Исследуя распространение и токсичности прионами как белков с использованием многоклеточных животных модельного организма

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Многие нейродегенеративные заболевания, включая болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (БП), боковой амиотрофический склероз (ALS), и трансмиссивных губчатых энцефалопатий (ТГЭ), связаны с агрегацией склонны белков и, следовательно, вместе известны как белковых неправильного сворачивания расстройства (PMDS ). ТГЭ или прионные болезни представляют собой уникальный класс PMDS в том, что они могут быть заразными в обоих людей и животных 1. На молекулярном уровне, прионы репликации путем набора и преобразования мономерный α-спираль-богатый узла в кодировке сотовой PrP (PrP C) в патологический β-листа богатой PrP Sc конформации 2,3. Самораспространяющиеся белковые агрегаты были также выявлены в грибах, которые разделяют важные характеристики с прионов млекопитающих 4,5. Кроме того, прионы млекопитающих способны перемещаться из клетки к клетке и заражать наивных клеток 6,7.

В то время как PMDS Othэ чем ТГЭ не заразны, они разделяют общую патогенную принцип с прионами 8,9. Хотя белки, связанные с каждой из PMDS не связаны в структуру или функцию, они все образуют агрегаты с помощью процесса кристаллизации, как называют зарождение и высевали полимеризации; Кроме того белковые семена расти, привлекая их растворимые изоформы 2,10,11. Эффективность на самоопределение распространяться варьируется в естественных условиях, в зависимости от собственных свойств белка, которые вместе с дополнительными клеточных факторов, таких как молекулярных шаперонов в конечном счете, определяют темпы совокупного зарождения, посев, фрагментации и распространения 12-15. Таким образом, должна существовать тонкий баланс между этими факторами, что позволяет эффективно распространение агрегации белков. Это может также объяснить, почему только некоторые амилоидогенные агрегаты убежищем характеристики прионов, и, таким образом, не все PMDS заразны. Прионы, кажется, представляют O 'топ-исполнителей,FA широкий спектр самовоспроизводящихся белковых агрегатов, что делает их мощным инструментом для изучения PMDS 8,13.

Интересно, токсичность, связанная с болезнью, связанные с агрегатами часто имеет автономную компонент не клеток 16,17. Это означает, что они влияют на соседние клетки, которые не экспрессируют соответствующий ген, в отличие от строго клеточно-автономными эффекта, откуда следует, что только клетки, экспрессирующие ген проявляют специфическую фенотип. Это было убедительно продемонстрирована путем экспрессии ткане-специфической или сбить из соответствующих белков в многочисленных моделей нейродегенеративных заболеваний 18-26. Различные механизмы были предложены в качестве основы для этого не-клеточной автономной токсичности в PMDS, в том числе подачи питательных веществ, уменьшается дисбаланс в нейрональной передачи сигналов, глутамат эксайтотоксичности и нейровоспаления 16,27,28. Кроме того, прион, как движение болезни связаны агрегатов между клетками mighт к этому аспекту 29,30. Увеличение данные свидетельствуют о том, что белковые включения других, чем прионов может передаваться от клетки к клетке, которая может объяснить характеристика распространения патологии наблюдается во многих PMDS 30-36. Тем не менее, до сих пор не определена, есть ли ясно причинно-следственная связь между межклеточной движения белков заболевания и токсического действия на соседних клетках. Таким образом, более глубокое понимание клеточных путей, которые лежат в основе передачи от клетки к клетке и без клеток автономный токсичности необходимо и важно для развития новых терапии. Тем не менее, многие аспекты прионов, как распространение и клеточных факторов, которые влияют на клетки к клетке передачи неправильно упакованных белков в многоклеточных не очень хорошо понимал, в частности, на организменном уровне.

Нематода Caenorhabditis Элеганс имеет ряд преимуществ, которые обеспечивают потенциал для открыть для себя новые грани прионов, как spreadiНГ многоклеточных 17. Она прозрачна, что позволяет в естественных условиях отслеживания флуоресцентно меченных белков в живом организме. Кроме того, многие клеточные и физиологические процессы, пострадавших от болезни сохраняются от червей до человека, и С. Elegans также поддаются широкого спектра генетических манипуляций и молекулярных и биохимических анализов 37-39. Ровно 959 соматические клетки составляют взрослых гермафродитом с простым строением тела, что до сих пор имеет несколько различных типов тканей, в том числе мышц, нейроны и кишечника.

Чтобы установить новую модель прионов в С. Элеганс, мы решили экзогенно выразить также характеризуется глутамин / аспарагин (Q / N), обогащенный прионов домена нм цитозольном дрожжи прионного белка Sup35, так как нет никаких известных эндогенные белки прионы в червей 4,40. Прионов дрожжей, внесли неоценимый вклад в выяснении основных механизмов прионов репликации 41-44. Кроме того, нм ельул цитозольный прионов, как белок, который, как было показано резюмировать весь жизненный цикл прионов в культуре клеток млекопитающих 45,46. Кроме того, при выраженной в С Элеганс, домен прионов Sup35 принят на удивление хорошо с различными требованиями к распространению в многоклеточных клеток по сравнению с дрожжевых клеток и выставлены ключевых особенностей прионов биологии агрегации 40. Н.М. было связано с глубоким токсичных фенотипа, в том числе нарушения митохондриального целостности и внешнего вида различные аутофагии, связанные пузырьки на клеточном уровне, а также в зачаточном состоянии и личинок арест, задержка развития, и широко распространено нарушение сворачивания белков среды на организменном уровне. Поразительно, домен прионов обладает клеток автономных и без клеток автономный токсичность, затрагивая соседние ткани, в которой не было высказано трансген. Кроме того, везикулярного транспортного домена прионов внутри и между клетками мониторинг в режиме реального времени <EM> В естественных условиях 40.

Здесь мы опишем, как исследовать прионов, как распространение в С Элеганс. Мы расскажем о том, чтобы следить за внутри- и межклеточных транспорт везикул, содержащих домен прионов с помощью покадровой флуоресцентной микроскопии. Подчеркнем, использование тканеспецифических складных датчиков и повсеместно выразил стресс журналистам, чтобы оценить клеток автономных и безалкогольные клеток автономных влияние на клеточный фитнеса. Наконец, мы опишем процедуру недавно проведенного широкого РНК-интерференция (RNAi) экран генома для выявления новых модификаторов прионов, вызванной токсичности. В сочетании, эти методы могут помочь дразнить друг от друга генетические путей, участвующих в межклеточной движения белков и их не клеточной автономной токсичности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Мониторинг трансцеллюлярного Распространение прионами как белков в естественных условиях ЗАМЕДЛЕННАЯ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Grow С Elegans дикого типа (WT) (N2) и трансгенные линии в соответствии со стандартными методами и тщательно контролировать температуру выращивания 47.

  1. Создание трансгенных линий С. Элеганс выражения прионов, как белок, маркированный мономерного красного флуоресцентного белка (MRFP). Смотреть это видео, которое демонстрирует, как использовать микроинъекции 48. Для получения более подробной информации и методов, описывающих, как интегрировать эти внехромосомных линии, см 49.
  2. Подготовка синхронизированных популяций путем укладки яиц или отбеливания в соответствии со стандартными методами 50.
    1. Синхронизация с откладки яиц
      1. Передача 10 - 20 беременные взрослых на тарелку и дайте им откладывают яйца за 1 - 2 часа. Удалить взрослых от пластины, и пусть потомство не растут до желаемого возраста.
    2. <LI> Синхронизация с помощью отбеливания
      1. Сбор несинхронизированный население беременных взрослых и отбелить их с щелочным раствором гипохлорита (250 мм NaOH и 1: 4 (V / V) разбавления коммерческой отбеливателя в H 2 O). Вымойте яйца в два раза (218 мкг в течение 1 мин) с M9 буфера 47 (21 mMNa 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, добавьте дН 2 O до 1 л).
      2. Позвольте им люк в M9 буфера при осторожном перемешивании O / N на 20 ° C. Развитие червь задержать на стадии L1 в отсутствие источника пищи, в результате чего синхронизированный население. Трансфер L1S на свежий нематоды питательной среды, (NGM) Плиты, посеянных с OP50 Е. бактерии кишечной палочки, и пусть потомки не развиться до требуемого возраста 47.
  3. Подготовка 2% агарозном колодки (в H 2 O) на предметном стекле микроскопа, как описано 50.
    1. Приготовьте два миcroscope слайды с маркировки ленты размещены по всей их длине, чтобы использовать в качестве прокладок. Поместите третий микроскопа между ними.
    2. Растворите 2% агарозы в H 2 O и пипетки одну каплю на чистую слайда.
    3. Поместите четвертый слайд перпендикулярно к трем другим скользит по верхней части агара капли. Аккуратно надавите на него, чтобы сгладить площадку к тому же толщины, как маркировочной лентой.
    4. Дайте высохнуть в течение 1 мин перед удалением прокладок и осторожно потянув слайды друг от друга. Агар панель будет придерживаться одного из них.
  4. Внесите ~ 10 мкл анестетика (2 мМ левамизол в M9 буфера) на площадку и передачи ~ 10 животных с использованием платиновой проволоки выбор. Крышка с покровным (~ 22 х 22 мм) и получать изображения в течение 1 часа.
  5. В качестве альтернативы, чтобы получить фильмы в течение более длительного периода времени, или для дальнейшего снижения вероятности любого движения животных, используют комбинацию анестетика и борта иммобилизации 51.
    1. Подготовка 10% агавырос колодки (в M9 буфера), как описано 51 и добавить червей до 3 мкл раствора стандартов размеров наносфера (полистирольные шарики, 100 нм) плюс 3 мкл анестезии (4 мМ левамизол в M9 буфера). Обложка осторожно покровным. Чтобы избежать высыхания, печать покровное с VALAP (смесь равных количеств вазелин, ланолин, и парафина).
  6. Изображение иммобилизованных червей с помощью конфокальной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты получены с использованием вращающегося диска AF конфокальной микроскопии, оснащенный EM-CCD камеры и микроскопия Автоматизация и анализ изображений программное обеспечение, такое как Метаморф и наметить особенности ниже, но и другие системы, сравнимые конфокальной микроскопии также могут быть использованы.
    1. Используйте масло цели 63x или 100X / 1.4NA и поместите стекло микроскопа, содержащий червей в держатель стекло микроскопа.
    2. Откройте программное обеспечение. Отрегулируйте мощность лазера и фильтров для работы с изображениями MRFP. Используйте лазер на 561 нм при 10% мощности и выбросов Filter> 600 нм.
    3. На вкладке "Сохранение" выберите или создайте папку директории, где будут сохраняться файлы. Назначьте имя файла.
    4. На вкладке "длина волны" выберите соответствующий освещение и настройки экспозиции и усиления. Используйте "YokoQuad Red" (или эквивалент установку освещения для изображений MRFP) с экспозицией между 100 и 300 мс и коэффициентом усиления камеры между 100 и 300, в зависимости от конкретного образца (оценивается с помощью живой образ).
    5. На вкладке "Интервальная" выберите "Кол-во пунктов Time" = 301, "Продолжительность" = 5 мин и "Time / Интервал" = 1 сек.
    6. Под "Журналы" выберите закладку журнала: "АФК SET Z HOLD" и "АФК Вернуться к Z HOLD", Тип: &# 8220; Специальный "(дважды), начальной точки:" Начало момент времени "и" Конец момент времени ". Этот вариант автофокусом важно, чтобы изображение той же самой секции в течение более длительного периода времени.
    7. Когда настройка закончена, нажмите "Приобрести". Интервальная видео приберег в виде отдельных файлов в формате TIFF.
    8. Откройте все .tiff файлов данного временного ряда в ImageJ. Перейти к "Image" → "Стеки" → "Изображения для складирования". По желанию, настроить яркость и контрастность, добавлять размера бар и т.д. Экспорт фильма в разделе "Файл" → "Сохранить как" → "AVI ..." (для примера см Видео 1 и 2, соответствующий рисунку 1).

2. Использование Складные Датчики и стресс Репортеры по расследованию Cell автономный и без клеток автономный влияет на Proteostasis и токсичность

  1. Создание трансгенных линий, которые coexpress датчик складной или стресс reporteг вместе с прион-подобный белок. Для методов о том, как установить кресты или создания трансгенных линий, см 48,49,52. В таблице 1 приведен список С. штаммы Элеганс, которые могут быть использованы.
  2. Подготовка синхронизированных популяций трансгенных животных и не растут их до желаемого возраста, как описано выше (раздел 1.2) 50.
  3. Использование стереомикроскопа, изучить соответствующую фенотип датчика складной или стресс репортера.
    1. Для датчика складывающиеся, определить количество животных, являющихся носителями агрегатов на каждый день после синхронизации (для примера, рис 2Е и F).
    2. Для стресс-репортера, проверить, если коэкспрессия прионных, как белка приводит к увеличению флуоресценции репортера (для примера см рисунок 3).

3. Генома экрана по пресечению прионному-индуцированной токсичности в C. Элеганс

Рисунок 4
Рисунок 4. Схематическое изображение протокол скрининга RNAi, см. Раздел 3 протокола для подробного описания отдельных этапов.

  1. Синхронизация С Элеганс червей и дублирование библиотеки РНК-интерференции
    1. Для экрана РНК-интерференции, использовать библиотеку Ahringer RNAi (или библиотеку Vidal RNAi) 53,54. Rearray библиотеку RNAi из исходного формата 384 а в 96-луночных планшетах при заполнении пластины 100 мкл LB-амп сред (50 мкг / мл ампициллина, в LB) с добавлением 10% глицерина и инокуляции с использованием 96-контактный репликатор. Выращивают при температуре 37 ° CO / N при перемешивании и хранят при -80 ° С.
    2. Поддержание C. Элеганс WT и трансгенных линий при 20 ° C на НГО пластин затравку OP50 Е. палочки бактерии в соответствии со стандартными методами 47.
    3. Синхронизация трансгенных домена прионов и WT (контроль) нематод с помощью отбеливания (см раздел 1.2).
    4. В тот же день, что черви беленой, подготовить LB среде с добавлением 50 мкг / мл ампициллина. Использование автоматизированной реагента дозатор для дозирования (или пипетки вручную) 65 мкл сред LB-Amp в каждую лунку 96-луночного планшета.
    5. Удалить 96 а библиотечные пластины Ahringer RNAi от -80 ° C и привести их в стерильную капот выстроились с бумажными полотенцами. Немедленно снять уплотнительную-ленту, держа планшет вверх дном, а пластины еще заморожены, будьте осторожны, чтобы избежать загрязнения от льда на внешней стороне пластин. Переворачивания тарелки и пусть таять в течение 30 мин.
    6. Опустите один стерильный 96-контактный репликатор в одну библиотеку РНК-интерференции пластины, а затем в один свежий LB-усилителя пластины. Использование свежей стерильной репликатор для каждой пластины. Закройте все таблички с клейкой фольги ленты и вернуть библиотечные пластин до -80 ° C. Репликаторы может быть насквозь пропитанной известью, ополаскивают,и выдерживают в автоклаве, чтобы использовать снова.
    7. Разрешить дублированные RNAi пластины расти O / N в инкубатор до 37 ° С и 300 оборотах в минуту. Для использования HT115 Е. палочка бактерии, несущие пустой вектор (L4440) в качестве контроля, вырастить его отдельно в пробирку, а затем пипеткой 65 мкл культуры с помощью многоканальной пипетки в одну четверть двух 96-луночных планшетах.
  2. Индукция бактериального дцРНК производства и добавлением червей
    1. Развести изопропил-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) до концентрации 5 мМ в DDH 2 O. Использование автоматизированное рабочее место с помощью многоканальной головкой для выдачи (или пипетки вручную) 10 мкл разбавленного IPTG в каждую лунку бактерий RNAi и контрольных плит. Плотно закройте и поместите пластины обратно в инкубатор. Пусть встряхивают в течение 3 ч при 37 ° С.
    2. В то время как бактерии трясутся, подготовить червей. Смешайте M9 / червей, подвеска хорошо, и пипетки небольшой образец (~ 5 - 10 мкл) в предметное стекло микроскопа. Считатьколичество червей под стереомикроскопом и рассчитать количество червей на мкл.
    3. Использование метода стерилизации, приготовить раствор с добавлением M9 (M9 +) со следующими конечных концентрациях: 0,20 мг / мл IPTG, 8,0 мкг / мл холестерина, 50 мкг / мл ампициллина, 9,6 мкг / мл тетрациклина, 0,0835 мкг / мл Fungizone, и 15 червей в 50 мкл.
      1. Сделайте отдельные решения для трансгенных домена прионов и WT червей. Конечный объем М9 + червячного раствора, необходимого будет зависеть от количества пластин RNAi скопированных (смотри ниже), а также ~ 30 мл мертвого объема, который будет оставаться в резервуаре, при использовании автоматизированной диспенсер.
    4. После 3 ч индукции бактериальных дсРНК, возьмите пластины из инкубатора и дайте им остыть до комнатной температуры (~ 30 мин), чтобы избежать тепла подчеркивая животных.
    5. Разлить по 50 мкл М9 + домена прион трансгенной червь раствора в каждую лунку планшетов RNAi и один из пустых пластин векторного управления. Сделатьобязательно смешать червь раствора перед каждым шагом, как животные, как правило, оседают на дно резервуара.
    6. Не включать WT червей во второй контрольной пластине. Оставьте пластин незапечатанных, чтобы аэрацию. Чтобы сохранить культуральной жидкости от испарения, стек 4 - 5 пластин вместе и оберните влажным полотенцем бумаги и алюминиевой фольги. Инкубируют при 200 оборотах в минуту при 20 ° С в течение 4 дней.
  3. Счет
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 4 дней в инкубаторе, черви будут на второй день совершеннолетия и готовы к экрану. Дай животным приспособиться к некурящих сотрясении в течение 30 мин до проверки, чтобы гарантировать бесперебойную взбучку.
    1. Используя камеру Сокол 4M60, подключенный к компьютеру с помощью монитора, экран визуально для увеличения обмолота по сравнению с контрольными лечение доменных прионов трансгенных животных.
    2. Составьте список предварительных просмотров, чтобы подтвердить с помощью wrMTrck (смотрите следующий раздел).

4. Подтверждение предварительногоЭкран Просмотров

  1. Подвижность анализ на твердых плит
    1. Подготовка пластин с NGM с добавкой 100 мкг / мл ампициллина, 12,5 мкг / мл тетрациклина и 1 мМ IPTG, в соответствии со стандартными методами 47. Если возможно, используйте пластины-заливки машину, чтобы обеспечить все пластины имеют одинаковую высоту СМИ, что позволит более упрощенной процедуре приобретения видео.
    2. Выращивают различные клоны RNAi в ~ 1 мл LB + 50 мкг / мл ампициллина, O / N при 37 ° С и 250 оборотах в минуту.
    3. На следующий день, индуцируют экспрессию дцРНК 1 мМ IPTG в течение 3 часов. Семенной пластин с 150 мкл каждой бактериальной клона РНК-интерференции, распространение в тонком слое. Пусть бактерии сухие в течение 2 дней при комнатной температуре в темноте. Подготовьте 3 пластин в РНК-интерференции клона.
    4. Синхронизация население червя при отбеливании в соответствии со стандартными методами 50 (см раздел 1.2), и пусть яйца люк O / N в М9.
    5. Возьмем образец червячного суспензии и определения количества NEMatodes в мкл на стереомикроскопом. Затем пипеткой надлежащего объема М9 плюс червей в каждой экспериментальной пластины таким образом, что она содержит 25 - 30 L1 червей. Расти нематод при 20 ° С в течение 4 дней, пока черви не достигнете день 2 взрослости.
  2. Количественный анализ червя моторики с помощью плагина wrMTrck для ImageJ
    ПРИМЕЧАНИЕ: видео были записаны с использованием стереомикроскопа с 10Х с Хамамацу Orca-R2 цифровой камеры C10600-10B и программного обеспечения Простой изображений PCI Хамамацу.
    1. Включите камеру и простое программное обеспечение визуализации PCI. Нажмите на кнопку "Live", чтобы обеспечить изменения условий формирования изображения.
    2. Настройка видео соблюдении следующих условий: усиление = 0; Light Mode = High; Скорость Index = 1; Биннинг = 2. Щелкните "Auto Expose", а затем настроить условия освещения, перемещения микроскопа зеркала и яркость и контрастность диски.
      ПРИМЕЧАНИЕ: видео необходимо иметь высокий контраст, не будучи ПЕРЕЭКСПosed, так что животные появляются в виде черных фигур на светлом фоне.
    3. Нажмите на кнопку "время сканирования" и выберите папку и имя файла. Установите "Поле задержка" на 20 мс и "Остановка на время" 30 сек. Нажмите "Live Обзор", чтобы выбрать область пластины для записи (где большинство червей). Нажмите пластина 3 или 4 раза на сцене, быстро подтвердить свою позицию в поле зрения и нажать кнопку "Старт".
    4. После фильма завершения записи, щелкните правой кнопкой мыши на изображение и выберите "Экспорт Montage последовательность", чтобы экспортировать фильм из .cxd формата в формате .avi.
  3. Анализируя моторики видео
    1. Откройте программное обеспечение ImageJ, перейдите на вкладку "Плагины", затем "wrmtrck" и выберите "wrMTrck партии". Выберите каталог, содержащий все файлы, которые будут проанализированы.
    2. В главном окне ввода wrMTrck_Batch, загрузите входные значения, как описано в Figurе 5C. Объяснение для каждого из параметров можно найти в инструкции, которые сопровождают плагин. Нажмите "OK", и пусть анализа движения перспективе.
    3. Курировать результаты и убедиться, что все обнаруженные следы от фактических С Элеганс и ликвидации артефакты, откройте каждый из .txt файлов, созданных для каждого фильма и копировать информацию в файл программного обеспечения для анализа данных. Откройте "* _labels.zip" файлы, созданные и запустить полученный "* _labels.tif", чтобы вручную проверить и устранить ложные червь треков.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мониторинг межклеточные распространения прионных-подобных белков по в естественных условиях покадровой съемки

Трансгенные С. Элеганс линии, экспрессирующие домен прионов, особенно хорошо подходит для анализа некоторых аспектов прионов-подобных белков, например, передачи от клетки к клетке и не клеточной автономной токсичности. Прозрачность животных позволяет отслеживания флуоресцентно меченных белков внутри живого организма на каждом этапе жизни. Воспользовавшись этим, движение прионов-подобных белков по всей клеток и тканей с использованием флуоресцентного микроскопа визуализируются. Масло целью 63X или 100X / 1.4NA необходимо решить везикулярного структур. Важно отметить, что область прион должен быть помечены MRFP, чтобы оставаться флуоресцентно видно в этих предположительно кислых везикул 40. Желтый флуоресцентный белок (YFP), который часто используется в качестве метки, яš не подходит, потому что это тушится в среде с низким рН 40,55. Процедить AM815 выражает RFP меченых R2E2 (весьма агрегации склонны искать и токсичную форму домена прионов Нью-Мексико), который накапливается в трубчатых везикул, в то время как RFP тег в одиночку остается растворимый (1А и В). Использование в естественных изображений в заданный промежуток времени, можно было наблюдать, что эти трубчатые везикулы транспортируются внутри и между клетками 40 (рис 1С и D, Video 1 и 2) [размещать ссылки на видео 1 и 2 здесь].

Использование складных датчики и стресс журналистам расследовать клеток автономные и не-клеточных автономных воздействие на proteostasis и токсичности

Прионы способны пересечь семян родственных белков и нарушить клеточный белок складной окружающей среды. Это могут быть выявлены с помощью коэкспрессии соответствующей складной SensoRS. Складные датчики несущественные метастабильные белки, которые зависят от функциональной сети proteostasis правильно сложить. Некоторые примеры хорошо известны люциферазы светлячка и белки, несущие чувствительные к температуре (TS) мутации 56-66. Нарушение proteostasis приводит к неправильного сворачивания репортера, который может быть обнаружен путем визуального осмотра или агрегатов под воздействием соответствующего TS мутантного фенотипа в разрешающих температурах. Участки полиглутаминовых (polyQ) с длиной на пороге агрегации (около 40 остатков) также часто используются, потому что они проявляют зависит от возраста агрегацию 67-69. Ранее начало агрегации показывает угрозу складной окружающей среды. Здесь мы использовали прионов мутант RΔ2-5, которая остается растворимый, выраженных в С Elegans стенки тела мышцы (BWM) клетки кишечника и 40 (Фиг.2А и В). При одновременном выражения с R2E2 в BWM клеток, RΔ2-5 READíly агрегаты (рис 2, б) выявление сотовый автономный эффект R2E2 на сворачивание белка окружающей среды. Широкое воздействие на proteostasis и индукции неправильного сворачивания через ткани может быть оценена путем экспрессии датчика складывания в отдельной ткани, который не экспрессирует сильно агрегации подверженных форму области прионов. Было высказано R2E2 под специфического промотора BWM клеток (мио-3P), в то время как Было высказано RΔ2-5 под промотором кишечника конкретных (VHA-6P). Объединение кишечника RΔ2-5 показывает, что R2E2 влияет сворачивание белков в не мобильный автономном режиме 40 (рис 2D). Вместо того чтобы использовать RΔ2-5, где агрегаты могут быть обнаружены только при высоком разрешении, использование polyQ44 выражены в кишечнике (Q44i) позволяет визуализировать агрегатов с низким разрешением при помощи стереомикроскопа (рис 2E и F). Кроме того, это позволяет количественно оценить анимыLs с агрегатов, а также количественное определение числа агрегатов.

Для исследования клеток без автономного токсичность области прионов, мы исследовали ранее соседних тканей, которые не экспрессируют R2E2 с помощью электронного микроскопа и обнаружили, что экспрессия области прионов в мышечных клетках приводит к клеточной автономной, не нарушения целостности митохондриальной в соседних тканей, таких как кишечник 40. Митохондриальная результаты дисфункция приводит к повышенной активных форм кислорода (АФК) производства и окислительного стресса. Неинвазивный способ визуализировать индукцию ответ окислительного стресса является использование окислительный стресс, индуцируемый репортер 70. Штамм CF1553 выражает зеленый флуоресцентный белок (GFP) под окислительный стресс индуцируемый промотор дерново-3 70. При подошел к животным, экспрессирующих домен прионного R2E2 в BWM клеток, репортер был значительно повышающей регуляции в BWM клеток, а также в многочисленных не-BWM тканей ( В таблице 1 приводится список С. Элеганс штаммы выражения складные датчики и стресс журналистам, что могут быть использованы аналогично.

Геном-широкий экран для подавления прионов, вызванной токсичности в C. Элеганс

Комплекс токсичности фенотип области прионного выражены в С Элеганс особенно интересно из-за отсутствия заметного токсичности, наблюдаемой в наиболее пробирке моделей прионов 71. Эта модель может выявить новые пути, которые могут повлиять на токсичность, связанную с прионов в многоклеточных. Для решения этой проблемы, мы скрининг генов, которые, когда РНК-интерференции истощены, могли бы улучшить моторику дефект R2E2 трансгенных животных. Контрольные обрабатывают WT червей может быть использована в качестве положительного COуправляете, хотя большинство генов-кандидатов не будет обеспечивать полный фенотип движение спасения, из-за переменной RNAi пенетрантности и высокой токсичности трансгена. Животных обрабатывали в течение 4 дней с RNAi, с первого личиночного состояния L1 в день 2 взрослой жизни. К этому времени, обмолота необработанных R2E2 животных значительно медленнее, чем обмолота WT животных, что является важным, потому что мы скрининга для улучшения подвижности. F1 потомство будет присутствовать (~ L1s), но легко отличить от поколения P0. Только поколения Р0 забил. Это начальный экран визуально и не количественное, и поэтому низкий порог был использован для определения предварительных хиты, это означает, что каждый бактериальная РНК-интерференции клон, который, казалось, увеличить обмолота прионами выражения животных повторно в количественном переползания анализа. Рисунок 4 излагаются Основные этапы установки экрана. Высокое разрешение камеры Сокол 4M60 включен визуальный скрининг в Quarтер пластины в то время, на экране компьютера, что позволило экран должен быть завершен более эффективно. В то время как полезным, в этом нет необходимости. Визуальный осмотр червячного обмолота также может быть выполнена с помощью стереоскоп при малом увеличении (10x).

Подтверждение предварительным хитов экрана

Высокие экраны пропускной выполняются как подход, который позволяет анализировать генома широкие последствия для получения первичного список генов-кандидатов, которые могут быть уточнены дополнительных методов. Проверка результатов на экране, поэтому важно, чтобы исключить возможные ложные срабатывания, которые могут возникнуть в результате выполнения экран только с одной экспериментального образца на РНК-интерференции. R2E2 трансгенные животные питались с РНК-интерференции клонов первичных обращений и измерил их скорость на NGM пластин на второй день взрослой жизни, как количественно считывания подвижности и снижение токсичности. Мы использовали плагин wrMTrck для ImageJ, разработанный в нашейлаборатория, которая точно определяет C. Элеганс в видео и следует их движение. Плагин и скрипты для автоматического анализа wrMTrck имеют открытый исходный код и публично доступны на http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, вместе с подробными инструкциями о том, как его использовать. После загрузки, скопируйте папку всю wrMTrck в папку с плагинами ImageJ. Этот протокол описывает метод wrMTrck_Batch, предпочтительный для анализа большого количества видео в то время, однако инструкции по ручной, фильм, кино, анализ, также доступны при загрузке плагина. WrMTrck_Batch преобразует оригинальный видео (Рисунок 5а) в двоичном формате с вычитанием фона, и каждый червь присваивается трек. Каждый из полученных видео позже могут быть просмотрены с этих треков, наложенных для того, чтобы вручную устранить любые артефакты, которые были ложно определенные как черви (е. Г., Дорожки 1 на рис 5B). Одним из эффективных способов устранения фона искусство ifacts (указано стрелкой на рисунке 5б) тщательно выбирать минимальный и максимальный размер объектов, которые будут определены (5С). Из различных выходов плагин wrMTrck, мы используем длины тела в секунду Параметр (BLPS), который измеряет среднюю скорость каждого животного, представленного длине каждой дорожки, разделенной на длину тела каждого объекта, таким образом, для нормализации разности потенциалов в размере нематод (рис 5D). Используя этот метод, мы определили 35 супрессоры прионов, вызванной токсичности (SOPT), что увеличило фенотип моторики в R2E2 выражения С. Элеганс, по крайней мере, 133% и до 256% по сравнению с пустыми векторных обработанных червей (рисунок 6). Эти SOPT гены представляют окончательное подтвердил хитов, которые в результате наших с высокой пропускной способностью усилий скрининга.

21fig1highres.jpg "/>
Рисунок 1. Область прионов распространяется между клеток и тканей в C. Элеганс по везикулярного транспорта. () Collapsed конфокальной Z-стеки нематод, выражающих RFP в стенки тела мышцы (BWM) клеток (RFPm.) (B) Collapsed конфокальной Z-стеки нематод выражения высокотоксичный и агрегации склонны NM вариант, R2E2 в BWM клеток (R2E2m). Стрелки указывают трубчатых везикул, стрелка указывает агрегат. (C + D) Покадровый серии животных выражая RFPm (C) и R2E2m (D). Стрелки указывают направления везикулярного движения. RFPm имеет в основном диффузное окрашивание. Даже когда RFPm находится в пузырьках, они с трудом двигаться. R2E2m локализуется в многочисленных пузырьков, которые переносятся внутри и между клетками. Шкала бары: 10 мкм. Прилагаемые Видео 1 и 2 [место ссылки на видео 1 и 2 здесь] соответствуют 1С цифры и D,соответственно.

Фиг.2
Рисунок 2. Датчики Складные раскрыть широкое воздействие домена прионов на proteostasis. (A + B) Коэкспрессия R2E2m способствует RΔ2-5m агрегации. Конфокальных изображений (A) RΔ2-5m управления и (В) RΔ2-5m совместной экспрессии с R2E2m в BWM клеток. (C + D) мышцы выражены R2E2m способствует кишечного RΔ2-5i агрегации. (C) конфокальной изображение контрольного животного, экспрессирующих RΔ2- 5i в клетках кишечника. (D) конфокальной изображение животных, экспрессирующих R2E2m в BWM клеток и RΔ2-5i в кишечнике. Шкала бары: 10 мкм (E + F) R2E2m вызывает не мобильный автономный агрегацию Q44i (E) Характерные флуоресцентные изображения Q44i и Q44i; R2E2m животные 4 дней после передачи синхронизированного L1 LAR..VAE на свежие OP50 семенами NGM пластин. Выражение R2E2 в BWM клеток приводит к более ранним началом Q44i агрегации в кишечнике. (F) Количественный анализ животных с агрегатами (в%) от указанных дней после синхронизации. Усы представляют SD Эта цифра была изменена с 40.

Рисунок 3
Рисунок 3. дерново-3p :: GFP транскрипции стресс репортер показывает, что домен прионов вызывает клеток автономных и без клеток автономный индукции окислительного стресса. (A + B) Типичные флуоресцентные изображения (используя то же время экспозиции) дерново-3p :: GFP выражения контрольные животные (А) и дерново-3p :: GFP;. R2E2m животные (B) на 2 день совершеннолетия (C) выражение R2E2 в BWM клеток приводит к индукции репортера не только в BWM клеткис (I), но также в кишечнике (II), нерв мозга (III), глотки и головы нейроны (IV).

Рисунок 5
Рисунок 5. Анализ движения червя с модулем wrMTrck для ImageJ. (А) Пример входного фильма, генерируемого с использованием соответствующего увеличения (~ 10X), чтобы контролировать несколько животных одновременно. (Б) "*" файлы _labels.tif являются выход wrMTrck_Batch и позволяют для ручной курирование результатов анализа. Стрелка указывает объект, который правильно исключены из анализа из-за соответствующего выбора минимальных и максимальных параметров размера. (C) входное окно wrMTrck_Batch, показывая параметры, используемые для этого протокола. Эти параметры должны быть скорректированы в соответствии с индивидуальными микроскопа и кино настроек. (D) Вывод результатов от movemeNT анализ (B), с колонкой BLPS выделены желтым цветом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 1
Рисунок 6. R2E2 черви, обработанные RNAi клонов, которые супрессоров прионного-индуцированной токсичности (SOPT) показывают улучшенную подвижность. Подвижность показано в виде относительных BLPS по сравнению с отрицательным контролем (пустым вектором). Показаны все статистически значимые (Стьюдента) РНК-интерференции клоны, идентифицированные на экране ПВТ. Black Star представляет хит, показанный в качестве примера на рисунке 5. Результаты из 3 фильмов, с 17 <N <53 дорожек на состоянии. Усы представляют SEM. </ P>

Таблица 1. С. Элеганс штаммы выражения складные датчики и стресс журналистам.

Название Штамм генотип Комментарии Источник Штамм
Складные датчики
трансгены
AM140 UNC-54P :: polyQ35 :: YFP специфического для мышц выражение polyQ35, зависимое от возраста агрегация CGC или Моримото лаборатория
AM141 UNC-54P :: polyQ40 :: YFP специфического для мышц выражение polyQ40, А.е зависит агрегации CGC или Моримото лаборатория
AM801 UNC-54P :: RΔ2-5 :: YFP мышц конкретное выражение нуклеации некомпетентного области прионов Моримото лаборатория
OG412 VHA-6P :: polyQ44 :: YFP Кишечник-специфическая экспрессия polyQ44, зависимое от возраста агрегация CGC
AM809 VHA-6P :: RΔ2-5 :: GFP; мио-2р :: mcherry Кишечник-специфическая экспрессия зарождения некомпетентного области прионов Моримото лаборатория
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP нейрон-специфическая экспрессия polyQ40, удельный агрегации тип клеток Моримото лаборатория
AM982 unc54p :: люциферазы :: YFP специфического для мышц выражение WT люциферазы светлячка Моримото лаборатория мио-3p :: люциферазы :: GFP; РОЛ-6 специфического для мышц выражение WT люциферазы светлячка Behl лаборатория
SNG-1P :: люциферазы :: GFP; РОЛ-6 специфического для мышц выражение WT люциферазы светлячка Behl лаборатория
FUH55 unc54p :: FLUC :: EGFP; РОЛ-6 специфического для мышц выражение WT люциферазы светлячка Hartl лаборатория
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; РОЛ-6 специфического для мышц выражение R188Q мутанта люциферазы светляков Hartl лаборатория
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; РОЛ-6 специфического для мышц выражение R188Q + R261Q двойной мутант люциферазы светляков Hartl лаборатория
FUH48 F25B3.3p :: FLUC :: EGFP; РОЛ-6 нейрон-специфическая экспрессия WT светлячка luciferaSE Hartl лаборатория
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; РОЛ-6 нейрон-специфическая экспрессия R188Q мутанта люциферазы светляков Hartl лаборатория
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; РОЛ-6 нейрон-специфическая экспрессия R188Q + R261Q двойной мутант люциферазы светляков Hartl лаборатория
TS-мутанты
CB1402 UNC-15 (e1402) Я Paramyosin (TS), чувствительный к температуре Unc-парализована, пусть CGC
CB1157 UNC-54 (e1157) Я Миозин (TS), чувствительный к температуре Unc CGC
CB1301 UNC-54 (e1301) Я Миозин (TS), чувствительный к температуре Unc CGC
CB286 UNC-45 (e286) III Unc-45 (ТС), чувствительны к температуре, медленно движущихся UNC, Egl CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (TS), чувствительный к температуре Unc, жесткой паралич CGC
SD551 LET-60 (ga89) IV Рас (TS), чувствительный к температуре Muv, Ste да, Льва, OSM CGC
CX51 дин-1 (ky51) X Динамин (TS), чувствительный к температуре Unc CGC
CW152 газо-1 (fc21) Х Газ-1 (TS), чувствительны к температуре чувствительности EtOH CGC
ZZ26 UNC-63 (x26) Я Рецептора ацетилхолина (TS), чувствительный термометр сопротивления левамизол CGC
стресс журналисты
CL2070 HSP-16.2p :: GFр; РОЛ-6 тепловой стресс; УПО цито CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP тепловой стресс; УПО цито CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; CBR-UNC-119 (+) тепловой стресс; УПО цито CGC
AM446 hsp70p :: GFP; РОЛ-6 тепловой стресс; УПО цито Моримото лаборатория
AM722 hsp70p :: mcherry; мио-2р :: CFP тепловой стресс; УПО цито Моримото лаборатория
AM799 hsp90p :: GFP тепловой стресс; УПО цито Моримото лаборатория
OG497 HSF-1P :: HSF-1 :: GFр; CBR-UNC-119 (+) тепловой стресс; УПО цито CGC
CF1553 дерново-3p :: GFP; РОЛ-6 окислительный стресс CGC
KN259 дерново-3p :: GFP; РОЛ-6 окислительный стресс CGC
CL2166 GST-4p :: GFP :: NLS окислительный стресс CGC
LD1171 GCS-1P :: GFP; РОЛ-6 окислительный стресс CGC
LD1 СКН-1P :: СКН-1 :: GFP; РОЛ-6 окислительный стресс CGC
IG274 НЛП-29P :: GFP осмотический стресс CGC
BC20309 MTL-1P :: GFP металл стресс Бейли лаборатория
BC20342 MTL-2р :: GFP металл улESS Бейли лаборатория
BC20314 ELT-2р :: GFP металл стресс Бейли лаборатория
SJ4005 HSP-4p :: GFP УПО ER CGC
SJ4100 HSP-6P :: GFP УПО Mito CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP УПО Mito CGC

CGC: Caenorhabditis генетический центр; TS = чувствительны к температуре; Ответ = развернутый белок УПО; цито = Цитозольные; Mito = митохондриальную; ER = эндоплазматическая сеть.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Способы, описанные здесь помогают проиллюстрировать распространения и клеточное автономным и не клеточно-автономными токсичность прионов-подобных белков. Недавно мы обнаружили, что цитозольный домена прионов агрегации склонны поглощают в мембраносвязанных везикул в процессе аутофагии связаны между собой. Определенное подмножество этих пузырьков переносит домен прионов внутри и между клетками и тканями 40. Ключ к контролировать их движение в живом том, что белок должен быть помечен MRFP, потому что только MRFP-меченных белков были видны в этих предположительно кислых везикул. Используя тот же подход, мы в настоящее время изучают потенциальную прионов, как поведение некоторых заболеваний, связанных с белками, такими как супероксиддисмутаза 1 (SOD1) (в связи со ALS), альфа-синуклеина (в связи с БП) или TAR ДНК-связывающего белка 43 (TDP-43) (в связи с БАС). Хотя это внутриклеточный транспорт в пузырьках, кажется, используется несколькими другими белками, могут бытьопо лни тельная пути, которые позволяют распространять.

Использование хорошо охарактеризованных складных датчиков мощный инструмент для мониторинга воздействия на клеточном сворачивания белков, среду, в С. Элеганс 63-66. Здесь мы показали, как использовать зависимое от возраста накопления флуоресцентно меченой агрегации, склонные белки экспрессируется под тканеспецифических промоутеров визуально контролировать складной потенциала различных тканей одновременно. Другие возможности для изучения организменном сети proteostasis включают использование эндогенных ц мутантных белков. Эти метастабильные белки будут нормально функционировать при допустимой температуре (15 ° C), но misfold и стать нефункциональные на рестриктивной температуре (25 ° C), показывая свой характерный фенотип мутанта. В присутствии лежа агрегация белков или в процессе старения, то TS мутантного фенотипа не подвергается даже при разрешающих условиях 63-66. Некоторые из этих мутантов ц выражены в оолько подмножество тканей или выставочных тканеспецифических фенотипов, что делает эти особенно полезны для проверки ячейки автономны и не клеточных автономных Протеотоксический эффектов. Например, TS мутант LET-60, член ГТФ-связывающий РАН протоонкогена семьи, Рас (TS), экспрессируется повсеместно, но показывает тканеспецифическая мутант фенотипы 63,66. С помощью этого мутанта тс, эффект polyQ разложения на клеточном proteostasis было показано, что клеточно-автономными 63. Выражение polyQ в генетическом фоне РАН (TS) показал только мутантный фенотип, специфичные для ткани, в которой было выражено белок. Воздействие нескольких мутантных фенотипов будет означать, что белок имеет не-клеточно-автономными Протеотоксический эффекты.

Кроме того, для проверки воздействия на клеточных путей стресс, есть большой выбор в естественных условиях люминесцентных стресс журналистами в C. Элеганс 72. Они, как правило транскрипцииAl журналисты, которые выражают зеленый флуоресцентный белок (GFP) под напряжением, индуцируемого промотора, такие как HSP-16.2p или дерново-3p, которые сообщают о термической или окислительный стресс, соответственно 72. С помощью соответствующих журналистам в сочетании с прионов-подобных белков, можно контролировать возможности индукции реакции на стресс и в других, чем тот, выражающего соответствующую трансген тканей. Одно предостережение, однако, является то, что эти стресс-журналисты часто не достаточно чувствительны, чтобы выявить тонкие положительную регуляцию данного пути (неопубликованные наблюдения).

На нашем стремлении изучить вопрос гены, которые влияют на автономную Токсичность клеток также влияют на белок распространения, мы начали скрининг генов, которые, когда сбили с ног, улучшающих дефекты движения. Использование визуальной оценки плавательных ставок, для чтения, мы были в состоянии удобно анализа ~ 25 пластин в сессии и выполнять два раунда этого протокола в неделю, в результате завершенияот начального экрана в течение 6 недель. Подтверждение хитов, количественным анализом движения червя на твердых плит, в трех экземплярах, используя wrMTrck проводили в дополнительных 3 недель. Одно предостережение, однако, является то, что с помощью ползет в виде пластин вместо купания в жидких средах в качестве чтения отъезда можно лишиться некоторых генов-кандидатов, как плавание и ползания, не являются идентичными движения и может быть под влиянием различных путей 73. Таким образом, если некоторые гены-кандидаты не могут быть подтверждены на твердых пластин, они должны быть повторно проверены в жидких средах, где бассейн может быть определена количественно путем подсчета частоты трешинг течение заданного времени.

Протокол скрининга, описанный здесь использует автоматизированная обработка рабочих станций жидкость, которая значительно уменьшает изменчивость. Недостатком является то, что избыток жидкости для резервуара роботов необходима, что не всегда может быть целесообразным. Эта установка скрининг может быть легко адаптирована для других экранов в C. Элеганс </ EM>, что использование обмолота в качестве экрана-out.This чтения был не предназначены, чтобы непосредственно идентифицировать гены, которые влияют на распространение клеток или не автономную токсичность области прионов, как генома широкие экраны должны быть просты по конструкции, так как должна быть выполнена своевременно. Подвижность дефекты могут возникать не только из мышечной, но и от повреждения нейронов и от ряда других дефектов генов 53. Таким образом, с помощью этого считывания, можно найти не только модификаторы специфического для мышц токсичности. Сейчас мы тестируем гены-кандидаты для их воздействия на домене прионов распространения и не клетка автономной токсичность с использованием методов, описанных выше. Эти эксперименты, в конечном счете определить, есть ли трансцеллюлярного распространения белковых агрегатов непосредственно связана с токсичностью, наблюдаемой в других тканях или если передача от клетки к клетке и не клетка автономной токсичность может быть отсоединен.

Взятые вместе, описанные методы могут быть использованы для изучения потенциального прионов, как поведение белков на клеточном и организменном уровне с использованием C. Элеганс.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics