Metazoan Model Organizma kullanma Serim ve toksisitesi prion-benzeri Proteinler incelenmesi

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Alzheimer hastalığı (AD), Parkinson hastalığı (PD), Amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve bulaşıcı sünger tipi ansefalopatiler (TSEler) dahil olmak üzere birçok nörodejeneratif hastalıklar, agregasyon eğilimli proteinler ile ilişkili ve dolayısıyla birlikte, protein yanlış katlanması bozuklukları (pmds şekilde bilinmektedir ). Her ikisi de insanlarda ve hayvanlarda 1 enfeksiyona sebep olabilir ki TSEler veya prion hastalıkları pmds benzersiz bir sınıfını teşkil ederler. Moleküler düzeyde, prion alımı ve patolojik β-tabaka zengin PrPSc konformasyonunda 2,3 içine monomerik α-sarmal zengin konak-kodlanmış hücresel PRP (PrP C) dönüştürerek çoğaltmak. Kendi kendine ilerleyen Protein topakları ayrıca memeli prion 4,5 ile önemli özellikleri paylaşan mantarlar içinde tanımlanmıştır. Buna ek olarak, bir memeli, prionlar hücreden hücreye hareket edebilen ve naif hücreleri 6,7 enfekte etmektedir.

Pmds OTH daer TSE'ler bulaşıcı değildir, daha onlar prion hastalıkları 8,9 ile ortak bir patojenik ilke paylaşıyoruz. Pmds her birine bağlı proteinler yapı veya fonksiyonunda ilgili olmasa da, bir kristalleşme gibi süreci ile tüm form agrega çekirdekli denir ya polimerizasyonu numaralı seribaşı; üstelik proteinli tohumlar onların çözünür izoformlarını 2,10,11 işe alarak büyür. öz-yayılmasına verimliliği birlikte, moleküler chaperones gibi ek hücresel faktörlerle sonuçta toplam çekirdeklenme, tohumlama, parçalanma ve 12-15 yayılma oranlarını belirlemek protein içsel özelliklerine bağlı olarak, in vivo değişir. Bu nedenle, protein agregasyonu verimli yayılmasını izin veren bu faktörler arasında ince bir denge bulunmalıdır. Sadece bazı Amiloidojenik agrega bir prion özelliklerini barındıran ve böylece tüm pmds bulaşıcı Bu yüzden de açıklayabilir. Prionlar 'üst-sanatçıların o temsil görünüyorOnlara pmds 8,13 incelemek için güçlü bir araç yapar kendini kopyalayan proteinli agrega fa geniş spektrumlu,.

Ilginç bir hastalıkla ilişkili agrega ile ilişkili toksisite genellikle olmayan bir hücre özerk bileşeni 16,17 sahiptir. Bu durum, sadece hücreler, gen sergilediğini belirli bir fenotip ifade ima katı bir hücre otonom etkisi, aksine, ilgili geni ifade etmeyen komşu hücreleri üzerinde etki anlamına gelir. Bu zorlayıcı dokuya özel ekspresyon gösterdiği veya nörodejeneratif hastalıklar 18-26 çok sayıda model ilgili proteinlerin yıkmak edildi. Çeşitli mekanizmalar azalmış besin kaynağı, nöronal sinyalleşme dengesizlik, glutamat eksitotoksisitesi ve nöro 16,27,28 içeren pmds bu sigara hücrenin otonom toksisite için bir temel olarak önerilmiştir. Buna ek olarak, hücreler arasında hastalığa bağlı agregalar prion-benzeri hareket might Bu açıdan 29,30 katkıda bulunur. Giderek artan kanıtlar, prionlar dışındaki protein inklüzyonlar özelliği de pmds 30-36 gözlenen patolojinin yayılma açıklayabilir, hücreden hücreye iletmek düşündürmektedir. Ancak, henüz hastalık proteinlerin hücreler arası hareket ve komşu hücreler üzerinde toksik etkisi arasında net bir nedensel bağlantı olup olmadığı belirlenecek olan. Bu nedenle, hücre-hücre iletim ve olmayan hücre özerk toksisite altında yatan hücresel yolların daha iyi anlaşılması yeni tedavilerin geliştirilmesi için gerekli ve önemlidir. Bununla birlikte, Metazoan'da olarak yanlış katlanmış proteinler, hücre-hücre iletim etkileyen yayılması ve hücresel faktörlerin prion-benzeri birçok yönü de organizma seviyesinde, özellikle anlaşılamamıştır.

Caenorhabditis elegans nematod potansiyeli sağlamak çeşitli avantajları vardır prion-benzeri SPREADI yeni yüzleri keşfedeceksinizMetazoan'da 17 ng. Bu, in vivo canlı bir organizmada floresan etiketli proteinleri izleme sağlayan saydamdır. Ayrıca, hastalıktan etkilenen birçok hücresel ve fizyolojik süreçler insana solucanlar korunmuş, ve C edilir C. elegans, genetik manipülasyon ve moleküler ve biyokimyasal analizler 37-39 çeşitli elverişlidir. Tam 959 somatik hücreler hala kas, nöronlar ve bağırsak dahil olmak üzere birçok farklı doku tipleri vardır basit bir vücut planına sahip yetişkin hermafrodit makyaj.

C. yeni bir prion modeli kurmak için elegans, biz solucanlar 4,40 bilinen hiçbir endojen prion proteinleri vardır çünkü dışsal olarak, iyi karakterize glutamin / asparagin (Q / N) sitozolik maya prion proteini Sup35 olan bakımından zengin prion alanı NM ifade seçti. Maya prionların prion çoğaltma 41-44 temel mekanizmaların tanıtılması çok değerli olmuştur. Ayrıca, NM FIRmemeli hücre kültüründe 45,46 bir prion tam yaşam döngüsü özetlemek gösterilmiştir st sitosolik prion-benzeri protein. Benzer şekilde, C olarak ifade edildiğinde elegans, mitokondriyal bütünlüğü ve görünüm bozulması dahil 40. NM toplama derin toksik fenotip ile ilişkili maya hücreleri ve prion biyoloji sergilenen temel özellikleri karşılaştırıldığında metazoan hücrelerde yayılması için farklı ihtiyaçlarına oldukça iyi kabul Sup35 prion alanı Hücresel düzeyde çeşitli otofaji ilgili kesecikler, yanı sıra embriyonik ve larva tutuklama, gelişimsel gecikme ve organizma düzeyinde protein katlanması ortamının yaygın bir rahatsızlık. Çarpıcı, prion etki transgen ifade değildi hangi komşu dokuları etkileyen, hücre özerk olmayan hücre özerk toksisite sergiler. Ayrıca, hücreler içinde ve arasında prion etki vesiküler taşıma gerçek zamanlı olarak izlenir <em> in vivo 40.

Burada C prion-benzeri yayılmasını incelemek için nasıl açıklamak elegans. Biz time-lapse floresan mikroskobu kullanarak prion alanı içeren veziküllerin içi ve hücreler arası ulaşım izlemek için nasıl açıklayacağız. Biz doku-spesifik katlama sensörleri kullanımını vurgulamak ve her yerde bulunan hücresel fitness hücre özerk olmayan hücre özerk etkilerini değerlendirmek için stres gazetecilere dile olacaktır. Son olarak, biz prion kaynaklı toksisite yeni değiştiricileri belirlemek için bir süre önce gerçekleştirilen genom RNA enterferans (RNAi) Ekranın prosedürü anlatacağız. Kombinasyon halinde, bu yöntemler, protein arası hareketi ve olmayan hücre otonom toksisite yer genetik yolları ayrı takılmak için yardımcı olabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. İzleme transselüler İn Vivo Time-lapse Görüntüleme By prion-benzeri Proteinlerin Yayılma

NOT: C büyütün standart yöntemlere ve dikkatli bir şekilde kültür sıcaklığı 47 kontrol göre elegans vahşi tip (WT) (N2) ve transgenik çizgiler.

  1. C transjenik çizgileri oluşturmak elegans monomerik kırmızı floresan proteini (MRFP) ile etiketlenmiş prion proteini gibi, ifade. Mikroenjeksiyon 48 nasıl kullanılacağını gösterir bu videoyu izleyin. Bu ekstrakromozomal satırları nasıl entegre açıklayan Daha detaylı bilgi ve yöntemleri için, 49 bkz.
  2. Yumurta standart yöntemlere göre 50 döşeme veya ağartıcı senkronize popülasyonlar hazırlayın.
    1. Yumurtlayarak Senkronizasyon
      1. Transferi 10-20 gebe bir plaka üzerinde yetişkin ve onları 1 yumurtalarını izin - 2 saat. Plaka yetişkin çıkarın ve döl istenen yaşına kadar büyümesine izin.
    2. <ağartma tarafından li> Senkronizasyon
      1. Gebe yetişkin eşleşmemiş olan bir popülasyon toplamak ve alkalin hipoklorit çözeltisi (250 mM NaOH ve 1: 2 konumundaki H O ticari ağartıcı 4 (h / h) seyreltme) ile, peroksijen ağartıcıdır. 2 O 7H, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, 1 dH 2 O toplayın M9 tampon 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · iki kez (218 xg az 1 için) yumurta yıkayın L) sokuldu.
      2. Bunları 20 ° C / nazik ajitasyon O ile M9 tampon N yumurtadan izin verin. Solucan geliştirme senkronize nüfusu bırakarak, bir besin kaynağı yokluğunda L1 aşamasında tutuklama olacaktır. OP50 E. ile seribaşı taze Nematodu Büyüme Medya (NGM) plakalar üzerine L1S Transferi E. coli bakteri ve döl istenen yaş 47 kadar geliştirmek verelim.
  3. 50 tarif edildiği gibi, bir mikroskop lamı üzerine (H2O)% 2 agaroz pedleri hazırlayın.
    1. İki mil hazırlayınbunların tüm uzunluğu boyunca yerleştirilmiş etiketleme bant ile mikroskop slayt ayırıcılar olarak kullanılır. Aralarında üçüncü bir mikroskop lamı yerleştirin.
    2. Temiz slayt üzerine H 2 O 2% agaroz ve pipet bir damla eritin.
    3. Agar damla üstüne diğer üç slaytlar dik dördüncü slayt yerleştirin. Yavaşça etiketleme bant aynı kalınlıkta pedi düzleştirmek için bastırın.
    4. Aralayıcıları kaldırılması ve hafifçe birbirinden slaytlar çekerek önce 1 dakika kurumaya bırakın. Agar ped bunlardan birine sopa olacak.
  4. Pipet ~ 10 ul anestezik pedi ve transfer (2 mM levamizol M9 tampon) ~ bir platin tel çekme kullanarak 10 hayvan. Bir kapak kayma (~ 22 x 22 mm) ile kaplayın ve 1 saat içinde görüntüleri almak.
  5. Seçenek olarak ise, daha uzun bir süre boyunca film elde etmek için ya da daha fazla, hayvanların herhangi bir hareket olasılığını azaltmak anestezi ve boncuk hareketsizleştirme 51 bir arada kullanımı.
    1. 10% aga hazırlayın(M9 tampon) 51 tarif ve 3 ul Nanokürecikli boyutu standartları çözüm solucanlar (polistiren boncuklar, 100 nm) artı 3 ul anestezik (M9 tampon 4mM Levamizol) ekleyin yastıkları yükseldi. Bir kapak kayma hafifçe örtün. Kuruma önlemek için, valap (vazelin, lanolin ve parafin mumu eşit miktarda karışımı) ile kapak kayma mühür.
  6. Görüntü konfokal mikroskop kullanılarak solucanlar hareketsiz.
    NOT: Sonuçlar bir EM-CCD kamera ve MetaMorph gibi bir Mikroskopi Otomasyon ve Görüntü Analiz Yazılımı ile donatılmış bir İplik Disk AF Konfokal Mikroskobu kullanılarak elde edilen ve aşağıda özelliklerini ana hatlarıyla, ancak diğer karşılaştırılabilir konfokal görüntüleme sistemleri de tercih edilebilir.
    1. 63X veya 100X / 1.4NA yağı hedefi kullanın ve mikroskop lamı tutucuya yerleştirin solucanları içeren mikroskop lamı yerleştirin.
    2. Yazılımını açın. MRFP görüntüleme için lazer gücü ve filtreleri ayarlayın. % 10 güç ve emisyon filtresi> 600 nm 561 nm lazer kullanın.
    3. "Tasarruf" sekmesinde seçmek veya dosyaların kaydedilmesi gereken dizin klasör oluşturun. Dosyaya bir ad atayın.
    4. "Dalga Boyu" sekmesi altında uygun aydınlatma seçmek ve pozlama ve kazancını ayarlayın. 100 ve 300 ms ve 100 ile 300 arasında bir kamera artışı arasında bir maruz kalma ile "YokoQuad Kırmızı" (ya da MRFP görüntüleme için eşdeğer aydınlatma ayarı) kullanarak, tek tek örnek olarak (canlı görüntü ile değerlendirildi).
    5. "Timelapse" sekmesi altında "zaman noktalarının sayısı" = 301, "Süre" = 5 dk ve "Zaman / Aralığı" = 1 sn seçin.
    6. "AFC SET Z TUT" ve "Z TUT için AFC dön", Türü: "Dergiler" sekmesi seçin Journal altında &# 8220; Özel "(iki kez), Başlangıç ​​Noktası:" Başlat zaman noktası "ve" zaman noktası Sonu ". Bu otofokus seçenek görüntünün daha uzun bir süre boyunca aynı bölümü için önemlidir.
    7. Kurulum tamamlandığında, basın "Acquire". timelapse Video ayrı TIFF dosyaları olarak safed edilir.
    8. ImageJ belirli bir zaman serisinin tüm .tiff dosyaları açın. "Image" → "Yığınlar" → "Yığınlarına Görüntüler" gidin. İsteğe bağlı olarak, → "File" altında film İhracat, vb boyut çubuğu eklemek, parlaklık ve kontrast ayarı → "AVI ..." "olarak Kaydet" (bir örnek için, Video 1 ve 2 Şekil 1'e tekabül bakın).

2. Özerk ve Non hücre Özerk Proteostasis ve Toksisite Etkileri Hücre Araştırma Katlanır Sensörleri ve Stres Gazeteciler kullanma

  1. Bir katlama sensörü veya stres önce bildirilmiştir birlikte açığa transgenik hatları oluşturunBirlikte prion-benzeri protein r. Çarpılar kurmak veya transgenik çizgiler oluşturmak için nasıl yöntemler için, 48,49,52 bkz. C listesi için bakınız Tablo 1 kullanılabilir elegans suşu.
  2. Transgenik hayvanların senkronize popülasyonları hazırlayın ve (bölüm 1.2) 50 yukarıda anlatıldığı gibi istenilen yaşına kadar onları büyümek.
  3. Bir Stereomikroskopta kullanarak, katlama sensörü veya stres muhabiri ilgili fenotip incelemek.
    1. Katlama sensörü için, senkronizasyon sonra her gün agrega barındıran hayvanların sayısını belirlemek (bir örnek için, Şekil 2E ve F).
    2. Stres haberci için, deney habercisinin artmış floresan prion-benzeri protein sonuçları birlikte ekspresyonu (örnek için, bakınız Şekil 3) gösterir.

C. prion kaynaklı zehirlilik Önlenmesi 3. genom Ekran elegans

Şekil 4,
RNAi tarama protokolü 4. şematik gösterimi Şekil. Bireysel adımların ayrıntılı bir açıklama için protokol bölümüne 3 Bkz.

  1. C. Senkronizasyon elegans solucanlar ve RNAi kütüphane çoğaltılması
    1. RNAi ekran için, Ahringer RNAi kütüphane (veya Vidal RNAi kütüphanesi) 53,54 kullanın. % 10 gliserol ile takviye edilmiş 100 ul LB-amp ortamı ile plakaları (LB içinde 50 ug / ml ampisilin) ​​doldurarak 96 gözlü levhalar içine, orijinal 384 gözlü formattan RNAi kütüphane Rearray ve 96 pimli çoğaltıcı kullanarak inoküle. -80 ° C'de ajitasyon ve mağaza ile 37 ° CO / N büyür.
    2. C koruyun elegans WT ve 20 ° C NGM üzerinde plakaları transgenik hatları OP50 E. ile seribaşı standart yöntemlere göre 47 E. coli bakterisi.
    3. Ağartma tarafından prion etki transgenik ve WT (kontrol) nematod senkronize (bölüm 1.2).
    4. Solucanlar ağartılmış aynı gün, 50 ug / ml ampisilin ile desteklenmiş LB ortam hazırlar. Dağıtmak için otomatik bir reaktif dağıtıcı kullanma (veya pipet el ile), 96 gözlü bir plakanın her oyuğuna LB-amp ortamının 65 ul.
    5. -80 ° C den 96 de Ahringer RNAi kütüphane plakaları çıkarın ve kağıt havlu ile kaplı steril bir kaput getirmek. Hemen plakaları hala donmuş ise plakaların dış buz kirlenmesini önlemek için dikkatli olmak, baş aşağı plaka tutarak mühür-bandı çıkarın. Plakaları Reinvert ve bunları yaklaşık 30 dakika çözülme sağlar.
    6. Bir taze LB-amp plaka içine sonra bir RNAi kütüphane plaka içine bir steril 96 pimli çoğaltıcı batırın ve. Her plaka için taze steril çoğaltıcısının kullanın. Yapışkanlı folyo bant ile tüm plakaları Seal ve -80 ° C kütüphane plakaları dönün. çoğaltıcılar, çamaşır suyu ile ıslatılmış çalkalanabilir,ve tekrar kullanılmak üzere otoklavlanmıştır.
    7. Çoğaltılmış RNAi plakalar 37 ° C ve 300 rpm'de ayarlanmış bir kuluçka makinesi içinde O / N büyümeye izin verin. HT115 E. kullanmak için E. coli, bir kontrol olarak boş bir vektör (L4440) barındıran bakteri, bir kültür tübü içinde ayrı olarak büyür ve daha sonra iki 96 gözlü levhalar dörtte biri bir çok kanallı pipet ile kültür 65 ul pipetle.
  2. Bakteriyel dsRNA'nın üretim ve solucanların ilavesinden indüksiyonu
    1. Ile kombine edilmiştir 2 O içinde bir 5 mM konsantrasyona kadar izopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) seyreltin Dağıtmak için çok kanallı bir kafa ile otomatik bir iş istasyonu kullanarak (veya pipeti el ile) RNAi bakteri ve kontrol plakalarının her bir oyuğuna seyreltildi IPTG 10 ul. Yeniden mühürlemek ve geri kuvöz içine plakaları yerleştirin. Bunların 37 ° C'de 3 saat boyunca sallamak olsun.
    2. Bakteriler sallayarak iken, solucanlar hazırlamak. Bir cam mikroskop lamı - (10 ul ~ 5) küçük bir örnek de M9 / solucan süspansiyon karıştırın ve pipetle. Saymaksteromikroskopla solucanlar sayısı ve ul başına solucanlar sayısını hesaplamak.
    3. , 0.20 mg / ml IPTG, 8.0 ug / ml kolesterol 50 ug / ml ampisilin, 9.6 ug / ml tetrasiklin, 0,0835 ug / ml Fungizone, ve: Steril teknik kullanılarak, aşağıdaki nihai konsantrasyonları ile desteklenmiş M9 (M9 +) ihtiva eden bir çözelti hazırlamak 50 ul başına 15 solucanlar.
      1. Prion etki transgenik ve WT solucanlar için ayrı çözümler olun. Nihai (aşağıya bakınız), kopyalanan RNAi plakalarının sayısına bağlıdır gerekli M9 + solucan çözeltisinin hacmi artı ~ otomatik dağıtıcı kullanılırsa, rezervuar içinde kalır ölü hacim 30 mi.
    4. Bakteriyel dsRNA'nın üretimi 3 saat indüksiyon sonrası, inkübatör dışına plakaları almak ve onları hayvanlar vurgulayarak ısı önlemek için RT (~ 30 dk) soğumasını bekleyin.
    5. Her RNAi plakaları kuyu ve boş vektör kontrol plakaları birine 50 ul M9 + prion alanı transgenik solucan çözümü dağıtın. Yapmakhayvanlar rezervuar altına birikme eğiliminde her adımdan önce solucan çözüm karıştırmak için emin olun.
    6. İkinci kontrol plakasına WT solucanlar dağıtın. Havalandırma sağlamak için mühürsüz plakaları bırakın. 5 tabak ve birlikte nemli bir kağıt havlu ve alüminyum folyo ile sarın - buharlaşan sıvı kültürü korumak için, 4 yığını. 4 gün boyunca 20 ° C'de 200 rpm'de inkübe edin.
  3. Puanlama
    NOT: inkübatör 4 gün sonra, solucanlar yetişkinliğe ikinci gününde olması ve ekran hazır olacaktır. Hayvanlar rahatsız dayak sağlamak için tarama önce 30 dakika süreyle olmayan sallayarak koşullarına uyum edelim.
    1. Kontrol tedavi prion alanı transgenik hayvanlara kıyasla artmış dayak için görsel bir monitör, ekran bir bilgisayara bağlı bir Falcon 4M60 kameranın kullanılması.
    2. WrMTrck kullanarak onaylamak için ön hit bir listesini derlemek (bir sonraki bölüme bakınız).

Preliminary 4. OnayEkran Hits

  1. Katı plakalar üzerinde Motilite deneyi
    1. Standart yöntemlere 47 göre 100 ug / ml ampisilin, 12.5 ug / ml tetrasiklin ve 1 mM IPTG ile takviye NGM ile tabak hazırlayın. Mümkünse, tüm plakalar daha akıcı bir video toplama işlemi için izin verecektir medya aynı yüksekliğe sahip sağlamak için bir plaka dökme makinesi kullanın.
    2. 37 ° C'de ve 250 rpm'de ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampisilin, O / N farklı RNAi klonlar büyütün.
    3. Bir sonraki gün, 3 saat süre ile, 1 mM IPTG ile dsRNA'nın ifadesini teşvik eder. Ince bir tabaka halinde yayılır, her RNAi bakteriyel klon 150 ul, plak Tohum. Karanlıkta ve oda sıcaklığında 2 gün boyunca kuru bakteri olsun. RNAi klon başına 3 tabak hazırlayın.
    4. Standart yöntemler 50 (bölüm 1.2) göre ağartıcı solucan nüfus senkronize ve yumurta ambar O / N M9 medyayı izin.
    5. Sonsuz bir süspansiyon örneği alın ve NEM miktarını belirlemekstereomikroskopta ul başına atodes. 30 L1 solucanlar - 25 içerecek şekilde Ardından, her deneysel plaka içine M9 artı solucanlar uygun hacmi pipetle. Solucanlar yetişkinliğe gün 2 ulaşana kadar 4 gün boyunca 20 ° C'de nematod büyütün.
  2. ImageJ için wrMTrck eklentisi ile solucan hareketlilik kantitatif analizi
    NOT: Video Hamamatsu Orca-R2, dijital kamera C10600-10B ve Hamamatsu Basit PCI görüntüleme yazılımı ile 10X büyütmede bir skala kullanılarak kaydedildi.
    1. Kamera ve Basit PCI görüntüleme yazılımı açın. Görüntüleme koşulları ayarlanması için izin vermek için "Canlı" üzerine tıklayın.
    2. Aşağıdaki gibi video koşullarını ayarlayın: Kazanç = 0; Işık Modu = Yüksek; Hız Endeksi = 1; Binning = 2. "Otomatik Açığa" ve ardından mikroskop aynalar ve parlaklık ve kontrast kadranları hareketli, aydınlatma koşulları ayarlayın.
      NOT: Video overexp olmadan yüksek kontrast olması gerekirhayvanlar parlak arka plan üzerine siyah şekiller görünür, böylece bırakılmıştı.
    3. "Zaman Scan" seçeneğini tıklayın ve bir klasör ve dosya adını seçin. 20 msn "Alan Gecikmesi" Set ve 30 sn "Zamanda Dur". (Çoğu solucanlar nerede) kaydetmek için plakanın alanı seçmek için basın "Live İnceleme". Görünümü ve basın "Başlat" alanındaki konumunu teyit hızlı, sahnede plaka 3 veya 4 kez dokunun.
    4. Film kayıt tamamlandıktan sonra, resmin üzerine sağ tıklayın ve bir avi bir .cxd formatta filmi ihracat "İhracat Montaj Sırası" seçin.
  3. Motilite videoları analiz
    1. , ImageJ yazılımı açın "Eklentiler" sekmesine gidin, ardından "wrmtrck" ve "wrMTrck Toplu" seçeneğini seçin. Tüm dosyaları içeren dizini seçin analiz edilecek.
    2. Figür detaylı olarak wrMTrck_Batch ana giriş penceresinde, giriş değerleri yüklemekE 5C. Parametrelerin her biri için açıklama eklentisi eşlik kılavuzunda bulunabilir. "Tamam" ı tıklayın ve hareket analizi çalışmasına izin.
    3. Sonuçları küratörlüğünü ve algılanan tüm parçaları gerçek C'den onaylamak için elegans ve ortadan kaldırmak eserler, her film için oluşturulan .txt dosyaları her açmak ve bir veri analiz yazılımı dosya bilgileri kopyalayın. Oluşturulan "* _labels.zip" dosyaları açın ve elle kontrol etmek ve yanlış solucan parçaları ortadan kaldırmak için ortaya çıkan "* _labels.tif" çalıştırın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In vivo time-lapse görüntüleme ile prion-benzeri proteinler yayılması hücrelerarası İzleme

Transgenik C. Prion domainini ifade eden C. elegans hatları prion-benzeri proteinler, örneğin, hücreden hücreye intikal olmayan hücre otonom toksisite bazı yönlerinin analizi için özel olarak uygundur. sağlayan floresan izleme hayvanların şeffaflık hayatın her aşamasında canlı organizma içinde proteinlerin etiketledi. Bu yararlanan, hücreler ve bir floresan mikroskop kullanılarak dokuların arasında prion-benzeri proteinlerin hareketi görüntülenmiştir. Bir 63X veya 100X / 1.4NA yağı hedefi veziküler yapılar çözmek için gereklidir. Önemli olarak, prion etki, bu muhtemelen asidik veziküller 40 içinde floresan görünür kalması için, MRFP ile etiketlenmiş gerekir. Genellikle, bir etiket olarak kullanılan sarı floresan proteini (YFP), idüşük bir pH ortamında 40,55 söndürülür için uygun değildir. Tek başına TTT etiketi (Şekil 1 A ve B), çözünür kalırken gerilme AM815, TTT-etiketli R2E2 boru şekilli veziküller birikir (prion etki NM yüksek topaklaşma eğilimi ve toksik formu) ifade eder. In vivo time-lapse görüntüleme kullanarak, bu boru şeklindeki veziküller içinde ve hücreler 40 (Şekil 1C ve D, Video 1 ve 2) Video [yer bağlantıları arasında taşınan olduğu görülmektedir olabilir 1 ve 2 burada].

Katlanır sensörleri ve stres gazetecilere kullanma proteostasis ve toksisite hücre özerk olmayan hücre özerk etkilerini araştırmak için

Prionlar tohum ile ilgili proteinleri çapraz ve hücresel protein katlanması ortamını bozmaya edebiliyoruz. Bu uygun katlama Senso birlikte ekspresyonuna yoluyla ortaya çıkabilmektedirrs. Katlanır sensörler doğru katlayın işlevsel bir proteostasis ağında bağlı olmayan temel metastabl proteinlerdir. Bazı örnekler, iyi bilinen ateşböceği lusiferazı ve sıcaklığa duyarlı (ts) mutasyonlar 56-66 barındıran proteinlerdir. Proteostasis bir bozulma agrega görsel inceleme ile veya izin sıcaklıklarda ilgili ts mutant fenotipinin maruz ile tespit edilebilir haberci, hatalı katlanması yol açar. Onlar yaşa bağlı toplanmasını 67-69 sergilerler çünkü toplama (yaklaşık 40 artıkları) eşiğinde bir uzunluğa sahip poliglutamin (polyQ) bölümleri ayrıca sık sık kullanılır. Toplama önceki başlangıçlı bir tehlikeye katlama ortamı ortaya koymaktadır. Burada, biz C. ifade edildiğinde çözünür kalan bir prion mutant RΔ2-5 istihdam elegans vücut duvarı kası (BWM) hücreleri ve bağırsak 40 (Şekil 2A ve C). BWM hücrelerinde R2E2 ile aynı anda sentezlenmesi üzerine, RΔ2-5 ReaProtein katlama ortamına R2E2 hücrenin otonom bir etki ortaya Dily agrega (Şekil 2B). proteostasis ve dokular arasında yanlış katlanma indüksiyonu ile ilgili yaygın etkisi prion alanının yüksek agregasyon eğilimli şeklinde ifade etmez farklı dokuda katlama sensörünün ifadesi ile değerlendirilebilir. RΔ2-5 bir bağırsak spesifik promotörünün (VHA-6p) altında ifade edilmiştir, oysa R2E2 bir BWM hücre spesifik promotörünün (miyo-3p) altında ifade edildi. Bağırsak RΔ2-5 agregasyonu R2E2 olmayan bir hücre otonom bir şekilde 40 (Şekil 2B), protein katlanmasına etkilediğini göstermektedir. Bunun yerine agrega sadece yüksek çözünürlükte tespit edilebilir RΔ2-5, kullanarak, polyQ44 kullanımı bağırsak ifade (Q44i) bir stereomikroskop (Şekil 2E ve F) altında düşük çözünürlükte agrega görselleştirme sağlar. Bundan başka, bu anima bir miktarının sağlaragrega ile mi, hem de agrega sayısının bir ölçümü.

Prion etki olmayan hücre özerk toksisite araştırmak için, daha önce elektron mikroskobu ile R2E2 ifade etmeyen dokuları komşu incelenmiş ve böyle kas hücrelerinde prion etki o ifade komşu dokularda mitokondriyal bütünlüğü olmayan bir hücre özerk bozulmasına yol açar bulundu bağırsak 40 olarak. Artan reaktif oksijen türleri (ROS) üretim ve oksidatif stres Mitokondriyal disfonksiyon sonuçları. Oksidatif stres yanıtının uyarılmasını görselleştirmek için bir noninvaziv yolu oksidatif stres uyarılabilir muhabiri 70 kullanmaktır. soy CF1553 oksidatif stresle uyarılabilir promotör sod-3, 70 altında yeşil floresan protein (GFP) ifade eder. BWM hücreleri prion etki R2E2 ifade hayvanlara geçtiklerinde, raportör grubunun (bir çok olmayan BWM dokularda olduğu gibi BWM hücrelerinde yukarı regüle edilmiştir Tablo 1 C'lik bir listesini sağlar elegans benzer kullanılabilir katlama sensörleri ve stres gazetecilere ifade suşları.

C prion kaynaklı toksisitenin önlenmesi için genom ekran elegans

Prion etki kompleks toksisite fenotipi C olarak belirtilmiştir elegans için in vitro bir model prion 71 çoğunda görülen fark toksisite olmaması ilginçtir. Bu model Metazoan'da içinde prionlara ile ilişkili toksisite etkileyebilecek yeni yollar ortaya olabilir. Bu adres için, biz RNAi tükenmiş zaman, R2E2 transgenik hayvanların motilite defekti artıracak, genler için gösterildi. Kontrol ile işlenmiş WT solucanlar pozitif ortak olarak kullanılabilirntrol, ancak çoğu aday genler nedeniyle değişken RNAi penetransı ve transgen yüksek toksisitesi, tam bir hareket fenotip kurtarma vermeyecektir. hayvanlar yetişkinlik gün 2 ilk larva devlet L1, RNAi ile 4 gün boyunca tedavi edildi. O zamana kadar, tedavi edilmemiş R2E2 hayvanların dayak biz motilite bir iyileşme için tarama çünkü önemli olan WT hayvanların dayak, önemli ölçüde daha yavaştır. F1 soyu (~ L1S) mevcut olabilir, ama P0 nesil ayırt etmek kolaydır olacaktır. Sadece P0 nesil atılırsa. Bu ilk taramayla nicel ve görsel olmayan ve bu nedenle, düşük bir eşik prion ifade hayvanların dayak artmış gibi her bakteri RNAi klon kantitatif tarama deneyinde yeniden test edildi, bunun anlamı, ön isabet tespit etmek için kullanıldı. 4 özetlenmektedir Şekil Ekran kurulum ana adımlar. Falcon 4M60 kamera yüksek çözünürlüklü bir quar görsel tarama etkinEkran daha verimli tamamlanması için izin verilen bir bilgisayar ekranında, bir defada plaka ter. Faydalı olsa da, bu durum zorunlu değildir. solucan dayak görsel muayenesi de düşük büyütme (10X) bir Stereoskop kullanılarak yapılabilir.

Ön ekran hit Onay

Yüksek verim ekranlar analiz genom etkiler tamamlayıcı yöntemlerle rafine edilebilir aday genlerin birincil listesini elde etmek için izin veren bir yaklaşım olarak yapılmaktadır. Ekran sonuçlarının Doğrulama RNAi başına sadece bir deney numune ile bir ekran performans doğabilecek olası yanlış pozitif, ortadan kaldırmak için elzemdir. R2E2 transgenik hayvanlar birincil hit RNAi klonları ile beslenen ve motilite bir ölçülebilir okuma olarak, yetişkinlik ikinci gününde NGM plakalar üzerinde kendi hız ölçülür ve toksisite azalmıştır. Bu geliştirilen ImageJ için wrMTrck eklentisi kullanılır edendoğru C tanımlayan laboratuvar, videoları elegans ve onların hareketlerini takip eder. wrMTrck eklentisi ve otomatik analizi için komut açık kaynak ve nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı talimatlar ile birlikte, http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html kamuya mevcuttur. Indirdikten sonra, ImageJ Eklentiler klasörüne tüm wrMTrck klasörünü kopyalayın. Bu protokol, bir seferde videoları çok sayıda analiz için tercih wrMTrck_Batch yöntemi, açıklar, ama film bir kitabı, film için talimatlar, analiz de eklenti yükleme mevcuttur. WrMTrck_Batch arka plan çıkarma ile bir ikili biçime orijinal video (Şekil 5A) dönüştürür ve her solucan bir parça atanır. Işlenmiş videoların her biri daha sonra elle yanlış olarak solucanlar (e. G., Pist 1 Şekil 5B) tespit edilmiştir herhangi eserler ortadan kaldırmak amacıyla, üst üste bu parçaları ile görülebilir. Önceki Teknik ortadan kaldırmak için etkili bir yolu, (Şekil 5B bir ok ile gösterilen) ifacts dikkatle tespit edilmesi nesnelerin minimum ve maksimum boyutu (Şekil 5C) seçmektir. WrMTrck eklentisi farklı çıkışları, biz böylece potansiyel farklılıkların normalleştirilmesi her nesnenin vücut uzunluğuna bölünmesiyle her parçanın uzunluğu ile temsil edilen her hayvanın ortalama hız ölçer (BLPS) parametresi, saniyede vücut uzunlukları kullanın nematod (Şekil 5D) büyüklüğünde. Bu yöntemi kullanarak, R2E2 C ifade motilite fenotip artan prion bağlı zehirlilik (sopt) 35 bastırıcıları tespit elegans en az% 133 ve boş vektör tedavi solucanlar (Şekil 6) göre 256 kadar%. Bu sopt genler son yüksek kapasiteli tarama çabaları sonucu hit doğruladı temsil eder.

21fig1highres.jpg "/>
Prion etki 1. Şekil C'de hücre ve dokular arasında yayılır veziküler taşıma ile elegans. (A) (B). Vücut duvarı kas RFP ifade nematod (BWM) hücreleri (RFPm) konfokal z-yığınları Çöktü son derece zehirli ve toplama eğilimli NM varyantı, R2E2 ifade nematod konfokal z-yığınları Çöktü , BWM hücrelerinde (R2E2m). Oklar tübüler veziküller gösterir, ok ucu agrega gösterir. (C + D) hayvanların Time-lapse serisi ifade RFPm (C) ve R2E2m (D). Oklar veziküler hareketin alanları gösterir. RFPm çoğunlukla yaygın boyanma arzetmektedir. RFPm veziküller bulunan bile, bu zorlukla hareket. R2E2m hücreler içinde ve arasında taşınan çok sayıda veziküller lokalize eder. Ölçek çubukları: 10 mikron. İlişikteki Videolar 1 ve 2 [burada Video 1 ve 2 yer bağlantılar], Şekil 1C ve D karşılıksırasıyla.

Şekil 2,
Şekil 2. Katlama sensörleri proteostasis üzerindeki prion etki yaygın etkisini ortaya koymaktadır. R2E2m (A + B) Koekspresyon RΔ2-5m toplanmasını teşvik eder. BWM hücrelerinde R2E2m ile birlikte eksprese olur (A) 'RΔ2-5m kontrol ve (B) RΔ2-5m Konfokal görüntüler. (C + D), kas R2E2m bağırsak RΔ2-5i toplanmasını teşvik eder olarak ifade edilmiştir. RΔ2- ifade kontrol hayvan (C) Konfokal görseli Bağırsak hücrelerinde 5i. (D) bağırsakta BWM hücreleri ve RΔ2-5i içinde R2E2m ifade hayvanların Konfokal görüntüsü. Ölçek çubukları: 10 um (E + F) R2E2m Q44i olmayan hücre otonom toplanmasını indükler (E) Q44i ve Q44i temsil floresan görüntüler, R2E2m hayvanlar 4 gün senkronize L1 LAR aktarıldıktan sonra..VAE taze OP50 numaralı seribaşı NGM plakalar üzerine. BWM hücrelerinde R2E2 sentezlenmesi bağırsakta Q44i toplanmasının daha önceki bir başlangıç ​​yol açar. (% olarak) agrega ile hayvanların (F) miktar tayini belirtilen günlerde senkronizasyon sonra. Hata çubukları SD temsil Bu rakam, 40 modifiye edilmiştir.

Şekil 3,
Şekil 3. çim-3p :: GFP transkripsiyonel stres muhabiri prion etki oksidatif stresin hücre özerk olmayan hücre özerk indüksiyon neden olduğunu ortaya koymaktadır. (A + B) Temsilcisi floresan çim-3p ve (aynı pozlama süresini kullanarak) görüntüleri :: GFP ifade kontrol hayvanları (A) ve çim-3p :: GFP;. Yetişkinlik gün 2 R2E2m hayvanlar (B) (C) BWM hücrelerinde R2E2 sentezlenmesi raportör bir endüksiyon BWM hücresinde sadece yol açaraynı zamanda bağırsak (ll), sinir kablosu s (I) 'e (III)' ün, farenks ve baş nöronlar (IV) '.

Şekil 5,
ImageJ için wrMTrck eklentisi ile solucan hareket Şekil 5. analizi. (A) bir defada birkaç hayvan izlemek için uygun bir büyütme (~ 10X) kullanılarak üretilen bir giriş filmi örneği. (B) "* _labels.tif" dosyaları wrMTrck_Batch bir çıkış ve analiz sonuçlarının manüel kürasyonunda için izin verir. Ok, bu protokol için kullanılan parametreleri gösteren. Ödenmesi gereken minimum ve maksimum boyut parametreleri uygun bir seçim doğru analiz dışında bir nesne gösterir wrMTrck_Batch (C) Giriş penceresi. Bu parametreler, bireysel mikroskop ve film ayarlara göre ayarlanması gerekir. MOVEME (D) Çıktı sonuçlarıBLPS kolonu ile (B) nt analizi, sarı vurgulanır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 1,
Prion uyarımlı toksisite (sopt) olarak bastırıcılar olan RNAi klonları ile muamele Şekil 6. R2E2 solucanlar geliştirilmiş hareketliliğini göstermektedir. Motilite göreli BLPS olarak gösterilmiştir negatif kontrol (boş vektör) ile karşılaştırıldığında arttırılmıştır. HTP ekranında tanımlanan tüm istatistiksel olarak anlamlı (Student t-testi) RNAi klonları gösterilmiştir. Siyah yıldız Şekil 5'te örnek olarak gösterilen hit temsil eder. Sonuçlar koşulu başına 17 <n <53 parça ile, 3 filmlerde vardır. Hata çubukları SEM temsil eder. </ P>

Tablo 1. C elegans katlanır sensörleri ve stres gazetecilere ifade suşları.

Gerilme adı genotip Yorumlar Gerilme kaynağı
Katlanır sensörler
transgenlerin
AM140 unc-54p :: polyQ35 :: YFP kas özel polyQ35 sentezlenmesi, yaşa bağlı agregasyonu CGC veya Morimoto laboratuar
AM141 unc-54p :: polyQ40 :: YFP polyQ40, ag'nin kas-spesifik ifadesiE bağımlı toplama CGC veya Morimoto laboratuar
AM801 unc-54p :: RΔ2-5 :: YFP çekirdeklenme beceriksiz prion etki kas-spesifik ifadesi Morimoto laboratuvar
OG412 VHA-6p :: polyQ44 YFP :: bağırsak özgü polyQ44 ifadesi, yaşa bağlı toplama CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: GFP; miyo-2p :: MCherry çekirdeklenme beceriksiz prion etki bağırsak özgü ifade Morimoto laboratuvar
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: cfp polyQ40 bir nörona özgü sentezleme, hücre tipi özel toplanma Morimoto laboratuvar
AM982 unc54p :: lusiferaz :: YFP WT ateşböceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Morimoto laboratuvar myo-3p :: lusiferaz :: GFP; rol-6 WT ateşböceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Behl laboratuvar
SNG-1p :: lusiferaz :: GFP; rol-6 WT ateşböceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Behl laboratuvar
FUH55 unc54p :: Fluc :: EGFP; rol-6 WT ateşböceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Hartl laboratuvar
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 R188Q mutant ateş böceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Hartl laboratuvar
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 R188Q + R261Q çift mutant ateş böceği lusiferaz kasa özgü sentezleme Hartl laboratuvar
FUH48 F25B3.3p :: Fluc :: EGFP; rol-6 WT ateşböceği Lucifera bir nörona özgü sentezlemese Hartl laboratuvar
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol-6 R188Q mutant ateş böceği lusiferaz nörona özgü sentezleme Hartl laboratuvar
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol-6 R188Q + R261Q çift mutant ateş böceği lusiferaz nörona özgü sentezleme Hartl laboratuvar
ts mutantlar
CB1402 unc-15 (e1402) I Paramiyozinler (ts), ısıya duyarlı UNC-felç, Let CGC
CB1157 unc-54 (e1157) I Miyozin (ts), ısıya duyarlı UNC CGC
CB1301 unc-54 (e1301) I Miyozin (ts), ısıya duyarlı UNC CGC
CB286 unc-45 (e286) III UNC-45 (ts), ısıya duyarlı, yavaş hareket eden UNC, Egl CGC
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlekan (ts), ısıya duyarlı UNC, sert felç CGC
SD551 let-60 (ga89) IV Ras (ts), ısıya duyarlı MuV, Ste, Lva, OSM Let CGC
CX51 din-1 (ky51) X, Dynamin (ts), sıcaklığa duyarlı UNC CGC
CW152 Gaz-1 (fc21) X, Gaz 1 (ts), sıcaklığa duyarlı EtOH hassasiyeti CGC
ZZ26 unc-63 (x26) I Asetilkolin reseptörü (ts), sıcaklığa duyarlı Levamizol direnci CGC
Stres gazetecilere
CL2070 HSP-16.2p :: GFp; rol-6 Termal stres; UPR cyto CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP Termal stres; UPR cyto CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; Cbr-unc-119 (+) Termal stres; UPR cyto CGC
AM446 hsp70p :: GFP, rol-6 Termal stres; UPR cyto Morimoto laboratuvar
AM722 hsp70p :: mCherry; miyo-2p :: CFP Termal stres; UPR cyto Morimoto laboratuvar
AM799 hsp90p :: GFP Termal stres; UPR cyto Morimoto laboratuvar
OG497 HSF-1p :: hsf-1 :: gfp; Cbr-unc-119 (+) Termal stres; UPR cyto CGC
CF1553 çim-3p :: GFP, rol-6 oksidatif stres CGC
KN259 çim-3p :: GFP, rol-6 oksidatif stres CGC
CL2166 gst-4p :: GFP :: nls oksidatif stres CGC
LD1171 gcs-1p :: GFP, rol-6 oksidatif stres CGC
LD1 skn-1p :: skn-1 :: GFP, rol-6 oksidatif stres CGC
IG274 NLP-29P :: GFP ozmotik stres CGC
BC20309 mtl-1p :: GFP metal stresi Baillie laboratuvar
BC20342 mtl-2p :: GFP Metal stress Baillie laboratuvar
BC20314 ELT-2p :: GFP metal stresi Baillie laboratuvar
SJ4005 hsp-4p :: GFP EPD ER CGC
SJ4100 hsp-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 HSP-60 p ​​:: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetik Merkezi; ts = sıcaklığa duyarlı; UPR = katlanmamış protein yanıtı; cyto Sitozolik =; mito mitokondriyal =; ER = endoplazmik retikulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada tarif edilen yöntemler yayılan göstermek için yardımcı ve prion-benzeri proteinler kompleks hücre otonom olmayan hücre otonom toksisitesi. Son zamanlarda, bir agregasyon eğilimli sitosolik prion alan bir Otofaji ilgili süreç içinde membran-sınırlayıcı kabarcıklar içine alınmış olduğunu keşfettik. Bu vesikül spesifik bir alt kümesi içindeki hücre ve doku 40 ile prion etki taşır. canlı bir hayvanda hareketlerini izlemek için anahtar proteinin, sadece MRFP-etiketli proteinler, bu muhtemelen asidik veziküllerinde görünür, çünkü MRFP ile etiketlenmesi olmasıdır. Aynı yaklaşım kullanılarak, şu anda bu tür (ALS bağlantılı), süperoksit dismutaz 1 (SOD1), (PD bağlantılı), alfa-sinüklein veya katran DNA-bağlama proteini olarak, belirli bir hastalık ile ilişkili proteinlerin, potansiyel prion-benzeri davranış soruşturma (ALS bağlı) 43 (TDP-43). Keseler içinde bu hücre içi ulaşım birçok başka protein tarafından kullanılan gibi görünse de, bir olabiliryayılma izin İ LAVE F yollar.

iyi karakterize katlama sensörlerin kullanılması C çevre katlama hücresel protein üzerindeki etkilerini izlemek için güçlü bir araçtır elegans 63-66. Burada görsel olarak aynı anda farklı dokuların katlama kapasitesini izlemek için dokuya spesifik promotörler altında ifade floresan yaşa bağlı birikimini nasıl kullanılacağını çekiş eğilimli etiketli proteinlerin göstermiştir. Organizma proteostasis ağ çalışma Diğer olasılıklar, endojen ts mutant proteinlerin kullanımını içerir. Bu yarı dengeli proteinler izin veren bir sıcaklıkta (15 ° C) normal olarak, fakat misfold ve karakteristik değişken fenotipi arzeden, kısıtlayıcı sıcaklığında (25 ° C) işlevsiz hale gelecektir. Bir toplama eğilimli proteinin varlığında veya yaşlanma sırasında, mutant fenotip bile hoşgörülü koşullarda 63-66 maruz alır ts. Bu ts mutantların bazıları o ifade edilmiştirHücre otonom olmayan hücre otonom proteotoxic etkilerini test etmek için, bu özellikle faydalı bir hale getirir, dokular veya sergi dokuya özel fenotiplerin bir alt nLy. Örneğin, bir ts mutant LET-60, GTP-bağlayıcı RAS protoonkojenden ailesinin bir üyesi, Ras (ts), yayg ifade, ancak doku-spesifik mutant fenotip 63,66 gösterir. Bu kullanarak mutant ts tarafından, hücresel proteostasis üzerindeki polyQ açılımları etkisi hücresi 63 özerk olduğu gösterilmiştir. Ras (ts) 'deki genetik arka polyQ sentezlenmesi proteini ifade edildiği dokuya spesifik sadece değişken fenotipi ortaya koymuştur. Birden fazla mutant fenotip maruz bir protein dışı hücre özerk proteotoxic etkileri olduğunu işaret eder.

Ayrıca, hücresel stres yollar üzerindeki etkileri test etmek için, C in vivo floresan stres gazetecilere büyük bir seçim var elegans 72. Bunlar, genellikle transkripsiyon olantermal ya da oksidatif stresin, sırasıyla 72 rapor bu HSP-16.2p veya çimen-3p bir stres-uyarımlı promotörün kontrolü altında, yeşil floresan proteini (GFP) ifade ark muhabir. Prion-benzeri proteinler ile kombinasyon halinde uygun bir haberci kullanılarak olarak, bir karşılık gelen transgen ifade dışındaki dokularda strese karşı verilen cevapların bir potansiyel indüksiyonu izleyebilir. Bir ihtar, ancak, bu stres gazetecilere sık sık belirli bir yolun (yayınlanmamış gözlemler) ince yükselişini ortaya çıkarmak için yeterince duyarlı olmaması.

Non-hücreli özerk toksisite etkileyen yayılan protein etkileyen genler, aşağı çaldı, hareket kusurları düzeltmek istiyorum genler için tarama tarafından başlatılan olsun bizim arayış incelemek için. Bir okuma-out gibi yüzme oranlarının görsel değerlendirme kullanarak, biz rahat tahlil başardık ~ 25 seans başına plakaları ve tamamlanması sonucunda, haftada bu protokolün iki tur gerçekleştirmek6 hafta içinde ilk ekran. köprücükler solucan hareket kantitatif analizi ile isabet onay, üçlü olarak kullanılarak wrMTrck ek olarak 3 hafta sonra gerçekleştirilmiştir. Bir ihtar, ancak, bir okuma-out gibi sıvı ortamda plakalar yerine yüzme emekleme kullanarak bir yüzme gibi, bazı aday genler kaybedebilirsiniz ve tarama aynı hareketler değildir ve farklı yollar 73 etkilendiği olmasıdır. Bir aday gen bir katı madde tabakalarına tespit edilemiyorsa nedenle, eğer bu yüzme belirli bir süre içinde harman frekansı sayılarak tayin edilebilir sıvı ortam içinde yeniden test edilmelidir.

Burada anlatılan tarama protokolü büyük ölçüde değişkenlik azaltır sıvı taşıma iş istasyonları, otomatik kullanır. Dezavantajı robotların rezervuar sıvıların aşırı her zaman mümkün olmayabilir olan gerekli olmasıdır. Bu tarama ayarları kolayca C diğer ekranlar için adapte edilebilir elegans <Yapılacak şekilde / em> salt out.This ekran gibi kullanan dayak, doğrudan geniş ekranlar tasarım basit olmalıdır genom olarak, prion etki yayılması veya olmayan hücre özerk toksisite etkileyen genleri tanımlamak için tasarlanmış değildi zamanında. Motilite kusurları kas ile ilgili fakat aynı zamanda nöronal hasar ve diğer gen kusurlar 53 arasında bir sayı, sadece kaynaklı olabilir. Böylece, bu okuma kullanarak, biz kas-spesifik toksisite sadece değiştiriciler bulabilirsiniz. Şu anda yayılan ve olmayan hücre özerk toksisite, yukarıda tarif edilen yöntemler kullanılarak prion etki üzerindeki etkileri için aday genler test ediyoruz. Bu deneyler sonunda bulunan protein unsurlarının yayılma transsellüler doğrudan diğer dokularda ya da hücre-hücre iletim ve olmayan hücre otonom toksisite bağlanmamış olması durumunda gözlemlenen toksisite ile bağlantılı olmadığını ortaya koyacaktır.

Birlikte ele alındığında, tarif edilen yöntemler potansiyel pr incelemek için kullanılabilirC. kullanarak hücresel ve organizma düzeyinde proteinlerin iyon-benzeri davranış elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics