이것은 스말의 쌍을 사용하여 심장을 올려 간단히 행해질 수있다L 마중을 무딘는 종단 밑바닥과 마음을 통해 봉합을 배치. LA는 현재 유관 할 준비가되어 있습니다. 제대로 좌심방으로 정맥의 위치를​​ 시각화하기 위해 픽업을 통해 LA 정맥 피드. 다시 좌심실로 정맥을 제거하지 않도록 각별히주의하십시오. 이어서 단단히 봉합 좌심실 심근 함께 고정되어야한다. 좌심방에 봉합 고정하면 전체 또는 정맥의 일부를 폐색 수 있습니다.

절차 동안, 공기가 장치의 유입 부에서 유지하는 것이 중요하지. 모든 중요한 공기는 공기 색전증은 주어진 압력 훨씬 낮은 관류 흐름을 발생시키는 PVR (효과적으로 "공기 잠금")을 증가 생성 할 수 있습니다. 다양한 지점은 시스템 내의 공기를 제거하는데 사용될 수있다. 유출 부 내에서 공기가 예상되고 폐에 어떤 해로운 영향을주지해야한다. 폐동맥 고혈압에 대한 돼지의 모델이되었습니다8 주 동안 연속적으로 공기로부터 소량 병리를 다시 도시. 주변 조직 (19)에 염증을 증가시키면서 공기 관류의 양은 감소한다.

재관류의 개시는 삽관이 완료되면 발생할 수 있지만,이 튜브로부터 LA 오기 전에 EVLP 선에 접속된다. 관류는 혈전을 취소를 통해 실행해야하고이 관류는 문제없이 가슴 벽에 비울 수 있습니다. 수동 모드로 관류 펌프를 전환 천천히 ~ 2 ml의에 유량을 증가 / 분 PA 압력의 확대 모니터링 할 수 있습니다. 20 ~ 30 CMH 2 O 이상 압력은 장애물을 표시하고 LA를 종료 관류에 대한보고도 표시하지만이보고 매우 어려울 수 있습니다. 압력이 O CMH 20-30 이상으로 증가 않는 경우, 펌프를 정지하고 두 삽관을 다시 확인. 압력은 약 10-20 CMH 2 O 번째 일정한 허용되면전자 관류 2 분을 통해 흉강으로 실행합니다. 이때 LA로부터 라인 EVLP 회로에 접속 될 수있다. 관류 펌프 속도는 5~10 ㎖ / 분으로 증가 될 수있다. 헤드가 유체 회로를 통해 진행되는 유체로 인해 헤드의 높이가 증가하고, 따라서 정압 PA 압력의 증가가있을 것이다. 유체 라인에서 최고점을 흘러 수 없다면 라인의 대향 단부에 흡인력을가하거나 줄의 가장 높은 부분을 낮추는 시도하거나하기 위해서는 필요하다. 이 문제가 해결되면, 관류는 문제없이 순환한다.

몇 가지 문제는 인공 호흡기에 대하여 모니터링해야한다. 폐는 더 부종과 체중 증가가 첫째, 기관지 / 기관 및 심장 - 폐 위치의 왜곡이 발생할 수 있습니다. 캐뉼라 따라서 변경, 비교적 가까운 위치에 남아 해부하는 것이 중요 하나 또는 모두 뉼러전자 필요할 수 있습니다. 압력 또는 볼륨 조절 팬뿐만 아니라 양 또는 음의 통풍이 EVLP의 시스템에서 사용할 수 있습니다. 쥐 모델의 경우, 우리는 긍정적 인 압력, 볼륨 제어 환기가 4-10 ㎖ / kg 사이 2-8 CMH 2 O 사이의 긍정적 인 기말 압력 (PEEP)에서 호흡량에서 잘 작동 사용하여 발견 그러나 8 CMH 2 O의 PEEP는 기관의 분기에서 가능한 파열의 원인이 될 수 있습니다. 각 실험 후기도로 이어지는 환기 라인이 기관을 여행 할 수있는 기관지 폐포 세척액 (BAL) 유체의 청소해야합니다 (백 - 투 - 백 수행 한 경우 또는 실험 세트). 손길이 닿지 않은 왼쪽으로 완전히 환기 라인을 차단할 수 있습니다 경우 유체는 강화됩니다.

관류 액 조성물은 성공적으로 EVLP 실험에 매우 중요합니다. 5 % 덱스 트란 혼합물, 생리적 조건에 가까운 폐 관류를 허용 유체 (B)를 구동하기위한 안정적인 oncotic 압력을 유지부종을 방지하기 위해 혈관에 ACK와 폐 혈관 내에서 혈전을 방지 할 수 있습니다. 그것은 쥐의 일부 종 폐부종 (20)가 발생할 수 있습니다 덱스 트란에 알레르기가 될 수 있음에 유의해야합니다. 관류의 내용은 따라서 덱스 트란 내용이 교란 요인 안된다, 본 연구에서 모든 실험군에서 일관했다. oncotic 압력은 향상 또는 조직 부종을 생산할 수있는 잠재력을 가지고 중요한 변수이다. 차가운 정적 저장 장치 또는 정상 체온 관류 최적화되어 시판 관류 용액은 폐 생존 시간을 증가시키는이 시스템에 이용되어왔다. 우리는 이러한 솔루션 중 일부는 알부민을 포함하는 하나의 관심사는 쥐의 폐에서 염증 반응을 유발 소 알부민의 가능성이 있습니다. 최적 관류 조성물 조사의 진행 주체이지만, 관류 액은 고려 oncotic 압력, 삼투압 및 버퍼링 용량을 취할 필요가있다. W전자는 솔루션이 수정 크렙스 - Henseleit 솔루션 또는 세포 배양 미디어를 기반으로하는 것이 좋습니다. oncotic 압력은 용도에 따라, 덱스 트란 또는 알부민에 의해 유지되어야한다. 관류 압력과 유량은 기관 및 문헌 - 생리 관류 매개 변수를 기계적 외상 기관이 발생하기 쉬운 수에 영향을줍니다.

실험 기간 동안 시각 표시 :

EVLP 실험 잘 실행되고 있는지 결정할 수있다 실시간 데이터로부터 여러 시각적 신호뿐만 아니라 표시가있다. 폐는 동일한 크기마다 유지되며 호흡 한 후 동일한 부피로 수축한다. 또한 폐 자체로부터 누출이 없을 것입니다. PVR, 폐 무게, 준수는 상대적으로 일정하게 유지됩니다. 산소 생산 일정하게 유지하거나 약간 증가 할 것이다.

폐는 실험 기간 동안 손상된다 많은 시각적 표시가 있습니다. 폐 부종이된다ND는 크기와 중량을 빠르게 성장한다. 폐 (흰색에 황갈색 핑크)에서 변경 및 액체 주머니의 색은 조직에서 식별 될 수있다. 압력 손상이나 팽창을 통해 기관 또는 폐 파열되면 부상의 점 (그림 12B)에서이 버블 링됩니다. 산소 생산이 감소하고 PVR 및 규정 준수 극적도 증가 할 것이다.

설치류 같은 작은 동물 EVLP 모델을 사용하는 잠재적 인 폐 이식 치료 개선 미래 연구를위한 문을 연다. 그러나, 작은 동물 모델은 진정으로 폐 이식을 모방하는 더 나은 이해를 필요로한다. 이 모델은 의학적 치료를 개선하고 미래 폐 이식 연구에 대한 기준 파라미터를 정의하기 위해 미래에 이용 될 수있다.

Disclosures

없음

Acknowledgements

저자는 회로 조립, 수정 및 관류 회로와 XVIVO 관류 (다니엘 마르티 넬리, CCP, CTP)에 대한의 문제 해결에서의 지원 하버드 장치, 특히 스테파니 Pazniokas, MS (생리학 시스템 및 재생 의학)의 도움을 인정하고 싶습니다 비 임상 폐 plegia을 제공한다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics