Onderzoek naar de verspreiding en de toxiciteit van Prion-achtige eiwitten met behulp van de Metazoan modelorganisme

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), en overdraagbare spongiforme encefalopathieën (TSE's), worden geassocieerd met aggregerende eiwitten en daarmee gezamenlijk bekend als eiwit misfolding stoornissen (PMDs ). TSE of prion ziekten vormen een unieke klasse van PMDs doordat zij infectieuze bij mens en dier 1 kan zijn. Op moleculair niveau, prionen repliceren door het aantrekken en het omzetten van monomere α-helix-rijk-gastheer gecodeerd cellulaire PrP (PrP C) in de pathologische β-sheet-rijke Prpsc conformatie 2,3. Zelf propageren eiwit aggregaten zijn ook geïdentificeerd in schimmels, die belangrijke kenmerken van zoogdieren prionen 4,5 delen. Daarnaast zoogdieren prionen kunnen verplaatsen van cel tot cel en infecteren naïeve cellen 6,7.

Terwijl PMDs other dan TSE's zijn niet besmettelijk, ze delen een gemeenschappelijke pathogene principe met prionziekten 8,9. Hoewel de eiwitten verbonden aan elk van de PMDs niet verbonden zijn in structuur of functie, ze vormen aggregaten via een kristallisatieproces-achtige proces genaamd kiemvorming of geënt polymerisatie; bovendien eiwithoudende zaden te laten groeien door het aantrekken van hun oplosbare isovormen 2,10,11. De efficiëntie zichzelf propageren varieert in vivo afhankelijk van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, die samen met andere cellulaire factoren zoals moleculaire chaperones tarieven aggregaat kiemvorming, zaaien, fragmentatie en verspreiding 12-15 uiteindelijk bepalen. Daarom moet er een goede balans tussen deze factoren efficiënte propagatie van eiwit aggregatie toelaat bestaan. Dit zou ook verklaren waarom slechts enkele amyloïdogene aggregaten haven de kenmerken van een prion, en dus niet alle PMDs zijn besmettelijk. Prionen lijken o 'top-performers' vertegenwoordigenfa breed spectrum van zelfreplicerende eiwitachtige aggregaten, waardoor ze een krachtig hulpmiddel om PMDs 8,13 studeren maakt.

Intrigerend de toxiciteit geassocieerd met ziekte gerelateerde aggregaten vaak niet cel autonoom component 16,17. Dit betekent dat zij invloed naburige cellen die geen expressie het overeenkomstige gen, in tegenstelling tot een strikt cel autonoom effect, wat impliceert dat alleen de cellen die het gen vertonen specifieke fenotype. Deze werd overtuigend aangetoond door weefsel-specifieke expressie of neerhalen van de respectievelijke eiwitten in tal van modellen van neurodegeneratieve ziekten 18-26. Verschillende mechanismen zijn voorgesteld als basis voor deze niet-cel autonome toxiciteit in PMDs, waaronder verminderde toevoer van voedingsstoffen, onbalans in neuronale signalering, glutamaat excitotoxiciteit en neuroinflammation 16,27,28. Bovendien, een prion-achtige beweging van ziekte gekoppelde aggregaten tussen cellen might dragen bij aan dit aspect 29,30. Meer bewijs suggereert dat andere eiwitten insluitsels dan prionen kan overbrengen van cel-cel, wat kan verklaren de karakteristieke verspreiding pathologie waargenomen in vele PMDs 30-36. Echter, het is nog te bepalen of er een duidelijk oorzakelijk verband tussen de intercellulaire beweging van ziekte-eiwitten en het toxische effect op naburige cellen. Daarom is een beter begrip van de cellulaire routes die cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit grondslag liggen noodzakelijk en essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutica. Maar veel aspecten van prion-achtige verspreiden en cellulaire factoren die cel tot cel transmissie van verkeerd gevouwen eiwitten beïnvloeden metazoa niet goed begrepen, in het bijzonder op organismale niveau.

De nematode Caenorhabditis elegans heeft een aantal voordelen die het potentieel heeft ontdek nieuwe facetten van prion-achtige spreading in metazoa 17. Het is transparant, waardoor in vivo volgen van fluorescent gelabeld eiwitten in de levende organisme. Verder veel cellulaire en fysiologische processen die door ziekte zijn geconserveerd tegen wormen menselijke en C. elegans ook geschikt zijn voor een breed scala van genetische manipulatie en moleculaire en biochemische analyses 37-39. Precies 959 somatische cellen vormen de volwassen hermafrodiet met een eenvoudige lichaam plan dat nog steeds heeft een aantal verschillende soorten weefsel, met inbegrip van de spieren, neuronen en darm.

Om een nieuwe prion model in C. vestigen elegans, kozen we ervoor om exogeen drukken de goed gekarakteriseerd glutamine / asparagine (Q / N) rijke prion domein NM van de cytosole gist prion eiwit Sup35, aangezien er geen bekende endogene prion-eiwitten in wormen 4,40. Gist prionen zijn van onschatbare waarde in het ophelderen van fundamentele mechanismen van prion replicatie 41-44 geweest. Bovendien, NM is de sparst cytosolische prion-achtige eiwit dat is aangetoond dat de volledige levenscyclus van een prion recapituleren in zoogdiercelkweek 45,46. Ook bij expressie in C. elegans, het opmerkelijk goed vastgesteld aan de verschillende vereisten voor propagatie in metazoan cellen vergeleken met gistcellen vertoonden belangrijkste kenmerken van prion biologie 40. NM aggregatie geassocieerd met een ernstige toxische fenotype, zoals verstoring van mitochondriale integriteit en het uiterlijk van Sup35 prion domein verschillende autophagy gerelateerde blaasjes op cellulair niveau, alsmede embryonale en larvale arrestatie, ontwikkelingsachterstand en een wijdverspreide verstoring van de eiwitvouwing omgeving op het organismale niveau. Opvallend het prion domein vertoont cel zelfstandige en niet cel autonoom toxiciteit, die naburige weefsels waarin het transgen niet tot uitdrukking. Verder wordt de vesiculaire transport van het prion-domein binnen en tussen cellen gecontroleerd real time <em> In vivo 40.

Hier beschrijven we hoe u prion-achtige verspreiding in C. onderzoeken elegans. We zullen uitleggen hoe de intra- en intercellulaire transport van blaasjes met daarin het prion domein met behulp van time-lapse fluorescentie microscopie te monitoren. We zullen het gebruik van weefsel-specifieke vouwen sensoren benadrukken en alomtegenwoordig uitgedrukt stress-verslaggevers naar cel autonome en niet-cel autonome effecten op cellulair conditie te bepalen. Ten slotte zullen we de procedure van een onlangs uitgevoerde genoomwijde RNA interferentie (RNAi) scherm te beschrijven om nieuwe modifiers van prion-geïnduceerde toxiciteit identificeren. Tezamen kunnen deze werkwijzen helpen plagen elkaar genetische routes betrokken bij de intercellulaire beweging van eiwitten en hun niet cel autonoom toxiciteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Monitoring transcellulaire Verspreiding van prion-achtige eiwitten door In Vivo Time-lapse Imaging

OPMERKING: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) en transgene lijnen volgens standaardwerkwijzen en de kweektemperatuur 47 zorgvuldig regelen.

  1. Genereren van transgene lijnen van C. elegans uiting van de prion-achtige eiwitten, gelabeld met monomere rood fluorescerend eiwit (mRFP). Bekijk deze video die laat zien hoe micro-injectie 48 gebruiken. Voor verdere details en methoden beschrijven hoe deze extrachromosomal lijnen integreren, zie 49.
  2. Bereid gesynchroniseerd populatie door het leggen van eieren of bleken volgens standaardmethoden 50.
    1. Synchronisatie van de eileg
      1. Transfer 10-20 gravid volwassenen op een bord en laat ze eitjes leggen voor 1-2 uur. Verwijder volwassenen uit de plaat en laat het nageslacht te laten groeien tot de gewenste leeftijd.
    2. <li> Synchronisatie door bleken
      1. Verzamel een gesynchroniseerde populatie van zwangere volwassenen en bleken ze met alkalische hypochlorietoplossing (250 mM NaOH en 1: 4 (v / v) verdunning van commercieel bleekmiddel in H2O). Was de eieren twee keer (218 g gedurende 1 min) met M9 buffer 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, voeg dH 2 O tot 1 L).
      2. Laat ze uitkomen in M9 buffer zacht schudden O / N bij 20 ° C. Ontwikkeling worm arresteren L1 fase in afwezigheid van een voedingsbron, waardoor een gesynchroniseerde bevolking. Transfer L1s op verse Nematode Growth Media (NGM) platen bezaaid met OP50 E. coli bacteriën en laat het nageslacht te ontwikkelen tot de gewenste 47-jarige leeftijd.
  3. Bereid 2% agarose pads (in H2O) op een microscoopglaasje beschreven 50.
    1. Bereid twee microscope dia etikettering tape die over hun gehele lengte worden gebruikt als afstandhouders. Plaats een derde microscoopglaasje daartussen.
    2. Los 2% agarose in H 2 O en de pipet een druppel op de schone dia.
    3. Plaats een vierde dia loodrecht op de drie glijbanen bovenop de agar vallen. Druk voorzichtig naar het pad plat dezelfde dikte als de etikettering tape.
    4. Laat het drogen gedurende 1 minuut voordat u de afstandhouders en de dia's voorzichtig te trekken uit elkaar. De agarkussen zal vasthouden aan een van hen.
  4. Pipet ~ 10 ul verdoving (2 mM levamisol in M9 buffer) aan de pad en de overdracht ~ 10 dieren met behulp van een platina draad pick. Dek af met een deksel slip (~ 22 x 22 mm) en neem beelden in 1 uur.
  5. Als alternatief, om films te verwerven over een langere periode van tijd of om de mogelijkheid van elke beweging van de dieren verder te verminderen, gebruik maken van een combinatie van verdoving en kraal immobilisatie 51.
    1. Bereid 10% agasteeg pads (in M9 buffer), zoals beschreven 51 en wormen tot 3 pi nanosfeer grootte normen oplossing (polystyreen korrels, 100 nm) plus 3 pi verdoving (4 mM levamisol in M9 buffer) toe te voegen. Bedek voorzichtig met een dekglas. Om uitdroging te voorkomen, sluit de deksel slip met valap (mengsel van gelijke hoeveelheden van vaseline, lanoline, en paraffine).
  6. Afbeelding geïmmobiliseerd wormen met een confocale microscoop.
    NB: resultaten worden verkregen met een draaiende schijf AF confocale microscoop uitgerust met een EM-CCD camera en een Microscopie Automation & Image Analysis Software zoals MetaMorph en schetsen onder de details, maar vergelijkbare confocale beeldvormende systemen kunnen ook worden gebruikt.
    1. Gebruik de 63X of 100X / 1.4NA olie objectief en plaats de microscoop dia met wormen in de houder microscoop dia.
    2. Open de software. Pas laservermogen en filters voor mRFP beeldvorming. Gebruik de 561 nm laser op 10% vermogen en emissie filter> 600 nm.
    3. Onder het tabblad "Opslaan" te selecteren of de map directory waar de bestanden moeten worden opgeslagen creëren. Wijs een naam aan het bestand.
    4. Onder het tabblad "Golflengte" te selecteren voor de juiste belichting en de belichting en gain. Gebruik "YokoQuad Red" (of een gelijkwaardige belichtingsinstelling voor mRFP beeldvorming) met een belichting tussen 100 en 300 msec en een camera versterking tussen 100 en 300, afhankelijk van het individu monster (bepaald door de live image).
    5. Onder het tabblad "Timelapse" selecteer "Aantal tijdstippen" = 301, "Duur" = 5 min en "Time / Interval" = 1 sec.
    6. Onder de "Journals" tab selecteer Journal: "AFC SET Z HOLD" en "AFC Terug naar Z HOLD", Type: &# 8220; Special "(tweemaal), Initial Point:" Begin van tijdstip "en" End of tijdstip ". Deze autofocus optie is belangrijk beeld hetzelfde gedeelte over een langere periode.
    7. Wanneer de installatie is voltooid, drukt u op "Acquire". De timelapse video wordt Safed als afzonderlijke TIFF-bestanden.
    8. Open alle .tiff bestanden van een gegeven tijdreeks in ImageJ. Ga naar "Beeld" → "Stacks" → "Beelden aan Stacks". Eventueel, de helderheid en het contrast, voeg grootte bar, enz. De film onder "File" exporteren → "opslaan als" → "AVI ..." (voor een voorbeeld, zie video 1 en 2 overeenkomt met figuur 1).

2. Met behulp van Folding Sensoren en Stress Reporters om Cell autonome en niet-autonome cel beïnvloedt op Proteostasis en toxiciteit Onderzoek

  1. Genereren van transgene lijnen die een opvouwbare sensor of stress reporte coexpressr samen met de prion-achtige eiwit. Voor methoden over hoe te kruisen vestigen of het genereren van transgene lijnen, zie 48,49,52. Zie tabel 1 voor een overzicht van C. elegans stammen die gebruikt kunnen worden.
  2. Bereid gesynchroniseerde populaties van transgene dieren en groeien ze tot de gewenste leeftijd als hierboven (paragraaf 1.2) 50 beschreven.
  3. Met een stereomicroscoop, onderzoekt de respectievelijke fenotype van de vouwen sensor of stress reporter.
    1. Voor het vouwen sensor bepaalt het aantal dieren herbergen aggregaten op elke dag na synchronisatie (voor een voorbeeld zie Figuur 2E en F).
    2. Voor de stress reporter, indien aan de co-expressie van het prion-achtige eiwit resulteert in een verhoogde fluorescentie van de reporter (voor een voorbeeld zie figuur 3).

3. Genoom-brede scherm voor Onderdrukking van-Prion geïnduceerde toxiciteit in C. elegans

Figuur 4
Figuur 4. Schematische weergave van de RNAi screening protocol. Zie protocol hoofdstuk 3 voor een gedetailleerde beschrijving van de verschillende stappen.

  1. Synchronisatie van C. elegans wormen en duplicatie van RNAi bibliotheek
    1. Voor het scherm RNAi, gebruik dan de Ahringer RNAi bibliotheek (of de Vidal RNAi bibliotheek) 53,54. Rearray de RNAi bibliotheek van de oorspronkelijke 384 putjes in platen met 96 putjes door het vullen van de platen met 100 pi LB-amp medium (50 ug / ml ampicilline in LB) aangevuld met 10% glycerol en beënt met een 96-pin replicator. Kweek bij 37 ° CO / N onder roeren en bewaar bij -80 ° C.
    2. Onderhouden C. elegans WT en transgene lijnen bij 20 ° C op NGM platen geënt met OP50 E. coli volgens standaardwerkwijzen 47.
    3. Synchroniseer prion domein transgene en WT (controle) nematoden door bleken (zie paragraaf 1.2).
    4. Op dezelfde dag dat de wormen worden gebleekt, bereiden LB media aangevuld met 50 ug / ml ampicilline. Gebruik een geautomatiseerde reagens dispenser te zien (of pipet handmatig) 65 pl van de LB-amp medium in elk putje van een plaat met 96 putjes.
    5. Verwijder 96 goed Ahringer RNAi bibliotheek platen van -80 ° C en breng ze naar een steriele kap bekleed met keukenpapier. Verwijder direct de seal-tape door het vasthouden van de plaat ondersteboven terwijl platen zijn nog bevroren, let daarbij goed op besmetting door het ijs aan de buitenkant van de platen te voorkomen. Reinvert de platen en laat ze ontdooien voor ongeveer 30 min.
    6. Dompel een steriele 96 pin replicator in een RNAi bibliotheek plaat, en dan in één vers LB-amp plaat. Gebruik een verse steriele replicator voor elke plaat. Dicht alle platen met zelfklevende folie tape en de terugkeer van de bibliotheek platen tot -80 ° C. De replicators kan worden gedrenkt in bleekwater, gespoeld,en geautoclaveerd opnieuw gebruiken.
    7. Laat gedupliceerd RNAi platen groeien O / N in een incubator op 37 ° C en 300 rpm. Om HT115 E. gebruiken coli bacteriën die de lege vector (L4440) als controle, groeien afzonderlijk een kweekbuis en pipetteer 65 pl van de kweek met een multichannel pipet in een kwart van twee 96 well platen.
  2. Inductie van bacteriële dsRNA productie en toevoeging van wormen
    1. Verdun isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) tot een 5 mM concentratie DDH 2 O. Gebruik een geautomatiseerd werkstation met een meerkanaals kop te zien (of pipet handmatig) 10 pl verdund IPTG in elk putje van de RNAi bacteriën en controle platen. Hersluiten en plaats de platen weer in de incubator. Laat ze schud gedurende 3 uur bij 37 ° C.
    2. Terwijl bacteriën worden schudden, de voorbereiding van de wormen. Meng de M9 / worm ophanging goed, en pipet een kleine steekproef (~ 5-10 ul) om een ​​glas microscoop dia. Tellenhet aantal wormen onder een stereomicroscoop en bereken het aantal wormen per pi.
    3. Met steriele techniek wordt een oplossing van aangevuld M9 (M9 +) met de volgende uiteindelijke concentraties: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml cholesterol, 50 ug / ml ampicilline, 9,6 ug / ml tetracycline, 0,0835 ug / ml Fungizone, en 15 wormen per 50 pi.
      1. Maak afzonderlijke oplossingen voor prion domein transgene en WT wormen. Het uiteindelijke volume van M9 + worm oplossing nodig is afhankelijk van het aantal platen RNAi gekopieerd (zie hieronder), plus ~ 30 ml dode volume in het reservoir blijft, indien een automatische dispenser wordt gebruikt.
    4. Na de 3 uur inductie van bacteriële dsRNA productie, neem de platen uit de couveuse en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur (~ 30 min) om warmte te worden voorkomen dat het dier.
    5. Pipetteer 50 ul M9 + prion domein transgene worm oplossing in elk putje van de RNAi platen en een van de lege vector controle platen. MakenZorg ervoor dat de worm oplossing voor elke stap samen, aangezien de dieren hebben de neiging om te bezinken naar de bodem van het reservoir.
    6. Doseer WT wormen in de tweede controle bord. Laat de platen ontzegeld om beluchting mogelijk te maken. Om de vloeistof cultuur verdampt houden, stapelen 4-5 platen samen en wikkel met een vochtige papieren handdoek en aluminiumfolie. Incubeer bij 200 rpm bij 20 ° C gedurende 4 dagen.
  3. Scoren
    OPMERKING: Na 4 dagen in de couveuse, zullen de wormen zijn op de tweede dag van de volwassenheid en zijn klaar om te screenen. Laat de dieren aan te passen aan niet schudden voorwaarden gedurende 30 minuten voordat het screenen om ongestoord pak slaag te garanderen.
    1. Met behulp van een Falcon 4M60 camera aangesloten op een computer met een monitor, scherm visueel voor verhoogde pak slaag in vergelijking met controle behandelde prion domeinbeheer transgene dieren.
    2. Opstelling van een lijst van voorlopige treffers te bevestigen met behulp van wrMTrck (zie volgende paragraaf).

4. Bevestiging van de VoorlopigeScreen Hits

  1. Beweeglijkheid test op vaste platen
    1. Bereid platen met NGM aangevuld met 100 ug / ml ampicilline, 12,5 ug / ml tetracycline en 1 mM IPTG, volgens standaardmethoden 47. Indien mogelijk, gebruik maken van een plaat gieten machine om te verzekeren alle platen hebben dezelfde hoogte van de media, die zal zorgen voor een meer gestroomlijnde video overnameproces.
    2. Groeien de verschillende RNAi klonen in ~ 1 ml LB + 50 pg / ml ampicilline, O / N bij 37 ° C en 250 rpm.
    3. De volgende dag, induceren de expressie van het dsRNA met 1 mM IPTG gedurende 3 uur. Zaad van de platen met 150 pi van elk RNAi bacteriële kloon, verspreid in een dunne laag. Laat de bacteriën droog gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur in het donker. Bereid 3 platen per RNAi kloon.
    4. Synchroniseer de worm bevolking door het bleken volgens standaardmethoden 50 (zie paragraaf 1.2), en laat de eieren uitkomen O / N in M9 media.
    5. Neem een ​​monster van de worm suspensie en het bedrag van nematodes per ul in de stereomicroscoop. Dan, pipet van de juiste omvang van de M9 plus wormen in elke experimentele plaat, zodat het bevat 25 - 30 L1 wormen. Groeien de nematoden bij 20 ° C gedurende 4 dagen tot de wormen bereiken dag 2 van volwassenheid.
  2. Kwantitatieve analyse van de worm beweeglijkheid met de wrMTrck plugin voor ImageJ
    OPMERKING: De video's zijn opgenomen met een stereomicroscoop bij 10x vergroting met een Hamamatsu Orca-R2 digitale camera C10600-10B en de Hamamatsu Eenvoudige PCI-imaging software.
    1. Schakel de camera en de Simple PCI imaging software. Klik op "live" om afstelling van de beeldvorming voorwaarden.
    2. Het opzetten van de video voorwaarden als volgt: Gain = 0; Light Mode = High; Speed ​​index = 1; Binning = 2. Klik op "Auto Expose" en pas dan de lichtomstandigheden, het verplaatsen van de microscoop spiegels en de helderheid en het contrast wijzerplaten.
      OPMERKING: De video moet op een hoog contrast zonder OVEREXP hebbenosed, zodat de dieren als zwarte vormen op een heldere achtergrond.
    3. Klik op "Time Scan" en kies een map en een bestandsnaam. Stel "Field Delay" tot 20 msec en "Stop bij Time" tot 30 sec. Druk op "Live-beoordeling" om de oppervlakte van de plaat ervoor kiezen om op te nemen (waar de meeste wormen zijn). Tik op de plaat 3 of 4 keer op het podium, snel te bevestigen haar positie op het gebied van uitzicht en druk op "Start".
    4. Na het einde van de film opnemen, klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en kies "Exporteren Montage Sequence" om de film uit een .cxd formaat te exporteren naar een .avi.
  3. Het analyseren van de beweeglijkheid video
    1. Open de ImageJ software, ga naar het tabblad "Plugins", dan "wrmtrck" en selecteer "wrMTrck Batch". Selecteer de map met alle bestanden te analyseren.
    2. In de belangrijkste ingang raam van wrMTrck_Batch, laadt de input waarden zoals beschreven in Figure 5C. Verklaring voor elk van de parameters vindt u in de instructies die de plugin te begeleiden. Klik op "OK" en laat de bewegingsanalyse run.
    3. Om de resultaten samen te stellen en te bevestigen dat alle gedetecteerde tracks zijn van de werkelijke C. elegans en elimineren van artefacten, opent elk van de .txt-bestanden die zijn gemaakt voor elke film en kopieert de gegevens naar een data-analyse software-bestand. Open het "* _labels.zip" bestanden die zijn gemaakt en voer het resulterende "* _labels.tif" om handmatig te controleren en valse worm tracks te elimineren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Monitoring intercellulaire verspreiding van prion-achtige eiwitten door in vivo time-lapse imaging

Transgene C. elegans lijnen expressie de prion domein zijn bijzonder geschikt voor de analyse van bepaalde aspecten van prion-achtige eiwitten, bijvoorbeeld cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit. De transparantie van de dieren maakt het bijhouden van fluorescent gelabelde eiwitten vanuit het levende organisme in elke fase van het leven. Gebruikmakend van deze beweging van prion-achtige eiwitten in cellen en weefsels met behulp van een fluorescentie microscoop worden gevisualiseerd. Een 63X en 100X / 1.4NA olie doel moet de vesiculaire structuren lossen. Belangrijk, de prion domein worden gelabeld met mRFP, om binnen deze vermoedelijk zure blaasjes 40 fluorescent zichtbaar blijven. Gele fluorescerend eiwit (YFP), welke vaak wordt gebruikt als een label, iis niet geschikt omdat het geblust in een omgeving van lage pH 40,55. Stam AM815 expressie-RFP gelabeld R2E2 (een zeer aggregerende en giftige vorm van het prion domein NM) dat zich ophoopt in buisvormige vesicles, terwijl de RFP tag alleen oplosbaar blijft (Figuur 1A en B). Met behulp van in vivo time-lapse imaging, kan worden opgemerkt dat deze buisvormige blaasjes in en tussen cellen 40 (figuur 1C en D, Video 1 en 2) [plaats links naar video worden vervoerd 1 en 2 hier].

Met behulp van vouwen sensoren en stress verslaggevers naar cel autonome en niet-cel autonome effecten op proteostasis en toxiciteit te onderzoeken

Prionen zijn in staat om zaad gerelateerde eiwitten te steken en verstoren de cellulaire eiwitten vouwen milieu. Dit kan worden aangetoond door middel van de co-expressie van geschikte vouwen sensors. Folding sensoren niet-essentiële metastabiele eiwitten die afhankelijk zijn van een functionele proteostasis netwerk te kunnen vouwen. Voorbeelden zijn de bekende vuurvlieg luciferase en eiwitten herbergen temperatuurgevoelige (ts) mutaties 56-66. Een verstoring van proteostasis leidt verkeerde vouwing van de reporter die gedetecteerd kan worden door visueel onderzoek van aggregaten of door blootstelling van de respectievelijke ts mutant fenotype bij permissieve temperatuur. Stukken van polyglutamine (polyQ) met een lengte op de drempel van aggregatie (ongeveer 40 residuen) worden ook vaak gebruikt omdat ze vertonen een leeftijdsafhankelijke aggregatie 67-69. Eerder begin van aggregatie onthult een gecompromitteerde vouwen omgeving. Hier gebruikten we een prion mutant RΔ2-5 dat oplosbaar blijft bij expressie in C. elegans lichaamswand spier (BWM) cellen en darmen 40 (figuur 2A en C). Bij gelijktijdige expressie met R2E2 in BWM cellen, RΔ2-5 reaDily aggregaten (figuur 2B), het onthullen van een cel autonoom effect van R2E2 op het vouwen van eiwitten milieu. De wijdverspreide effect op proteostasis en inductie van misvouwing in weefsels kunnen worden geëvalueerd door de expressie van het vouwen sensor in een afzonderlijke weefsel dat niet tot expressie het hoogst aggregerende vorm van het prion domein. R2E2 werd uitgedrukt onder een BWM cel specifieke promotor (myo-3p), terwijl RΔ2-5 werd uitgedrukt onder een darm-specifieke promotor (VHA-6p). Aggregatie van intestinale RΔ2-5 toont aan dat R2E2 beïnvloedt het vouwen van eiwitten in een niet-cel autonoom 40 (figuur 2D). In plaats van RΔ2-5, waar aggregaten alleen kan worden gedetecteerd met hoge resolutie, het gebruik van polyQ44 expressie in de darm (Q44i) maakt visualisatie van aggregaten lage resolutie onder een stereomicroscoop (Figuur 2E en F). Bovendien is dit mogelijk een kwantificering van animals met aggregaten, en een kwantificering van het aantal aggregaten.

Aan niet cel autonoom toxiciteit van het prion domein onderzoeken we eerder onderzocht naburige weefsels die niet tot expressie R2E2 van elektronenmicroscopie en gevonden dat expressie van het prion domein spiercellen leidt tot een niet cel autonoom verstoring van mitochondriale integriteit in aangrenzende weefsels, zoals de darm 40. Mitochondriale disfunctie resulteert in een verhoogde reactive oxygen species (ROS) productie en oxidatieve stress. Een niet-invasieve manier om inductie van de oxidatieve stressrespons visualiseren is om een oxidatieve stress induceerbare reporter 70 gebruiken. De stam CF1553 uitdrukt groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de oxidatieve stress induceerbare promoter zode-3 70. Bij gekruiste dieren expressie het prion domein R2E2 in BWM cellen, werd het reporter aanzienlijk opgereguleerd in BWM cellen alsook in talloze niet-BWM weefsels ( Tabel 1 geeft een lijst van C. elegans stammen die vouwen sensoren en stress reporters die op analoge wijze kunnen worden gebruikt.

Genoom-brede scherm voor de onderdrukking van de prion-geïnduceerde toxiciteit in C. elegans

Het complex toxiciteit fenotype van het prion domein uitgedrukt in C. elegans is bijzonder interessant vanwege het ontbreken van waarneembare toxiciteit waargenomen bij de meeste in vitro prion modellen 71. Dit model zou kunnen nieuwe routes die de toxiciteit in verband met prionen in metazoa kunnen beïnvloeden onthullen. Om dit aan te pakken, hebben we gescreend op genen die, wanneer RNAi-uitgeput, zou de beweeglijkheid defect van R2E2 transgene dieren te verbeteren. Controle behandelde WT wormen kunnen worden gebruikt als positieve control, hoewel de meeste kandidaatgenen zal niet de volle beweging fenotype redding, dankzij de variabele penetrantie RNAi en de hoge toxiciteit van het transgen. De dieren werden gedurende 4 dagen met RNAi, van de eerste larven staat L1 tot dag 2 van volwassenheid. Tegen die tijd, het dorsen onbehandeld R2E2 dieren aanzienlijk langzamer dan het dorsen van WT dieren, wat belangrijk is omdat we screenen op een verbetering van de beweeglijkheid. F1 nakomelingen aanwezig (~ L1s), maar is gemakkelijk te onderscheiden van de P0 generatie. Alleen de P0 generatie gescoord. Deze eerste scherm is visuele en niet kwantitatief en daarom werd er een lage drempel gehanteerd om voorlopige treffers te identificeren, wat betekent dat elke bacteriële RNAi kloon dat leek de pak slaag van prion-uiting dieren te verhogen werd opnieuw getest in een kwantitatieve kruipen test. Figuur 4 schetst de belangrijkste stappen van het instellingenscherm. De hoge resolutie van de Falcon 4M60 camera ingeschakeld een visuele screening van een quarter van de plaat in een tijd op een computerscherm, waardoor het scherm om efficiënter te worden ingevuld. Hoewel nuttig, is dit niet noodzakelijk. De visueel onderzoek worm dorsen kan ook worden uitgevoerd door een stereoscoop bij lage vergroting (10X).

Bevestiging van de voorlopige scherm treffers

High throughput schermen worden uitgevoerd als een aanpak die het mogelijk maakt het analyseren van het gehele genoom effecten om een ​​primaire lijst van kandidaat-genen die kunnen worden verfijnd door complementaire methoden te verkrijgen. Validatie van de resultaten scherm is daarom essentieel om mogelijke valse positieven, die zou kunnen voortvloeien uit het uitvoeren van een scherm met slechts één experimentele monster per RNAi elimineren. R2E2 transgene dieren werden gevoed met de RNAi klonen primaire treffers en maten hun snelheid op NGM platen op de tweede dag van volwassenheid, als een meetbare uitlezing van motiliteit en verminderde toxiciteit. We gebruikten de wrMTrck plugin voor ImageJ, ontwikkeld in onzelaboratorium, die nauwkeurig identificeert C. elegans in video's en volgt hun beweging. De wrMTrck plugin en scripts voor geautomatiseerde analyse zijn open-source en publiekelijk verkrijgbaar bij http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html, samen met gedetailleerde instructies over hoe het te gebruiken. Na het downloaden, kopiëren de hele wrMTrck map naar de map Plugins van ImageJ. Dit protocol beschrijft de wrMTrck_Batch methode, de voorkeur voor het analyseren van een groot aantal video's in een tijd, maar aanwijzingen voor een handleiding, film van film, analyse zijn ook verkrijgbaar met de plugin te downloaden. WrMTrck_Batch zet een originele video (figuur 5A) in een binair formaat met achtergrond aftrekken en elke worm is een nummer toegewezen. Elk van de verwerkte video kan later worden bekeken met deze sporen gesuperponeerd teneinde alle artefacten die ten onrechte werden geïdentificeerd als wormen (e. G., Nummer 1 in figuur 5B) handmatig heffen. Een effectieve manier om de stand van de techniek te elimineren ifacts (aangegeven met een pijl in Figuur 5B) moet zorgvuldig kiezen van de minimale en maximale afmetingen van de objecten worden geïdentificeerd (Figuur 5C). Uit de verschillende uitgangen van de wrMTrck plugin gebruiken we het lichaam lengten per seconde parameter (BLPS) dat de gemiddelde snelheid van elk dier, vertegenwoordigd door de lengte van elk spoor gedeeld door de lengte van elk object meet, waardoor normaliseren voor potentiaalverschillen grootte van de nematoden (Figuur 5D). Met deze methode identificeerden we 35 onderdrukkers van prion-geïnduceerde toxiciteit (sopt) de motiliteit fenotype verhoogd R2E2 expressie C. elegans ten minste 133% en 256% in vergelijking met lege vector behandelde wormen (figuur 6). Deze sopt genen vertegenwoordigen de uiteindelijke bevestigd hits die het gevolg is van onze high throughput screening inspanningen.

21fig1highres.jpg "/>
Figuur 1. Het prion domein verspreidt tussen cellen en weefsels in C. elegans door vesiculaire vervoer. (A) Ingestort confocale z-stacks van nematoden uiten RFP in het lichaam muur spier (BWM) cellen (RFPm). (B) Ingestort confocale z-stacks van nematoden uiting van de zeer giftige en aggregatie gevoelig NM variant, R2E2 , in BWM cellen (R2E2m). Pijlen geven buisvormige blaasjes, pijlpunt geeft aggregaat. (C + D) Time-lapse serie dieren uiten RFPm (C) en R2E2m (D). Pijlen geven gebieden van vesiculaire beweging. RFPm vertoont meestal een diffuse kleuring. Zelfs wanneer RFPm wordt gevonden in blaasjes, die nauwelijks bewegen. R2E2m lokaliseert talrijke blaasjes die binnen en tussen cellen worden getransporteerd. Schaalbalken: 10 pm. De bijbehorende video's 1 en 2 [plaats links naar Video 1 en 2 hier] komen overeen met de figuren 1C en D,respectievelijk.

Figuur 2
Figuur 2. Folding sensoren onthullen de wijdverspreide effect van het prion domein proteostasis. (A + B) Co-expressie van R2E2m bevordert RΔ2-5m aggregatie. Confocale beelden van (A) RΔ2-5m controle en (B) RΔ2-5m co-expressie gebracht met R2E2m in BWM cellen. (C + D) Muscle (C) confocale beeld van controledier expressie RΔ2- uitgedrukt R2E2m bevordert intestinale RΔ2-5i aggregatie. 5i in intestinale cellen. (D) confocale beeld dieren expressie R2E2m in BWM cellen en RΔ2-5i in de darm. Schaalbalken: 10 micrometer (E + F) R2E2m induceert non cel autonome aggregatie van Q44i (E) Vertegenwoordiger fluorescerende beelden van Q44i en Q44i; R2E2m dieren 4 dagen na het overbrengen gesynchroniseerd L1 lar..vae op verse OP50-geplaatste NGM platen. De expressie van R2E2 in BWM cellen leidt tot een eerder begin van Q44i aggregatie in de darm. (F) Kwantificering van dieren aggregaten (in%) op aangegeven dagen na synchronisatie. Foutbalken vertegenwoordigen SD Dit cijfer is gewijzigd van 40.

Figuur 3
Figuur 3. De SOD-3p :: GFP transcriptionele stress-reporter blijkt dat het prion domein veroorzaakt cel autonome en niet-autonome cel inductie van oxidatieve stress. (A + B) Vertegenwoordiger fluorescerende beelden (met dezelfde belichtingstijd) van zode-3p :: GFP tot expressie controle dieren (A) en zode-3p :: GFP;. R2E2m dieren (B) op dag 2 van de volwassenheid (C) De expressie van R2E2 in BWM cellen leidt tot een inductie van de verslaggever niet alleen in BWM cels (I), maar ook in de darm (II), zenuwkoord (III), pharynx en hoofd neuronen (IV).

Figuur 5
Figuur 5. Analyse van worm beweging met de wrMTrck plugin voor ImageJ. (A) Voorbeeld van een film met gegenereerd door het gebruik van een geschikte vergroting (~ 10x) meerdere dieren tegelijk te controleren. (B) "* _labels.tif" -bestanden zijn een output van wrMTrck_Batch en zorgen voor handmatige conservatie van analyseresultaten. Pijl geeft een object dat correct is uitgesloten van de analyse door een geschikte keuze van minimale en maximale grootte parameters. (C) Invoer raam van wrMTrck_Batch, met parameters voor dit protocol. Deze parameters moeten worden aangepast aan de individuele microscoop en film instellingen. (D) Output resultaten van movement analyse van (B), met de kolom BLPS geel gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 1
Figuur 6. R2E2 wormen behandeld met RNAi klonen die supressors van prion-geïnduceerde toxiciteit (sopt) vertonen verbeterde motiliteit. Motiliteit wordt weergegeven als relatieve BLPS vergelijking met de negatieve controle (lege vector). Getoond zijn statistisch significant (student t-test) RNAi klonen die in het HTP scherm. zwarte ster vertegenwoordigt het als voorbeeld getoond in figuur 5 hit. De resultaten zijn vanaf 3 films, met 17 <n <53 tracks per conditie. Fout balken geven SEM. </ P>

Tabel 1. C. elegans stammen die vouwen sensoren en stress verslaggevers.

Stam naam genotype Reacties Stam bron
Folding sensoren
transgenen
AM140 unc-54p :: polyQ35 :: YFP spier-specifieke expressie van polyQ35, leeftijd afhankelijke aggregatie CGC of Morimoto lab
AM141 unc-54p :: polyQ40 :: YFP spier-specifieke expressie van polyQ40, age afhankelijke aggregatie CGC of Morimoto lab
AM801 unc-54p :: RΔ2-5 :: YFP spier-specifieke expressie van nucleatie incompetent prion domein Morimoto lab
OG412 VHA-6p :: polyQ44 :: YFP darm-specifieke expressie van polyQ44, leeftijd afhankelijke aggregatie CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: GFP; myo-2p :: mCherry darm-specifieke expressie van nucleatie incompetent prion domein Morimoto lab
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: GVB neuron-specifieke expressie van polyQ40, celtype specifieke aggregatie Morimoto lab
AM982 unc54p :: luciferase :: YFP spier-specifieke expressie van WT vuurvliegluciferase Morimoto lab myo-3p :: luciferase :: GFP; Rol-6 spier-specifieke expressie van WT vuurvliegluciferase Behl lab
sng-1p :: luciferase :: GFP; Rol-6 spier-specifieke expressie van WT vuurvliegluciferase Behl lab
FUH55 unc54p :: Fluc :: egfp; Rol-6 spier-specifieke expressie van WT vuurvliegluciferase Hartl lab
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: egfp; Rol-6 spier-specifieke expressie van R188Q mutant vuurvliegluciferase Hartl lab
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: egfp; Rol-6 spier-specifieke expressie van R188Q + R261Q dubbele mutant vuurvliegluciferase Hartl lab
FUH48 F25B3.3p :: Fluc :: egfp; Rol-6 neuron-specifieke expressie van WT vuurvlieg luciferase Hartl lab
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: egfp; Rol-6 neuron-specifieke expressie van R188Q mutant vuurvliegluciferase Hartl lab
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: egfp; Rol-6 neuron-specifieke expressie van R188Q + R261Q dubbele mutant vuurvliegluciferase Hartl lab
ts mutanten
CB1402 unc-15 (e1402) I Paramyosin (ts), temperatuurgevoelige Unc-verlamd, Laten CGC
CB1157 unc-54 (E1157) I Myosine (ts), temperatuurgevoelige Unc CGC
CB1301 unc-54 (e1301) I Myosine (ts), temperatuurgevoelige Unc CGC
CB286 unc-45 (E286) III Unc-45 (ts), temperatuurgevoelige, langzaam bewegende Unc, Egl CGC
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlecan (ts), temperatuurgevoelige Unc, stijve verlamming CGC
SD551 laat-60 (ga89) IV Ras (ts), temperatuurgevoelige Muv, Ste, Laat, Lva, Osm CGC
CX51 dyn-1 (ky51) X Dynamin (ts), temperatuurgevoelige Unc CGC
CW152 gas-1 (FC21) X Gas-1 (ts), temperatuurgevoelige EtOH gevoeligheid CGC
ZZ26 unc-63 (x26) I Acetylcholine receptor (ts), temperatuurgevoelige weerstand levamisol CGC
stress-verslaggevers
CL2070 hsp-16.2p :: gfp; rol-6 thermische stress; UPR cyto CGC
TJ375 hsp-16.2p :: GFP thermische stress; UPR cyto CGC
TJ3000, TJ3001 hsp-16.2p :: GFP; Cbr-unc-119 (+) thermische stress; UPR cyto CGC
AM446 hsp70p :: GFP; rol-6 thermische stress; UPR cyto Morimoto lab
AM722 hsp70p :: mCherry; myo-2p :: GVB thermische stress; UPR cyto Morimoto lab
AM799 hsp90p :: GFP thermische stress; UPR cyto Morimoto lab
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; Cbr-unc-119 (+) thermische stress; UPR cyto CGC
CF1553 SOD-3p :: GFP; rol-6 oxidatieve stress CGC
KN259 SOD-3p :: GFP; rol-6 oxidatieve stress CGC
CL2166 GST-4p :: GFP :: nls oxidatieve stress CGC
LD1171 GCS-1p :: GFP; rol-6 oxidatieve stress CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: GFP; rol-6 oxidatieve stress CGC
IG274 NLP-29p :: GFP osmotische stress CGC
BC20309 mtl-1p :: GFP metal stress Baillie lab
BC20342 mtl-2p :: GFP metal stress Baillie lab
BC20314 ELT-2p :: GFP metal stress Baillie lab
SJ4005 hsp-4p :: GFP UPR ER CGC
SJ4100 hsp-6p :: GFP UPR mito CGC
SJ4058 hsp-60p :: GFP UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetics Center; ts = temperatuur gevoelig; UPR = ongevouwen eiwit reactie; cyto = cytosole; mito = mitochondriale; ER = endoplasmatisch reticulum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De hier beschreven methoden helpen om te illustreren de verspreiding en de complexe cel autonome en niet-autonome cel toxiciteit van prion-achtige eiwitten. We hebben onlangs ontdekt dat een aggregatie-gevoelige cytosole prion domein wordt opgenomen in membraangebonden blaasjes in een autofagie gerelateerde proces. Een specifieke subgroep van deze vesicles transporteert het prion domein binnen en tussen cellen en weefsels 40. De sleutel tot hun beweging in het levende dier volgen is dat het eiwit moet worden gelabeld met mRFP, omdat alleen mRFP-gemerkte eiwitten werden zichtbaar in deze vermoedelijk zure blaasjes. Met behulp van dezelfde benadering, zijn we momenteel onderzoek naar de potentiële prion-achtige gedrag van bepaalde ziekte-gerelateerde eiwitten, zoals superoxide dismutase 1 (SOD1) (gekoppeld aan ALS), alfa-synucleïne (gekoppeld aan PD) of TAR DNA-bindend eiwit 43 (TDP-43) (gekoppeld aan ALS). Hoewel dit intercellulaire vervoer binnen blaasjes lijkt te worden gebruikt door verschillende andere eiwitten, kunnen er eenbijkom paden die het mogelijk maken het verspreiden.

Het gebruik van goed gekarakteriseerd vouwen sensoren is een krachtig instrument om de effecten op de cellulaire eiwitten vouwen milieu in C. bewaken elegans 63-66. Hier hebben we laten zien hoe je de leeftijd afhankelijke ophoping van fluorescent gebruiken tagged aggregatie gevoelig eiwitten onder weefsel-specifieke initiatiefnemers om visueel het vouwen capaciteit van de verschillende weefsels tegelijkertijd bewaken. Andere mogelijkheden om het organismal proteostasis netwerkstudie omvatten het gebruik van endogene ts mutante eiwitten. Deze metastabiele eiwitten functioneert normaal bij de permissieve temperatuur (15 ° C), maar misfold en wordt functioneel bij de restrictieve temperatuur (25 ° C) vertoont de karakteristieke mutant fenotype. In aanwezigheid van een combinatie gevoelig eiwit of tijdens veroudering, de ts mutant fenotype wordt blootgesteld, zelfs in permissie-omstandigheden 63-66. Sommige ts mutanten worden uitgedrukt in only een subset van weefsels of vertonen weefselspecifieke fenotypes, waardoor deze bijzonder nuttig testen cel zelfstandige en niet cel autonoom proteotoxic effecten. Bijvoorbeeld, een ts mutant van Let-60, een lid van de GTP bindende RAS oncogen familie, Ras (ts), alomtegenwoordig uitgedrukt, maar toont weefselspecifieke mutante fenotypen 63,66. Door deze ts mutant, het effect van polyQ uitbreidingen op de cellulaire proteostasis bleek cel autonoom 63 zijn. Expressie van polyQ in de genetische achtergrond van ras (ts) leverden alleen het mutante fenotype specifiek voor het weefsel waarin het eiwit tot expressie. De blootstelling van meerdere mutante fenotype zou aangeven dat een eiwit niet-cel autonome proteotoxic effecten.

Bovendien, om te testen op effecten op cellulaire stress trajecten, is er een grote selectie van in vivo fluorescente reporters spanning in C. elegans 72. Deze zijn meestal transcriptieal verslaggevers dat groen fluorescerend eiwit (GFP) uit te drukken onder een spanning-induceerbare promotor, zoals HSP-16.2p of zode-3p, die verslag uitbrengen over thermische of oxidatieve stress, respectievelijk 72. Door gebruikmaking van geschikte reporters in combinatie met prion-achtige eiwitten kan men een potentiële inductie van stressresponsen in andere dan de expressie de respectievelijke transgen weefsels controleren. Een nadeel is echter dat deze spanning reporters vaak niet gevoelig genoeg om subtiele opregulatie van een bepaald traject (ongepubliceerde observaties) onthullen.

Op onze zoektocht om te onderzoeken of genen die de niet-cel autonome toxiciteit beïnvloeden, ook van invloed eiwit verspreiden, we begonnen door te screenen op genen die, wanneer neergehaald, zou de beweging gebreken te verbeteren. Met behulp van visuele evaluatie van het zwemmen tarieven als een read-out, waren we in staat om comfortabel assay ~ 25 platen per sessie en het uitvoeren van twee rondes van dit protocol per week, wat resulteert in de voltooiingvan het eerste scherm binnen 6 weken. De bevestiging van de hits, door middel van kwantitatieve analyse van worm beweging op vaste platen, in drie exemplaren, met behulp van wrMTrck werd uitgevoerd in een extra 3 weken. Een nadeel is echter dat door kruipen in platen in plaats van zwemmen in vloeibare media als uitlezing een verloren gaan bepaalde kandidaatgenen, zwemmen en kruipen niet identiek bewegingen en kunnen worden beïnvloed door verschillende paden 73. Dus, als sommige kandidaat-genen niet kan worden bevestigd op vaste platen, moeten ze opnieuw worden getest in vloeibare media, waar zwemmen kan worden gekwantificeerd door het pak slaag frequentie tellen binnen een bepaalde tijd.

De screening hier beschreven protocol maakt gebruik van geautomatiseerde liquid handling werkstations, die sterk vermindert variabiliteit. Het nadeel is dat een overmaat van fluïda voor het reservoir van de robots nodig, die niet altijd haalbaar. Deze screening opstelling kan eenvoudig worden aangepast voor andere schermen in C. elegans </ Em> die gebruik thrashing als read-out.This scherm werd niet ontworpen om direct genen die van invloed zijn het opbrengen of niet cel autonoom toxiciteit van het prion domein, zoals genomische scherm moet eenvoudig in design identificeren teneinde te voeren in een tijdige wijze. Motiliteit gebreken kunnen ontstaan ​​niet alleen spier, maar ook van neuronale schade en een aantal andere gendefecten 53. Aldus, door deze uitlezing, we zouden niet alleen modifiers spier-specifieke toxiciteit vinden. Momenteel testen we de kandidaatgenen op hun effecten voor prion domein verspreiden en niet cel autonoom toxiciteit volgens de hierboven beschreven werkwijzen. Deze experimenten zullen uiteindelijk blijken of transcellulair verspreiding van proteïneaggregaten rechtstreeks verband met de toxiciteit waargenomen in andere weefsels of cel tot cel transmissie en niet cel autonoom toxiciteit kan worden losgekoppeld.

Samengevat kan de beschreven methoden worden toegepast om de potentiële pr onderzochtion-achtig gedrag van eiwitten op cellulair en organismaal niveau met behulp van C. elegans.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216, (4542), 136-144 (1982).
  2. Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie. Cell. 73, (6), 1055-1058 (1993).
  3. Caughey, B., Kocisko, D. A., Raymond, G. J., Lansbury, P. T. Aggregates of scrapie-associated prion protein induce the cell-free conversion of protease-sensitive prion protein to the protease-resistant state. Chem Biol. 2, (12), 807-817 (1995).
  4. Wickner, R. B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae. Science. 264, (5158), 566-569 (1994).
  5. Chien, P., Weissman, J. S., DePace, A. H. Emerging principles of conformation-based prion inheritance. Annu Rev Biochem. 73, 617-656 (2004).
  6. Kimberlin, R. H., Walker, C. A. Pathogenesis of mouse scrapie: patterns of agent replication in different parts of the CNS following intraperitoneal infection. J R Soc Med. 75, (8), 618-624 (1982).
  7. Beekes, M., McBride, P. A., Baldauf, E. Cerebral targeting indicates vagal spread of infection in hamsters fed with scrapie. J Gen Virol. 79, (3), 601-607 (1998).
  8. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  9. Aguzzi, A. Cell biology: Beyond the prion principle. Nature. 459, (7249), 924-925 (2009).
  10. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  11. Wood, S. J., et al. alpha-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease. J Biol Chem. 274, (28), 19509-19512 (1999).
  12. Wang, Y. Q., et al. Relationship between prion propensity and the rates of individual molecular steps of fibril assembly. J Biol Chem. 286, (14), 12101-12107 (2011).
  13. Cushman, M., Johnson, B. S., King, O. D., Gitler, A. D., Shorter, J. Prion-like disorders: blurring the divide between transmissibility and infectivity. J Cell Sci. 123, (8), 1191-1201 (2010).
  14. Tanaka, M., Collins, S. R., Toyama, B. H., Weissman, J. S. The physical basis of how prion conformations determine strain phenotypes. Nature. 442, (7102), 585-589 (2006).
  15. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J Struct Biol. 179, (2), 152-160 (2012).
  16. Ilieva, H., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Non-cell autonomous toxicity in neurodegenerative disorders: ALS and beyond. J Cell Biol. 187, (6), 761-772 (2009).
  17. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cell-autonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. Dis Model Mech. 7, (1), 31-39 (2014).
  18. Lino, M. M., Schneider, C., Caroni, P. Accumulation of SOD1 mutants in postnatal motoneurons does not cause motoneuron pathology or motoneuron disease. J Neurosci. 22, (12), 4825-4832 (2002).
  19. Li, J. Y., et al. Lewy bodies in grafted neurons in subjects with Parkinson's disease suggest host-to-graft disease propagation. Nat Med. 14, (5), 501-503 (2008).
  20. Desplats, P., et al. Inclusion formation and neuronal cell death through neuron-to-neuron transmission of alpha-synuclein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 13010-13015 (2009).
  21. Clement, A. M., et al. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice. Science. 302, (5642), 113-117 (2003).
  22. Gu, X., et al. Pathological cell-cell interactions elicited by a neuropathogenic form of mutant Huntingtin contribute to cortical pathogenesis in HD mice. Neuron. 46, (3), 433-444 (2005).
  23. Yamanaka, K., et al. Mutant SOD1 in cell types other than motor neurons and oligodendrocytes accelerates onset of disease in ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (21), 7594-7599 (2008).
  24. Garden, G. A., et al. Polyglutamine-expanded ataxin-7 promotes non-cell-autonomous purkinje cell degeneration and displays proteolytic cleavage in ataxic transgenic mice. J Neurosci. 22, (12), 4897-4905 (2002).
  25. Raeber, A. J., et al. Astrocyte-specific expression of hamster prion protein (PrP) renders PrP knockout mice susceptible to hamster scrapie. EMBO J. 16, (20), 6057-6065 (1997).
  26. Yazawa, I., et al. Mouse model of multiple system atrophy alpha-synuclein expression in oligodendrocytes causes glial and neuronal degeneration. Neuron. 45, (6), 847-859 (2005).
  27. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  28. Sambataro, F., Pennuto, M. Cell-autonomous and non-cell-autonomous toxicity in polyglutamine diseases. Prog Neurobiol. 97, (2), 152-172 (2012).
  29. Polymenidou, M., Cleveland, D. W. Prion-like spread of protein aggregates in neurodegeneration. J Exp Med. 209, (5), 889-893 (2012).
  30. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  31. Braak, H., Braak, E., Bohl, J. Staging of Alzheimer-related cortical destruction. Eur Neurol. 33, (6), 403-408 (1993).
  32. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  33. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  34. Clavaguera, F., et al. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain. Nat Cell Biol. 11, (7), 909-913 (2009).
  35. Nonaka, T., et al. Prion-like Properties of Pathological TDP-43 Aggregates from Diseased Brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  36. Lundmark, K., et al. Transmissibility of systemic amyloidosis by a prion-like mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (10), 6979-6984 (2002).
  37. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10, (5), 703-713 (2000).
  38. Xu, X., Kim, S. K. The early bird catches the worm: new technologies for the Caenorhabditis elegans toolkit. Nat Rev Genet. 12, (11), 793-801 (2011).
  39. Boulin, T., Hobert, O. From genes to function: the C. elegans genetic toolbox. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, (1), 114-137 (2012).
  40. Nussbaum-Krammer, C. I., Park, K. W., Li, L., Melki, R., Morimoto, R. I. Spreading of a prion domain from cell-to-cell by vesicular transport in Caenorhabditis elegans. PLoS Genet. 9, (3), e1003351 (2013).
  41. Chernoff, Y. O., Lindquist, S. L., Ono, B., Inge-Vechtomov, S. G., Liebman, S. W. Role of the chaperone protein Hsp104 in propagation of the yeast prion-like factor [psi. Science. 268, (5212), 880-884 (1995).
  42. Liu, J. J., Lindquist, S. Oligopeptide-repeat expansions modulate 'protein-only' inheritance in yeast. Nature. 400, (6744), 573-576 (1999).
  43. Halfmann, R., et al. Prions are a common mechanism for phenotypic inheritance in wild yeasts. Nature. 482, (7385), 363-368 (2012).
  44. Tyedmers, J., Madariaga, M. L., Lindquist, S. Prion switching in response to environmental stress. PLoS Biol. 6, (11), e294 (2008).
  45. Krammer, C., et al. The yeast Sup35NM domain propagates as a prion in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (2), 462-467 (2009).
  46. Hofmann, J. P., et al. Cell-to-cell propagation of infectious cytosolic protein aggregates. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (15), 5951-5956 (2013).
  47. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. (2006).
  48. Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833 (2008).
  49. Transformation and microinjection. WormBook. Evans, T. C. (2006).
  50. Methods in cell biology. Wormbooks. Shaham, S. (2006).
  51. Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization). PLoS One. 8, (1), e53419 (2013).
  52. Fay, D. Genetic mapping and manipulation: Chapter 1-Introduction and basics. WormBook. (2006).
  53. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30, (4), 313-321 (2003).
  54. Rual, J. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Res. 14, (10B), 2162-2168 (2004).
  55. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2, (12), 905-909 (2005).
  56. Kern, A., Ackermann, B., Clement, A. M., Duerk, H., Behl, C. HSF1-controlled and age-associated chaperone capacity in neurons and muscle cells of C. elegans. PLoS One. 5, (1), e8568 (2010).
  57. Becker, J., Walter, W., Yan, W., Craig, E. A. Functional interaction of cytosolic hsp70 and a DnaJ-related protein, Ydj1p, in protein translocation in vivo. Mol Cell Biol. 16, (8), 4378-4386 (1996).
  58. Salvaterra, P. M., McCaman, R. E. Choline acetyltransferase and acetylcholine levels in Drosophila melanogaster: a study using two temperature-sensitive mutants. J Neurosci. 5, (4), 903-910 (1985).
  59. Goloubinoff, P., Mogk, A., Zvi, A. P., Tomoyasu, T., Bukau, B. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (24), 13732-13737 (1999).
  60. Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. D. naK. DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage. EMBO J. 12, (11), 4137-4144 (1993).
  61. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, (21), 4221-4235 (2012).
  62. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat Methods. 8, (10), 879-884 (2011).
  63. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, (5766), 1471-1474 (2006).
  64. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (35), 14914-14919 (2009).
  65. Karady, I., et al. Using Caenorhabditis elegans as a model system to study protein homeostasis in a multicellular organism. J Vis Exp. (82), e50840 (2013).
  66. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (3), e1000399 (2009).
  67. Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (16), 10417-10422 (2002).
  68. Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. J Neurosci. 26, (29), 7597-7606 (2006).
  69. Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection. J Biol Chem. 283, (1), 194-201 (2008).
  70. Libina, N., Berman, J. R., Kenyon, C. Tissue-specific activities of C. elegans DAF-16 in the regulation of lifespan. Cell. 115, (4), 489-502 (2003).
  71. Schatzl, H. M., et al. A hypothalamic neuronal cell line persistently infected with scrapie prions exhibits apoptosis. J Virol. 71, (11), 8821-8831 (1997).
  72. Keith, S. A., Amrit, F. R., Ratnappan, R., Ghazi, A. The C. elegans healthspan and stress-resistance assay toolkit. Methods. (2014).
  73. Pierce-Shimomura, J. T., et al. Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (52), 20982-20987 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics