Metazoan मॉडल जीव का प्रयोग फैल और विषाक्तता prion-तरह प्रोटीन की जांच कर

Biology

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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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Abstract

Introduction

अल्जाइमर रोग (ई), पार्किंसंस रोग (पीडी), पार्श्व काठिन्य (ए एल एस), और संक्रामक Spongiform encephalopathies (TSEs) सहित कई neurodegenerative रोगों, एकत्रीकरण की आशंका वाले प्रोटीन के साथ जुड़े रहे हैं और इसलिए सामूहिक रूप से प्रोटीन misfolding विकारों (PMDs के रूप में जाना जाता है )। वे दोनों मनुष्यों और पशुओं के एक में संक्रामक हो सकता है कि में TSEs या prion रोगों PMDs की एक अद्वितीय वर्ग का गठन। आणविक स्तर पर, prions की भर्ती और रोग β-शीट-अमीर पीआरपी एस सी रचना 2,3 में मोनोमेरिक α-कुण्डल युक्त मेजबान इनकोडिंग सेलुलर पीआरपी (पीआरपी सी) में कनवर्ट करके पेश करता है। आत्म प्रचार प्रोटीन समुच्चय भी स्तनधारी prions 4,5 के साथ महत्वपूर्ण विशेषताओं का हिस्सा है, जो कवक, में पहचान की गई है। इसके अतिरिक्त, स्तनधारी prions सेल के लिए सेल से चलती करने में सक्षम हैं और भोले कोशिकाओं 6,7 संक्रमित।

PMDs अन्य संगठनों जबकिएर TSEs संक्रामक नहीं कर रहे हैं, की तुलना में वे prion रोगों 8,9 के साथ एक आम रोगजनक सिद्धांत को साझा करें। PMDs में से प्रत्येक से जुड़ा हुआ प्रोटीन संरचना या समारोह में संबंधित नहीं कर रहे हैं, वे एक crystallization-तरह की प्रक्रिया के माध्यम से सभी फार्म समुच्चय एकल कहा जाता है या polymerization के वरीयता प्राप्त; इसके अलावा प्रोटीन बीज उनके घुलनशील isoforms 2,10,11 भर्ती से बढ़ता है। आत्म-प्रचार करने के लिए दक्षता एक साथ इस तरह के आणविक संरक्षिकाओं के रूप में अतिरिक्त सेलुलर कारकों के साथ अंततः कुल न्यूक्लिएशन, बोने, विखंडन और 12-15 के प्रसार की दरों का निर्धारण, जो प्रोटीन का आंतरिक गुणों पर निर्भर करता है, विवो में बदलता है। इसलिए, प्रोटीन एकत्रीकरण के कुशल प्रचार की अनुमति देता है कि इन कारकों के बीच एक अच्छा संतुलन वहां मौजूद होना चाहिए। केवल कुछ amyloidogenic समुच्चय एक prion की विशेषताओं बंदरगाह, और इस तरह नहीं सभी PMDs संक्रामक क्यों कर रहे हैं यह भी समझा सकता है। Prions 'शीर्ष कलाकारों ओ' का प्रतिनिधित्व करने लगते हैंउन्हें PMDs 8,13 अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना देता है जो स्वयं नकल प्रोटीन समुच्चय के एफए व्यापक स्पेक्ट्रम,।

दिलचस्प, रोग संबंधी समुच्चय के साथ जुड़े विषाक्तता अक्सर एक गैर सेल स्वायत्त घटक 16,17 है। यह है कि वे केवल कोशिकाओं जीन प्रदर्शनी विशिष्ट फेनोटाइप व्यक्त तात्पर्य है कि जो एक सख्ती सेल स्वायत्त प्रभाव, के विपरीत, इसी जीन व्यक्त नहीं करते कि पड़ोसी कोशिकाओं को प्रभावित है कि इसका मतलब है। इस compellingly ऊतक विशेष अभिव्यक्ति द्वारा प्रदर्शन या neurodegenerative रोगों 18-26 के कई मॉडल में संबंधित प्रोटीन के नीचे दस्तक गया था। विभिन्न तंत्रों कम पोषक तत्वों की आपूर्ति, न्यूरोनल संकेतन में असंतुलन, ग्लूटामेट excitotoxicity, और neuroinflammation 16,27,28 सहित PMDs में इस गैर-सेल स्वायत्त विषाक्तता, के लिए एक आधार के रूप में सुझाव दिया गया है। इसके अलावा, कोशिकाओं के बीच इस बीमारी से जुड़े समुच्चय के एक prion आंदोलन की तरह mighटी इस पहलू 29,30 करने के लिए योगदान करते हैं। बढ़ती सबूत prions के अलावा अन्य प्रोटीन समावेशन विशेषता कई PMDs 30-36 में मनाया विकृति विज्ञान के प्रसार को समझा जा सकता है, जो सेल के लिए सेल से संचारित कर सकते हैं कि पता चलता है। हालांकि, यह अभी तक रोग प्रोटीन की कहनेवाला आंदोलन और पड़ोसी कोशिकाओं पर विषाक्त प्रभाव के बीच एक स्पष्ट कारण लिंक है कि क्या वहाँ निर्धारित किया गया है। इसलिए, सेल करने वाली सेल ट्रांसमिशन और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता आबाद कि सेलुलर रास्ते में से एक बेहतर समझ उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास के लिए आवश्यक है और आवश्यक है। हालांकि, मेटाजोअन में misfolded प्रोटीन की सेल करने वाली कोशिका संचरण को प्रभावित है कि प्रसार और सेलुलर कारकों prion-तरह के कई पहलुओं को अच्छी तरह से जीवधारी के स्तर पर विशेष रूप से, समझ नहीं रहे हैं।

Caenorhabditis एलिगेंस निमेटोड क्षमता के लिए प्रदान करते हैं कि कई फायदे हैं prion तरह SPREADI के नए पहलुओं की खोजमेटाजोअन 17 में एनजी। यह vivo में रहने वाले जीव में की fluorescently टैग प्रोटीन पर नज़र रखने के लिए अनुमति देता है, पारदर्शी है। इसके अलावा, इस बीमारी से प्रभावित कई सेलुलर और शारीरिक प्रक्रियाओं मानव को कीड़े से संरक्षित हैं, और सी कर रहे हैं एलिगेंस भी आनुवंशिक जोड़तोड़ और आणविक और जैव रासायनिक विश्लेषण 37-39 की एक विस्तृत विविधता के लिए उत्तरदायी है। वास्तव में 959 दैहिक कोशिकाओं को अभी भी मांसपेशी, न्यूरॉन्स और आंत सहित कई विशिष्ट प्रकार के ऊतकों की है कि एक साधारण शरीर योजना के साथ वयस्क द्विलिंग बनाते हैं।

सी में एक नया prion मॉडल स्थापित करने के लिए एलिगेंस, हम कीड़े 4,40 में कोई ज्ञात अंतर्जात prion प्रोटीन के बाद से वहाँ exogenously, अच्छी तरह से विशेषता glutamine / asparagine (क्यू / एन) साइटोसोलिक खमीर prion प्रोटीन Sup35 के अमीर prion डोमेन समुद्री मील दूर व्यक्त करने के लिए चुना है। खमीर prions prion प्रतिकृति 41-44 के बुनियादी तंत्र elucidating में अमूल्य किया गया है। इसके अलावा, समुद्री मील दूर देवदार हैस्तनधारी सेल संस्कृति 45,46 में एक prion का पूरा जीवन चक्र पुनरावृत्ति दिखाया गया है कि सेंट साइटोसोलिक prion की तरह प्रोटीन। इसी तरह, सी में व्यक्त जब एलिगेंस, माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता और की उपस्थिति के विघटन सहित 40। समुद्री मील दूर एकत्रीकरण एक गहरा विषाक्त phenotype के साथ जुड़े थे खमीर कोशिकाओं और prion जीव विज्ञान के प्रदर्शित प्रमुख विशेषताओं की तुलना metazoan कोशिकाओं में प्रचार के लिए विभिन्न आवश्यकताओं के लिए उल्लेखनीय अच्छी तरह से अपनाया Sup35 prion डोमेन सेलुलर स्तर पर विभिन्न भोजी संबंधित पुटिकाओं, साथ ही भ्रूण और लार्वा गिरफ्तारी, विकास में देरी, और जीवधारी स्तर पर प्रोटीन तह पर्यावरण के एक बड़े पैमाने पर अशांति। Strikingly, prion डोमेन transgene व्यक्त नहीं किया गया था, जिसमें पड़ोसी ऊतकों को प्रभावित करने, सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता दर्शाती है। इसके अलावा, के भीतर और कोशिकाओं के बीच prion डोमेन के vesicular परिवहन वास्तविक समय निगरानी रखी जाती है <उन्हें> विवो 40 में।

यहाँ हम सी में prion की तरह प्रचार-प्रसार की जांच करने के लिए कैसे का वर्णन एलिगेंस। हम समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग prion डोमेन युक्त vesicles के intra- और कहनेवाला परिवहन पर नजर रखने के लिए समझाना होगा। हम ऊतक विशेष तह सेंसर का उपयोग पर जोर देना और सर्वत्र सेलुलर फिटनेस पर सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए तनाव संवाददाताओं व्यक्त करेंगे। अंत में, हम prion प्रेरित विषाक्तता के नए संशोधक की पहचान करने के लिए एक हाल ही में प्रदर्शन किया जीनोम चौड़ा शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) स्क्रीन की प्रक्रिया का वर्णन करेंगे। संयोजन में, इन तरीकों में प्रोटीन की कहनेवाला आंदोलन और उनके गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता में शामिल आनुवंशिक रास्ते अलग तंग करने के लिए कर सकते हैं।

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Protocol

1. निगरानी Transcellular में vivo इमेजिंग समय चूक द्वारा prion-तरह प्रोटीन का प्रसार

नोट: सी बढ़ो मानक तरीकों के लिए और ध्यान से खेती तापमान 47 को नियंत्रित अनुसार एलिगेंस जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) (एन 2) और ट्रांसजेनिक लाइनों।

  1. सी के ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न एलिगेंस मोनोमेरिक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mRFP) के साथ टैग prion की तरह प्रोटीन, व्यक्त। Microinjection के 48 उपयोग करने के लिए दर्शाता है कि यह वीडियो देखें। इन extrachromosomal लाइनों को एकीकृत करने का वर्णन कैसे आगे के विवरण और तरीकों के लिए, 49 को देखते हैं।
  2. अंडा मानक तरीकों 50 के अनुसार बिछाने या ब्लीचिंग द्वारा सिंक्रनाइज़ आबादी तैयार करें।
    1. अंडा बिछाने से तुल्यकालन
      1. स्थानांतरण 10-20 gravid एक थाली पर वयस्कों और उन्हें 1 के लिए अंडे देते हैं - 2 घंटे। थाली से वयस्कों निकालें और संतान वांछित उम्र तक हो जाना।
    2. <विरंजन द्वारा ली> तुल्यकालन
      1. Gravid वयस्कों के एक अनसिंक्रनाइज़्ड आबादी लीजिए और क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान (250 मिमी NaOH और 1: एच 2 ओ में वाणिज्यिक ब्लीच की 4 (वी / वी) के कमजोर पड़ने) के साथ उन्हें ब्लीच। 2 हे 7H, 22 mMKH 2 पीओ 4, 86 mMNaCl, एक mMMgSO 4 · 7H 2 हे, एक करने के लिए DH 2 ओ को जोड़ M9 बफर 47 (21 mMNa दो HPO 4 · के साथ दो बार (218 XG मिनट के लिए 1) अंडे धो एल)।
      2. उन्हें 20 डिग्री सेल्सियस पर / कोमल आंदोलन हे के साथ M9 बफर में एन हैच करने की अनुमति दें। इल्ली विकास एक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या छोड़ रहा है, एक खाद्य स्रोत के अभाव में एल 1 चरण में गिरफ्तार करेगी। OP50 के साथ वरीयता प्राप्त ताजा निमेटोड विकास मीडिया (एन जी एम) प्लेटों पर L1s स्थानांतरण कोलाई बैक्टीरिया और संतान वांछित 47 साल की उम्र तक विकसित करते हैं।
  3. 50 के रूप में वर्णित एक खुर्दबीन स्लाइड पर (एच में 2 हे) 2% agarose पैड तैयार करें।
    1. दो मील तैयार करेंअपनी पूरी लंबाई के ऊपर रखा लेबलिंग टेप के साथ croscope स्लाइड spacers के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा। उन दोनों के बीच एक तिहाई खुर्दबीन स्लाइड रखें।
    2. साफ स्लाइड पर एच 2 ओ में 2% agarose और पिपेट एक बूंद भंग।
    3. अगर बूंद के शीर्ष पर तीन अन्य स्लाइड सीधा करने के लिए एक चौथी स्लाइड रखें। धीरे लेबलिंग टेप के रूप में एक ही मोटाई के पैड समतल करने के लिए इसे नीचे दबाएँ।
    4. Spacers के हटाने और धीरे अलावा स्लाइड खींच से पहले एक मिनट के लिए इसे सूखा। अगर पैड उनमें से एक के लिए छड़ी होगी।
  4. पिपेट ~ 10 μl संवेदनाहारी पैड और हस्तांतरण करने के लिए (2 मिमी levamisole M9 बफर में) ~ एक प्लैटिनम तार पिकअप का उपयोग कर 10 जानवरों। एक कवर पर्ची (~ 22 x 22 मिमी) के साथ कवर और 1 घंटे के भीतर छवियों को ले।
  5. वैकल्पिक रूप से, समय की एक लंबी अवधि से अधिक फिल्मों का अधिग्रहण करने या आगे, जानवरों के किसी भी आंदोलन की संभावना को कम संवेदनाहारी और मनका स्थिरीकरण 51 के संयोजन का उपयोग करने के लिए।
    1. 10% आगा तैयार करें(M9 बफर में) 51 में वर्णित है और 3 μl nanosphere आकार मानकों के समाधान के लिए कीड़े (polystyrene मोती, 100 एनएम) प्लस 3 μl संवेदनाहारी (M9 बफर में 4 मिमी levamisole) जोड़ने के पैड के रूप में गुलाब। एक कवर पर्ची के साथ धीरे को कवर किया। सुखाना से बचने के लिए, VALAP (वेसिलीन, लानौलिन, और पैराफिन मोम के बराबर राशि का मिश्रण) के साथ कवर पर्ची सील।
  6. छवि एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कीड़े immobilized।
    नोट: परिणाम एक EM सीसीडी कैमरा और MetaMorph के रूप में इस तरह के एक माइक्रोस्कोपी स्वचालन और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर से लैस एक कताई डिस्क वायुसेना confocal खुर्दबीन का उपयोग प्राप्त की है और नीचे बारीकियों की रूपरेखा तैयार है, लेकिन अन्य तुलनीय confocal इमेजिंग सिस्टम का भी इस्तेमाल किया जा सकता है कर रहे हैं।
    1. 63X या 100X / 1.4NA तेल उद्देश्य का प्रयोग करें और खुर्दबीन स्लाइड धारक में कीड़े युक्त खुर्दबीन स्लाइड जगह है।
    2. सॉफ्टवेयर खोलें। MRFP इमेजिंग के लिए लेजर शक्ति और फिल्टर समायोजित करें। 10% बिजली और उत्सर्जन फिल्टर> 600 एनएम पर 561 एनएम लेजर का उपयोग करें।
    3. "बचत" टैब के तहत चयन करें या फ़ाइलों को बचाया जाना चाहिए जहां निर्देशिका फ़ोल्डर बनाएँ। फाइल करने के लिए एक नाम निर्दिष्ट करें।
    4. "तरंग लंबाई" टैब के तहत उचित रोशनी का चयन करें और जोखिम और लाभ को समायोजित। 100 और 300 मिसे और 100 और 300 के बीच एक कैमरा लाभ के बीच एक जोखिम के साथ "YokoQuad लाल" (या mRFP इमेजिंग के लिए एक बराबर रोशनी सेटिंग) का प्रयोग करें, व्यक्तिगत नमूना के आधार पर (लाइव छवि का उपयोग द्वारा मूल्यांकन)।
    5. "Timelapse" टैब के अंतर्गत "समय बिंदुओं की संख्या" = 301, "अवधि" = 5 मिनट और "समय / अंतराल" = 1 सेकंड का चयन करें।
    6. "एएफसी सेट जेड पकड़" और "जेड धारण करने के लिए एएफसी वापसी", प्रकार: "पत्रिकाएं" टैब का चयन जर्नल के तहत &# 8220; स्पेशल "(दो बार), प्रारंभिक बिंदु:" प्रारंभ समय की बात है "और" समय बिंदु के अंत "। इस ऑटोफोकस विकल्प छवि समय की एक लंबी अवधि में एक ही अनुभाग के लिए महत्वपूर्ण है।
    7. सेटअप किया जाता है, प्रेस "मोल"। timelapse वीडियो अलग झगड़ा फ़ाइलों के रूप में सफ़ेद है।
    8. ImageJ में एक निश्चित समय श्रृंखला के सभी झगड़ा फ़ाइलें खोलें। "छवि" → "ढेर" → "के ढेर के लिए छवियाँ" के लिए जाओ। वैकल्पिक रूप से, → "फाइल" के तहत फिल्म निर्यात आदि, आकार बार जोड़ने के लिए, चमक और विपरीत समायोजित → "AVI के ..." "के रूप में बचाने के लिए" (एक उदाहरण के लिए, वीडियो 1 और 2 1 चित्रा करने के लिए इसी देखें)।

2. स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त Proteostasis और विषाक्तता पर प्रभावित करता है सेल की जांच करने के लिए तह सेंसर और तनाव रिपोर्टर का प्रयोग

  1. एक तह संवेदक या तनाव reporte coexpress कि ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्नएक साथ prion-जैसे प्रोटीन के साथ आर। पार की स्थापना या ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करने के लिए कैसे पर तरीकों के लिए, 48,49,52 देखते हैं। सी की एक सूची के लिए 1 टेबल देखें इस्तेमाल किया जा सकता है कि एलिगेंस उपभेदों।
  2. ट्रांसजेनिक जानवरों के सिंक्रनाइज़ आबादी को तैयार है और (धारा 1.2) 50 से ऊपर वर्णित के रूप में वांछित उम्र तक उन्हें विकसित।
  3. एक stereomicroscope का प्रयोग, तह संवेदक या तनाव संवाददाता के संबंधित फेनोटाइप जांच करते हैं।
    1. तह संवेदक के लिए, तुल्यकालन के बाद प्रत्येक दिन पर समुच्चय को शरण देने के पशुओं की संख्या का निर्धारण (उदाहरण के लिए, चित्रा 2 ई और एफ देखें)।
    2. तनाव पत्रकार के लिए, परीक्षण संवाददाता का एक बढ़ा प्रतिदीप्ति में prion की तरह प्रोटीन परिणामों की coexpression (उदाहरण के लिए, चित्रा 3 देखें) यदि।

सी में prion प्रेरित विषाक्तता के दमन के लिए 3. जीनोम चौड़ा स्क्रीन एलिगेंस

चित्रा 4
आरएनएआई स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल 4. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा। अलग अलग चरणों का विस्तृत विवरण के लिए प्रोटोकॉल धारा 3 देखें।

  1. सी के तुल्यकालन एलिगेंस कीड़े और आरएनएआई पुस्तकालय के दोहराव
    1. आरएनएआई स्क्रीन के लिए, Ahringer आरएनएआई पुस्तकालय (या विडाल आरएनएआई पुस्तकालय) 53,54 का उपयोग करें। 10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक 100 μl लेग amp के मीडिया के साथ प्लेट (पौंड में 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन) भरकर 96 अच्छी तरह प्लेटों में मूल 384 अच्छी तरह प्रारूप से आरएनएआई पुस्तकालय Rearray और एक 96-पिन प्रतिलिपिकार का उपयोग कर टीका लगाना। -80 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन और दुकान के साथ 37 डिग्री सीओ / एन से बढ़ने।
    2. सी बनाए रखें एलिगेंस WT और 20 डिग्री सेल्सियस एन जी एम पर प्लेटों पर ट्रांसजेनिक लाइनों OP50 के साथ वरीयता प्राप्त मानक तरीकों 47 के अनुसार कोलाई बैक्टीरिया।
    3. विरंजन द्वारा prion डोमेन ट्रांसजेनिक और WT (नियंत्रण) नेमाटोड सिंक्रनाइज़ (धारा 1.2 देखें)।
    4. कीड़े प्रक्षालित कर रहे हैं कि एक ही दिन, 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक लेग मीडिया तैयार करते हैं। बांटना एक स्वचालित अभिकर्मक मशीन का उपयोग करें (या पिपेट स्वयं) एक 96 अच्छी तरह से थाली में से प्रत्येक कुएं में लेग amp के मीडिया के 65 μl।
    5. -80 डिग्री सेल्सियस से 96 अच्छी तरह से Ahringer आरएनएआई पुस्तकालय प्लेटें निकालें और कागज तौलिये के साथ लाइन में खड़ा एक बाँझ हुड के लिए उन्हें लाने के लिए। इसके तत्काल बाद प्लेटों अभी भी जमे हुए हैं, जबकि प्लेटों के बाहर पर बर्फ से संक्रमण से बचने के लिए सावधान किया जा रहा है, उल्टा थाली पकड़े द्वारा सील टेप को हटा दें। प्लेटों reinvert और उनके बारे में 30 मिनट के लिए पिघलना करते हैं।
    6. एक ताजा लेग amp के थाली में तो एक आरएनएआई पुस्तकालय की थाली में एक बाँझ 96 पिन प्रतिलिपिकार डुबकी, और। प्रत्येक थाली के लिए एक ताजा बाँझ प्रतिलिपिकार का प्रयोग करें। चिपकने वाला पन्नी टेप के साथ सभी प्लेटों को सील करने और डिग्री सेल्सियस -80 के लिए पुस्तकालय प्लेटें लौटें। replicators, ब्लीच में भिगो rinsed जा सकता है,और फिर से इस्तेमाल किया जा करने के लिए autoclaved।
    7. दोहराया आरएनएआई प्लेटों 37 डिग्री सेल्सियस और 300 rpm के लिए एक मशीन सेट में हे / एन विकसित करने के लिए अनुमति दें। HT115 का उपयोग करने के लिए कोलाई एक नियंत्रण के रूप में खाली सदिश (L4440) को शरण देने के बैक्टीरिया, एक संस्कृति ट्यूब में इसे अलग से बढ़ने और फिर दो 96 अच्छी तरह प्लेटों में से एक तिमाही में एक multichannel विंदुक के साथ संस्कृति के 65 μl विंदुक।
  2. बैक्टीरियल dsRNA उत्पादन और कीड़े के अलावा के प्रेरण
    1. DDH 2 ओ में एक 5 मिमी एकाग्रता के लिए इसोप्रोपाइल-β-डी-thiogalactopyranosid (IPTG) पतला बांटना एक मल्टीचैनल सिर के साथ एक स्वचालित कार्य केंद्र का उपयोग (या pipet का स्वयं) आरएनएआई बैक्टीरिया और नियंत्रण प्लेटों के प्रत्येक कुएं में पतला IPTG के 10 μl। Reseal और वापस इनक्यूबेटर में प्लेटें जगह है। उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए मिलाओ।
    2. बैक्टीरिया मिलाते रहे हैं, कीड़े तैयार करते हैं। एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड करने के लिए - (10 μl ~ 5) एक छोटा सा नमूना अच्छी तरह से M9 / कीड़ा निलंबन मिक्स, और विंदुक। गिनतीएक stereomicroscope के तहत कीड़े की संख्या और μl प्रति कीड़े की संख्या की गणना।
    3. , 0.20 मिलीग्राम / एमएल IPTG, 8.0 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / कोलेस्ट्रॉल 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन, 9.6 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन, 0.0835 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / Fungizone, और बाँझ तकनीक का प्रयोग कर निम्न अंतिम सांद्रता के साथ पूरक M9 (M9 +) के एक समाधान तैयार 50 μl प्रति 15 कीड़े।
      1. Prion डोमेन ट्रांसजेनिक और WT कीड़े के लिए अलग समाधान करें। अंतिम (देखें नीचे) की नकल की आरएनएआई प्लेटों की संख्या पर निर्भर करेगा की जरूरत M9 + कीड़ा समाधान की मात्रा, प्लस ~ एक स्वचालित मशीन का इस्तेमाल किया जाता है, तो जलाशय में रहेगा कि मृत मात्रा का 30 मिलीलीटर।
    4. बैक्टीरियल dsRNA उत्पादन के 3 घंटा प्रेरण के बाद, इनक्यूबेटर से बाहर प्लेटें लेते हैं और उन्हें जानवरों पर बल देते गर्मी से बचने के लिए आर टी (~ 30 मिनट) को शांत करते हैं।
    5. प्रत्येक आरएनएआई प्लेटों की अच्छी तरह से और खाली वेक्टर नियंत्रण प्लेटों में से एक को 50 μl M9 + prion डोमेन ट्रांसजेनिक कीड़ा समाधान बांटना। मेकजानवरों जलाशय के तल तलछट के लिए करते हैं के रूप में हर कदम से पहले कीड़ा समाधान मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करें।
    6. दूसरी नियंत्रण थाली में गुम्मट कीड़े बांटना। वातन अनुमति देने के लिए unsealed प्लेटों छोड़ दें। 5 प्लेटें एक साथ और एक नम कागज तौलिया और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेट - evaporating से तरल संस्कृति रखने के लिए, 4 हो चुकी है। चार दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर 200 rpm पर सेते हैं।
  3. स्कोरिंग
    नोट: इनक्यूबेटर में चार दिनों के बाद, कीड़े वयस्कता के दूसरे दिन में हो सकता है और स्क्रीन करने के लिए तैयार कर रहे हैं। जानवरों अबाधित ताड़ना सुनिश्चित करने के लिए स्क्रीनिंग से पहले 30 मिनट के लिए गैर झटकों की स्थिति को समायोजित करते हैं।
    1. नियंत्रण इलाज किया prion डोमेन ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ तुलना में वृद्धि हुई ताड़ना के लिए नेत्रहीन एक मॉनिटर, स्क्रीन के साथ एक कंप्यूटर से जुड़ा एक फाल्कन 4M60 कैमरे का उपयोग करना।
    2. WrMTrck का उपयोग कर पुष्टि करने के लिए प्रारंभिक हिट की एक सूची संकलित (अगले अनुभाग देखें)।

प्रारंभिक 4. पुष्टिस्क्रीन हिट

  1. ठोस प्लेटों पर गतिशीलता परख
    1. मानक तरीकों 47 के अनुसार, 100 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन, 12.5 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / टेट्रासाइक्लिन और 1 मिमी IPTG के साथ पूरक एन जी एम के साथ प्लेटों की तैयारी। यदि संभव हो तो, सभी प्लेटें एक और अधिक सुव्यवस्थित वीडियो अधिग्रहण की प्रक्रिया के लिए अनुमति देगा जो मीडिया के एक ही ऊंचाई है, आश्वस्त करने के लिए एक थाली-डालने का कार्य मशीन का उपयोग करें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस और 250 rpm पर ~ 1 मिलीलीटर लेग 50 माइक्रोग्राम प्रति / एमएल एम्पीसिलीन, ओ / एन में अलग आरएनएआई क्लोन हो जाओ।
    3. अगले दिन, 3 घंटे के लिए 1 मिमी IPTG साथ dsRNA की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित। एक पतली परत में फैल प्रत्येक आरएनएआई बैक्टीरियल क्लोन के 150 μl, साथ प्लेटों बीज। अंधेरे में आरटी पर दो दिनों के लिए सूखी बैक्टीरिया करते हैं। आरएनएआई क्लोन प्रति तीन प्लेटों की तैयारी।
    4. मानक तरीकों 50 (धारा 1.2 देखें) के अनुसार विरंजन द्वारा कीड़ा जनसंख्या तुल्यकालन, और अंडे हैच हे / एन M9 में मीडिया करते हैं।
    5. कीड़ा निलंबन का एक नमूना लेने और nem की राशि का निर्धारणstereomicroscope पर μl प्रति atodes। 30 एल 1 कीड़े - यह 25 में शामिल है कि तो फिर, प्रत्येक प्रयोगात्मक थाली में M9 के साथ साथ कीड़े की उचित मात्रा विंदुक। कीड़े वयस्कता के 2 दिन तक 4 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर नेमाटोड आगे बढ़ें।
  2. ImageJ के लिए wrMTrck प्लगइन के साथ कीड़ा गतिशीलता के मात्रात्मक विश्लेषण
    नोट: वीडियो एक हमामात्सू Orca-आर 2 डिजिटल कैमरे C10600-10B और हमामात्सू सरल पीसीआई इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ 10X बढ़ाई पर एक stereomicroscope का उपयोग कर दर्ज किया गया।
    1. कैमरा और साधारण पीसीआई इमेजिंग सॉफ्टवेयर चालू करें। इमेजिंग शर्तों के समायोजन के लिए अनुमति देने के लिए "लाइव" पर क्लिक करें।
    2. इस प्रकार के रूप वीडियो शर्तों स्थापित: लाभ = 0; लाइट मोड = उच्च; स्पीड सूचकांक = 1; Binning = 2. क्लिक करें "ऑटो बेनकाब" और फिर खुर्दबीन दर्पण और चमक और विपरीत डायल चलती है, प्रकाश व्यवस्था की स्थिति को समायोजित।
      नोट: वीडियो overexp किया जा रहा बिना एक उच्च विपरीत है की जरूरत हैजानवरों के एक उज्ज्वल पृष्ठभूमि पर के रूप में काली आकृति दिखाई देते हैं, ताकि osed।
    3. "टाइम स्कैन" पर क्लिक करें और एक फ़ोल्डर और फ़ाइल नाम का चयन करें। 20 मिसे के लिए "फील्ड विलंब" सेट और 30 सेकंड के लिए "समय पर बंद करो"। (सबसे कीड़े कहाँ हैं) दर्ज करने के लिए थाली के क्षेत्र का चयन करने के क्रम में प्रेस "लाइव समीक्षा"। देखें और प्रेस "प्रारंभ" के क्षेत्र में अपनी स्थिति की पुष्टि जल्दी से मंच पर थाली 3 या 4 बार ठोकर।
    4. फिल्म रिकॉर्डिंग खत्म करने के बाद, सही छवि पर क्लिक करें और एक AVI करने के लिए एक .cxd प्रारूप से फिल्म निर्यात करने के लिए "निर्यात असेंबल अनुक्रम" का चयन करें।
  3. गतिशीलता वीडियो का विश्लेषण
    1. , ImageJ सॉफ्टवेयर खोलें "प्लगइन्स" टैब पर जाएँ, तो "wrmtrck" और "wrMTrck बैच" का चयन करें। सभी फ़ाइलों वाले निर्देशिका का चयन करें विश्लेषण किया जा सके।
    2. Figur में विस्तृत रूप wrMTrck_Batch की मुख्य इनपुट विंडो में, इनपुट मूल्यों लोडई 5C। मापदंडों में से प्रत्येक के लिए विवरण प्लगइन के साथ कि निर्देशों में पाया जा सकता है। "ठीक" क्लिक करें और आंदोलन विश्लेषण चला करते हैं।
    3. परिणाम उपपादरी और सभी का पता चला पटरियों वास्तविक सी से कर रहे हैं कि इस बात की पुष्टि करने के लिए एलिगेंस और खत्म करने कलाकृतियों, प्रत्येक फिल्म के लिए बनाई गई .txt फ़ाइलों में से प्रत्येक के लिए खुला है और एक डाटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर फाइल करने के लिए जानकारी की प्रतिलिपि। निर्मित "* _labels.zip" फ़ाइलों को खोलने और मैन्युअल रूप से जाँच करें और झूठी कीड़ा पटरियों को खत्म करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप "* _labels.tif" चलाते हैं।

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Representative Results

इन विवो समय चूक इमेजिंग द्वारा prion की तरह प्रोटीन का प्रसार कहनेवाला निगरानी

ट्रांसजेनिक सी prion डोमेन व्यक्त एलिगेंस लाइनों prion की तरह प्रोटीन, जैसे, सेल करने वाली सेल ट्रांसमिशन और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता के कुछ पहलुओं के विश्लेषण के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल हैं। सक्षम बनाता है की fluorescently पर नज़र रखने के जानवरों की पारदर्शिता जीवन के हर स्तर पर रहने वाले जीव के भीतर से प्रोटीन टैग किया। इस का लाभ ले रहा है, कोशिकाओं और एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग ऊतकों भर prion-जैसे प्रोटीन के आंदोलन कल्पना कर रहे हैं। एक 63x या 100X / 1.4NA तेल उद्देश्य vesicular संरचनाओं को हल करने के लिए आवश्यक है। महत्वपूर्ण बात है, prion डोमेन इन संभवतः अम्लीय पुटिकाओं 40 भीतर fluorescently दृश्य रहना करने के क्रम में, mRFP के साथ टैग किया जाना है। अक्सर एक टैग के रूप में प्रयोग किया जाता है, जो पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (YFP), मैंयह एक कम पीएच वातावरण 40,55 में बुझती है क्योंकि उपयुक्त नहीं है। अकेले आरएफपी टैग (चित्रा 1 ए और बी) घुलनशील बनी हुई है, जबकि तनाव AM815, आरएफपी टैग R2E2 ट्यूबलर पुटिकाओं में जम जाता है कि (prion डोमेन एनएम के एक उच्च एकत्रीकरण का खतरा और जहरीले फार्म) को व्यक्त करता है। विवो समय चूक इमेजिंग में उपयोग करना है, यह इन ट्यूबलर पुटिकाओं के भीतर और कोशिकाओं 40 (चित्रा 1C और डी, वीडियो 1 और 2) वीडियो के लिए [जगह लिंक के बीच ले जाया जाता है कि देखा जा सकता है 1 और 2 यहाँ]।

तह सेंसरों और तनाव संवाददाताओं का प्रयोग proteostasis और विषाक्तता पर सेल स्वायत्त और गैर-सेल स्वायत्त प्रभाव की जांच करने के लिए

Prions बीज से संबंधित प्रोटीन पार और सेलुलर प्रोटीन तह वातावरण को बाधित करने में सक्षम हैं। यह उचित तह senso के coexpression के माध्यम से पता चला जा सकता हैरुपये। तह सेंसर सही ढंग से गुना करने के लिए एक कार्यात्मक proteostasis नेटवर्क पर निर्भर करती है कि गैर जरूरी है metastable प्रोटीन होते हैं। कुछ उदाहरणों में जाने-माने जुगनू luciferase और तापमान के प्रति संवेदनशील (टीएस) म्यूटेशन 56-66 शरण प्रोटीन होते हैं। Proteostasis की एक व्यवधान समुच्चय के दृश्य परीक्षा से या अनुमोदक तापमान पर संबंधित टीएस उत्परिवर्ती phenotype के प्रदर्शन से पता लगाया जा सकता है, जो रिपोर्टर के misfolding की ओर जाता है। वे एक उम्र पर निर्भर एकत्रीकरण 67-69 दिखा रहे हैं क्योंकि एकत्रीकरण (लगभग 40 अवशेषों) की दहलीज पर लंबाई के साथ पॉलीग्लूटमाइन (polyQ) के हिस्सों को भी अक्सर किया जाता है। एकत्रीकरण के पहले शुरू होने के एक समझौता तह वातावरण का पता चलता है। यहाँ, हम सी में व्यक्त जब घुलनशील बनी हुई है कि एक prion उत्परिवर्ती RΔ2-5 कार्यरत एलिगेंस शरीर दीवार मांसपेशियों (BWM) कोशिकाओं और आंत 40 (2A चित्रा और सी)। BWM कोशिकाओं में R2E2 के साथ एक साथ अभिव्यक्ति पर, RΔ2-5 वजहप्रोटीन तह पर्यावरण पर R2E2 की एक सेल स्वायत्त प्रभाव खुलासा dily समुच्चय (चित्रा 2B),। proteostasis और ऊतकों भर misfolding के शामिल होने पर व्यापक प्रभाव prion डोमेन के अत्यधिक एकत्रीकरण-प्रवण रूप व्यक्त नहीं करता है कि एक विशिष्ट ऊतकों में तह सेंसर की अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। RΔ2-5 एक आंत-विशिष्ट प्रमोटर (vha-6p) के तहत व्यक्त की गई थी जबकि R2E2, एक BWM सेल विशिष्ट प्रमोटर (Myo-3P) के तहत व्यक्त की गई थी। आंतों RΔ2-5 के एकत्रीकरण R2E2 एक गैर सेल स्वायत्त तरीके से 40 (चित्रा 2 डी) में प्रोटीन तह को प्रभावित करता है कि यह दर्शाता है। इसके बजाय समुच्चय ही उच्च संकल्प में पता लगाया जा सकता है, जहां RΔ2-5, का उपयोग कर के, polyQ44 का उपयोग आँत में व्यक्त (Q44i) एक stereomicroscope (चित्रा 2 ई और एफ) के तहत कम संकल्प पर समुच्चय के दृश्य की अनुमति देता है। इसके अलावा, इस एनिमा की मात्रा का ठहराव में सक्षम बनाता हैसमुच्चय के साथ रास, साथ ही समुच्चय की संख्या का एक मात्रा का ठहराव।

Prion डोमेन के गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता की जांच करने के लिए, हम पहले से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा R2E2 व्यक्त नहीं करते कि ऊतकों पड़ोसी की जांच की और, इस तरह की मांसपेशियों की कोशिकाओं में prion डोमेन की अभिव्यक्ति है कि आसन्न ऊतकों में mitochondrial अखंडता के एक गैर सेल स्वायत्त विघटन की ओर ले जाती पाया आंत के रूप में 40। बढ़ी हुई प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन और oxidative तनाव में mitochondrial रोग का परिणाम है। ऑक्सीडेटिव तनाव प्रतिक्रिया की प्रेरण कल्पना करने के लिए एक noninvasive तरह से एक oxidative तनाव inducible रिपोर्टर 70 उपयोग करने के लिए है। तनाव CF1553 oxidative तनाव inducible प्रमोटर वतन-3 70 के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त करता है। BWM कोशिकाओं में prion डोमेन R2E2 व्यक्त पशुओं को पार कर गया है, जब संवाददाता काफी (कई गैर BWM ऊतकों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से BWM कोशिकाओं में upregulated किया गया था तालिका 1 सी की एक सूची प्रदान करता है एलिगेंस तुलनात्मक रूप से इस्तेमाल किया जा सकता है कि तह सेंसरों और तनाव संवाददाताओं व्यक्त उपभेदों।

सी में prion प्रेरित विषाक्तता के दमन के लिए जीनोम चौड़ा स्क्रीन एलिगेंस

prion डोमेन के जटिल विषाक्तता फेनोटाइप सी में व्यक्त किया एलिगेंस क्योंकि इन विट्रो prion मॉडल 71 में अधिकांश में मनाया प्रत्यक्ष विषाक्तता की कमी की वजह से विशेष रूप से दिलचस्प है। इस मॉडल मेटाजोअन में prions के साथ जुड़े विषाक्तता प्रभावित कर सकते हैं कि नए रास्ते प्रकट हो सकता है। यह पता करने के लिए, हम आरएनएआई समाप्त करते हैं, R2E2 ट्रांसजेनिक जानवरों की गतिशीलता दोष में सुधार होगा कि, जीन के लिए जांच की है। नियंत्रण इलाज किया गुम्मट कीड़े एक सकारात्मक सह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैntrol, हालांकि अधिकांश उम्मीदवार जीन की वजह से चर आरएनएआई अंतर्वेधन और transgene की उच्च विषाक्तता के लिए, एक पूर्ण आंदोलन फेनोटाइप बचाव उपलब्ध नहीं कराएगा। जानवरों वयस्कता के 2 दिन के लिए पहली लार्वा राज्य एल 1 से, आरएनएआई के साथ 4 दिनों के लिए इलाज किया गया। उस समय तक, अनुपचारित R2E2 जानवरों की ताड़ना हम गतिशीलता के एक सुधार के लिए जांच कर रहे हैं क्योंकि जो महत्वपूर्ण है गुम्मट जानवरों की ताड़ना, की तुलना में काफी धीमी है। F1 संतान (~ L1s) उपस्थित होना है, लेकिन P0 पीढ़ी से अलग करने के लिए आसान है जाएगा। केवल P0 पीढ़ी रन बनाए है। यह प्रारंभिक स्क्रीन मात्रात्मक दृश्य और गैर है और इसलिए, एक सीमा से कम prion व्यक्त जानवरों की ताड़ना को बढ़ाने के लिए लग रहा था कि हर बैक्टीरियल आरएनएआई क्लोन एक मात्रात्मक रेंगने परख में पुनर्परीक्षण किया गया था जिसका अर्थ है कि प्रारंभिक हिट की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। चार की रूपरेखा चित्रा स्क्रीन सेटअप के मुख्य कदम। फाल्कन 4M60 कैमरे के उच्च संकल्प एक quar के एक दृश्य स्क्रीनिंग सक्षम होना चाहिएस्क्रीन और अधिक कुशलता से पूरा होने की अनुमति दी है जो एक कंप्यूटर स्क्रीन पर एक समय में एक थाली के आतंकवाद। उपयोगी है, यह आवश्यक नहीं है। कीड़ा ताड़ना के दृश्य परीक्षा भी कम बढ़ाई (10X) में एक स्टिरियोस्कोप का उपयोग करके किया जा सकता है।

प्रारंभिक स्क्रीन हिट की पुष्टि

उच्च throughput स्क्रीन विश्लेषण जीनोम चौड़ा प्रभाव पूरक तरीकों से परिष्कृत किया जा सकता है कि उम्मीदवार जीन के एक प्राथमिक सूची प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है कि एक दृष्टिकोण के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं। स्क्रीन परिणामों के मान्यकरण आरएनएआई प्रति केवल एक प्रयोगात्मक नमूने के साथ एक स्क्रीन प्रदर्शन से परिणाम हो सकता है, जो संभव झूठी सकारात्मक, समाप्त करने के लिए इसलिए जरूरी है। R2E2 ट्रांसजेनिक जानवरों प्राथमिक हिट की आरएनएआई क्लोन के साथ तंग आ गया और गतिशीलता का एक quantifiable readout के रूप में, वयस्कता के दूसरे दिन पर एन जी एम प्लेटों पर उनकी गति को मापा और विषाक्तता की कमी हुई थे। हम में विकसित ImageJ के लिए wrMTrck प्लगइन का उपयोग किया था हमारेसही रूप में सी पहचानती है जो प्रयोगशाला, वीडियो में एलिगेंस और उनके आंदोलन के बाद। wrMTrck प्लगइन और स्वचालित विश्लेषण के लिए स्क्रिप्ट खुला स्रोत है और यह कैसे उपयोग करने के बारे में विस्तृत निर्देश के साथ, http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं। डाउनलोड करने के बाद, ImageJ के प्लगइन्स फ़ोल्डर में पूरे wrMTrck फ़ोल्डर की नकल। इस प्रोटोकॉल एक समय में वीडियो की एक बड़ी संख्या का विश्लेषण करने के लिए पसंदीदा wrMTrck_Batch विधि का वर्णन करता है, लेकिन फिल्म से एक पुस्तिका, फिल्म के लिए निर्देश, विश्लेषण भी प्लगइन डाउनलोड के साथ उपलब्ध हैं। WrMTrck_Batch पृष्ठभूमि घटाव के साथ एक द्विआधारी प्रारूप में एक मूल वीडियो (चित्रा 5A) धर्मान्तरित और प्रत्येक कीड़ा एक ट्रैक सौंपा है। प्रसंस्कृत वीडियो में से प्रत्येक बाद में मैन्युअल रूप से झूठा के रूप में कीड़े (ई। जी।, ट्रैक 1 चित्रा 5 ब में) की पहचान की गई है कि किसी भी कलाकृतियों को खत्म करने के क्रम में, आरोपित इन पटरियों के साथ देखा जा सकता है। पृष्ठभूमि कला को खत्म करने के लिए एक प्रभावी तरीका (चित्रा 5 ब पर एक तीर के साथ संकेत दिया) ifacts ध्यान से पहचाना जा करने के लिए वस्तुओं की न्यूनतम और अधिकतम आकार (चित्रा 5C) का चयन करने के लिए है। WrMTrck प्लगइन के विभिन्न outputs से, हम इस प्रकार संभावित मतभेद के लिए सामान्य प्रत्येक वस्तु के शरीर की लंबाई से विभाजित प्रत्येक ट्रैक की लंबाई के प्रतिनिधित्व वाले प्रत्येक जानवर की औसत गति, जो उपाय (BLPS) पैरामीटर प्रति सेकंड शरीर की लंबाई का उपयोग नेमाटोड (चित्रा 5D) के आकार में। इस विधि का उपयोग करना, हम R2E2 सी व्यक्त करने में गतिशीलता फेनोटाइप कि वृद्धि prion प्रेरित विषाक्तता (sopt) का 35 दमन पहचान एलिगेंस कम से कम 133% करने के लिए और खाली वेक्टर इलाज कीड़े (चित्रा 6) की तुलना में जब 256% तक। ये sopt जीन अंतिम हमारे उच्च throughput प्रदर्शन के प्रयासों से हुई कि हिट की पुष्टि की है प्रतिनिधित्व करते हैं।

21fig1highres.jpg "/>
Prion डोमेन 1. चित्रा सी में कोशिकाओं और ऊतकों के बीच फैलता vesicular परिवहन के द्वारा एलिगेंस। (ए) (बी)। शरीर दीवार मांसपेशियों में आरएफपी व्यक्त नेमाटोड (BWM) कोशिकाओं (RFPm) के confocal जेड ढेर ढह बेहद जहरीला और एकत्रीकरण का खतरा समुद्री मील दूर संस्करण, R2E2 व्यक्त नेमाटोड के confocal जेड ढेर ढह , BWM कोशिकाओं में (R2E2m)। तीर ट्यूबलर पुटिकाओं से संकेत मिलता है, Arrowhead कुल इंगित करता है। (सी + डी) पशुओं के समय चूक श्रृंखला व्यक्त RFPm (सी) और R2E2m (डी)। तीर vesicular आंदोलन के क्षेत्रों से संकेत मिलता है। RFPm ज्यादातर एक फैलाना धुंधला दर्शाती है। RFPm पुटिकाओं में पाया जाता है, तब भी जब इन मुश्किल से चलते हैं। R2E2m भीतर और कोशिकाओं के बीच ले जाया जाता है कि कई पुटिकाओं के लिए localizes। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन। साथ वीडियो 1 और 2 [यहाँ वीडियो 1 और 2 के लिए जगह कड़ियाँ], आंकड़े 1C और डी के अनुरूपक्रमशः।

चित्रा 2
चित्रा 2. तह सेंसर proteostasis पर prion डोमेन के व्यापक प्रभाव का पता चलता है। R2E2m की (ए + बी) Coexpression RΔ2-5m एकत्रीकरण को बढ़ावा देता है। BWM कोशिकाओं में R2E2m साथ coexpressed (ए) RΔ2-5m नियंत्रण और (बी) RΔ2-5m की Confocal छवियों। (सी + डी) स्नायु R2E2m आंतों RΔ2-5i एकत्रीकरण को बढ़ावा देता है व्यक्त की है। RΔ2- व्यक्त नियंत्रण जानवर (सी) confocal छवि आंतों की कोशिकाओं में 5I। (डी) आंत में BWM कोशिकाओं और RΔ2-5i में R2E2m व्यक्त जानवरों की confocal छवि। स्केल सलाखों: 10 माइक्रोन (ई + एफ) R2E2m Q44i के गैर सेल स्वायत्त एकत्रीकरण लाती (ई) Q44i और Q44i के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों; R2E2m जानवरों 4 दिनों सिंक्रनाइज़ एल 1 LAR स्थानांतरित होने के बाद।।VAE ताजा OP50 वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों पर। BWM कोशिकाओं में R2E2 की अभिव्यक्ति आंत में Q44i एकत्रीकरण के पहले के एक शुरुआत हो जाती है। (% में) समुच्चय के साथ पशुओं के (एफ) मात्रा में संकेत दिनों पर तुल्यकालन के बाद। त्रुटि सलाखों एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं यह आंकड़ा 40 से संशोधित किया गया है।

चित्रा 3
चित्रा 3. वतन-3P :: GFP के ट्रांसक्रिप्शनल तनाव संवाददाता prion डोमेन oxidative तनाव की सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त प्रेरण का कारण बनता है कि पता चलता है। (ए + बी) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट वतन-3P की (एक ही जोखिम समय का उपयोग) छवियों :: GFP व्यक्त नियंत्रण जानवरों (ए) और वतन-3P :: GFP;। वयस्कता के दिन 2 पर R2E2m जानवर (बी) (सी) BWM कोशिकाओं में R2E2 की अभिव्यक्ति रिपोर्टर की एक प्रेरण BWM सेल में न केवल करने के लिए सुराग, लेकिन यह भी आंत (द्वितीय), तंत्रिका कॉर्ड में है (मैं) (iii), ग्रसनी और सिर न्यूरॉन्स (चतुर्थ)।

चित्रा 5
ImageJ के लिए wrMTrck प्लगइन के साथ कीड़ा आंदोलन की चित्रा 5. विश्लेषण। (ए) एक समय में कई जानवरों की निगरानी के लिए एक उपयुक्त बढ़ाई (~ 10X) का उपयोग द्वारा उत्पन्न एक इनपुट फिल्म का उदाहरण। (ख) "* _labels.tif" फ़ाइलें wrMTrck_Batch की एक उत्पादन कर रहे हैं और विश्लेषण के परिणामों के मार्गदर्शन क्यूरेशन के लिए अनुमति देते हैं। एरो इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों दिखा रहा है,। के कारण न्यूनतम और अधिकतम आकार मापदंडों का एक उपयुक्त विकल्प को सही ढंग से विश्लेषण से बाहर रखा गया था कि एक वस्तु को इंगित करता है wrMTrck_Batch (सी) इनपुट विंडो। इन मानकों व्यक्ति माइक्रोस्कोप और फिल्म सेटिंग्स के अनुसार समायोजित करने की जरूरत है। Moveme से (डी) आउटपुट परिणामBLPS स्तंभ के साथ (बी) के NT विश्लेषण, पीले रंग में प्रकाश डाला। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 1
Prion प्रेरित विषाक्तता (sopt) की supressors हैं कि आरएनएआई क्लोन के साथ इलाज चित्रा 6 R2E2 कीड़े सुधार गतिशीलता दिखा। गतिशीलता रिश्तेदार BLPS के रूप में दिखाया गया है नकारात्मक नियंत्रण (खाली वेक्टर) की तुलना में। HTP स्क्रीन में पहचान की सभी महत्वपूर्ण सांख्यिकीय (छात्र टी परीक्षण) आरएनएआई क्लोन कर रहे हैं दिखाया गया है। ब्लैक स्टार चित्रा 5 में एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया हिट का प्रतिनिधित्व करता है। परिणाम हालत प्रति 17 <n <53 पटरियों के साथ, 3 फिल्मों से हैं। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। </ P>

तालिका 1 सी एलिगेंस तह सेंसरों और तनाव संवाददाताओं व्यक्त उपभेदों।

तनाव नाम जीनोटाइप कमेंट्स तनाव के स्रोत
तह सेंसर
ट्रांसजीन
AM140 UNC-54p :: polyQ35 :: YFP मांसपेशी विशिष्ट polyQ35 की अभिव्यक्ति, उम्र निर्भर एकत्रीकरण CGC या Morimoto प्रयोगशाला
AM141 UNC-54p :: polyQ40 :: YFP polyQ40, एजी की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्तिई निर्भर एकत्रीकरण CGC या Morimoto प्रयोगशाला
AM801 UNC-54p :: RΔ2-5 :: YFP न्यूक्लिएशन अक्षम prion डोमेन की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति Morimoto प्रयोगशाला
OG412 vha-6p :: polyQ44 YFP :: आंत-विशिष्ट polyQ44 की अभिव्यक्ति, उम्र निर्भर एकत्रीकरण CGC
AM809 vha-6p :: RΔ2-5 :: GFP; Myo-2P :: mCherry न्यूक्लिएशन अक्षम prion डोमेन की आंत विशिष्ट अभिव्यक्ति Morimoto प्रयोगशाला
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: CFP polyQ40 के न्यूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति, सेल प्रकार विशिष्ट एकत्रीकरण Morimoto प्रयोगशाला
AM982 unc54p :: luciferase :: YFP गुम्मट जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति Morimoto प्रयोगशाला Myo-3P :: luciferase :: GFP; rol -6 गुम्मट जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति बहल प्रयोगशाला
SNG-1P :: luciferase :: GFP; rol -6 गुम्मट जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति बहल प्रयोगशाला
FUH55 unc54p :: FLUC :: EGFP; rol -6 गुम्मट जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति Hartl प्रयोगशाला
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: EGFP; rol -6 R188Q उत्परिवर्ती जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति Hartl प्रयोगशाला
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: EGFP; rol -6 R188Q + R261Q डबल उत्परिवर्ती जुगनू luciferase की मांसपेशी विशिष्ट अभिव्यक्ति Hartl प्रयोगशाला
FUH48 F25B3.3p :: FLUC :: EGFP; rol -6 गुम्मट जुगनू lucifera के न्यूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्तिएसई Hartl प्रयोगशाला
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: EGFP; rol -6 R188Q उत्परिवर्ती जुगनू luciferase के न्यूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति Hartl प्रयोगशाला
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: EGFP; rol -6 R188Q + R261Q डबल उत्परिवर्ती जुगनू luciferase के न्यूरॉन विशिष्ट अभिव्यक्ति Hartl प्रयोगशाला
टीएस म्यूटेंट
CB1402 UNC-15 (e1402) मैं Paramyosin (टीएस), तापमान संवेदनशील Unc-रुक, चलो CGC
CB1157 UNC-54 (e1157) मैं मायोसिन (टीएस), तापमान संवेदनशील Unc CGC
CB1301 UNC-54 (e1301) मैं मायोसिन (टीएस), तापमान संवेदनशील Unc CGC
CB286 UNC-45 (e286) तृतीय UNC-45 (टीएस), तापमान संवेदनशील, धीमी गति से चलती UNC, EGL CGC
HE250 UNC-52 (e669su250) द्वितीय Perlecan (टीएस), तापमान संवेदनशील UNC, कठोर पक्षाघात CGC
SD551 जाने-60 (ga89) चतुर्थ रास (टीएस), तापमान संवेदनशील एमयूवी, Ste, LVA, OSM दें CGC
CX51 DYN -1 (ky51) एक्स Dynamin (टीएस), तापमान संवेदनशील Unc CGC
CW152 गैस-1 (fc21) एक्स गैस-1 (टीएस), तापमान संवेदनशील EtOH के प्रति संवेदनशीलता CGC
ZZ26 UNC-63 (x26) मैं Acetylcholine रिसेप्टर (टीएस), तापमान संवेदनशील levamisole प्रतिरोध CGC
तनाव संवाददाताओं से
CL2070 HSP-16.2p :: GFपी, rol -6 थर्मल तनाव; UPR cyto CGC
TJ375 HSP-16.2p :: GFP थर्मल तनाव; UPR cyto CGC
TJ3000, TJ3001 HSP-16.2p :: GFP; सीबीआर-UNC-119 (+) थर्मल तनाव; UPR cyto CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol -6 थर्मल तनाव; UPR cyto Morimoto प्रयोगशाला
AM722 hsp70p :: mCherry; Myo-2P :: CFP थर्मल तनाव; UPR cyto Morimoto प्रयोगशाला
AM799 hsp90p :: GFP थर्मल तनाव; UPR cyto Morimoto प्रयोगशाला
OG497 HSF-1P :: HSF-1 :: GFपी; सीबीआर-UNC-119 (+) थर्मल तनाव; UPR cyto CGC
CF1553 वतन-3P :: GFP; rol -6 oxidative तनाव CGC
KN259 वतन-3P :: GFP; rol -6 oxidative तनाव CGC
CL2166 जीएसटी 4P :: GFP :: एनएलएस oxidative तनाव CGC
LD1171 जीसी-1P :: GFP; rol -6 oxidative तनाव CGC
LD1 एसकेएन-1P :: एसकेएन-1 :: GFP; rol -6 oxidative तनाव CGC
IG274 एनएलपी-29p :: GFP आसमाटिक तनाव CGC
BC20309 MTL-1P :: GFP धातु तनाव Baillie प्रयोगशाला
BC20342 MTL-2P :: GFP धातु एसटीआरईएसएस Baillie प्रयोगशाला
BC20314 ELT-2P :: GFP धातु तनाव Baillie प्रयोगशाला
SJ4005 HSP-4P :: GFP UPR ईआर CGC
SJ4100 HSP-6p :: GFP UPR मिटो CGC
SJ4058 HSP-60p :: GFP UPR मिटो CGC

CGC: Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र; टीएस = तापमान संवेदनशील; UPR = सामने आया प्रोटीन प्रतिक्रिया; cyto साइटोसोलिक =; Mito माइटोकॉन्ड्रियल =; ईआर = endoplasmic जालिका।

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Discussion

यहाँ वर्णित विधियों के प्रसार को वर्णन करने में मदद मिलेगी और prion की तरह प्रोटीन की जटिल सेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता। हमने हाल ही में एक एकत्रीकरण-प्रवण साइटोसोलिक prion डोमेन एक भोजी से संबंधित प्रक्रिया में झिल्ली ही सीमित vesicles में लिया जाता है कि खोज की। इन vesicles के एक विशिष्ट सबसेट के भीतर और कोशिकाओं और ऊतकों के बीच 40 prion डोमेन transports। रहने वाले जानवर में उनकी आवाजाही पर नजर रखने के लिए कुंजी प्रोटीन केवल mRFP टैग प्रोटीन इन संभवतः अम्लीय पुटिकाओं में दिखाई दे रहे थे, क्योंकि mRFP के साथ टैग किया जाना है कि है। एक ही दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम वर्तमान में इस तरह के (ए एल एस से जुड़े) superoxide dismutase 1 (SOD1), (पीडी से जुड़ा हुआ) अल्फा synuclein या राल डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के रूप में कुछ रोग से संबंधित प्रोटीन, की संभावित prion की तरह व्यवहार की जांच कर रहे (ए एल एस से जुड़े) 43 (तेदेपा-43)। पुटिकाओं के भीतर इस कहनेवाला परिवहन कई अन्य प्रोटीन द्वारा इस्तेमाल किया जा रहा है, एक हो सकता हैप्रसार की अनुमति देते हैं कि dditional रास्ते।

अच्छी तरह से विशेषता तह सेंसर का उपयोग सी में पर्यावरण तह सेलुलर प्रोटीन पर प्रभाव की निगरानी के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है एलिगेंस 63-66। यहाँ हम नेत्रहीन एक साथ अलग ऊतकों की तह क्षमता की निगरानी के लिए ऊतक विशेष प्रमोटरों के तहत व्यक्त fluorescently की उम्र निर्भर संचय का उपयोग कैसे एकत्रीकरण का खतरा टैग प्रोटीन से पता चला है। जीवधारी proteostasis नेटवर्क का अध्ययन करने के लिए अन्य संभावनाओं अंतर्जात टीएस उत्परिवर्ती प्रोटीन का उपयोग शामिल है। ये metastable प्रोटीन अनुमोदक तापमान (15 डिग्री सेल्सियस) पर सामान्य रूप से कार्य है, लेकिन misfold और उनकी विशेषता उत्परिवर्ती phenotype का प्रदर्शन, प्रतिबंधात्मक तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर nonfunctional बन जाएगा। एक एकत्रीकरण का खतरा प्रोटीन की उपस्थिति में या उम्र बढ़ने के दौरान, उत्परिवर्ती phenotype भी अनुमोदक शर्तों 63-66 में उजागर हो जाता है टीएस। इन टीएस म्यूटेंट के कुछ ओ में व्यक्त कर रहे हैंसेल स्वायत्त और गैर सेल स्वायत्त proteotoxic प्रभावों के लिए परीक्षण करने के लिए इन विशेष रूप से उपयोगी है, जिससे ऊतकों या प्रदर्शनी ऊतक विशेष phenotypes की एक सबसेट nly। उदाहरण के लिए, की एक टीएस उत्परिवर्ती लश्कर-60, जीटीपी बाध्यकारी रास protooncogene परिवार के एक सदस्य, रास (टीएस), सर्वत्र व्यक्त की, लेकिन ऊतक विशेष उत्परिवर्ती 63,66 phenotypes से पता चलता है। इस का उपयोग कर उत्परिवर्ती टीएस द्वारा, सेलुलर proteostasis पर polyQ विस्तार के प्रभाव सेल 63 स्वायत्त होना दिखाया गया था। आरएएस (टीएस) के आनुवंशिक पृष्ठभूमि में polyQ की अभिव्यक्ति प्रोटीन व्यक्त की गई थी, जिसमें ऊतक के लिए विशिष्ट केवल उत्परिवर्ती phenotype का पता चला। कई उत्परिवर्ती phenotypes के लोगों तक पहुंचाने के लिए एक प्रोटीन गैर सेल स्वायत्त proteotoxic असर पड़ता है कि संकेत होगा।

इसके अतिरिक्त, सेलुलर तनाव रास्ते पर प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए, सी में vivo में फ्लोरोसेंट तनाव पत्रकारों की एक बड़ी चयन है एलिगेंस 72। ये आम तौर पर प्रतिलेखन हैंथर्मल या oxidative तनाव, क्रमश: 72 पर रिपोर्ट, जो इस तरह के HSP-16.2p या वतन-3P के रूप में एक तनाव-inducible प्रमोटर के तहत हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त कि अल संवाददाताओं,। Prion-जैसे प्रोटीन के साथ संयोजन में उपयुक्त संवाददाताओं का उपयोग करके, एक संबंधित transgene व्यक्त एक से दूसरे ऊतकों में तनाव प्रतिक्रियाओं का एक संभावित प्रेरण निगरानी कर सकते हैं। एक चेतावनी है, हालांकि, इन तनाव संवाददाताओं अक्सर एक दिया मार्ग (अप्रकाशित टिप्पणियों) के सूक्ष्म upregulation प्रकट करने के लिए काफी संवेदनशील नहीं हो रहा है।

यह भी गैर-सेल स्वायत्त विषाक्तता को प्रभावित प्रसार प्रोटीन को प्रभावित करने वाले जीन, हम नीचे गिरा दिया, जब आंदोलन दोष सुधारना होगा कि जीनों के लिए स्क्रीनिंग द्वारा शुरू कर दिया है कि क्या हमारे खोज पर जांच करने के लिए। एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में स्विमिंग दरों के दृश्य मूल्यांकन का उपयोग करना, हम आराम से परख करने में सक्षम थे ~ 25 प्रति सत्र प्लेटें और पूरा होने में जिसके परिणामस्वरूप, प्रति सप्ताह इस प्रोटोकॉल के दो राउंड प्रदर्शन6 सप्ताह के भीतर प्रारंभिक स्क्रीन के। ठोस प्लेटों पर कीड़ा आंदोलन के मात्रात्मक विश्लेषण से हिट की पुष्टि, triplicates में, का उपयोग कर wrMTrck एक अतिरिक्त 3 हफ्तों में प्रदर्शन किया गया था। एक चेतावनी है, हालांकि, एक-पढ़ने के लिए बाहर के रूप में तरल मीडिया में प्लेटों के बजाय तैराकी में रेंगने का उपयोग करके एक तैराकी के रूप में, कुछ उम्मीदवार जीन खो सकता है और रेंगने समान गतियों नहीं कर रहे हैं और अलग रास्ते 73 से प्रभावित किया जा सकता है। कुछ उम्मीदवार जीन ठोस प्लेटों पर इस बात की पुष्टि नहीं की जा सकती इस प्रकार, यदि वे तैराकी एक निश्चित समय के भीतर ताड़ना आवृत्ति की गणना के द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है, जहां तरल मीडिया में फिर से परीक्षण किया जाना चाहिए।

यहाँ वर्णित स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल बहुत परिवर्तनशीलता कम कर देता है जो तरल से निपटने कार्यस्थानों, स्वचालित का उपयोग करता है। नुकसान यह है कि रोबोट के जलाशय के लिए तरल पदार्थ की एक अतिरिक्त हमेशा संभव नहीं हो सकता है, जो की जरूरत है कि है। इस स्क्रीनिंग सेटअप आसानी से सी में अन्य स्क्रीन के लिए अनुकूलित किया जा सकता एलिगेंस <प्रदर्शन करने की इतनी के रूप में / उन्हें> एक ​​पढ़ा-out.This स्क्रीन के रूप में उपयोग करें कि ताड़ना, सीधे चौड़ी स्क्रीन डिजाइन में सरल होना चाहिए जीनोम के रूप में, prion डोमेन के प्रसार या गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता को प्रभावित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए तैयार नहीं था एक समय पर ढंग से। गतिशीलता दोष पेशी से, लेकिन यह भी न्यूरोनल नुकसान से और अन्य जीन दोष 53 के एक नंबर से न केवल पैदा कर सकते हैं। इस प्रकार, इस readout का उपयोग करके, हम मांसपेशी विशिष्ट विषाक्तता का न केवल संशोधक मिल सकता है। वर्तमान में हम प्रसार और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता ऊपर वर्णित तरीकों का उपयोग कर prion डोमेन पर उनके प्रभाव के लिए उम्मीदवार जीन परीक्षण कर रहे हैं। इन प्रयोगों के अंत में प्रोटीन समुच्चय के प्रसार transcellular सीधे अन्य ऊतकों में या सेल करने वाली सेल ट्रांसमिशन और गैर सेल स्वायत्त विषाक्तता uncoupled हो सकता है अगर मनाया विषाक्तता से जुड़ा हुआ है कि क्या खोलेगा।

साथ में ले ली, वर्णित विधि संभावित जनसंपर्क की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसी का उपयोग कर सेलुलर और जीवधारी के स्तर पर प्रोटीन के आयन की तरह व्यवहार एलिगेंस।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

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