拡散とプリオン様タンパク質の毒性は後生動物モデル生物を用いて調査

Biology

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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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Abstract

Introduction

アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、および伝染性海綿状脳症(TSE)を含む多くの神経変性疾患は、凝集しやすいタンパク質と会合している、したがって、集合的にタンパク質の誤った折りたたみに起因する疾患(PMDのとして知られている)。それらはヒトおよび動物の両方1に感染することができるという点でのTSEまたはプリオン病は、PMDののユニークなクラスを構成する。分子レベルでは、プリオンは募集および病理学的βシートが豊富なPrP Sc高次構造2,3に単量体のαヘリックスが豊富なホストでエンコードされた細胞のプリオン(PRP C)を変換することによって複製する。自己増殖タンパク質凝集体は、哺乳動物のプリオン4,5との重要な特徴を共有する真菌、で同定されている。さらに、哺乳類プリオンは細胞間の移動が可能であり、ナイーブ細胞6,7-感染する。

のPMD OTHながらERのTSEが感染性はないよりも、彼らは、プリオン病8,9と共通の病原性の原則を共有しています。のPMDのそれぞれにリンクされたタンパク質は、構造または機能に関連していないが、これらは結晶化のようなプロセスを経由してすべてのフォームの凝集体は核と呼ばれるまたは重合を播種。さらに、タンパク質性種子はそれらの可溶性アイソ2,10,11を補充することによって成長する。自己増殖に効率が一緒にそのような分子シャペロンなどの追加の細胞因子と最終的に集計核、播種、断片化および12〜15の拡散率を決定するタンパク質の固有の特性に応じて、 生体内で変化する。したがって、タンパク質凝集を効率的に伝播することができ、これらの要素の間で微妙なバランスが存在しなければならない。唯一のいくつかのアミロイド形成凝集体はプリオンの特性を保有するため、すべてのPMDが感染性ではない理由も説明するかもしれない。プリオンは、「トップパフォーマー 'Oを表しているようだそれらのPMD 8,13を研究するための強力なツールになり自己複製タンパク性凝集体のFA広いスペクトル、。

興味深いことに、疾患関連凝集に関連する毒性は、多くの場合、非細胞自律的な構成要素16,17を持っています。これは、厳密にのみ細胞が遺伝子を示すの特定の表現型を発現することを意味している自律的な効果を、細胞とは対照的に、対応する遺伝子を発現しない隣接細胞に影響を与えることを意味する。これは説得力組織特異的発現によって実証または神経変性疾患18-26の多数のモデルにおけるそれぞれのタンパク質のノックダウンした。様々なメカニズムが減少した栄養供給、ニューロンのシグナル伝達における不均衡、グルタミン酸興奮毒性、および神経炎症16,27,28を含むのPMDで、この非細胞自律的毒性、の基礎として提案されている。また、セル間の疾患関連プリオン凝集体のような動きは、mighTこの側面29,30に貢献する。増加する証拠は、プリオン以外のタンパク質含有物特性は、多くのPMD 30-36で観察病理の広がりを説明し得る、細胞間で伝達することができることを示唆している。しかし、まだ疾患タンパク質の細胞間移行及び隣接セルに対する毒性効果の間に明確な因果関係が存在するか否かを決定されなければならない。したがって、細胞間の伝送と非細胞自律的な毒性の根底にある細胞経路のより良い理解は、新規治療薬の開発のために必要不可欠である。しかし、後生動物において、ミスフォールドタンパク質の細胞から細胞への伝達に影響を広げ、細胞因子プリオン様の多くの側面はよく生物レベルで、特に理解されていない。

線虫(Caenorhabditis elegans)線虫は、電位を提供するいくつかの利点を有する プリオン様spreadiの新しい面を発見後生17 ngの。これは、in vivoで生体内の蛍光タグ化タンパク質の追跡を可能にする、透明である。さらに、病気の影響を受け、多くの細胞および生理学的プロセスは、人間のワームから保存されており、C.されているも遺伝子操作および分子および生化学的解析37-39幅広い種類のに適している。正確には959体細胞はまだ筋肉、神経細胞および腸を含む、いくつかの異なる組織タイプがあり、シンプルなボディプランに大人の雌雄同体を構成している。

C.の新しいプリオンモデルを確立するために、 虫は、我々はワーム4,40には知られている内因性プリオンタンパク質が存在しないので、外因的に、よく特徴付けグルタミン/アスパラギン(Q / N)細胞質の酵母プリオンタンパク質Sup35のリッチプリオンドメインNMを表現することにしました。酵母プリオンはプリオン複製41-44の基本的なメカニズムの解明に貴重だった。さらに、NMはモミです哺乳動物細胞培養45,46におけるプリオンの完全なライフサイクルを再現することが示されている第サイトゾルプリオン様タンパク質。同様に、Cで発現した場合虫は 、Sup35プリオンドメインは、酵母細胞と比較して、後生動物細胞内での増殖のためのさまざまな要件に非常によく採用され、プリオン生物学40の主要な機能を示した。NM凝集は、ミトコンドリアの完全性の破壊との外観を含め、深遠な有毒な表現型と関連していた細胞レベルで、様々なオートファジー関連小胞、ならびに胚および幼虫停止、発達遅延、および生物レベルでのタンパク質の折り畳み環境の広範な乱れ。驚くべきことに、プリオンドメインは、導入遺伝子が発現していないもので、隣接組織に影響を与え、細胞自律的かつ非細胞自律的な毒性を示す。さらに、内および細胞間のプリオンドメインの小胞輸送をリアルタイムに監視される<em>の生体内40で。

ここでは、Cのプリオンのような普及を検査する方法を説明します 。私たちは、タイムラプス蛍光顕微鏡を用いてプリオンドメインを含む小胞の細胞内および細胞間輸送を監視する方法について説明します。私たちは、組織特異的な折り畳み式センサの使用を強調し、普遍的に細胞のフィットネス上の細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を評価するためのストレスレポーターを表現します。最後に、プリオン誘発毒性の新たな変性剤を同定するために最近行われたゲノムワイドRNA干渉(RNAi)は、画面の手順を説明する。組み合わせて、これらの方法は、タンパク質の細胞間移行及びそれらの非細胞自律的な毒性に関与する遺伝的経路を離れていじめるのを助けることができる。

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Protocol

1.モニタリング経細胞は、in vivoタイムラプスイメージングにより、プリオン様タンパク質の広がり

:C.を育てる注意深くエレガンス野生型(WT)(N2)とトランスジェニック系統の標準的な方法に従ってとは、培養温度47を制御する。

  1. C.のトランスジェニック系統を生成しますエレガンス単量体赤色蛍光タンパク質(mRFPと)でタグ付けされたプリオン様タンパク質を発現する。マイクロインジェクション48を使用する方法示し、このビデオを見る。これらの染色体外の行を統合する方法を説明し、さらに詳細及び方法については、49を参照してください。
  2. 卵は、標準的な方法50に従って敷設又は漂白によって同期集団を準備します。
    1. 産卵による同期
      1. 転送10から20妊娠プレート上の大人とそれらの1のために卵を産むましょう - 2時間。プレートから大人を削除し、子孫が希望歳までに成長しましょう​​。
    2. <漂白によるLI>同期
      1. 妊娠大人の非同期の人口を収集し、アルカリ性の次亜塩素酸ナトリウム溶液(250 mMのNaOHおよび1:H 2 O中の市販の漂白剤の4(v / v)で希釈)でそれらを漂白。二回(1分間218×gで)M9バッファ47(21 MMNA 2 HPO 4·7H 2 O、22 mMKH 2 PO 4、86 mMNaCl、1 mMMgSO 4·7H 2 O、1までのdH 2 Oを追加すると、卵を洗うL)。
      2. 彼らは20℃で穏やかに撹拌し、O / NでM9バッファーに孵化することを許可する。ワームの開発が同期集団を残し、食料源の非存在下でL1段階で阻止するであろう。 OP50 E.を播種し、新鮮な線虫の成長メディア(NGM)プレート上になL1を転送大腸菌とは、子孫が希望する47歳まで開発してみましょう。
  3. 50を説明するように顕微鏡スライド上に(H 2 O)2%アガロースパッドを準備します。
    1. 2マイルを準備その全長にわたって配置された表示用テープとcroscopeスライドをスペーサーとして使用する。それらの間の第三の顕微鏡スライドを置きます。
    2. H 2 Oおよびクリーンスライド上にピペット1滴の2%アガロースを溶解する。
    3. 寒天ドロップの上に他の3つのスライドに垂直な第四のスライドを置きます。静かにラベルテープと同じ厚さにパッドを平らにするためにそれを押し下げます。
    4. スペーサを取り外し、静かに離れてスライドを引いて前に1分間、それが乾燥してみましょう。寒天パッドは、それらのいずれかに固執します。
  4. 白金線のピックを使って、パッドと転送〜10匹の動物にピペット〜10μlの麻酔薬(M9バッファーで2 mMのレバミゾール)。カバースリップ(〜22×22 mm)ので覆い、1時間以内に画像を撮影する。
  5. あるいは、より長い期間にわたって動画を取得するか、さらに、動物の任意の動きの可能性を低減するために、麻酔薬およびビーズ固定化51の組み合わせを使用。
    1. 10%のAGAを準備(M9バッファ内の)51を説明し、3μlのナノスフェアサイズ標準溶液へのワーム(ポリスチレンビーズ、100nm)を加えた3μlの麻酔薬(M9バッファーで4 mMのレバミゾール)を追加すると、パッドの増加となりました。カバースリップで優しくカバー。乾燥を避けるために、VALAP(ワセリン、ラノリン、パラフィンワックスの等量混合物)を用いてカバースリップをシールする。
  6. 画像は、共焦点顕微鏡を使用してワームを固定化した。
    注:結果は、EM-CCDカメラとのMetaMorphなどの顕微鏡オートメーションおよび画像解析ソフトウェアを備えたスピニングディスクAF共焦点顕微鏡を用いて得られ、以下の仕様の概要を説明するが、他の同等の共焦点撮像システムも使用することができるされている。
    1. 63Xまたは100X / 1.4NA油浸対物を使用して、顕微鏡スライドホルダーにワームを含む顕微鏡スライドを配置。
    2. ソフトウェアを開きます。 mRFPとイメージング用のレーザパワーとフィルタを調整します。 10%の電力とエミッションフィルタ> 600 nmで561 nmのレーザーを使用してください。
    3. 「保存」タブで選択したり、ファイルを保存するディレクトリのフォルダを作成します。ファイルに名前を割り当てます。
    4. 「ウェーブ長」タブの下で適切な照明を選択して、露出とゲインを調整します。 (ライブ画像を用いて評価)個々のサンプルに応じて、100と300ミリ秒と100と300の間で、カメラのゲインと露出で「YokoQuadレッド」(またはmRFPを撮像のための同等の照明設定)を使用します。
    5. 「微速度撮影」タブで「時間ポイント数」= 301、 "時間" = 5分および「時間/間隔」= 1秒を選択します。
    6. 「AFCのSET ZのHOLD」と「AFCリターンのZ HOLDに」、種類::& "ジャーナル」タブでジャーナルを選択#8220;スペシャル」(2回)、初期点:「スタート時点」と「時点の終わり」。このオートフォーカスオプションは、画像より長期間にわたって同じセクションに重要です。
    7. セットアップが終了したら、Enterキーを押して「取得」。タイムラプスビデオは、独立したTIFFファイルとしてリコールセーフされている。
    8. ImageJの中で与えられた時系列のすべて.TIFFファイルを開きます。 「イメージ」→「スタック」→「スタックへのイメージ」に進みます。必要に応じて、→「ファイル」の下にムービーを書き出すなど、サイズバーを追加、明るさとコントラストを調整→「AVI ...」「名前を付けて保存」(例えば、ビデオ1と2は図1を対応する参照)。

2。細胞自律と非細胞自律を調査するために折りたたみセンサーおよびストレスレポーターを使用すると、タンパク質恒常性と毒性に影響

  1. 折りたたみセンサやストレスreporteを同時発現するトランスジェニック系統を生成しますプリオン様タンパク質と一緒にrを。十字架を確立するか、トランスジェニック系統を生成する方法の方法については、48,49,52を参照してください。 C.のリストについては、表1を参照してください使用することができる。エレガンス株
  2. トランスジェニック動物の同期化された集団を準備し、(セクション1.2)50上記のように希望歳までに成長します。
  3. 実体顕微鏡を用いて、折り畳み式センサやストレスレポーターのそれぞれの表現型を調べる。
    1. 折り畳みセンサーは、同期後に各日の凝集体を保有する動物の数を決定する(例えば、 図2EおよびF参照)。
    2. ストレスレポーターのために、テストレポーターの増加した蛍光のプリオン様タンパク質の共発現の結果(例えば、 図3を参照)場合。

C.におけるプリオン誘導毒性の抑制3.ゲノムワイドスクリーンエレガンス

図4
のRNAiスクリーニングプロトコルの4略図を図。個々のステップの詳細については、プロトコルセクション3を参照してください。

  1. C.の同期虫ワームおよびRNAiライブラリの重複
    1. RNAiスクリーニングのために、AhringerのRNAiライブラリ(またはビダルのRNAiライブラリ)53,54を使用しています。 10%グリセロールを補った100μlのLB-アンプメディアとプレート(LB中の50μg/ mlのアンピシリン)を充填することにより、96ウェルプレートにオリジナルの384ウェルフォーマットからのRNAiライブラリをRearrayと96ピンレプリケーターを使用して接種する。 -80℃で攪拌し、店舗で37℃CO / Nで成長する。
    2. C.を維持 WT及び20℃のNGMプレート上でのトランスジェニック系統をOP50 E.を播種標準的な方法47に従って大腸菌
    3. 漂白によってプリオンドメイントランスジェニックおよびWT(コントロール)線虫を同期する(セクション1.2を参照)。
    4. ワームが漂白されていることを同じ日に、50μg/ mlのアンピシリンを補充したLBメディアを準備。分配するために、自動試薬ディスペンサーを使用する(またはピペット手動で)、96ウェルプレートの各ウェルにLB-アンプ培地65μlの。
    5. -80℃から96ウェルAhringerのRNAiライブラリプレートを取り外し、ペーパータオルで並んで無菌フードにそれらをもたらす。すぐにプレートがまだ凍結されている間、プレートの外側に氷からの汚染を避けるように注意しながら、上下逆さまにプレートを保持することにより、シールテープを取り除く。プレートを再反転し、それらを約30分間解凍しましょう​​。
    6. 1のRNAiライブラリのプレートに1無菌の96ピン·レプリケータを浸し、その後1新鮮なLB-Ampプレートに。各プレートのために新鮮な無菌のレプリケータを使用してください。接着剤箔テープですべてのプレートを密封し、-80℃にライブラリプレートを返す。リプリケータは、漂白剤に浸しすすぐことができ、そして再使用するオートクレーブ処理。
    7. 複製されたのRNAiプレートを37℃、300rpmに設定したインキュベーター中でO / Nを成長させる。 HT115 Eを使用するには大腸菌対照として空のベクター(L4440)を保有する細菌は、培養チューブに分けて、それを成長した後、2枚の96ウェルプレートの四分の一にマルチチャンネルピ ​​ペットとの文化の65μlのピペット。
  2. 細菌のdsRNA生産やワームの追加の誘導
    1. 希釈しイソプロピルβ-D- thiogalactopyranosid(IPTG)のddH 2 Oで5 mMの濃度まで希釈されたIPTG10μlのは、RNAi細菌と対照プレートの各ウェルに(手動またはピペット)分配するマルチチャンネルヘッドを自動化されたワークステーションを使用してください。バックインキュベーターにプレートを再シールして配置します。それらは、37℃で3時間振盪しましょう​​。
    2. 細菌が揺れている間、ワームを準備します。ガラス顕微鏡スライドに - (10μL〜5)少量のサンプルをよくM9 /ワームのサスペンションを混ぜ、ピペット。カウント実体顕微鏡下でのワームの数と、1μl当たりのワームの数を計算する。
    3. 0.20 mg / mlのIPTG、8.0 / mlのコレステロール、50μg/ mlのアンピシリン、9.6 / mlのテトラサイクリン、0.0835 / mlのファンギゾン、および:無菌技術を用いて、以下の最終濃度を補充したM9(M9 +)の溶液を調製する50μLあたり15ワーム。
      1. プリオンドメイントランスジェニックおよびWTワームのための別々の溶液を作る。必要なM9 +ワーム溶液の最終体積は、RNAiコピープレート(下記参照)に加え〜自動化ディスペンサーが使用される場合、リザーバ内に残るデッドボリュームを30mlの数に依存する。
    4. 細菌のdsRNA生産の3時間の誘導後、培養器の外板を取り、動物にストレスを熱を避けるために、RT(〜30分)にそれらを冷ます。
    5. 50μlのM9 +プリオンドメインジェニックワームのRNAiプレートの各ウェルに溶液および空ベクター対照プレートのいずれかを分配する。作る動物は貯水池の底に沈降する傾向があるので、各ステップの前にワームの溶液を混合するようにしてください。
    6. 第二制御板へのWTワームを分注する。通気を可能にするために開封プレートのままにしておきます。一緒に5皿や湿ったペーパータオルとアルミホイルで包む - 蒸発する液体培養を維持するには、4スタック。 4日間、20℃、200rpmでインキュベートする。
  3. 得点
    注:インキュベーターで4日後、ワームは、成人期の二日目にも、画面の準備ができています。動物が邪魔されずにスラッシングを確実にするためにスクリーニングする前に30分間ノン揺れ条件に合わせて調整しましょう​​。
    1. 対照処置プリオンドメイントランスジェニック動物と比較して増加したスラッシングを目視でモニターとコンピュータに接続されたファルコン4M60カメラを用いて、スクリーン。
    2. wrMTrck(次のセクションを参照)を使用して確認するために、予備的ヒットのリストをコンパイルします。

予備の4.確認画面のヒット

  1. 固体プレート上の運動アッセイ
    1. 標準的な方法47に従って、アンピシリン100μg/ ml、12.5 / mlのテトラサイクリンおよび1mM IPTGを補ったNGMでプレートを準備します。可能な場合は、より合理映像取得プロセスを可能にするメディアの同じ高さを、持っているすべてのプレートを確実にするために、板注ぐマシンを使用しています。
    2. 37℃、250 rpmで〜1ミリリットルのLB +アンピシリン50μg/ ml、O / Nで異なるRNAiのクローンを育てる。
    3. 次の日、3時間、1mMのIPTGでdsRNAの発現を誘導する。薄い層に広げ、それぞれのRNAi細菌クローン150μlでプレートをシード。暗闇の中で室温で2日間乾燥細菌をしてみましょう。 RNAiのクローン当たり3プレートを準備します。
    4. 標準的な方法50(セクション1.2を参照)に応じて漂白することによりワームの人口を同期して、M9培地中で卵が孵化O / Nを聞かせて。
    5. ワーム懸濁液のサンプルを取り、NEMの量を決定する実体顕微鏡で1μl当たりatodes。 30のL1ワーム - それは25を含むように続いて、各実験プレートにM9プラスワームの適切な量をピペット。ワームは成人期の2日目に達するまで4日間、20℃で線虫を成長させる。
  2. ImageJのためのwrMTrckのプラグインとのワ​​ームの運動性の定量分析
    注:ビデオは浜松オルカ-R2デジタルカメラC10600-10Bと浜松シンプルPCIイメージングソフトウェアと10倍の倍率で立体顕微鏡を用いて記録した。
    1. カメラとシンプルなPCIイメージングソフトウェアをオンにします。画像形成条件の調整を可能にする「ライブ」をクリックする。
    2. 次のようにビデオ条件を設定します。ゲイン= 0;ハイライトモード=;高速インデックス= 1;ビニング= 2.「自動公開」した後、顕微鏡鏡と明るさとコントラストダイヤルを動かし、照明条件を調整します。
      NOTE:ビデオoverexpことなく、高いコントラストを有する必要がある動物は明るい背景に黒い図形として表示されるように、osed。
    3. 「リアルタイム検索」をクリックし、フォルダとファイル名を選択します。 30秒20ミリ秒と「時の停止」に「フィールド遅延」に設定します。 (ほとんどのワームがどこにあるか)を記録する板の面積を選択するために押して「ライブレビュー "。ステージ上でプレートを3または4回タップして、すぐに「開始」ビューとプレスの分野での地位を確認する。
    4. 映画は記録を終了した後、画像の上で右クリックして、.AVIに.cxd形式からムービーを書き出すために「エクスポートモンタージュシーケンス」を選択します。
  3. 運動性のビデオを分析する
    1. ImageJソフトウェアを開き、「プラグイン」タブに移動し、その後「wrmtrck」と選択して "wrMTrckバッチ」。分析対象のすべてのファイルを含むディレクトリを選択します。
    2. FIGURで詳述するようにwrMTrck_Batchの主入力ウィンドウでは、入力値をロードE 5C。各パラメータの説明は、プラグインに付属の説明書に記載されています。 「OK」をクリックし、運動解析の実行をしてみましょう。
    3. 結果をキュレーションし、検出されたすべてのトラックが実際のCからであることを確認するエレガンスと、アーチファクトを排除する各ムービーの作成​​.txtファイルのそれぞれを開き、データ解析ソフトウェアファイルに情報をコピーする。手動で偽のワームのトラックをチェックし、排除するために作成された「* _labels.zip」ファイルを開き、得られた「* _labels.tif "を実行。

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Representative Results

in vivoでのタイムラプスイメージングによるプリオン様タンパク質の広がり間のモニタリング

トランスジェニックC.プリオンドメインを発現する線虫株、例えば 、細胞から細胞への伝達および非細胞自律的な毒性、プリオン様タンパク質の特定の側面を分析するために特に適している。動物の透明性は、蛍光人生のあらゆる段階での生体内からタンパク質をタグ付けトラッキングが可能。これを利用して、蛍光顕微鏡を用いて細胞や組織を横断プリオン様タンパク質の移動が視覚化される。 63Xまたは100X / 1.4NA油目的は、小胞構造を解決することが必要である。重要なことは、プリオンドメインは、これらのおそらく酸性小胞40内の蛍光表示されたままにするためには、mRFPとでタグ付けする必要があります。多くの場合、タグとして使用されている黄色蛍光タンパク質(YFP)、Iそれは低pH環境40,55で急冷されているため、適切ではないよ。単独のRFPタグが( 図1AおよびB)可溶性のままひずみAM815は、筒状の小胞に蓄積RFPタグ付きR2E2(プリオンドメインNMの非常に発生しやすい凝集と毒性型)を発現する。 インビボでのタイムラプスイメージング使用することにより、これらの管状小胞はセル40( 図1C及びD、ビデオ1及び2)内との間で輸送されることを観察することができた[ビデオの場所リンク 1と2はこちら]。

折り畳み式センサやストレスレポーターを使用すると、タンパク質恒常性と毒性上の細胞自律的かつ非細胞自律的な効果を調査する

プリオンは、シードに関連するタンパク質を渡り、細胞タンパク質の折り畳み環境を破壊することができる。これにより、適切なフォールディング浅草寺の共発現を通して明らかにすることができるRS。折りたたみセンサーが正しくフォールディングする機能的なタンパク質恒常ネットワークに依存して非本質的な準安定タンパク質である。いくつかの例はよく知られているホタルルシフェラーゼおよび温度感受性(ts)変異56-66を保有するタンパク質である。タンパク質恒常性の崩壊は、凝集物の目視検査によって、または許容温度でのそれぞれのts突然変異表現型の露光によって検出され得るレポーターのミスフォールディングを導く。彼らは年齢依存アグリゲーション67〜69を示すのでアグリゲーション(約40残基)の閾値での長さのポリグルタミン(ポリQ)のストレッチもしばしば使用されている。集計の以前の発症が侵害折りたたみ環境を明らかにする。ここでは、C言語で発現された場合に可溶性のままであるプリオン変異体RΔ2-5を採用elegansの体壁筋(BWM)細胞および腸40( 図2A及びC)。 BWM細胞におけるR2E2との同時発現の際に、RΔ2-5REAタンパク質の折り畳み環境上のR2E2の細胞自律的な効果を明らかにしdily集合体( 図2B)、。タンパク質恒常性および組織全体でミスフォールディングの誘導に対する広範な作用は、プリオンドメインの高度に凝集しやすいフォームを発現しない別個の組織折り畳みセンサーの発現によって評価することができる。 RΔ2-5が腸特異的プロモーター(VHA-6P)下で発現したのに対しR2E2は、BWM細胞特異的プロモーター( ミオ-3P)の下で発現させた。腸RΔ2-5の凝集はR2E2非細胞自律的に40( 図2D)でタンパク質のフォールディングに影響を与えることを示している。代わりに、凝集体は唯一の高分解能で検出することができるRΔ2-5を使用する、polyQ44の使用は、腸内で発現(Q44i)は、実体顕微鏡( 図2EおよびF)の下で、低解像度での凝集体の可視化を可能にする。さらに、これは、アニマの定量化を可能に凝集とはls、ならびに凝集体の数の定量化。

プリオンドメインの非細胞自律的な毒性を調べるために、我々は以前に、電子顕微鏡でR2E2を発現しない隣接する組織を検査し、筋肉細胞のプリオンドメインの発現は、隣接する組織におけるミトコンドリアの完全性の非細胞自律的な破壊が生じることを見出し、このような腸40として。増加した活性酸素種(ROS)産生および酸化ストレス、ミトコンドリア機能不全をもたらす。酸化的ストレス応答の誘導を可視化する非侵襲的方法は、酸化ストレス誘導性レポーター70を使用することである。歪みCF1553、酸化ストレス誘導性プロモーター芝-3 70の下の緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現する。 BWM細胞におけるプリオンドメインR2E2を表現する動物に交差した場合、レポーターが大幅に(BWM細胞内だけでなく、数多くの非BWM組織においてアップレギュレートされた表1は、Cのリストを提供虫を同様使用することができます折りたたみセンサやストレスレポーターを発現する株。

C.におけるプリオン誘導毒性の抑制のためのゲノムワイドスクリーンエレガンス

C.において発現プリオンドメインの複雑な毒性表現型虫が原因体外プリオンモデル71 最もにおいて観察された識別可能な毒性の欠如のために特に興味深い。このモデルは、後生動物におけるプリオンに関連した毒性に影響を与えることができる新しい経路を明らかにするかもしれません。これに対処するために、我々は、RNAi枯渇、遺伝子についてスクリーニングし、R2E2トランスジェニック動物の運動性不良を改善するであろう。対照処置WTワームは、正の共同として使用することができますntrol、ほとんどの候補遺伝子が原因変数のRNAi浸透度および導入遺伝子の高い毒性のために、完全な動きの表現型の救済を提供することはありません。動物は、最初の幼虫状態L1から成人期の2日目に、RNAiを用いて4日間処理した。その時までに、未処理R2E2動物のスラッシングは、我々は運動性の改善のためにスクリーニングされているために重要であるWT動物のスラッシング、より大幅に遅くなります。 F1子孫は(〜なL1)に存在することが、P0世代と区別することは容易であるでしょう。唯一P0生成が採点される。この初期画面は、視覚的および非定量的であり、したがって、低い閾値は、プリオンを発現する動物のスラッシングを高めるように見えたすべての細菌のRNAiクローンを定量クロールアッセイで再試験したことを意味し、予備的ヒットを同定するために使用した。 図4概説画面設定の主なステップ。ファルコン4M60カメラの高解像度はquarの視覚的なスクリーニングを可能に画面がより効率的に完了することを許可コンピュータ画面、上の当時のプレートのTER。役立つが、これは必要ではない。ウォームスラッシングの目視検査は、低倍率(10×)での立体鏡を用いて行うことができる。

予備画面ヒットの確認

ハイスループットスクリーニングは、相補的な方法によって精製することができる候補遺伝子の主要なリストを取得するために、ゲノムワイドの効果を分析することが可能なアプローチとして実行される。画面結果の検証は、RNAiごとに1つの実験サンプルで画面を実行することから生じる可能性のある偽陽性を排除することが不可欠です。 R2E2トランスジェニック動物は、一次ヒットのRNAiのクローンで供給され、運動性の定量化可能な読み出しとして、成人期の二日目NGMプレート上での速度を測定し、毒性を減少した。私たちは、私たちの中で開発され、ImageJのためにwrMTrckプラグインを使用正確にC.を識別し、実験室、ビデオでとその動きに追従。 wrMTrckプラグインと自動分析のためのスクリプトは、オープンソースとそれを使用する方法の詳細な手順に沿って、http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.htmlで公開されている。ダウンロードした後、ImageJののPluginsフォルダに全体wrMTrckフォルダをコピーします。このプロトコルは、一度にビデオの多数を分析するために好ましいwrMTrck_Batch方法について説明したが、映画による手動、映画のための指示、分析はまた、プラグインのダウンロードで利用できます。 WrMTrck_Batchは背景差分とバイナリ形式にオリジナルのビデオ( 図5A)に変換し、各ワームは、トラックが割り当てられます。処理されたビデオのそれぞれは、後で手動で誤っとしてワーム例えば、トラック1 図5B)で同定された任意のアーチファクトを除去するために、重ね合わせたこれらのトラックを見ることができる。背景技術を排除する1つの効果的な方法 ( 図5Bに矢印で示す)ifactsを慎重に識別するオブジェクトの最小値と最大サイズ( 図5C)を選択することです。 wrMTrckプラグインの異なる出力から、我々は、このように潜在的な違いを正規化し、各オブジェクトの本体の長さで分割された各トラックの長さによって表される各動物の平均速度を測定する毎秒ボディ長(BLPS)パラメータを使用線虫( 図5D)の大きさ。この方法を使用して、我々はC.を表現R2E2で運動性表現型を増加プリオン誘導毒性(SOPT)の35抑制を特定し少なくとも133パーセントの256%までの線虫 、空のベクターで処理した蠕虫( 図6)と比較。これらのSOPTの遺伝子は、最終的には私たちのハイスループットスクリーニングの取り組みから生じたヒットを確認した表す。

21fig1highres.jpg "/>
プリオンドメイン。図はCでの細胞や組織の間で広がる小胞輸送による 。(A)は(B)。体壁筋におけるRFPを表現する線虫(BWM)細胞(RFPm)の共焦点のzスタック崩壊毒性が高く、凝集しやすいNMバリアント、R2E2を表現する線虫の共焦点のzスタック崩壊、BWM細胞(R2​​E2m)で。矢印は、矢印の集計を示 ​​し、筒状の小胞を示している。RFPm(C)及びR2E2m(D)を発現する動物の(C + D)タイムラプスシリーズ。矢印は、水疱性運動の領域を示している。 RFPmは、主に拡散し、染色を示す。 RFPmがベシクル中に発見された場合でも、これらのほとんど移動する。 R2E2m、細胞内との間で輸送される多数の小胞に局在する。スケールバー:10μmである。添付動画1及び2 [ここビデオ1と2の場所へのリンク]は、図1CおよびDに対応それぞれ。

図2
図2.折りたたみセンサーはタンパク質恒常上のプリオンドメインの広範な影響を明らかにする。 R2E2mの(A + B)共発現はRΔ2-5m凝集を促進します。 (A)RΔ2-5mコントロールと(B)RΔ2-5mBWM細胞でR2E2mと共発現。(C + D)は、筋肉の共焦点画像は、R2E2m腸RΔ2-5i凝集を促進表明した。RΔ2-を発現する対照動物の(C)の共焦点画像腸細胞で5I。(D)腸内のBWM細胞とRΔ2-5iでR2E2mを表現する動物の共焦点画像。スケールバー:10μmの(E + F)R2E2mはQ44iの非細胞自律的な凝集を誘導(E)Q44iとQ44iの代表的な蛍光画像、R2E2m動物4日間同期化されたのL1 LARを転送した後。。新鮮なOP50シードNGMプレートにVAE。 BWM細胞におけるR2E2の発現は、腸内でQ44i凝集の以前の発症につながる。(%で)凝集による動物の(F)の定量示した日に同期の後。エラーバーは、この図は、40から変更されているSDを表す。

図3
図3. SOD-3P :: GFP転写ストレス記者がプリオンドメインは酸化ストレスの細胞自律的かつ非細胞自律的な誘導を引き起こすことを明らかにしている。成人の2日目R2E2m動物(B)(C)、(A + B) 芝-3pの代表的な蛍光画像(同じ露光時間を使用して):: GFPは、対照動物(A)及び芝-3pとを発現:: GFP。 BWM細胞におけるR2E2の発現は、BWM細胞におけるレポーターばかりの誘導につながるだけでなく、腸(II)、神経索での(I)、(III)、咽頭、頭ニューロン(IV)。

図5
ImageJのためwrMTrckプラグとワームの動きを図5の分析。(A)一度に複数の動物を監視するために、適切な倍率(〜10倍)を用いて生成された入力動画の例(B)「* _labels.tif」ファイルwrMTrck_Batchの出力であり、分析結果の手動キュレーションを可能にする。矢印が正しくにより最小値と最大サイズのパラメータの適切な選択に分析から除外した。wrMTrck_Batchの(C)入力ウィンドウを、このプロトコルのために使用されるパラメータを示すオブジェクトを示します。これらのパラメータは、個々の顕微鏡や映画の設定に応じて調整する必要がある。movemeから(D)の出力結果BLPSカラムを有する(B)の分析は、黄色で強調表示NT。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図1
プリオン誘導毒性(SOPT)のサージサプレッサであるRNAiのクローンで処理図6. R2E2ワームは、改善された運動性を示している。運動は相対BLPSとして表示され、陰性対照(空ベクター)と比較した場合。 HTPのスクリーニングで同定されたすべての統計的に有意(スチューデントt検定)のRNAiクローンも示されている。 ブラックスター 図5に例示したヒットを表します。結果は、条件ごとに17 <N <53トラックと、3本からのものである。エラーバーはSEMを表す。</ pの>

表1. C. elegansの折り畳みセンサーやストレスレポーターを発現する株。

系統名 遺伝子型 注釈 ひずみソース
折りたたみセンサー
導入遺伝子
AM140 UNC-54P :: polyQ35 :: YFP polyQ35の筋肉特異的な発現、年齢依存集約 CGCまたは森本ラボ
AM141 UNC-54P :: polyQ40 :: YFP polyQ40、AGの筋肉特異的な発現電子依存集約 CGCまたは森本ラボ
AM801 UNC-54P ::RΔ2-5:: YFP 核無能なプリオンドメインの筋肉特異的な発現森本ラボ
OG412 VHA-6P :: polyQ44 :: YFP polyQ44の腸特異的な発現、年齢依存集約 CGC
AM809 VHA-6P ::RΔ2-5:: GFP。ミオ2P :: mCherryを 核無能なプリオンドメインの腸特異的発現森本ラボ
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP polyQ40のニューロン特異的発現は、細胞型特異的凝集森本ラボ
AM982 unc54p ::ルシフェラーゼ:: YFP WTホタルルシフェラーゼの筋肉特異的な発現森本ラボ ミオ3P ::ルシフェラーゼ:: GFP。 ROL-6 WTホタルルシフェラーゼの筋肉特異的な発現 Behlラボ
SNG-1P ::ルシフェラーゼ:: GFP。 ROL-6 WTホタルルシフェラーゼの筋肉特異的な発現 Behlラボ
FUH55 unc54p :: Flucを:: EGFP。 ROL-6 WTホタルルシフェラーゼの筋肉特異的な発現ハートルラボ
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP。 ROL-6 R188Q変異型ホタルルシフェラーゼの筋肉特異的な発現ハートルラボ
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP。 ROL-6 R188Q + R261Qの筋肉特異的な発現二重変異型ホタルルシフェラーゼハートルラボ
FUH48 F25B3.3p :: Flucを:: EGFP。 ROL-6 WTホタルルシフェラのニューロン特異的発現SE ハートルラボ
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP。 ROL-6 R188Q変異型ホタルルシフェラーゼのニューロン特異的発現ハートルラボ
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP。 ROL-6 R188Q + R261Qのニューロン特異的発現二重変異型ホタルルシフェラーゼハートルラボ
TS突然変異体
CB1402 UNC-15(e1402)I パラミオシン(TS)、温度感受性UNC-麻痺、しましょう CGC
CB1157 UNC-54(e1157)I ミオシン(tsで)、温度感受性UNC CGC
CB1301 UNC-54(e1301)I ミオシン(tsで)、温度感受性UNC CGC
CB286 UNC-45(e286)III UNC-45(TS)、温度感受性、ゆっくり移動するUNC、EGL CGC
HE250 UNC-52(e669su250)II パールカン(TS)、温度感受性UNC、硬い麻痺 CGC
SD551 -60を聞かせて(ga89)IV RAS(TS)、温度感受性マブラヴ、サント、ましょう、LVA、OSM CGC
CX51 ダイン-1(ky51)X ダイナミン(tsで)、温度感受性UNC CGC
CW152 ガス-1(FC21)X ガス-1(tsが)、温度感受性のEtOH感受性 CGC
ZZ26 UNC-63(X26)I アセチルコリン受容体(tsで)、温度感受性レバミゾール抵抗 CGC
ストレス記者
CL2070 HSP-16.2p :: GFP; ROL-6 熱応力。 UPR CYTO CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP 熱応力。 UPR CYTO CGC
TJ3000、TJ3001 HSP-16.2p :: GFP。 CBR-UNC-119(+) 熱応力。 UPR CYTO CGC
AM446 hsp70p :: GFP、ROL-6 熱応力。 UPR CYTO 森本ラボ
AM722 hsp70p :: mCherryを。ミオ2P :: CFP 熱応力。 UPR CYTO 森本ラボ
AM799 hsp90p :: GFP 熱応力。 UPR CYTO 森本ラボ
OG497 HSF-1P :: HSF-1 :: GFP; CBR-UNC-119(+) 熱応力。 UPR CYTO CGC
CF1553 SOD-3P :: GFP、ROL-6 酸化的ストレス CGC
KN259 SOD-3P :: GFP、ROL-6 酸化的ストレス CGC
CL2166 GST-4P :: GFP :: NLS 酸化的ストレス CGC
LD1171 GCS-1P :: GFP、ROL-6 酸化的ストレス CGC
LD1 SKN-1P :: SKN-1 :: GFP、ROL-6 酸化的ストレス CGC
IG274 NLP-29P :: GFP 浸透圧ストレス CGC
BC20309 MTL-1P :: GFP 金属ストレスベイリーラボ
BC20342 MTL-2P :: GFP 金属STRS字形ベイリーラボ
BC20314 ELT-2P :: GFP 金属ストレスベイリーラボ
SJ4005 HSP-4P :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 HSP-6P :: GFP UPR 水戸 CGC
SJ4058 HSP-60P :: GFP UPR 水戸 CGC

CGC:線虫遺伝学センター。温度感受性TS =; UPR =小胞体ストレス応答。 CYTO =細胞質ゾル。水戸=ミトコンドリア。 ER =小胞体。

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Discussion

ここに記載されている方法は、拡散とプリオン様タンパク質の複雑な細胞自律的かつ非細胞自律的毒性を説明するのに役立つ。我々は最近、凝集しやすいサイトゾルプリオンドメインはオートファジー関連プロセスでの膜結合小胞に取り込まれることを発見した。これらの小胞の特定のサブセット内および細胞及び組織40との間のプリオンドメインを輸送する。生きている動物に彼らの動きを監視するための鍵は、タンパク質のみmRFPと標識タンパク質がこれらおそらく酸性小胞で見ることができたので、mRFPとでタグ付けなければならないことである。同じアプローチを使用して、我々は現在、そのような(ALSにリンク)スーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)、(PDにリンク)、α-シヌクレインまたはTAR DNA結合タンパク質として、特定の疾患関連タンパク質の可能性プリオンのような挙動を調査している(ALSにリンク)43(TDP-43)。ベシクル内でこの間輸送は、いくつかの他のタンパク質で使用されると思われるが、あるかもしれません拡散できるようdditional経路。

よく特徴付け折り畳みセンサを使用するC.における細胞タンパク質の折り畳み環境への影響を監視するための強力なツールであるelegansの 63〜66。ここでは、視覚的に同時に異なる組織の折り畳み能力をモニターするために組織特異的プロモーター下で発現蛍光の年齢依存性の蓄積を使用する方法を凝集しやすいタンパク質タグ付きを示している。生物タンパク質恒常ネットワークを研究する他の可能性は、内因性のts変異タンパク質の使用を含む。これらの準安定なタンパク質は、許容温度(15℃)で正常に機能するが、ミスフォールドおよびそれらの特徴的な変異体の表現型を示す、制限温度(25℃)で機能しなくなるであろう。凝集しやすいタンパク質の存在下で、または加齢の間に、TS突然変異体の表現型であっても許容条件下63〜66で露出されます。これらのts突然変異体のいくつかは、Oで表現される細胞自律的かつ非細胞自律的なタンパク質毒性(proteotoxic)の影響をテストするために、これらは特に有用なものと、組織または展示組織特異的な表現型のサブセットをNLY。例えば、LET-60のts変異体、GTP結合のRASオンコジーンファミリーのメンバー、RAS(TS)は、普遍的に発現するが、組織特異的な変異体は63,66の表現型を示している。この変異tsは使用することによって、細胞のタンパク質恒常性におけるポリQ拡張の効果は、自律セル63であることが示された。 ラス(tsが)の遺伝的背景におけるポリQの発現は、タンパク質が発現している組織に特異的な唯一の変異体表現型を明らかにした。複数の変異体の表現型の露光は、タンパク質が非細胞自律的タンパク質毒性(proteotoxic)効果を有することを示すであろう。

さらに、細胞ストレス経路への影響をテストするために、C.におけるin vivo蛍光ストレスレポーターの大規模な選択があります 72。これらは通常、転写されそれぞれ熱や酸化ストレス、72の報告などHSP-16.2pまたはSOD-3Pなどのストレス誘導性プロモーター下で緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現らの記者、、。プリオン様タンパク質と組み合わせて適切なレポーターを使用することにより、それぞれの導入遺伝子を発現する1つ以外の組織におけるストレス応答の潜在的誘導を監視することができる。一つ注意すべき点は、しかし、これらのストレス記者は、多くの場合、特定の経路(未発表の観察)の微妙なアップレギュレーションを明らかにするのに十分な感度ではないということである。

非細胞自律的な毒性に影響を与える遺伝子も拡散タンパク質に影響を与えるかどうかを調べるために私たちの探求に、私たちは運動欠陥を改善するだろう、ノックダウンされ、遺伝子をスクリーニングすることにより開始した。読み出しとして水泳率の目視評価を使用して、我々は完了で、その結果、快適にセッションごと〜25プレートをアッセイし、週にこのプロトコルの2ラウンドを行うことができました6週間以内の初期画面の。固体プレート上でワームの動きの定量分析によるヒットの確認は、トリプリケートで、使用wrMTrckさらに3週間後に行った。一つ注意すべき点は、しかし、水泳、クロールが同一の動きではなく、異なる経路73によって影響を受けることができるようにプレートでクロールを使用する代わりに、読み出しなどの液体培地で泳いによって一つは、特定の候補遺伝子を失う可能性があることです。いくつかの候補遺伝子が、固体プレート上で確認できない場合にはこのように、それらは水泳が所定の時間内にスラッシング周波数をカウントすることによって定量することができる液体培地中に再試験されるべきである。

ここで説明するスクリーニングプロトコルが大幅に変動を軽減自動液体処理ワークステーションを使用しています。欠点は、必ずしも実現可能ではないかもしれない、ロボットの貯水池のための流体の過剰が必要であることである。このスクリーニングのセットアップが容易にC.で他のスクリーンに適合させることができる虫</ em>の実行されるようにゲノムワイドスクリーンは、設計が単純であるべきな読み取りout.This画面は、直接プリオンドメインの拡散または非細胞自律的な毒性に影響を与える遺伝子を同定するために設計されていなかったとしてスラッシングを使用することタイムリーに。運動欠陥が筋肉から、だけでなく、神経損傷からと他の遺伝子の欠陥53の数からだけでなく、発信することができます。したがって、この読み出しを用いて、我々は、筋特異的な毒性のないだけの修飾子を見つけるかもしれない。現在、上記の方法を用いて、細胞自律的毒性を拡散し、非プリオンドメインに対する効果のための候補遺伝子をテストしている。これらの実験は、最終的には、タンパク質凝集体の拡散経細胞を直接他の組織または細胞から細胞への透過及び非細胞自律的な毒性は切り離すことができる場合に観察された毒性にリンクされているかどうかを明らかにする。

まとめると、記載された方法は、潜在的な広報を調べるために使用できるC.を使用して、細胞および生物レベルでのタンパク質のイオンのような振る舞い

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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References

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