WERKWIJZE Geïsoleerde * These authors contributed equally

Medicine
 

Summary

Ex-Vivo longperfusie (EVLP) heeft toegestaan ​​longtransplantatie bij de mens om meer direct beschikbaar doordat de mogelijkheid om organen te beoordelen en uit te breiden het donorpool geworden. We beschrijven hier de ontwikkeling van een rat EVLP programma en verfijningen die zorgen voor een reproduceerbaar model voor toekomstige uitbreiding.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, K., Bobba, C., Eren, E., Spata, T., Tadres, M., Hayes, Jr., D., Black, S. M., Ghadiali, S., Whitson, B. A. Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program. J. Vis. Exp. (96), e52309, doi:10.3791/52309 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Het aantal aanvaardbare donorlongen beschikbaar voor longtransplantatie is sterk beperkt als gevolg van slechte kwaliteit. Ex-Vivo longperfusie (EVLP) heeft toegestaan ​​longtransplantatie bij de mens om meer direct beschikbaar doordat de mogelijkheid om organen te beoordelen en uit te breiden het donorpool geworden. Aangezien deze technologie uitbreidt en verbetert het vermogen om potentieel evalueren en de kwaliteit van ondermaatse longen voor transplantatie is een kritieke behoefte. Om deze benaderingen strenger evalueren reproduceerbaar diermodel te worden vastgesteld die het mogelijk maken het testen van verbeterde technieken en beheer van de gedoneerde longen en de long-transplantatie ontvanger. Bovendien, een EVLP diermodel van geassocieerde pathologieën, bijvoorbeeld ventilatie geïnduceerde longbeschadiging (VILI), zou een nieuwe werkwijze om behandelingen voor deze pathologieën evalueren. We beschrijven hier de ontwikkeling van een rat EVLP long programma verfijningen dit method die het mogelijk maken voor een reproduceerbaar model voor toekomstige uitbreiding. We beschrijven ook de toepassing van deze EVLP systeem te modelleren VILI in longen rat. Het doel is om de onderzoeksgemeenschap te voorzien van belangrijke informatie en "parels van wijsheid" / technieken die is ontstaan ​​uit vallen en opstaan ​​en zijn cruciaal voor de oprichting van een EVLP systeem dat is robuust en reproduceerbaar.

Introduction

Klinische relevantie

Er is momenteel een gebrek aan geschikte longen voor transplantatie beschikbaar met slechts 19% van de longen in staat om op nationaal niveau worden gebruikt die leidt tot langdurige wachtlijst tijd of patiënten sterven wachten op een transplantatie 1. Het tekort kan het gevolg oudere donors, trauma, infecties, multisysteem orgaanfalen en soms gewonden donorlongen bij oogst 2. Bovendien is de long een zwakke orgaan buiten de borstholte en bandtransporttoetsen en conserveringstechnieken kunnen leiden tot verslechtering en niet-levensvatbare longen. Vandaar dat het handhaven en verbeteren van de longen levensvatbaarheid ex-vivo is een belangrijk aandachtspunt in longtransplantatie geneeskunde onlangs geworden.

Ex-vivo longperfusie (EVLP)

Ex-vivo long perfusie (EVLP) heeft zich ontwikkeld om continu perfuseren organen wordt geëvalueerd voor transplantatie en maakt een periode van evaluatie dat alleows voor het potentieel van de long reanimatie of reconditionering. EVLP kan verlengen totaal uit het lichaam orgel ischemische tijd en laat de gedoneerde organen om verdere afstanden 3 reizen. Typisch worden de longen geventileerd bij 50% van de totale longcapaciteit of 20 cmH 2 O piek luchtwegdruk met een fractie van ingeademde zuurstof (FiO2) van 30% tot 50% 4. Behoud oplossing geperfundeerd 40-60 ml / kg (ongeveer 40% van de voorspelde hartdebiet 100 ml / kg) bij mensen en grote dieren 5,6, maar geperfuseerd op ongeveer 20% van de cardiale output voor ratten 7. De opname van STEEN oplossing liet menselijke longen in RT omgevingen reizen zonder ontwikkeling van longoedeem 9. Dit pionierswerk is verfijnd door de Universiteit van Toronto Lung Transplant Program 10-13 en wordt geëvalueerd voor een betere evaluatie van de marginale donorlongen voor transplantatie 14,15. De optimale Ventin en perfusie voorwaarden die nodig zijn om marginale en / of sub-standaard longen regenereren voor transplantatie is niet bekend en is momenteel een actief gebied van onderzoek.

Geïsoleerde longperfusie systemen zijn in kleine dieren veroorzaken longschade, herscheppen luchtwegen en de longen perfuseren met verschillende oplossingen ischemische schade te voorkomen. Onderzoekers hebben een klein diermodel longtransplantatie gemaakt met de geïsoleerde long-perfusie systeem de EVLP protocollen die kunnen worden gebruikt bij mensen en grotere dieren 16-18 nabootsen. Echter, deze experimentele model vele problemen met betrekking tot de verschillende technieken en parameters toegepast om menselijke fysiologie bootsen. In het bijzonder, zijn er vele subtiliteiten in het handhaven van de longen levensvatbaarheid tijdens EVLP. Deze subtiele kunnen ontstaan ​​door verschillen in oogst techniek beademing instellingen perfusaat samenstelling en stroomomstandigheden en canulatie van de long. Theroordat, het doel hier is om de onderzoeksgemeenschap te voorzien van een aantal problemen oplossen en implementatie tips die we leiden hebben gevonden om een ​​robuuste methode voor de uitvoering van EVLP in een knaagdier model.

Protocol

OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care en Gids van de National Research Council voor de Humanitaire Zorg en gebruik van proefdieren (IACUC) en is goedgekeurd door de Ohio State University IACUC commissie ondergaan.

1. Initial Setup

  1. Stel de EVLP circuit en warm (37 ° C) perfusaat circuleert door het systeem voorafgaand aan het opnemen van de ex geplant long (figuur 1).
  2. Stel het warm water bad, gebruikt om jas het perfusaat reservoir, warmtewisselaar, en kunstmatige thorax, tot 37 ° C en circulerende (figuur 1).
  3. Voer een de-oxygenatie oplossing (bijvoorbeeld 6% O2, 8% CO2, 84% N2) nog door het perfusaat in de gasfilter te zorgen voor de perfusievloeistof heeft ~ 6% opgeloste zuurstof het experiment teller.
    LET OP: Deze-de zuurstofrijk perfusaat maakt de beoordeling of de longfunctie door meting van de zuurstof ingebracht in het perfusaat, post-orgaan.
  4. Open het data acquisitie programma en sluit de longslagader drukomzetter, tracheale drukverschiltransducer, ademstroom drukverschiltransducer, longgewicht transducer en pompsnelheid transducer en EVLP circuit en de converter data-acquisitie / analoog-digitaal ( Figuur 2).
  5. Het opzetten van de operatietafel en de toepassing van de hulpmiddelen bij het ​​EVLP schakeling (figuur 3).
  6. Het opzetten van een kleine container van vloeibare stikstof in de buurt van de EVLP circuit als monsters worden verkregen.
    OPMERKING: het systeem van de auteur is aangepast om pre-orgel en post-orgel perfusaat verzamelen zonder onderbreking van de druk-flow dynamiek die mogelijk kunnen verwonden de long.

2. Voorbereiding van anesthetica en Heparine, verdoving van de Rat

  1. Doe de volgende persoonlijke beschermingsmiddelen(PPE) voor de behandeling van ratten en rat weefsel: chirurgisch masker, chirurgische handschoenen, en wegwerp toga.
  2. Weeg de rat en registreer het gewicht.
  3. Bereid 1,200 U / kg heparine.
  4. Bereid beide 60 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine in dezelfde injectiespuit eerst bereiden van de ketamine.
  5. Intraperitoneaal injecteren van het mengsel van ketamine en Xylazine in de rat en laat 5 min voor de rat te bewusteloos raken.
  6. Bevestig de juiste verdoving door het controleren teen knijpen reflex. Als de rat haar teen niet intrekt, is het niet voelt pijn.
  7. Verplaats rat te operatietafel, veilig in rugligging, en spray met alcohol voor sterilisatie.

3. Extraction en Initial Ventilatie van de Rat Longen

  1. Bereid 4-20 cm lange zijden hechtingen (3-0 of 4-0 moeten volstaan).
  2. Beginnen met het opnemen van gegevens met behulp van de data-acquisitie programma.
  3. Controleer op de juiste diepte van de anesthesie, met behulp van chirurgische schaar in te voeren peritoneale caviteit door een middellijn laparotomie en injecteer heparine in de inferior vena cava.
  4. Draag de incisie craniaal voorbij de manubrium in de hals tot aan de luchtpijp wordt blootgesteld. Niet breken de borstholte (figuur 4A).
  5. Ontleden posterior de luchtpijp in de middellijn en schuif een zijden hechtdraad posterieur van de luchtpijp (Figuur 4B).
  6. Hef het voorste deel van de luchtpijp en maak een dwarse incisie tussen de kraakbeenvissen ringen, hoog op de luchtpijp. Snij niet door de achterste membraneuze deel van de luchtpijp op dit punt (figuur 4C).
  7. Canule de luchtpijp met de luchtpijp canule en veilig met de zijden hechtdraad (Figuur 4D). Zorg ervoor dat de hechtdraad ligatuur wordt vastgezet in de kerven om migratie van de canule te verzachten.
  8. Sluit de trachea canule aan het ademhalingscircuit.
  9. Zet de mechanische ventilator mechanisch beginnen ventilatie van de luNGS.
    OPMERKING: Initiële instellingen werden gekozen om een tidal volume van 4 ml / kg en positieve eind-expiratoire druk (PEEP) van 2 zijn cmH 2 O. Deze instellingen zijn de standaardinstellingen en afhankelijk van de experimentele omstandigheden worden aangepast nadat het orgaan in het ex vivo perfusiesysteem.
  10. Voer de borstholte door het borstbeen / xyphoid en blijven craniaal naar de suprasternal inkeping. Zorg om te voorkomen dat het aanraken van de longen.
    OPMERKING: Als de longen rat is fragiel, kan elke onbedoelde manipulatie leiden tot trauma en longoedeem (Figuur 5A).
  11. Met behulp van 2 retractors, trekken de borstholte aan de anatomie (figuur 5A) goed te belichten. Nogmaals, zorg om te voorkomen dat het aanraken van de longen.
  12. Verwijder de thymus met een lichte verhoging en stompe dissectie.
  13. Schuif de abdominale inhoud naar een kant om ofwel de onderste vena cava (IVC) of mesenterica (MV) blootstellen.
  14. Incise ofwel de IVC of de MV om de rat exsanguinate, het verstrekken van euthanasie.
  15. Plaats een zijden hechtdraad posterieur van de longslagader en de aorta in voorbereiding voor het bevestigen van de longslagader canule (figuur 5B).
  16. Maak een incisie van 2-3 mm op het voorste oppervlak van de rechter ventrikel outflow tract en plaats de canule in de incisie en in de belangrijkste longslagader en veilig met de zijden hechtdraad (Figuur 5C).
  17. Doorsnijden de apex van het hart om toegang tot het linker ventrikel mogelijk en Spoel stolsels in de pulmonaire vasculatuur door stromend ~ 15 ml van een lage K + elektrolytoplossing via de longslagader en via de apex van het hart in de borstholte ( Figuur 5D).
  18. Sluit de longslagader (PA) canule aan de EVLP circuit. Zorg ervoor dat de instroom lijn afkomstig van het circuit aan de PA canule wordt gegrond met perfusaat om eventuele lucht die het hart en de longen te voorkomen.
  19. Schakel debelangrijkste peristaltische pomp en zet deze op een laag (~ 2 ml / min) snelheid te laten perfusaat te lopen door de longslagader en uit de linker hartkamer in de borstholte. ** Kritische stap ** Zorg ervoor dat de PA druk niet zo spike Dit is een teken van ofwel een verstopping of slechte canule (figuur 6).
  20. Schakel de peristaltische pomp.
  21. Plaats een zijden hechtdraad achter het hart, rond de ventrikels (figuur 7).
  22. Begin het proces van de canule linkeratrium door er een paar kleine chirurgische forceps in de apex door de mitralisklep en in het linker atrium.
    LET OP: Dit zal de mitralisklep verwijden en de infusen te vergemakkelijken. Agressieve dilatatie, of te diep dilatatie, kan onbedoeld verscheuren het linker atrium waardoor de inkoop ineffectief.
  23. Verwijder de tang uit het hart.
  24. Plaats de linkerboezem canule in de apex via de mitralisklep en in de linker oprium.
  25. Bevestig de linkerboezem canule met de zijden hechtdraad achter het hart (figuur 8).
    LET OP: Deze hechtdraad kan "pre-gebonden" zijn om canulatie vergemakkelijken.
  26. Sluit de longslagader canule aan de ex-vivo long perfusiecircuit (Figuur 9A). Gebruik de linker atrium canule niet aan op de EVLP circuit totdat de hart-long blok volledig is verwijderd uit het lichaam.
  27. Klem de slokdarm met een hemostaat en onder de klem knip (tussen de klem en het membraan) zodat de slokdarm kan worden gebruikt om de cardiopulmonale structuren craniale verhogen.
  28. Botweg ontleden het omliggende weefsel en snijd de aorta descendens en hulpschepen te bevrijden van de hart-long blok als het wordt via de slokdarm (Figuur 9B) verhoogd.
  29. Doorsnijden de luchtpijp craniale naar de tracheacanule om helemaal vrij de hart-long block.
  30. Verwijder de hart-long blok en plaatsen in de desineerd locatie op de EVLP circuit (Figuur 9C).
  31. Sluit de linkerboezem canule om de uitstroom lijn en start de belangrijkste peristaltische pomp (figuur 9D).

4. Ex Vivo Perfusie van de longen

  1. Verwijder snel de ventilatie-lijn van de top van de EVLP apparaat en bevestig de behuizing met de druksensoren, dan plaatst u de ventilatie-lijn op de bovenkant van de behuizing aan de bovenkant van de EVLP apparaat.
    OPMERKING: Hierdoor kan de ventilatie te registreren gegevens en de druk gecontroleerd.
  2. Zorg ervoor dat de opvanginrichting is gevuld met een voldoende hoeveelheid perfusaat zodat er geen luchtbellen (dwz, luchtembolie) worden ingevoerd om de longen.
  3. Langzaam ventilatie en perfusie instellingen gewenste experimentele niveau veranderen gedurende de eerste 15 min. Bovendien, tijdens deze eerste opstartfase, verhoging van de perfusie debiet naar de gewenste snelheid en / of druk.
    OPMERKING: Programming de ventilator aan intermitterende zucht adem, die de beweging van de vloeistof uit de longen ruimte vergemakkelijken produceren en dus vertragen het ontstaan ​​van oedeem, is aan te bevelen. Deze kunnen worden geproduceerd door ventilatoren uitgerust met de zucht functie.
  4. Bepaal "Tijd 0" als de tijd waarin ventilatie parameters op een tidal volume van 4 ml / kg, PEEP 2 cm H2O en perfusie parameters op de verwachte niveaus en constant blijven.
  5. Indien nodig, perfusaat monsters van de bemonsteringspoort, flash bevriezen in vloeibare stikstof, en noteer het tijdstip van de monsters.
  6. Wanneer het experiment is voltooid, isoleren nodige anatomische stukken voor inzameling en ofwel flash bevriezen in vloeibare stikstof of plaats bij de vaststelling oplossing voor verdere studies.

Representative Results

De real-time mechanische gegevens die via het data acquisitie programma kan eenvoudig worden geanalyseerd willekeurig aantal hypothesen te testen. Bijvoorbeeld, Figuur 10A toont de gemiddelde longgewicht door 60 min van 10 rat experimenten waarbij dieren werden geventileerd met een lage tidal volume / lage PEEP van 4 ml / kg en 2 cmH 2 O. Hoewel er een geringe toename longgewicht gehele experiment, deze toename niet statistisch significant (ANOVA, p = 0,92). Figuur 10B toont de gemiddelde pulmonale arteriële druk (PAP) door 60 min van 12 ratten experimenten. De onderste PAP in de 0 min tijdstip is door lagere stroom en beademingsinstellingen gebruikt aan het begin van alle experimenten en de PAP constant blijft na dit tijdstip geen statistisch significante veranderingen na t = 10 min (ANOVA van rangen, blz = 0,89). Figuur 10C toont de pulmonale vaatweerstand (PVR) via 60 min van 12 ratexperimenten en hoewel er een kleine afname in PVR na t = 20 min, was er geen statistisch significant verschil in PVR tijdens dit experiment (ANOVA van rangen, p = 0.65). In vergelijking met de PVR data hier getoond, Noda et al. is gebleken dat de PVR licht toenemen in de tijd gedurende 4 uur. Echter, de auteurs rapporteren gegevens PVR vanaf 1 uur in plaats van de start van de proef en geen standaarddeviatiewaarden voorzien 7. Noda et al. evenmin longoedeem gegevens voor de 4 hr experimenten dus geen vergelijking worden gemaakt met de hier weergegeven in figuur 10A gegevens tonen. Grote verschillen in Noda et al. procedure vergelijking met wat is getoond in dit document omvatten: 1 hr koude bewaring in LPS-oplossing voor EVLP werden ratten aanvankelijk geventileerd met een gasmengsel isofluraan ze bewusteloos werd het perfusaat oplossing aangevuld met 50 mg methylprednisolon en 50 mg van cefalosporine, in totaal flow werd gedefinieerd als 20% van de berekende hartminuutvolume perfusaat monsters werden genomen nadat de long werd geventileerd bij 100% O 2 gedurende 5 min voor en het experiment werd 4 uur.

De monsters genomen tijdens de proef van het perfusaat kan worden geanalyseerd voor vele doeleinden. Als voorbeeld, in figuur 11 tonen we hoe hoog slagvolume / hoge PEEP ventilatie kan een pro-inflammatoire respons in 60 min induceren. Voor deze experimenten het perfusaat van 4 ratten geventileerde onder schadelijke omstandigheden, bijvoorbeeld de hoge tidal volume van 10 ml / kg en hoge PEEP 8 cmH 2 O, werden geanalyseerd pro- en anti-inflammatoire cytokines IL1β, TNFa en IL-4 met standaard ELISA-technieken. Zoals getoond in figuur 11, vergeleken met cytokine niveaus voor ventilatie (0 min), 60 min van schadelijke ventilatie resulteerde in een statistisch significante toename van IL-1β en TNFa (cytokines) een nd geen verandering in IL-4 (een anti-inflammatoir cytokine) concentratie. Daarom is deze EVLP systeem kan longschade profielen vaak waargenomen tijdens mechanische ventilatie genereren.

Figuur 1
Figuur 1. Diagram en een foto van kleine dieren ex-vivo long perfusie (EVLP) circuit. Letters in het schema overeenkomen met letters op de foto. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Alle sensoren worden aangesloten op de schakelkasten."> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3. De rat operatietafel stevig is opgezet naast het ex vivo long perfusie (EVLP) circuit. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. (A) een incisie craniaal aan de luchtpijp bloot. De borstholte is niet blootgesteld. (B) Een zijden hechtdraad wordt achter de trachea. (C) De trachea gedeeltelijk gesneden bereiden canulatie. (D) De trachea canule is geplaatst in positio n en beveiligd met een zijden hechtdraad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 5
Figuur 5 (A) De borstkas wordt teruggetrokken om toegang tot het hart en de longen mogelijk. (B) Voorbereiding voor het plaatsen van hechtdraad achter de longslagader. (C) De longslagader wordt een canule en gebonden met de eerder geplaatste zijden hechtdraad. (D) Een lage K + elektrolyt oplossing wordt gespoeld door de longslagader en de linkerboezem naar eventuele bloedstolsels te verwijderen. Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.

lways "> Figuur 6
Figuur 6. Het verhogen van de pulmonale arteriële doorstroming bij het ​​spoelen van de longen kan leiden tot de pulmonale arteriële druk om drastisch te verhogen. Als canulatie correct werd uitgevoerd en er is geen grote blokkade, moet de druk te verlagen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken .

Figuur 7
Figuur 7. zijden hechtdraad wordt geplaatst rond de hele hart in de voorbereiding op het linker atrium canulatie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

n-page = "always"> Figuur 8
Figuur 8. De linker atrium canule wordt vastgezet op zijn plaats met een zijden hechtdraad. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 9
Figuur 9 (A) de longslagader canule is verbonden met de ex-vivo long perfusie circuit. (B) De slokdarm wordt geklemd en het bindweefsel bot ontleed de hart-long blok te verwijderen. (C) Het hart-long blok verwijderd uit de borstholte en geplaatst in de ex-vivo long perfusie circuit. (D) De linker atrium is verbonden met de ex-vivo long perfusie circuit. href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 10
Figuur 10. (A) longgewicht van mannelijke Sprague Dawley ratten door 60 min van ex vivo longperfusie (n = 10). (B) Pulmonale arteriële druk van mannelijke Sprague Dawley ratten door 60 min van ex vivo longperfusie (n = 12). (C) longvaatweerstand van mannelijke Sprague Dawley ratten door 60 min van ex vivo longperfusie (n = 12), NS geeft geen statistisch significant verschil. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

</ Html "Figuur 11" src = "/ files / ftp_upload / 52.309 / 52309fig11highres.jpg" />
Figuur 11. Effect van 1 uur ventilatie hoog teugvolumes (10 ml / kg) en hoge PEEP (8 cmH 2 O) op pro- en anti-inflammatoire cytokine concentraties in het perfusaat. N = 4, * geeft statistisch significant verschil betrekking tot 0 uur monster (p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 12
Figuur 12. (A) Een goed ventilerende en perfusie long verbonden met de EVLP circuit. (B) High positieve eindexpiratoire druk (PEEP) veroorzaakt een scheur in de luchtpijp splitsing waardoor luchtbellen te vormen tegen de schade en vul de kunstmatige thorax. es / ftp_upload / 52.309 / 52309fig12large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 13
Figuur 13 (A) Longslagader canule. Deze canule is kleiner dan het linker atrium canule. (B) Linker atrium canule. Deze canule is veel groter dan de longslagader canule. (C) trachea canule. Deze canule heeft ribben om te helpen bij het veiligstellen van de luchtpijp met zijden hechtdraad. Het einde dat in de luchtpijp wordt ingebracht wordt ook een beetje puntig om te helpen bij het ​​inbrengen van de canule in de luchtpijp. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

09fig14highres.jpg "/>
Figuur 14. (A) Het hart top wordt gehouden door een pincet het rechterventrikel staat te worden ingesneden om de longslagader canule. (B) verwijding van de mitralisklepring met een paar kleine stompe pick-ups maakt het makkelijker om de luchtwegen in de linkerboezem visualiseren. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussion

Systeem monitoring

Welke dingen eruit zien als experiment goed loopt:

Zodra de canules zijn in het circuit is geplaatst en de longen ventilatie- er meerdere manieren om te waarborgen het systeem goed werkt. Er mag geen lekkage van perfusaat de hele lijn. De pulmonale vasculaire weerstand (PVR) betrekkelijk constant blijft (uitgaande van een constante stroom). De zuurstof uitwisseling moeten toenemen zodra de ventilator goed werkt en het uitbreiden van de longen om meer longblaasjes te werven voor de gasuitwisseling. Figuur 12A correct toont geventileerd en doorbloed longen aangesloten op de EVLP circuit binnenin de kunstmatige thorax.

Welke dingen eruit zien als experiment is niet goed draait:

Er zijn een aantal veel voorkomende problemen die de hoogste mate van het optreden tijdens de beginfase van een EVLP experiment hebben gehad. De eerste en eenvoudigste to remedie is een lek in de lijn verlaten van de long. Dit is merkbaar door een pool van perfusaat pooling onder deel van het circuit en het niveau in het reservoir voortdurend afneemt. Controleer en haal buisconnectoren rond het gebied waar gemorst is en inspecteer de buis zelf voor een lek. Als dit lek plaatsvindt vóór de longen, kan het ook bellen introduceren in de longen. Dit moet zo snel mogelijk worden verholpen als luchtbellen in de perfusievloeistof zal resulteren in weefselschade en veroorzaken een significante toename van de PVR. Er kan ook een lek vanuit de long of een van de canules zijn. Dit kan worden veroorzaakt door een slippen van een canule of een obstructie in de uittredende lijn waardoor een drukopbouw. Controleer de positie voor beide canules om ervoor te zorgen noch is uitgegleden of gedraaid. De PA druk moet ook worden gecontroleerd tijdens dit proces, omdat een onmiddellijke stijging in de PA druk is een duidelijk teken dat een obstructie van een soort onlangs heeft plaatsgevonden. Figuur 12Btoont een gescheurde long die verbroken als gevolg van hoge druk. Een lek in de longen zelf kan ook worden veroorzaakt door een scheur in het weefsel. Dit probleem kan wel of niet herstelbaar maar herpositionering en het natrekken van de canules is de beste optie in dit scenario.

Key Learning Points / kansen:

Trial and error ontwikkeling van de ex-vivo longperfusie systeem heeft ons toegelaten om een aantal belangrijke kwesties die we hier schetsen voor een efficiënte uitvoering van de EVLP systeem vergemakkelijken. Ten eerste, met betrekking tot verkrijgen, is het belangrijk dat standaard anesthesietechnieken gevolgd goed verdoven dieren (genoeg verdoving, injectie in het peritoneum) en naleving van alle IACUC beleid vereist. De canules (figuur 13 A, B en C) moeten herhaaldelijk worden gespoeld om eventuele stollen en / of vuil in de pulmonaire vasculat verwijderenure. Met betrekking tot de selectie van dieren, raden we het gebruik van Sprague Dawley of Lewis-ratten met een gewicht van 250-350 g. Speciale aandacht moet worden genomen bij het cannulating ratten met een gewicht dicht tot 250 g, omdat de schepen kleiner en dus veel moeilijker zal zijn om canule zonder verwonden van het vaatstelsel. Indien kleinere ratten, of een muismodel, wordt gebruikt, moet kleiner canule worden gebruikt.

Trachea canule is niet typisch uitdagend zolang de hechting goed is bevestigd dat vooraf een zijden hechtdraad posterieur van de luchtpijp na het ontleden van de omringende fascia en voorafgaand aan cannulatie. Volg deze met een anterieure incisie 1-2 tracheale ringen boven de hechting aan de canule passeren. Tie vierkante knopen tussen de tracheale ringen om te verzekeren binnen een groef voor een betere beveiliging (Figuur 4C). Canulatie van de longslagader (PA) is een grotere uitdaging in vergelijking met de tracheacanule. De volgende stappen werden bij dit onderzoekvoor deze procedure. Ten eerste, pakt het hart apex met een pincet. Pass een pincet in de dwarsrichting sinus en draad een hechting aan de canule in de proximale PA beveiligen. Incise de rechterkamer direct voor de rechter ventrikel outflow tract (RVOT) (Figuur 14A). Na de incisie in de RVOT, wordt de canule worden geleid naar de longslagader uitstroom. Het hebben van de hechtdraad in positie achter de longslagader / aorta voordat het recht ventriculotomy verhoogt de efficiency (figuur 5C). De canule moet worden vastgezet op hun plaats met de hechtdraad om losraken te voorkomen. Een belangrijke complicatie kan optreden als de PA canule niet in de juiste anatomische oriëntatie. De canule kan te ver worden geplaatst en slechts perfuse één tak of mal gepositioneerd met het verdraaien van de hart-long monster na verwijdering uit de borstholte worden. Dit kan gemakkelijk worden georiënteerd naar de oorspronkelijke positie om de juiste hoek van anatomi bewarencal positie. Tenslotte linkeratrium (LA) canule is het meest uitdagende gedeelte van de procedure. De LA canule moet binnen het linkeratrium worden geplaatst. Met de weefsels uiterst bros, rekening te houden met belangrijke kracht of draaien niet gebruiken om een ​​scheur in de longader en linkerboezem die dan zou het experiment unsalvageable voorkomen. De PA canule wordt het best geplaatst voor de LA canule. Een linker ventriculotomy verwijdering van de apex is aangetoond dat de cordae tendinae verstoren en vergemakkelijken de toegang via de mitrale folders. Ook de ventriculotomy gemakkelijker verwijden en visualiseren de mitralisklep en de canule voeren door de mitralisklep. Dilatatie van de mitrale klep annulus met een paar kleine stompe uiteinde pick-ups kunnen worden gedaan om de luchtwegen in de LA (figuur 14B) te visualiseren. Hechtdraad moet achter het hart worden geplaatst voordat infusen. Dit kan eenvoudig worden gedaan door het opheffen van de kern met behulp van een paar small stompe uiteinden pick-ups en het plaatsen van de hechting onder en aan de overkant van het hart. De LA is nu klaar om te worden voorzien van een canule. Voer de LA canule door de opnemers om goed zichtbaar de plaatsing van de canule in het linker atrium. Wees extra voorzichtig niet aan de canule terug in de linker ventrikel te verjagen. De hechting moet dan stevig worden vastgezet aan het myocard van het linker ventrikel. Bevestiging van de hechting aan het linker atrium kunnen afsluiten het gehele of een deel van de canule.

Tijdens de procedure, is het cruciaal dat geen lucht blijven de instroom gedeelte van de inrichting. Significante lucht kan produceren een luchtembolie verhogen PVR (effectief een "air-lock"), die zal resulteren in een veel lagere perfusaat stroom bij een bepaalde druk. Verschillende punten kunnen worden gebruikt om lucht in het systeem te verwijderen. Lucht in het gedeelte uitstroom wordt verwacht en mag geen nadelig effect hebben op de longen. Een varkensmodel voor pulmonaire hypertensie isgetoond aan de pathologie van continue kleine hoeveelheden lucht over een periode van 8 weken opnieuw. De verhoogde lucht vermindert de hoeveelheid perfusie onderhavige terwijl die ontsteking van de omliggende weefsels 19.

De inleiding van perfusie kan optreden wanneer de canule is voltooid maar voordat de buis uit de LA is verbonden met de EVLP lijn. Perfusaatmonsters moeten worden doorlopen om duidelijk uit elke bloedstolsels en dit perfusaat kan legen in de borstwand zonder problemen. Omschakelen van de perfusaat pomp naar de handmatige modus en langzaam verhogen van de doorstroming naar ~ 2 ml / min zorgt voor een nauwkeurige controle van de PA druk. Druk gedurende 20-30 cmH 2 O kan een obstructie aangeven en kijken voor perfusaat verlaten van de LA is ook een indicator, maar dit kan heel moeilijk te zien zijn. Als de druk doet toenemen tot meer dan 20-30 cmH 2 O, stop de pomp en controleer beide canuleringen. Zodra de druk is constant rond de 10-20 cmH 2 O toestaan ​​the perfusaat om door en in de borstholte draaien gedurende 2 minuten. Op dit moment de lijn van de LA kan worden aangesloten op de EVLP circuit. Het perfusaat pompsnelheid kan worden verhoogd tot 5-10 ml / min. Aangezien het fluïdum kop doorloopt het circuit, zal een verhoging van de PA-druk als gevolg van de toename in hoogte van de vloeistof kop en derhalve de statische druk. Indien de vloeistof niet op het hoogste punt kan stromen in de lijn, kan het nodig zijn hetzij toepassen van een zuigkracht op het tegenoverliggende uiteinde van de lijn of trachten het hoogste gedeelte van de lijn te verlagen. Zodra dit probleem is te overwinnen, moet het perfusaat circuleren zonder problemen.

Een aantal zaken moet worden gecontroleerd met betrekking tot de ventilator. Ten eerste kan het verdraaien van bronchiën / luchtpijp en hart-long positie ontstaan ​​als de longen worden meer oedemateus en het gewicht toeneemt. Het is belangrijk dat de canules te blijven in een relatief nauwe anatomische positie, dus veranderen of beide canulee noodzakelijk zijn. Druk of volume gecontroleerde ventilatoren als positief of negatief ventilatie kan worden gebruikt met deze EVLP systeem. Voor de rat model, hebben we gevonden met behulp van positieve druk, volume gecontroleerde ventilatie werkt goed bij teugvolumes tussen 4-10 ml / kg en bij positieve eind-expiratoire druk (PEEP) tussen 2-8 cmH 2 O. Echter, een PEEP van 8 cmH 2 O een mogelijke breuk veroorzaken bij de splitsing van de luchtpijp. Na elk experiment (of aantal experimenten als back-to-back uitgevoerde), de ontluchtingsleiding die naar de luchtpijp te worden gereinigd van bronchoalveolaire lavage (BAL) vloeistof die kan zijn gereisd de luchtpijp. Deze vloeistof zal verharden als links onaangeroerd en kan de ventilatie-lijn volledig te blokkeren.

Het perfusaat samenstelling essentieel voor een succesvolle EVLP experiment. Een 5% dextraan mengsel laat longperfusie dat dicht bij fysiologische omstandigheden handhaaft een stabiele oncotische druk fluïdum b rijdenack in het vaatstelsel om oedeem te voorkomen en voorkomt trombose in de longvaten. Het is belangrijk op te merken dat sommige soorten ratten allergisch dextran waarvan longoedeem 20 kan leiden kan. De inhoud van het perfusaat was consistent in alle experimentele groepen in deze studie ook de dextraangehalte niet confounder zijn. De oncotische druk een kritieke variabele die het potentieel verbeteren of produceren weefsel oedeem. Commercieel verkrijgbare perfusie-oplossingen die zijn geoptimaliseerd voor koude statische opslag of normotherme longperfusies zijn gebruikt bij dit systeem long levensvatbaarheid malen te verhogen. We merken dat sommige van deze oplossingen bevatten albumine en een zorg is de mogelijkheid runderalbumine welke leidt tot een ontstekingsreactie in de knaagdierlong. Hoewel een optimale perfusaat samenstelling een lopend onderwerp van onderzoek, de perfusievloeistof dient rekening te houden met de oncotische druk, de osmotische druk en buffercapaciteit. Wbevelen e de oplossing gebaseerd op een gemodificeerde Krebs-Henseleit oplossing of celkweekmedium. De oncotische druk moet worden gehandhaafd door dextran of albumine, afhankelijk van de toepassing. De perfusie druk en debiet van invloed op het orgel en supra-fysiologische perfusieparameters kan het orgel gevoelig voor mechanische trauma te maken.

Visuele indicatoren tijdens Experiment:

Er zijn vele visuele aanwijzingen en aanduidingen uit real-time data die kunnen worden gebruikt om te bepalen of een EVLP experiment goed functioneert. De long is even groot blijven en leeglopen om hetzelfde volume na elke ademhaling. Er zal ook geen lekken uit de longen zelf. De PVR, longgewicht, en de naleving zal relatief constant blijven. Productie van zuurstof zal constant blijven of licht stijgen.

Er zijn vele visuele indicatoren als de longen gecompromitteerd tijdens een experiment. De long wordt oedemateus eennd groeit snel in omvang en gewicht. De kleur van de longen verandert (van een beige-roze tot wit) en zakken van vloeistof kan worden geïdentificeerd in het weefsel. Indien de trachea of longen breuken van barotrauma of meer distensie, zal er borrelen van het punt van verwonding (figuur 12B). Productie van zuurstof zal afnemen en de PVR en de naleving zal drastisch toenemen als goed.

De mogelijkheden voor het gebruik van een EVLP model op kleine dieren zoals knaagdieren opent de deur voor toekomstige studies betere behandeling van long transplantaties. De kleine diermodel vereist een beter begrip van een longtransplantatie werkelijk nabootsen. Dit model kan worden gebruikt in de toekomst medische behandelingen te verbeteren en vast basislijn parameters voor toekomstig longtransplantatie studies.

Disclosures

Geen

Acknowledgements

De auteurs willen graag de hulp van Harvard Apparatus, vooral Stephanie Pazniokas, MS (Fysiologie Systems & Regenerative Medicine) erkennen voor hun hulp bij het ​​circuit montage, wijziging en het oplossen van problemen van het perfusiecircuit en XVIVO Perfusie (Daniel Martinelli, CCP, CTP) voor het verstrekken van niet-klinisch gebruik pulmonale plegia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
IPL-2 Basic Lung Perfusion System Harvard Apparatus
Tweezer #5 stainless steel, curved 11 cm Kent Scientific Corporation IND500232
Tweezer #5 Dumostar, 11 cm Kent Scientific Corporation INS500085-A
Tweezer #7 Titanium, 12 cm tips curved Kent Scientific Corporation INS600187
McPherson-Vannas Scissors 8 cm, Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14124
Vannas Scissors 8 cm Str 5 mm Kent Scientific Corporation INS14003
Instrument Sterilization Tray 5" x 7" Kent Scientific Corporation INS800101
Heparin 30,000 units per 30 ml APP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Ketamine 500 mg per 5 ml JHP Pharmaceuticals Supplied from OSU Pharmacy
Xylazine 100 mg per 1 ml Akorn Supplied from OSU Pharmacy
10 cc insulin syringe 29 G x 1/2" needle B-D 309301
Hyflex NBR Ansell S-17310M Bite proof gloves
BL1500 Sartarius Practum 1102-1S Scale
Large Flat Bottom Restrainer Braintree Scientific Inc FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat  Rat tunnel for injection
Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large Kiberly-Clark 50708
Rapidpoint 405 Siemens blood gas analyzer
Fiberoxygenator D150 Hugo Sachs Elektronik PY2 73-3762
LabChart v7.3.7 ADInstruments
Tracheal cannula Harvard Apparatus 733557
Pulmonary Artery cannula Harvard Apparatus 730710
Left Atrium cannula Harvard Apparatus 730712
Peristaltic Pump  Ismatec ISM 827B
Small Animal Ventilator model 683 Harvard Apparatus 55-000
Ecoline Star Edition 003, E100 Lauda LCK 1879 Water Heater
Tubing Cassette Cole-Parmer IS 0649
Connect kit D150 Cole-Parmer VK 73-3763
PowerLab 8/35 ADInstruments 730045
TAM-A transducer amplifier module type 705/1 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-0065
TAM-D transducer amplifier type 705/2 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 73-1793
SCP Servo controller for perfusion type 704 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 732806
CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731747
VCM ventilator control module type 681 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731741
TCM time control module type 686 Hugo Sachs - Harvard Apparatus 731750
IL2 Tube set for perfusate Harvard Apparatus 733842
Tube set for moist chamber Harvard Apparatus 73V83157
Tygon E-3603 Tubing 2.4 mm ID Harvard Apparatus 721017 perfusate line entering lung
Tygon E-3603 Tubing 3.2 mm ID Harvard Apparatus 721019 perfusate line leaving lung
low potassium dextran glucose solution flushing the lung

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. United States Organ Transplantation, Organ Procurement and Transplantation Network & Scientific Registry for Transplant Recipients Annual Report 2011. Available from: http://srtr.transplant.hrsa.gov/annual_reports/2011 (2011).
  2. Maathuis, M. H., Leuvenink, H. G., Ploeg, R. J. Perspectives in organ preservation. Transplantation. 83, 1289-1298 (2007).
  3. Cardoso, P. F. New perspectives in lung transplantation: from conventional preservation to ex vivo lung perfusion and lung reconditioning. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 35, 1057-1059 (2009).
  4. DeCampos, K. N., Keshavjee, S., Liu, M., Slutsky, A. S. Optimal inflation volume for hypothermic preservation of rat lungs. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 17, 599-607 (1998).
  5. Perrot, M., et al. Report of the ISHLT Working Group on Primary Lung Graft Dysfunction part III: donor-related risk factors and markers. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 24, 1460-1467 (2005).
  6. Mulloy, D. P., et al. Ex vivo rehabilitation of non-heart-beating donor lungs in preclinical porcine model: delayed perfusion results in superior lung function. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 144, 1208-1215 (2012).
  7. Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European journal of cardio-thoracic surgery : official journal of the European Association for Cardio-thoracic Surgery. 45, e54-e60 (2014).
  8. Perrot, M., Liu, M., Waddell, T. K., Keshavjee, S. Ischemia-reperfusion-induced lung injury. American journal of respiratory and critical care medicine. 167, 490-511 (2003).
  9. Steen, S., et al. Transplantation of lungs from a non-heart-beating donor. The Lancet. 357, 825-829 (2001).
  10. Perrot, M., et al. Strategies to optimize the use of currently available lung donors. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 23, 1127-1134 (2004).
  11. Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of heart and lung transplantation : the official publication of the International Society for Heart Transplantation. 27, 1319-1325 (2008).
  12. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo perfusion prevents lung injury compared to extended cold preservation for transplantation. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 9, 2262-2269 (2009).
  13. Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. The New England journal of medicine. 364, 1431-1440 (2011).
  14. Cypel, M., et al. Normothermic Human Ex Vivo Lung Perfusion (EVLP) for Improved Assessment of Extended Criteria Donor Lungs for Transplantation. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 28, S126-S126 (2009).
  15. Sanchez, P. G., et al. Normothermic Ex Vivo Lung Perfusion as an Assessment of. Marginal Donor Lungs - The NOVEL Lung Trial. J Heart Lung Transpl. 32, S16-S17 (2013).
  16. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation proceedings. 42, 444-447 (2010).
  17. Pego-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: technique and application in lung preservation studies. Jornal brasileiro de pneumologia : publicacao oficial da Sociedade Brasileira de Pneumologia e Tisilogia. 36, 490-493 (2010).
  18. Niemeier, R. W. The isolated perfused lung. Environmental health perspectives. 56, 35-41 (1984).
  19. Zhou, X., et al. A pulmonary hypertension model induced by continuous pulmonary air embolization. The Journal of surgical research. 170, e11-e16 (2011).
  20. Harris, J. M. Differences in responses between rat strains and colonies. Food and cosmetics toxicology. 3, 199-202 (1965).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics