La investigación de las proteínas priónicas, como la extensión y la toxicidad de Uso del Metazoan Organismo modelo

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Muchas de las enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), y las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), se asocian con proteínas de agregación propensos y están, por tanto, colectivamente conocidos como proteínas misfolding trastornos (PMD ). EET o enfermedades priónicas constituyen una clase única de PMD en que pueden ser infecciosas en seres humanos y animales 1. A nivel molecular, los priones se replican mediante el reclutamiento y la conversión-rica α-hélice PrP celular codificada por el hospedador monomérico (PrP C) en el rico en β-hoja de PrP Sc conformación patológica 2,3. Agregados de proteínas autopropagante también se han identificado en los hongos, que comparten características importantes con priones mamíferos 4,5. Además, priones mamíferos son capaces de pasar de célula a célula e infectan células de los animales 6,7.

Mientras PMD other de EET no son infecciosas, comparten un principio patógena común con las enfermedades priónicas 8,9. Aunque las proteínas vinculadas a cada uno de los PMD no están relacionadas en estructura o función, que todos los agregados formulario a través de un proceso de cristalización como llaman nucleado o polimerización sembraron; Además semillas proteicas crecen mediante la contratación de sus isoformas solubles 2,10,11. La eficiencia a la auto-propagan in vivo varía, dependiendo de las propiedades intrínsecas de la proteína, que junto con factores celulares adicionales, tales como chaperones moleculares en última instancia determinan las tasas de nucleación agregada, la siembra, la fragmentación y la difusión de 12-15. Por lo tanto, debe existir un equilibrio entre estos factores que permiten la propagación eficiente de la agregación de proteínas. Esto también podría explicar por qué sólo algunos agregados amiloidogénicos albergan las características de un prión, y por lo tanto no todos los PMD son infecciosos. Los priones parecen representar o 'top artistas intérpretes o ejecutantesfa amplio espectro de agregados proteicos auto-replicantes, que los convierte en una poderosa herramienta para estudiar PMD 8,13.

Curiosamente, la toxicidad asociada con los agregados relacionados con la enfermedad tiene a menudo un componente autónomo no celular 16,17. Esto significa que afectan a las células vecinas que no expresan el gen correspondiente, en contraste con un efecto de célula autónoma estrictamente, lo que implica que sólo las células que expresan el gen de la exposición fenotipo específico. Esto fue convincentemente demostrado por la expresión específica de tejido o derribar las respectivas proteínas en numerosos modelos de enfermedades neurodegenerativas 18-26. Diversos mecanismos se han sugerido como una base para esta toxicidad autónoma no celular en PMD, incluyendo el suministro de nutrientes disminuido, el desequilibrio en la señalización neuronal, excitotoxicidad del glutamato, y la neuroinflamación 16,27,28. Además, un movimiento de priones como de agregados de enfermedades vinculadas entre las células Might contribuyen a este aspecto 29,30. La evidencia creciente sugiere que las inclusiones proteína distinta de priones pueden transmitir de célula a célula, lo que puede explicar la característica de propagación de la patología observado en muchos PMD 30-36. Sin embargo, aún no se ha determinado si existe una clara relación causal entre el movimiento intercelular de proteínas de la enfermedad y el efecto tóxico sobre las células vecinas. Por lo tanto, una mejor comprensión de las vías celulares que subyacen a la transmisión de célula a célula y la toxicidad celular autónomo no es necesario y esencial para el desarrollo de nuevas terapias. Sin embargo, muchos aspectos de priones como la difusión y celulares factores que influyen en la transmisión de célula a célula de proteínas mal plegadas en metazoos no se conocen bien, en particular a nivel del organismo.

El nematodo Caenorhabditis elegans tiene varias ventajas que ofrecen el potencial de descubrir nuevas facetas de priones como spreading en metazoos 17. Es transparente, lo que permite el seguimiento in vivo de las proteínas fluorescentemente marcadas en el organismo vivo. Además, muchos procesos celulares y fisiológicas afectadas por la enfermedad se conservan de gusanos para la salud humana, y C. elegans también es susceptible a una amplia variedad de manipulaciones genéticas y análisis moleculares y bioquímicos 37-39. Exactamente 959 células somáticas conforman el adulto hermafrodita con un plan de cuerpo simple que todavía tiene varios tipos de tejidos distintos, incluyendo los músculos, neuronas y delgado.

Para establecer un nuevo modelo de prión en C. elegans, se optó por expresar de forma exógena la glutamina / asparagina bien caracterizado (Q / N) ricos en priones dominio NM de la proteína priónica de levadura citosólica Sup35, ya que no hay proteínas priónicas endógenos conocidos gusanos 4,40. Los priones de levadura han sido invaluables en la aclaración de los mecanismos básicos de la replicación de priones 41-44. Además, Nuevo México es el abetocitosólica proteína prión como st que se ha demostrado para recapitular el ciclo de vida completo de un prión en cultivos celulares de mamíferos 45,46. Del mismo modo, cuando se expresa en C. elegans, el dominio prión Sup35 adoptado notablemente bien a los diferentes requisitos para la propagación en células de metazoos en comparación con células de levadura y de las características clave de la biología expuestas prión agregación 40. NM se asoció con una profunda fenotipo tóxicos, incluyendo la interrupción de la integridad mitocondrial y la apariencia de diversas vesículas autofagia relacionados en el nivel celular, así como la detención embrionario y larval, retraso del desarrollo, y una alteración generalizada del medio ambiente plegamiento de la proteína en el nivel del organismo. Sorprendentemente, el dominio prion celular exhibe toxicidad celular autónoma y no autónoma, que afecta a los tejidos vecinos en la que no se expresó el transgén. Además, el transporte vesicular del dominio prión dentro de y entre las células se monitoriza en tiempo real <em> in vivo 40.

Aquí se describe cómo examinar difusión-prión como en C. elegans. Vamos a explicar cómo supervisar el transporte intra e intercelular de vesículas que contienen el dominio de priones usando microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo. Haremos hincapié en el uso de sensores de plegado específicos de tejido y de expresión ubicua reporteros de estrés para evaluar los teléfonos celulares efectos autónomas autónomas y no sobre la aptitud celular. Por último, vamos a describir el procedimiento de una pantalla recientemente realizado genoma amplia ARN de interferencia (RNAi) para identificar nuevos modificadores de la toxicidad inducida por priones. En combinación, estos métodos pueden ayudar a desmenuzar las vías genéticas implicadas en el movimiento intercelular de proteínas y su toxicidad autónoma no celular.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Seguimiento transcelular Difusión de proteínas priónicas-como por En Vivo Time-lapse de imágenes

NOTA: Crecer C. elegans de tipo salvaje (WT) (N2) y las líneas transgénicas de acuerdo con métodos estándar y controlar cuidadosamente la temperatura de cultivo 47.

  1. Generar líneas transgénicas de C. elegans expresar la proteína prión como, etiquetados con la proteína fluorescente de color rojo monomérica (mRFP). Mira este video que muestra cómo utilizar la microinyección 48. Para más información y métodos que describen cómo integrar estas líneas extracromosómicos, ver 49.
  2. Preparar poblaciones sincronizadas por la puesta de huevos o de blanqueo de acuerdo con métodos estándar 50.
    1. Sincronización de la puesta de huevos
      1. Transferencia 10-20 adultos grávidas en un plato y dejar que ellos ponen huevos por 1 - 2 horas. Retire los adultos de la placa y dejar que la progenie crecer hasta la edad deseada.
    2. <li> Sincronización por blanqueo
      1. Recoger una población no sincronizada de los adultos grávidas y blanquear con solución de hipoclorito alcalino (NaOH 250 mM y 1: 4 (v / v) dilución de lejía comercial en H 2 O). Lavar los huevos dos veces (218 g durante 1 min) con tampón M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, agregue dH2O hasta 1 L).
      2. Deje que se traman en tampón M9 con suave agitación O / N a 20 ° C. Desarrollo gusano arresto en la fase L1 en ausencia de una fuente de alimento, dejando una población sincronizada. Traslado L1s en crecimiento de Medios (NGM) placas fresco nematodos sembradas con OP50 E. bacterias coli y permiten la progenie se desarrolla hasta la edad de 47 años que desee.
  3. Prepare 2% agarosa almohadillas (en H 2 O) en un portaobjetos de microscopio como se describe 50.
    1. Prepare dos millasdiapositivas croscope con la cinta de etiquetado se coloca sobre toda su longitud para ser utilizados como espaciadores. Coloque una tercera portaobjetos de microscopio entre ellos.
    2. Disolver 2% de agarosa en H 2 O y una pipeta una gota sobre el portaobjetos limpio.
    3. Coloque cuarto de diapositivas perpendicular a los otros tres se desliza sobre la parte superior de la caída de agar. Presione suavemente hacia abajo para aplanar la almohadilla en el mismo grosor que la cinta de etiquetar.
    4. Deje que se seque durante 1 minuto antes de retirar los espaciadores y tirando suavemente de las diapositivas aparte. La almohadilla de agar se apegará a uno de ellos.
  4. Pipeta ~ 10 l anestésico (levamisol 2 mM en tampón M9) en la superficie y la transferencia de ~ 10 animales utilizando un pico alambre de platino. Cubra con una hoja de cubierta (~ 22 x 22 mm) y tomar imágenes dentro de 1 hora.
  5. Alternativamente, para adquirir películas durante un período de tiempo más largo o para reducir aún más la posibilidad de cualquier movimiento de los animales, utilizar una combinación de anestésico y el talón de inmovilización 51.
    1. Preparar 10% agaalmohadillas rosas (en tampón M9) como se describe 51 y agregar gusanos a solución normas de tamaño nanoesfera 3 l (perlas de poliestireno, 100 nm), además de 3 l anestésicos (levamisol 4 mM en tampón M9). Cubra ligeramente con un cubreobjetos. Para evitar la desecación, sellar la hoja de la cubierta con valap (mezcla de cantidades iguales de vaselina, lanolina y cera de parafina).
  6. Image inmovilizado gusanos usando un microscopio confocal.
    Nota: Los resultados se obtienen utilizando un Spinning Disc AF Microscopio Confocal equipado con una cámara EM-CCD y un software de Microscopía Automatización y Análisis de imagen tales como MetaMorph y describen los detalles a continuación, pero otros sistemas de formación de imágenes confocal comparable también se pueden utilizar.
    1. Utilice el objetivo aceite 63X o 100X / 1.4NA y colocar el portaobjetos de microscopio que contiene gusanos en el soporte de portaobjetos de microscopio.
    2. Abrir el software. Ajustar la potencia del láser y filtros para imágenes mRFP. Utilice el láser de 561 nm en el 10% de energía y la emisión de filtro> 600 nm.
    3. Bajo la pestaña "Saving" seleccionar o crear la carpeta del directorio donde los archivos deben ser guardados. Asigne un nombre al archivo.
    4. Bajo la pestaña "Longitud de onda", seleccione la iluminación adecuada y ajustar la exposición y ganancia. Use "YokoQuad Red" (o una configuración de iluminación equivalente para formación de imágenes mRFP) con una exposición de entre 100 y 300 mseg y una ganancia de la cámara entre 100 y 300, dependiendo de la muestra individual (evaluado mediante el uso de la imagen en vivo).
    5. Bajo la pestaña "Timelapse" seleccione "Número de puntos de tiempo" = 301 "Duración" = 5 min y "Tiempo / Intervalo" = 1 seg.
    6. En el marco del "Revistas" pestaña seleccione Diario: "AFC SET Z HOLD" y "AFC Volver a Z HOLD", Tipo: &# 8220; Especial "(dos veces), Punto inicial:" Inicio de la hora punta "y" Fin de punto en el tiempo ". Esta opción de enfoque automático es importante para la imagen de la misma sección durante un período de tiempo más largo.
    7. Una vez finalizada la configuración, pulse "Adquirir". El vídeo timelapse se safed como archivos TIFF independientes.
    8. Abre todos los archivos .tiff de una serie de tiempo dada en ImageJ. Diríjase a "Imagen" → "Stacks" → "Imágenes Stacks". Opcionalmente, ajustar el brillo y el contraste, añadir la barra de tamaño, etc. Exportar la película en "Archivo" → "Guardar como" → "AVI ..." (por ejemplo, ver video 1 y 2 correspondientes a la Figura 1).

2. Usando sensores plegables y Reporteros Estrés encargado de investigar la célula autónoma y no de células Autónoma Afecto sobre Proteostasis y Toxicidad

  1. Generar líneas transgénicas que coexpresan un sensor de plegado o Reporte estrésr junto con la proteína prión-similares. Para los métodos sobre cómo establecer cruces o generar líneas transgénicas, consulte 48,49,52. Ver Tabla 1 para una lista de C. elegans cepas que se pueden utilizar.
  2. Preparar poblaciones sincronizados de animales transgénicos y crecer hasta la edad deseada como se describió anteriormente (sección 1.2) 50.
  3. El uso de un microscopio estereoscópico, examine el respectivo fenotipo del sensor de plegado o reportero estrés.
    1. Para el sensor de plegado, determinar el número de animales que albergan agregados de cada día después de la sincronización (por ejemplo, véase la Figura 2E y F).
    2. Para el reportero estrés, prueba si la coexpresión de las proteínas priónicas resultados similares en un aumento de fluorescencia del informador (por ejemplo, véase la Figura 3).

3. Pantalla de todo el genoma para la supresión de la toxicidad inducida por priones en C. elegans

Figura 4
Figura 4. Representación esquemática del protocolo de cribado RNAi. Vea la sección protocolo 3 para una descripción detallada de los pasos individuales.

  1. Sincronización de C. gusanos elegans y la duplicación de RNAi biblioteca
    1. Para la pantalla de RNAi, utilizar la biblioteca Ahringer RNAi (o la biblioteca Vidal RNAi) 53,54. Rearray la biblioteca RNAi desde el formato de pozo original 384 en placas de 96 pocillos llenando las placas con 100 l de medios LB-Amp (50 mg / ml de ampicilina en LB) suplementado con 10% de glicerol y inocular utilizando un replicador de 96 pines. Crece a 37 ° CO / N con agitación y se almacena a -80 ° C.
    2. Mantener C. elegans WT y líneas transgénicas a 20 ° C en NGM placas sembradas con OP50 E. bacterias coli de acuerdo con métodos estándar 47.
    3. Sincronizar transgénico dominio prión y WT (control) nematodos por el blanqueamiento (ver sección 1.2).
    4. El mismo día que los gusanos se blanquean, preparar medio LB suplementado con 50 mg / ml de ampicilina. Utilice un dispensador de reactivos automatizado para dispensar (o una pipeta manual) 65 l de los medios de comunicación LB-amp en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
    5. Retire 96 y placas de biblioteca Ahringer RNAi de -80 ° C y llevarlos a una campana estéril forrada con papel de cocina. Retire inmediatamente la junta cinta manteniendo la placa boca abajo mientras que las placas todavía están congelados, teniendo cuidado de evitar la contaminación de hielo en el exterior de las placas. Reinvertir las placas y dejar que se descongelen durante aproximadamente 30 minutos.
    6. Sumerja una estéril replicador de 96 pines en una placa RNAi biblioteca, y luego en una placa LB-amp fresco. Use un replicador estéril nueva para cada plato. Selle todas las placas con cinta de papel adhesivo y devolver las placas de biblioteca a -80 ° C. Los replicadores pueden ser remojados en lejía, enjuagarse,y en autoclave para ser utilizado de nuevo.
    7. Permitir a las placas de RNAi duplicados para crecer O / N en una incubadora a 37 ° C y 300 rpm. Para utilizar HT115 E. coli bacterias que albergan el vector vacío (L4440) como un control, que crecen por separado en un tubo de cultivo y después de pipetear 65 l de cultivo con una pipeta multicanal en un cuarto de dos placas de 96 pocillos.
  2. La inducción de la producción bacteriana dsRNA y la adición de gusanos
    1. Diluir isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) a una concentración 5 mM en ddH 2 O. Utilice una estación de trabajo automatizado con una cabeza multicanal para dispensar (o pipeta manualmente) 10 l de IPTG diluido en cada pocillo de las bacterias RNAi y las placas de control. Volver a sellar y colocar las placas de nuevo en la incubadora. Deja que sacuden durante 3 horas a 37 ° C.
    2. Mientras que las bacterias están temblando, preparar los gusanos. Mezclar el / suspensión gusano M9 bien, y la pipeta una muestra pequeña (~ 5-10 l) a un portaobjetos de vidrio. Contarel número de gusanos bajo un microscopio estereoscópico y calcular el número de gusanos por l.
    3. Utilizando una técnica estéril, preparar una solución de M9 suplementado (M9 +) con las siguientes concentraciones finales: 0,20 mg / ml de IPTG, 8,0 g / ml de colesterol, 50 mg / ml de ampicilina, 9,6 g / ml de tetraciclina, 0.0835 g / ml de Fungizone, y 15 gusanos por 50 l.
      1. Haga soluciones separadas para transgénico dominio prión y gusanos WT. El volumen final de la solución gusano M9 + necesaria dependerá del número de placas de RNAi copiados (ver más abajo), además de ~ 30 ml de volumen muerto que permanecerá en el depósito, si se utiliza un dispensador automatizado.
    4. Después de la inducción 3 h de producción bacteriana dsRNA, tome las placas de la incubadora y dejar que se enfríe a temperatura ambiente (~ 30 min) para evitar el calor perturbe a los animales.
    5. Dispensar 50 l M9 + dominio prión solución gusano transgénico a cada pocillo de las placas de RNAi y una de las placas de control de vector vacío. HacerAsegúrese de mezclar la solución gusano antes de cada paso como los animales tienden a sedimentar al fondo del depósito.
    6. Prescindir gusanos WT en la segunda placa de control. Deje las placas sin sellar para permitir la aireación. Para mantener el cultivo líquido se evapore, apilar 4-5 platos juntos y envolver con una toalla de papel húmeda y papel de aluminio. Incubar a 200 rpm a 20 ° C durante 4 días.
  3. Tanteo
    NOTA: Después de 4 días en la incubadora, los gusanos estarán en el segundo día de la edad adulta y están listos para defender. Deje que los animales se adaptan a condiciones no sacuden durante 30 minutos antes de cribado para asegurar golear sin ser molestados.
    1. Utilizando una cámara Falcon 4M60 conectado a un ordenador con una pantalla del monitor visual para aumentar la thrashing en comparación con tratados con el control de dominio prión animales transgénicos.
    2. Compilar una lista de éxitos preliminares confirmar utilizando wrMTrck (véase la sección siguiente).

4. Confirmación de preliminarPantalla Golpea

  1. Ensayo de la motilidad en placas sólidas
    1. Preparar placas con NGM suplementadas con 100 g / ml de ampicilina, 12,5 mg / ml de tetraciclina y 1 mM IPTG, de acuerdo con métodos estándar 47. Si es posible, utilice una máquina de placa de vertido para asegurar todas las placas tienen la misma altura de los medios de comunicación, lo que permitirá un proceso de adquisición de vídeo más ágil.
    2. Cultivar las diferentes clones RNAi en ~ 1 ml de LB + 50 mg / ml de ampicilina, O / N a 37 ° C y 250 rpm.
    3. El día siguiente, inducir la expresión de la dsRNA con 1 mM IPTG durante 3 horas. Sembrar las placas con 150 l de cada clon bacteriano RNAi, que se distribuyen en una capa delgada. Deje que las bacterias secas durante 2 días a temperatura ambiente en la oscuridad. Preparar 3 planchas por RNAi clon.
    4. Sincronizar la población de gusanos por blanqueo de acuerdo con los métodos estándar 50 (ver sección 1.2), y dejar que los huevos eclosionan O / N en M9 medios.
    5. Tomar una muestra de la suspensión de gusano y determinar la cantidad de nematodes por l en el microscopio estereoscópico. Entonces, pipetear el volumen adecuado de M9 más gusanos en cada placa experimental para que contenga de 25 - 30 gusanos L1. Crecer los nematodos a 20 ° C durante 4 días hasta que los gusanos alcanzan día 2 de la edad adulta.
  2. El análisis cuantitativo de la motilidad gusano con el plugin wrMTrck para ImageJ
    NOTA: Los videos fueron grabados utilizando un microscopio estereoscópico a 10 aumentos con un Hamamatsu Orca-R2 cámara digital C10600-10B y el software de imágenes PCI simple Hamamatsu.
    1. Encienda la cámara y el software de imágenes PCI simple. Haga clic en "Live" para permitir el ajuste de las condiciones de la imagen.
    2. Configurar las condiciones de vídeo de la siguiente manera: Ganancia = 0; Modo Luz = Alta; Velocidad Índice = 1; Intervalos = 2. Haga clic en "Auto Expose" y luego ajustar las condiciones de luz, mover los espejos de microscopio y los diales de brillo y contraste.
      NOTA: El video tiene que tener un alto contraste sin ser Sobreexpcerradas de la, por lo que los animales aparecen como formas negras sobre un fondo brillante.
    3. Haga clic en "Scan Time" y seleccione una carpeta y un nombre de archivo. Ajuste "Delay Campo" a 20 ms y "Parada en el tiempo" a 30 seg. Presione "Revisión Live" con el fin de elegir el área de la placa para grabar (donde la mayoría de los gusanos son). Toque en la placa de 3 o 4 veces en el escenario, de forma rápida confirmar su posición en el campo de visión y presione "Start".
    4. Después de la película termine de grabar, haga clic derecho sobre la imagen y selecciona "Exportar Montaje Secuencia" para exportar la película a partir de un formato .cxd a un .avi.
  3. El análisis de los vídeos de la motilidad
    1. Abra el software ImageJ, vaya a la pestaña "Plugins", luego "wrmtrck" y selecciona "Lote wrMTrck". Seleccione el directorio que contiene todos los archivos a analizar.
    2. En la ventana de entrada principal de wrMTrck_Batch, cargue los valores de entrada como se detalla en Figure 5C. Explicación para cada uno de los parámetros se puede encontrar en las instrucciones que acompañan el plugin. Haga clic en "Aceptar" y dejar que el análisis del movimiento de ejecución.
    3. El comisariado de los resultados y confirmar que todas las pistas detectadas son de real C. elegans y eliminar los artefactos, se abren cada uno de los archivos .txt creados para cada película y copiar la información a un archivo de software de análisis de datos. Abra el "*" _labels.zip archivos creados y ejecutar el resultante "* _labels.tif" para comprobar y eliminar pistas falsas gusano manualmente.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monitoreo intercelular propagación de proteínas priónicas como in vivo por time-lapse

Transgénicos C. elegans líneas que expresan el dominio de priones son particularmente adecuados para el análisis de ciertos aspectos de proteínas priónicas-como, por ejemplo, la transmisión de célula a célula y la toxicidad no autónoma de la célula. La transparencia de los animales permite el seguimiento de fluorescencia proteínas etiquetadas desde dentro del organismo vivo en todas las etapas de la vida. Tomando ventaja de esto, el movimiento de las proteínas priónicas-como a través de las células y los tejidos usando un microscopio de fluorescencia se visualizan. Un objetivo aceite 63X o 100X / 1.4NA es necesario resolver las estructuras vesiculares. Es importante destacar que el dominio prión tiene que ser etiquetados con mRFP, a fin de permanecer con fluorescencia visible dentro de estas vesículas ácidas presumiblemente 40. Proteína fluorescente amarilla (YFP), que se utiliza a menudo como una etiqueta, is no es adecuado, ya que se apaga en un entorno de bajo pH 40,55. Strain AM815 expresa RFP-etiquetados R2E2 (una forma altamente propensos a la agregación y tóxica del dominio prión NM) que se acumula en vesículas tubulares, mientras que la etiqueta RFP solo permanece soluble (Figura 1A y B). Uso en time-lapse vivo, se pudo observar que estas vesículas tubulares se transportan dentro y entre las células 40 (Figura 1 C y D, Video 1 y 2) [colocar enlaces a vídeo 1 y 2 aquí].

Utilizando sensores plegables y reporteros de estrés para investigar los efectos de células autónomas autónomos y no celulares en Proteostasis y toxicidad

Los priones son capaces de cruzar las proteínas relacionadas semillas y perturbar el ambiente de plegamiento de la proteína celular. Esto puede ser revelada a través de la co-expresión de senso plegamiento apropiadors. Sensores plegables son proteínas metaestables no esenciales que dependen de una red Proteostasis funcional para plegar correctamente. Algunos ejemplos son la luciferasa y las proteínas que albergan sensibles a la temperatura (ts) mutaciones 56-66 luciérnaga bien conocido. Una interrupción de Proteostasis conduce a un mal plegamiento de la reportero, que puede ser detectado por examen visual de los agregados o por la exposición de la respectiva fenotipo mutante ts a temperaturas permisivas. Tramos de poliglutaminas (polyQ) con una longitud en el umbral de la agregación (alrededor de 40 residuos) también se utilizan a menudo debido a que presentan una agregación dependiente de la edad 67-69. A principios de inicio de la agregación revela un entorno de plegado comprometida. Aquí, se empleó un mutante prión RΔ2-5 que permanece soluble cuando se expresa en C. elegans músculo de la pared del cuerpo las células (BWM) y el intestino 40 (Figura 2A y C). Tras la expresión simultánea con R2E2 en las células de BWM, RΔ2-5 reaDily agregados (Figura 2B), que revelan un efecto autónoma de células de R2E2 sobre el medio ambiente plegamiento de proteínas. El efecto generalizado sobre Proteostasis y la inducción de misfolding través de los tejidos se puede evaluar mediante la expresión del sensor de plegado en un tejido distinto que no expresa la forma altamente agregación propensos del dominio prión. R2E2 se expresó bajo un promotor específico de células BWM (myo-3p), mientras que RΔ2-5 se expresó bajo un promotor específico intestino (VHA-6p). La agregación de RΔ2-5 intestinal demuestra que R2E2 afecta el plegamiento de proteínas de una manera autónoma no celular 40 (Figura 2D). En lugar de utilizar RΔ2-5, donde los agregados sólo pueden ser detectados en alta resolución, el uso de polyQ44 expresa en el intestino (Q44i) permite la visualización de los agregados a baja resolución bajo un estereomicroscopio (Figura 2E y F). Además, esto permite una cuantificación de animals con agregados, así como una cuantificación del número de agregados.

Para investigar la toxicidad de células no autónoma del dominio prión, hemos examinado previamente los tejidos que no expresan R2E2 por microscopía electrónica vecina y encontró que la expresión del dominio de priones en las células musculares conduce a una interrupción de células no autónoma de la integridad mitocondrial en los tejidos adyacentes, tales como el intestino 40. Resultados disfunción mitocondrial en el aumento de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el estrés oxidativo. Un método no invasivo para visualizar la inducción de la respuesta al estrés oxidativo es utilizar un estrés oxidativo reportero inducible 70. La cepa CF1553 expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el estrés oxidativo promotor inducible SOD-3 70. Cuando se cruzan con los animales que expresan el dominio prión R2E2 en las células BWM, el reportero se upregulated significativamente en células BWM, así como en numerosos tejidos no BWM ( La Tabla 1 proporciona una lista de C. elegans cepas que expresan sensores plegables y reporteros de estrés que pueden ser utilizados de forma análoga.

Genoma de pantalla ancha para la supresión de la toxicidad inducida por priones en C. elegans

El complejo fenotipo toxicidad del dominio prión expresada en C. elegans es particularmente interesante debido a la falta de toxicidad discernible observado en la mayoría de los modelos de priones in vitro 71. Este modelo podría revelar nuevos caminos que pueden influir en la toxicidad asociada con priones en metazoos. Para solucionar esto, hemos analizado los genes que, cuando se agota RNAi, mejorarían el defecto de la motilidad R2E2 animales transgénicos. Control tratado gusanos WT se pueden utilizar como un co positivontrol, aunque la mayoría de genes candidatos no proporcionarán un rescate completo fenotipo movimiento, debido a la penetrancia variable RNAi y la alta toxicidad del transgén. Los animales fueron tratados durante 4 días con RNAi, desde el primer estado larval L1 a día 2 de la edad adulta. En ese momento, la paliza de los animales no tratados R2E2 es significativamente más lento que la paliza de animales WT, lo cual es importante porque estamos de revisión para una mejora de la motilidad. Progenie F1 estará presente (~ L1), pero es fácil de distinguir de la generación P0. Solamente la generación P0 se anotó. Esta pantalla inicial es visual y no cuantitativa y por lo tanto, se utilizó un umbral bajo para identificar los accesos preliminares, lo que significa que cada clon RNAi bacteriana que parecía aumentar la paliza de los animales por priones que expresan se repitió la prueba en un ensayo de rastreo cuantitativo. La Figura 4 describe la pasos principales de la configuración de pantalla. La alta resolución de la cámara Falcon 4M60 activar una detección visual de un Quarter de la placa a la vez en una pantalla de ordenador, lo que permitió a la pantalla para completar de manera más eficiente. Aunque útil, esto no es necesario. El examen visual de thrashing gusano también se puede realizar mediante el uso de un estereoscopio a bajo aumento (10X).

Confirmación de accesos pantalla preliminares

Pantallas de alto rendimiento se llevan a cabo como un enfoque que permite a los efectos amplios del genoma de análisis para obtener una lista primaria de genes candidatos que se pueden refinar mediante métodos complementarios. Validación de los resultados de pantalla tanto, es esencial para eliminar los posibles falsos positivos, lo que podría resultar de la realización de una pantalla con una sola muestra experimental por RNAi. R2E2 animales transgénicos fueron alimentados con los clones de ARNi de éxitos primarios y miden su velocidad en placas de NGM en el segundo día de la edad adulta, como una lectura cuantificable de la motilidad y la disminución de la toxicidad. Utilizamos el plugin wrMTrck para ImageJ, desarrollado en nuestrolaboratorio, que identifica con precisión C. elegans en los videos y sigue su movimiento. El plugin wrMTrck y guiones para el análisis automatizado son de código abierto y disponible públicamente en http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, junto con instrucciones detalladas sobre cómo usarlo. Después de descargar, copiar la carpeta wrMTrck todo a la carpeta Plugins de ImageJ. Este protocolo describe el método wrMTrck_Batch, preferido para el análisis de un gran número de videos a la vez, pero las instrucciones de un manual, película por película, análisis también están disponibles con la descarga de plugins. WrMTrck_Batch convierte un video original (Figura 5) en un formato binario con sustracción de fondo y cada gusano se le asigna una pista. Cada uno de los videos procesados ​​más tarde se puede ver con estas pistas superpuestas, a fin de eliminar manualmente los artefactos que fueron identificados erróneamente como gusanos (e. G, la pista 1 en la Figura 5B.). Una forma eficaz de eliminar de fondo de arte ifacts (indicados con una flecha en la figura 5B) es elegir cuidadosamente el tamaño mínimo y máximo de los objetos que deben ser identificados (Figura 5C). De las diferentes salidas de el plugin wrMTrck, usamos las longitudes corporales por segundo parámetro (BLPS) que mide la velocidad media de cada animal, representado por la longitud de cada pista dividida por la longitud del cuerpo de cada objeto, normalizando así las diferencias potenciales en el tamaño de los nematodos (Figura 5d). Usando este método, se identificaron 35 supresores de la toxicidad inducida por priones (sopt) que el aumento de la motilidad fenotipo en R2E2 expresar C. elegans a por lo menos 133% y hasta el 256% en comparación con gusanos tratados con el vector vacío (Figura 6). Estos genes SOPT representan golpes que resultaron de nuestros esfuerzos cribado de alto rendimiento de la final confirmó.

21fig1highres.jpg "/>
Figura 1. El dominio prión se extiende entre las células y tejidos en C. elegans en transporte vesicular. (A) se derrumbó confocal z-pilas de nematodos que expresan RFP en el músculo de la pared corporal (BWM) células (RFPm). (B) se derrumbó confocal z-pilas de nematodos que expresa la variante altamente tóxico y agregación NM prono, R2E2 , en las células de BWM (R2E2m). Las flechas indican vesículas tubulares, punta de flecha indica agregado. (C + D) serie Time-lapse de animales expresando RFPm (C) y R2E2m (D). Las flechas indican las áreas de movimiento vesicular. RFPm exhibe principalmente una tinción difusa. Incluso cuando RFPm se encuentra en vesículas, éstas apenas se mueven. R2E2m localiza en numerosas vesículas que se transportan dentro y entre las células. Las barras de escala: 10 m. Los Videos adjuntos 1 y 2 [colocar enlaces a Video 1 y 2 aquí] corresponden a la 1C Figuras y D,respectivamente.

Figura 2
Figura 2. Sensores plegables revelan el efecto generalizado del dominio del prión en Proteostasis. (A + B) La coexpresión de R2E2m promueve la agregación RΔ2-5m. Las imágenes confocales de (A) control de RΔ2-5m y (B) RΔ2-5m coexpressed con R2E2m en las células BWM. (C + D) Muscle expresaron R2E2m promueve la agregación RΔ2-5i intestinal. (C) Confocal imagen de control de animales que expresan RΔ2- 5i en las células intestinales. (D) Imagen confocal de animales que expresan R2E2m en las células BWM y RΔ2-5i en el intestino. Las barras de escala: 10 m (E + F) R2E2m induce a la no agregación de células autónomas de Q44i (E) imágenes fluorescentes representativos de Q44i y Q44i; animales R2E2m 4 días después de la transferencia sincronizada lar L1..VAE en placas-OP50 sembrado frescas NGM. La expresión de R2E2 en las células BWM conduce a un inicio más temprano de la agregación Q44i en el intestino. (F) Cuantificación de los animales con agregados (en%) en los días indicados después de la sincronización. Las barras de error representan SD Esta cifra se ha modificado desde el 40.

Figura 3
Figura 3. El césped-3p :: GFP reportero estrés transcripción revela que el dominio del prión provoca celular celular inducción autónoma autónomos y no del estrés oxidativo. (A + B) Imágenes representativas fluorescentes (utilizando el mismo tiempo de exposición) de césped-3p :: animales de control que expresan GFP (A) y césped-3p :: GFP;. Animales R2E2m (B) el día 2 de la edad adulta (C) La expresión de R2E2 en las células BWM conduce a una inducción del reportero no sólo en la celda BWMs (I), sino también en el intestino (II), cordón nervioso (III), las neuronas de la faringe y de la cabeza (IV).

Figura 5
Figura 5. Análisis de movimiento de tornillo sin fin con el plugin wrMTrck para ImageJ. (A) Ejemplo de una película de entrada generado mediante el uso de una ampliación apropiada (~ 10 veces) para supervisar varios animales a la vez. (B) "*" _labels.tif archivos son una salida de wrMTrck_Batch y permitir la curación manual de resultados de análisis. La flecha indica un objeto que fue excluido correctamente desde el análisis debido a una elección adecuada de los parámetros de tamaño mínimo y máximo. (C) Ventana de entrada de wrMTrck_Batch, mostrando los parámetros utilizados para este protocolo. Estos parámetros deben ser ajustados de acuerdo a la configuración de microscopio y películas individuales. (D) los resultados de salida de movemeanálisis nt de (B), con la columna de la BLPS resaltado en amarillo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 1
Figura 6. gusanos R2E2 tratados con RNAi clones que son supresores de inducida por priones toxicidad (sopt) muestran la mejora de la motilidad. Motilidad se muestra como BLPS relativos en comparación con el control negativo (vector vacío). Se muestran todos los estudiantes (t-test) RNAi clones estadísticamente significativos identificados en la pantalla de HTP. estrella negro representa el golpe se muestra como un ejemplo en la Figura 5. Los resultados son de 3 películas, con 17 <n <53 pistas por condición. Las barras de error representan SEM. </ P>

Tabla 1. C. elegans cepas que expresan sensores plegables y reporteros de estrés.

Nombre de la cepa genotipo Comentarios Fuente Strain
Sensores plegables
transgenes
AM140 UNC-54p :: polyQ35 :: YFP muscular específica expresión de polyQ35, la agregación dependiente de la edad CGC o Morimoto laboratorio
AM141 UNC-54p :: polyQ40 :: YFP expresión muscular específica de polyQ40, agagregación dependiente e CGC o Morimoto laboratorio
AM801 UNC-54p :: RΔ2-5 :: YFP expresión muscular específica de nucleación dominio prión incompetente Laboratorio Morimoto
OG412 vha-6p :: polyQ44 :: YFP intestino específica expresión de polyQ44, la agregación dependiente de la edad CGC
AM809 vha-6p :: RΔ2-5 :: GFP; myo-2p :: mCherry expresión intestino específica de nucleación de dominio prión incompetente Laboratorio Morimoto
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: PPC expresión neuronal específica de polyQ40, agregación tipo de células específicas Laboratorio Morimoto
AM982 unc54p :: luciferasa :: YFP expresión muscular específica de WT luciferasa de luciérnaga Laboratorio Morimoto myo-3p :: luciferasa :: GFP; rol-6 expresión muscular específica de WT luciferasa de luciérnaga Laboratorio Behl
SNG-1p :: luciferasa :: GFP; rol-6 expresión muscular específica de WT luciferasa de luciérnaga Laboratorio Behl
FUH55 unc54p :: FLUC :: egfp; rol-6 expresión muscular específica de WT luciferasa de luciérnaga Laboratorio Hartl
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: egfp; rol-6 expresión muscular específica de R188Q mutante luciferasa de luciérnaga Laboratorio Hartl
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: egfp; rol-6 expresión muscular específica de R188Q + R261Q mutante doble luciferasa de luciérnaga Laboratorio Hartl
FUH48 F25B3.3p :: FLUC :: egfp; rol-6 expresión neuronal específica de WT lucifera luciérnagasí Laboratorio Hartl
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: egfp; rol-6 expresión neuronal específica de R188Q mutante luciferasa de luciérnaga Laboratorio Hartl
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: egfp; rol-6 expresión neuronal específica de R188Q + R261Q mutante doble luciferasa de luciérnaga Laboratorio Hartl
mutantes ts
CB1402 UNC-15 (e1402) I Paramiosina (ts), sensible a la temperatura paralizado-Unc, Let CGC
CB1157 UNC-54 (E1157) I La miosina (ts), sensible a la temperatura Unc CGC
CB1301 UNC-54 (e1301) I La miosina (ts), sensible a la temperatura Unc CGC
CB286 UNC-45 (E286) III UNC-45 (ts), sensibles a la temperatura, lento Unc movimiento, Egl CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) II Perlecan (ts), sensible a la temperatura Unc, parálisis rígida CGC
SD551 let-60 (ga89) IV Ras (ts), sensible a la temperatura Muv, Ste, Let, Lva, Osm CGC
CX51 dyn-1 (ky51) X Dinamina (ts), sensible a la temperatura Unc CGC
CW152 gas-1 (FC21) X Gas-1 (ts), sensible a la temperatura Sensibilidad EtOH CGC
ZZ26 UNC-63 (x26) I Receptor de acetilcolina (ts), resistencia levamisol sensible a la temperatura CGC
reporteros de estrés
CL2070 hsp-16.2p :: gfp; rol-6 estrés térmico; Cito UPR CGC
TJ375 hsp-16.2p :: GFP estrés térmico; Cito UPR CGC
TJ3000, TJ3001 hsp-16.2p :: GFP; Cbr-UNC-119 (+) estrés térmico; Cito UPR CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol-6 estrés térmico; Cito UPR Laboratorio Morimoto
AM722 hsp70p :: mCherry; myo-2p :: PPC estrés térmico; Cito UPR Laboratorio Morimoto
AM799 hsp90p :: GFP estrés térmico; Cito UPR Laboratorio Morimoto
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; Cbr-UNC-119 (+) estrés térmico; Cito UPR CGC
CF1553 SOD-3p :: GFP; rol-6 estrés oxidativo CGC
KN259 SOD-3p :: GFP; rol-6 estrés oxidativo CGC
CL2166 gst-4p :: GFP :: nls estrés oxidativo CGC
LD1171 GCS-1p :: GFP; rol-6 estrés oxidativo CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 estrés oxidativo CGC
IG274 PNL-29p :: GFP estrés osmótico CGC
BC20309 mtl-1p :: GFP estrés de metal Laboratorio Baillie
BC20342 mtl-2p :: GFP str metalesess Laboratorio Baillie
BC20314 ELT-2p :: GFP estrés de metal Laboratorio Baillie
SJ4005 hsp-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 hsp-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 hsp-60p :: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Centro de Genética; ts = sensible a la temperatura; UPR respuesta = proteína desplegada; cito = citosólica; mito = mitocondrial; ER = retículo endoplásmico.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Los métodos descritos aquí ayudan a ilustrar la difusión y la toxicidad celular autónoma la célula compleja autónomos y no de las proteínas priones similares. Recientemente hemos descubierto que un dominio citosólico prión agregación propensos se recoge en vesículas de membrana en un proceso de autofagia relacionados. Un subconjunto específico de estas vesículas transporta el dominio prión dentro de y entre las células y los tejidos 40. La clave para controlar su movimiento en el animal vivo es que la proteína tiene que ser etiquetados con mRFP, porque sólo las proteínas marcadas con mRFP eran visibles en estas vesículas presumiblemente ácidas. Utilizando el mismo método, actualmente estamos investigando el potencial comportamiento prión como de ciertas proteínas relacionadas con la enfermedad, como la superóxido dismutasa 1 (SOD1) (vinculado a ALS), alfa-sinucleína (vinculado al PD) o la proteína de unión al ADN TAR 43 (TDP-43) (vinculado a ALS). Aunque este transporte intercelular dentro de vesículas parece ser utilizado por varias otras proteínas, que podría haber unavías adicionales A que permiten la difusión.

El uso de sensores de plegado bien caracterizado es una poderosa herramienta para vigilar los efectos de la proteína celular plegable ambiente en C. elegans 63-66. Aquí hemos demostrado cómo utilizar la acumulación dependiente de la edad de fluorescencia de proteínas marcadas agregación propensos expresado bajo promotores específicos de tejido para monitorear visualmente la capacidad de plegado de tejidos distintos al mismo tiempo. Otras posibilidades para estudiar la red Proteostasis del organismo incluyen el uso de proteínas mutantes ts endógenos. Estas proteínas metaestables funcionarán normalmente a la temperatura permisiva (15 ° C), pero misfold y convertirse en no funcional a la temperatura restrictiva (25 ° C), exhibiendo su característica fenotipo mutante. En presencia de una proteína de agregación o propensos durante el envejecimiento, los ts fenotipo mutante se expone incluso en condiciones permisivas 63-66. Algunos de estos mutantes ts se expresan en oólo un subconjunto de los tejidos o exhiben fenotipos específicos de tejido, por lo que éstos particularmente útil para detectar células autónomas y no de células efectos proteotoxic autónomas. Por ejemplo, un mutante ts de LET-60, un miembro de la familia proto-oncogén RAS unión a GTP, Ras (ts), se expresa de forma ubicua, pero muestra mutante específico de tejido fenotipos 63,66. Mediante el uso de este mutante ts, el efecto de las expansiones polyQ en la Proteostasis celular ha demostrado ser células autónomas 63. Expresión de polyQ en el fondo genético de ras (ts) reveló sólo el fenotipo mutante específico para el tejido en el que se expresó la proteína. La exposición de múltiples fenotipos mutantes indicaría que una proteína tiene efectos celulares no proteotoxic autónomas.

Además, para probar los efectos sobre las vías de estrés celular, hay una gran selección de estrés in vivo reporteros fluorescentes en C. elegans 72. Estos son por lo general de transcripciónAL reporteros que expresan la proteína fluorescente verde (GFP) bajo un promotor inducible por estrés, tales como hsp-16.2p o SOD-3p, que informan sobre el estrés oxidativo térmico o, respectivamente 72. Mediante el uso de los reporteros adecuados en combinación con proteínas priónicas-como, se puede monitorizar un potencial de inducción de respuestas de estrés en los tejidos distintos del que expresa el transgén respectivo. Una advertencia, sin embargo, es que estos reporteros de estrés a menudo no son lo suficientemente sensibles para revelar sutil upregulation de una vía dada (observaciones no publicadas).

En nuestra búsqueda para examinar si los genes que influyen en la toxicidad autónoma no celular también afectan proteína difusión, empezamos por la detección de genes que, cuando derribado, mejorarían defectos de movimiento. El uso de la evaluación visual de las tasas de natación como una lectura de datos, pudimos cómodamente ensayo ~ 25 placas por sesión y realizar dos rondas de este protocolo por semana, lo que resulta en la terminaciónde la pantalla inicial en un plazo de 6 semanas. La confirmación de los resultados, mediante análisis cuantitativo de movimiento gusano en placas sólidas, por triplicado, utilizando wrMTrck se realizó en un adicional de 3 semanas. Una advertencia, sin embargo, es que mediante el uso de rastreo en placas en vez de nadar en medio líquido como una lectura de uno podría perder ciertos genes candidatos, como la natación y el rastreo no son movimientos idénticos y pueden ser influenciados por distintas vías 73. Por lo tanto, si algunos genes candidatos no pueden ser confirmados en placas sólidas, deben ser re-evaluados en medios líquidos, donde la natación se puede cuantificar contando la frecuencia de golear en un tiempo determinado.

El protocolo de investigación descrito aquí utiliza estaciones de trabajo de manejo de líquidos, lo que reduce en gran medida la variabilidad automatizado. La desventaja es que se necesita un exceso de fluidos para el depósito de los robots, que no siempre podría ser factible. Esta configuración de detección se puede adaptar fácilmente para otras pantallas en C. elegans </ Em> que el uso de golear como una pantalla-out.This lectura no fue diseñado para identificar directamente los genes que intervienen en la no toxicidad celular autónoma difusión o del dominio de priones, como genoma pantallas anchas deben ser simples en el diseño, con el fin de llevar a cabo de una manera oportuna. Motilidad defectos pueden originarse no sólo desde muscular, sino también de daño neuronal y de un número de otros defectos genéticos 53. Así, mediante el uso de esta lectura, podríamos encontrar no sólo los modificadores de toxicidad muscular específica. Actualmente estamos probando los genes candidatos por sus efectos en el dominio del prión difusión y toxicidad autónoma no celular utilizando los métodos descritos anteriormente. Estos experimentos eventualmente revelar si la difusión transcelular de agregados de proteínas está directamente relacionada con la toxicidad observada en otros tejidos o si la transmisión de célula a célula y la toxicidad celular autónomo no puede ser desacoplado.

Tomados en conjunto, los métodos descritos se pueden utilizar para examinar el potencial de prcomportamiento de iones como de las proteínas a nivel celular y del organismo usando C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics