Untersuchung der Verbreitung und Toxizität von Prion-ähnlichen Proteine ​​Mit dem Metazoan Modellorganismus

Biology

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Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321, doi:10.3791/52321 (2015).

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Abstract

Introduction

Viele neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich Alzheimer-Krankheit (AD), Parkinson-Krankheit (PD), Amyotrophe Lateralsklerose (ALS), und übertragbaren spongiformen Enzephalopathien (TSE) werden mit Aggregation neigende Proteine ​​verbunden und werden daher allgemein als Proteinfehlfaltungserkrankungen (PMDs bekannt ). TSE oder Prionenerkrankungen stellen eine einzigartige Klasse von PMDs indem sie Infektions in Mensch und Tier 1 sein kann. Auf molekularer Ebene, replizieren Prionen durch die Rekrutierung und Umwandlung von monomeren α-Helix reiche Wirts kodierten zellulären PrP (PrP C) in die pathologische β-Faltblatt-reiche PrP Sc Konformation 2,3. Selbstausbreiteproteinaggregate wurden auch in Pilzen, die wichtige Eigenschaften mit Säugetier Prionen 4,5 austauschen können. Zusätzlich sind Säuger Prionen bewegen kann, von Zelle zu Zelle und infizieren naiven Zellen 6,7.

Während PMDs other als TSE nicht infektiös sind, teilen sie sich eine gemeinsame pathogene Prinzip mit Prionenerkrankungen 8,9. Obwohl die Proteine, die jeder der PMDs verknüpft sind nicht in der Struktur oder Funktion bezogen, sie bilden alle Aggregate über eine Kristallisationsartigen Prozess namens nukleierten oder impft Polymerisation; außerdem proteinhaltigen Samen wachsen durch die Einstellung ihrer löslichen Isoformen 2,10,11. Die Effizienz der Selbst Propagate variiert in vivo in Abhängigkeit von den intrinsischen Eigenschaften des Proteins, die zusammen mit zusätzlichen zellulären Faktoren wie molekulare Chaperone bestimmen letztlich Raten Aggregat Nukleation, Säen, Fragmentierung und Ausbreiten 12-15. Daher muss es eine feine Balance zwischen diesen Faktoren, die eine effiziente Vermehrung von Proteinaggregation ermöglicht existieren. Dies könnte auch erklären, warum nur einige amyloidogenen Aggregate Hafen der Eigenschaften eines Prion und damit nicht alle PMDs sind ansteckend. Prionen scheint "Top-Performer" o vertretenfa breites Spektrum von sich selbst replizierenden proteinartige Aggregate, die ihnen ein leistungsfähiges Werkzeug zur PMDs 8,13 zu studieren.

Interessanterweise hat die Toxizität mit krankheitsbedingten Aggregaten assoziiert oft ein nicht zellautonomen Komponenten 16,17. Dies bedeutet, dass sie Nachbarzellen, die das entsprechende Gen nicht exprimieren, im Gegensatz zu einem rein Zelle autonome Wirkung, was bedeutet, daß nur die Zellen, die das Gen weisen die spezifischen Phänotyp beeinflussen. Dies wurde überzeugend von gewebespezifische Expression nachgewiesen oder knock down der entsprechenden Proteine ​​in zahlreichen Modellen neurodegenerativer Erkrankungen 18-26. Verschiedene Mechanismen wurden als Grundlage für diese nicht-zellautonomen Toxizität PMDs einschließlich vermindert Nährstoffversorgung Ungleichgewicht in neuronalen Signalisierung Glutamatexzitotoxizität und neuroinflammation 16,27,28 vorgeschlagen. Zusätzlich ist ein Prion artige Bewegung der Krankheit gebundenen Aggregate zwischen Zellen might diesem Aspekt 29,30 tragen. Zunehmende Hinweise darauf, dass andere Proteineinschlüsse als Prionen von Zelle-zu-Zelle zu übertragen, was erklären kann, die charakteristische Verteilung der Pathologie in vielen PMDs 30-36 beobachtet. Es hat sich jedoch noch nicht bestimmt werden, ob es einen klaren ursächlichen Zusammenhang zwischen interzelluläre Bewegung Krankheit Proteine ​​und die toxische Wirkung auf Nachbarzellen. Daher ist ein besseres Verständnis der zellulären Wege, die Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität zugrunde notwendig und wesentlich für die Entwicklung neuartiger Therapeutika. Allerdings sind viele Aspekte der Prionartigen Ausbreitung und zellulären Faktoren, die Zell-zu-Zell-Übertragung von fehlgefalteten Proteinen Metazoen beeinflussen nicht gut verstanden, insbesondere auf der Ebene der Organismen.

Der Nematode Caenorhabditis elegans hat mehrere Vorteile, die das Potential bieten entdecken Sie neue Facetten des Prion-ähnlichen spreading in Metazoen 17. Es ist transparent, so dass für in vivo-Tracking von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​im lebenden Organismus. Darüber hinaus werden viele zelluläre und physiologische Prozesse durch Krankheit betroffen von Würmern die menschliche konserviert und C. elegans eignet sich auch für eine Vielzahl von genetischen Manipulationen und molekularen und biochemischen Analysen 37-39. Genau 959 Körperzellen bilden die erwachsenen Hermaphroditen mit einem einfachen Körper Plan, der noch mehrere verschiedene Gewebearten, einschließlich Muskeln, Neuronen und Darm hat.

Um eine neue Prion-Modell in C zu etablieren elegans, entschieden wir uns für exogen drücken die gut charakterisiert Glutamin / Asparagin (Q / N) -reichen Prion Domain NM der cytosolischen Hefe-Prion-Protein Sup35, da gibt es keine bekannten endogenen Prion-Proteine ​​in Würmern 4,40. Hefe Prionen waren von unschätzbarem Wert bei der Aufklärung grundlegender Mechanismen von Prionenreplikation 41-44. Darüber hinaus ist die Tanne NMst cytosolische Prion-ähnliches Protein, die gezeigt wurde, um den gesamten Lebenszyklus eines Prion in Säugetierzellkulturen 45,46 rekapitulieren. Ebenso wird, wenn in C exprimiert elegans, die hervorragend an die unterschiedlichen Anforderungen für die Vermehrung in Metazoen-Zellen im Vergleich zu Hefezellen und wiesen Merkmale von Prion biology 40. NM Aggregation wurde mit einem tiefen toxischen Phänotyp verbunden sind, einschließlich der Störung der mitochondrialen Integrität und das Aussehen angenommen Sup35 Prion Domäne verschiedene Autophagie bezogenen Vesikel auf zellulärer Ebene sowie embryonale und larvale Stillstand, Entwicklungsverzögerung, und eine weit verbreitete Störung der Proteinfaltung Umgebung auf der organismischen Ebene. Auffallend ist, dass das Prion-Domain weist Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität, Auswirkungen auf benachbarte Gewebe, bei denen das Transgen nicht ausgedrückt. Ferner ist der vesikulären Transport des Prion Domäne innerhalb und zwischen den Zellen in Echtzeit überwacht <em> In-vivo-40.

Hier beschreiben wir, wie man Prion-ähnlichen Verbreitung in C prüfen elegans. Wir werden erklären, wie die intra- und interzellulären Transport von Vesikeln, die das Prion-Domäne mit Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen. Wir werden die Verwendung von gewebespezifischen Klapp Sensoren unterstreichen und ubiquitär exprimiert Stress Reportern zu Zelle autonomen und nicht autonomen Zell Effekte auf zellulärer Fitness zu bewerten. Schließlich werden wir den Ablauf einer vor kurzem durchgeführt genomweiten RNA-Interferenz (RNAi) Bildschirm beschreiben, neue Modifikatoren von Prion-induzierte Toxizität zu identifizieren. In Kombination können diese Methoden helfen, necken neben genetischen Pfade in der interzellulären Bewegung von Proteinen und ihre nicht zellautonomen Toxizität beteiligt.

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Protocol

1. Überwachung transzelluläre Verbreitung des Prion-ähnlichen Proteine ​​durch In-vivo-Zeitraffer-Imaging

HINWEIS: Wachsen C. elegans Wildtyp (WT) (N2) und transgenen Linien nach Standardmethoden und die Kultivierungstemperatur 47 sorgfältig zu kontrollieren.

  1. Gene transgenen Linien von C elegans Expression des Prion-ähnlichen Protein, mit monomeren rot fluoreszierendes Protein (mRFP) markiert. In diesem Video, das, wie man die Mikroinjektion 48 demonstriert. Weitere Details und die Methoden beschreiben, wie Sie diese extrachromosomale Linien zu integrieren, finden 49.
  2. Bereiten synchronisiert Populationen Eiablage oder Bleichen nach Standardverfahren 50.
    1. Synchronisation durch Eiablage
      1. Über 10-20 gravid Erwachsenen auf einem Teller und lassen Sie sie Eier legen für 1-2 Std. Erwachsene entfernen von der Platte und lassen Sie die Nachkommen wachsen, bis die gewünschte Zeit.
    2. <li> Synchronisation von Bleich
      1. Sammeln Sie eine unsynchronisierte Bevölkerung von schwangeren Erwachsenen und bleichen sie mit alkalischen Natriumhypochlorit-Lösung (250 mM NaOH und 1: 4 (v / v) Verdünnung der kommerziellen Bleichmittel in H 2 O). Zweimal (218 · g für 1 min) Waschen Sie die Eier mit M9-Puffer 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7 H 2 O, 22 MMKH 2 PO 4, 86 mM NaCl, 1 mMMgSO 4 · 7 H 2 O, fügen dH 2 O bis zu 1 L).
      2. Es ihnen ermöglichen, in M9-Puffer unter leichtem Schütteln O bei 20 ° C schlüpfen / N. Worm Entwicklung wird im L1 Stufe in Abwesenheit eines Nahrungsmittels zu verhaften, so dass eine synchronisierte Bevölkerung. Übertragen L1s auf frische Nematode Wachstumsmedien (NGM) Platten mit OP50 E. ausgesät coli-Bakterien und lassen Sie die Nachkommen entwickeln, bis die gewünschte 47 Jahren.
  3. Planen 2% Agarose-Pads (in H 2 O) auf einen Objektträger, wie beschrieben 50.
    1. Bereiten Sie zwei mikop Folien mit Etikettenband über ihre ganze Länge angeordnet, um als Abstandshalter verwendet werden. Platzieren Sie eine dritte Objektträger zwischen ihnen.
    2. Löse 2% Agarose in H 2 O und Pipette ein Tropfen auf die saubere Folie.
    3. Platzieren eines vierten Schieber senkrecht zu den drei anderen Folien oben auf den Agar Abfall. Drücken Sie ihn vorsichtig nach unten, um das Kissen in die gleiche Dicke wie die Etikettierung Band zu glätten.
    4. Lassen Sie es trocken für 1 Minute, bevor Sie die Abstandshalter und leichtes Ziehen die Folien auseinander. Die Agar-Pad, einen von ihnen zu bleiben.
  4. Pipette ~ 10 ul Anästhetikum (2 mM Levamisol in M9-Puffer) mit dem Pad und Übertragungs ~ 10 Tieren unter Verwendung einer Platindraht-Pick. Deckel mit einem Deckglas (~ 22 x 22 mm) und nehmen Sie Bilder in 1 Std.
  5. Alternativ, um Filme über einen längeren Zeitraum hinweg zu erwerben oder die Möglichkeit einer Bewegung der Tiere weiter zu reduzieren, verwenden eine Kombination von Betäubung und Ruhigstellung Wulst 51.
    1. Bereiten Sie 10% agaRose-Pads (in M9-Puffer), wie beschrieben, 51 und fügen Würmer zu 3 ul Nanokugel Größenstandards Lösung (Polystyrol-Kügelchen, 100 nm) und 3 ul Betäubung (4 mM Levamisol in M9-Puffer). Bedecken Sie vorsichtig mit einem Deckglas. Um ein Austrocknen zu verhindern, versiegeln das Deckglas mit VALAP (Mischung aus gleichen Teilen Vaseline, Lanolin und Paraffinwachs).
  6. Bild immobilisiert Würmer mit einem konfokalen Mikroskop.
    HINWEIS: Die Ergebnisse werden mit einem Spinning Disc AF Konfokalmikroskop mit einem EM-CCD-Kamera und einem Mikroskopie Automatisierung und Bildanalyse-Software wie MetaMorph ausgestattet erhalten und stellen die Besonderheiten unter, aber vergleichbaren konfokalen Bildgebungssysteme können ebenfalls verwendet werden.
    1. Verwenden Sie das 63X oder 100X / 1.4NA Öl-Objektiv und setzen Sie den Objektträger, die Würmer in den Mikroskopobjektträgerhalter.
    2. Öffnen Sie die Software. Passen Laserleistung und Filter für mRFP Bildgebung. Verwenden Sie die 561-nm-Laser mit 10% Leistung und Emissionsfilter> 600 nm.
    3. Auf der Registerkarte "Speichern" auswählen oder das Verzeichnis Ordner, in dem die Dateien gespeichert werden sollen. Benennen Sie die Datei.
    4. Unter dem Reiter "Wellenlänge", wählen Sie die entsprechende Beleuchtung und die Belichtungszeit und Verstärkung. Mit "YokoQuad Red" (oder eine äquivalente Beleuchtungseinstellung für mRFP imaging) mit einer Einwirkungszeit zwischen 100 und 300 ms und einer Kameraverstärkung zwischen 100 und 300, abhängig von der einzelnen Probe (beurteilt unter Verwendung der Livebild).
    5. Unter dem Reiter "Timelapse" wählen Sie "Anzahl der Zeitpunkte" = 301, "Dauer" = 5 min und "Zeit / Intervall" = 1 Sek.
    6. Im Rahmen des "Journals" Tab wählen Journal: "AFC SET Z HOLD" und "AFC Zurück zur Z HOLD", Typ: &# 8220; Special "(zweimal), Ausgangspunkt:" Start Zeitpunkt "und" End of Zeitpunkt ". Das Autofokus-Option ist wichtig, um Bild die gleiche Abschnitt über einen längeren Zeitraum.
    7. Wenn das Setup abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Erfassen". Die Zeitraffer-Video wird als separate TIFF-Files abgelegt.
    8. Öffnen Sie alle TIFF-Dateien eines bestimmten Zeitreihen in ImageJ. Gehen Sie auf "Bild" → "Stacks" → "Bilder zu Stacks". Optional können Helligkeit und Kontrast, fügen Größe Bar, etc. Exportieren Sie den Film unter "Datei" → "Speichern als" → "AVI ..." (zum Beispiel siehe Video 1 und 2 entsprechend Figur 1).

2. Mit Klapp Sensoren und Spannungs Reporter Cell Autonome und Nichtzellen Autonome Wirkt auf Proteostase und Toxizität Untersuchen

  1. Gene transgenen Linien, die einen Klappsensor oder Stress reporte coexprimierenr zusammen mit der Prion-ähnlichen Proteins. Für Methoden, wie man Kreuze errichten oder zu generieren transgenen Linien finden 48,49,52. Siehe Tabelle 1 für eine Liste von C elegans-Stämme, die verwendet werden können.
  2. Bereiten synchronisierten Populationen transgener Tiere und wachsen, bis die gewünschte Alters wie oben (Abschnitt 1.2) 50 beschrieben.
  3. Mit einem Stereomikroskop, überprüfen Sie die entsprechende Phänotyp des Faltungssensor oder Stress Reporter.
    1. Für die Faltung Sensor, bestimmen die Anzahl der Tiere beherbergen Aggregate an jedem Tag nach der Synchronisation (ein Beispiel finden Sie in Abbildung 2 E und F).
    2. Für die Stress-Reporter, Test, wenn die Co-Expression der Prion-ähnlichen Protein führt zu einer erhöhten Fluoreszenz des Reporter (für ein Beispiel siehe Abbildung 3).

3. Genomweite Bildschirm Unterdrückung von Prion-induzierte Toxizität in C. elegans

4
Abbildung 4. Schematische Darstellung des RNAi-Screening-Protokoll. Siehe Protokoll Abschnitt 3 für eine detaillierte Beschreibung der einzelnen Schritte.

  1. Synchronisation von C. elegans Würmer und Vervielfältigung von RNAi-Bibliothek
    1. Für die RNAi Bildschirm aus den Ahringer RNAi-Bibliothek (oder die Vidal RNAi-Bibliothek) 53,54. Rearray das RNAi-Bibliothek aus dem ursprünglichen 384-Well-Format in ein 96-Well-Platten, indem die Platten mit 100 & mgr; l LB-Amp-Medium (50 ug / ml Ampicillin in LB) mit 10% Glycerin ergänzt und Beimpfen mit einem 96-Pin-Replikator. Wachsen bei 37 ° CO / N unter Rühren und bei -80 ° C.
    2. Pflegen C. elegans WT und transgenen Linien bei 20 ° C auf NGM-Platten ausgesät mit OP50 E. coli Bakterien nach Standardverfahren 47.
    3. Synchronisieren Prion Domain transgene und WT (Kontrolle) Nematoden durch Bleichen (siehe Abschnitt 1.2).
    4. Am selben Tag, dass die Würmer gebleicht werden, bereiten LB-Medium mit 50 ug / ml Ampicillin. Verwenden Sie eine automatisierte Reagenzspender zu verzichten (oder Pipette manuell) 65 ul der LB-Amp-Medium in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen.
    5. Entfernen Sie 96-Loch Ahringer RNAi Bibliothek Platten von -80 ° C und bringt sie zu einer sterilen Haube mit Küchenpapier ausgekleidet. Unverzüglich entfernen Sie die Dichtungsband, indem Sie die Platte auf den Kopf, während Platten noch gefroren sind, wobei darauf geachtet, um eine Kontamination von Eis auf der Außenseite der Platten zu vermeiden. Reinvert die Teller und lassen Sie sie für etwa 30 Minuten auftauen.
    6. Tauchen Sie ein steriles 96 Pin-Replikator in einem RNAi-Bibliothek Platte und dann in eine frische LB-Amp-Platte. Verwenden Sie eine neue sterile Replikator für jede Platte. Dichten Sie alle Platten mit Klebefolienband und geben die Bibliotheksplatten bis -80 ° C. Die Replikatoren in Bleichmittel eingeweicht werden, gespült,und autoklaviert, um wieder verwendet werden.
    7. Lassen duplizierten RNAi Platten zu O / N in einem Brutschrank auf 37 ° C und 300 Umdrehungen pro Minute eingestellt wachsen. Um HT115 E. verwenden coli Bakterien beherbergen, die einen leeren Vektor (L4440) als Kontrolle, wachsen sie einzeln in ein Kulturröhrchen pipettieren und 65 ul der Kultur mit einer Mehrkanalpipette in ein Viertel der zwei Platten mit 96 Vertiefungen.
  2. Die Induktion der Bakterien dsRNA Produktion und Zugabe von Würmern
    1. Verdünne Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer 5 mM Konzentration in ddH 2 O. Verwenden Sie eine automatisierte Workstation mit einem Mehrkanal-Kopf zu verzichten (oder Pipette manuell) 10 ul verdünnt IPTG in jede Vertiefung der RNAi Bakterien und der Steuerplatten. Verschließen Sie und legen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Lassen Sie sie schütteln für 3 Stunden bei 37 ° C.
    2. Während Bakterien zittern, bereiten die Würmer. Mischen Sie die M9 / Wurm Federung gut und Pipette eine kleine Probe (~ 5-10 ul) auf einen Glasobjektträger. Zählendie Zahl der Würmer unter einem Stereomikroskop und berechnen Sie die Anzahl der Würmer pro ul.
    3. Unter Einhaltung steriler Techniken bereiten eine Lösung ergänzt M9 (M9 +) mit den folgenden Endkonzentrationen: 0,20 mg / ml IPTG, 8,0 ug / ml Cholesterin, 50 ug / ml Ampicillin, 9,6 ug / ml Tetracyclin, 0,0835 g / ml Fungizone und 15 Würmer pro 50 ul.
      1. Tätigen Sie Lösungen für Prionen Domain transgene und WT Würmer. Das Endvolumen M9 + benötigt wird von der Anzahl der RNAi Platten kopiert werden (siehe unten) abhängig Schneckenlösung plus ~ 30 ml Totvolumen, das in dem Reservoir verbleiben, wenn eine automatisierten Dispenser verwendet.
    4. Nach 3 Stunden Induktion der Bakterien dsRNA Produktion, nehmen die Platten aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (~ 30 min) zu kühlen, um Wärme zu belasten die Tiere.
    5. Dispense 50 ul M9 + Prion Domain transgenen Wurm-Lösung in jede Vertiefung der RNAi-Platten und einer der leeren Vektor Kontrollplatten. Machensicher, dass die Schnecken Lösung vor jedem Schritt zu mischen, wie die Tiere dazu neigen, auf den Boden des Behälters absetzen.
    6. Dispense WT Würmer in die zweite Steuerplatte. Lassen Sie die Platten nicht abgedichtet, um die Belüftung zu ermöglichen. Um die Flüssigkultur verdunstet halten, Stack 4-5 Platten zusammen und wickeln mit einem feuchten Papiertuch und Aluminiumfolie. Inkubation bei 200 rpm bei 20 ° C für 4 Tage.
  3. Wertung
    HINWEIS: Nach 4 Tagen im Brutschrank werden die Würmer am zweiten Tag Erwachsenenalter sein und bereit sind, zu untersuchen. Lassen Sie die Tiere nicht schütteln Bedingungen anpassen 30 min vor Screening ungestört Prügel zu gewährleisten.
    1. Mit einem Falcon 4M60 Kamera an einen Computer mit Monitor, Bildschirm visuell erhöht Prügel verbunden, verglichen mit Kontrolle behandelt Prion Domain transgenen Tieren.
    2. Stellen Sie eine Liste der vorläufigen Ergebnisse zu bestätigen, mit wrMTrck (siehe nächster Abschnitt).

4. Bestätigung der vorläufigenBildschirm Hits

  1. Motilität Assay auf festen Platten
    1. Bereiten Platten mit NGM mit 100 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Tetracyclin und 1 mM IPTG ergänzt, nach Standardverfahren 47. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen platten Gießmaschinen, um sicherzustellen, alle Platten haben die gleiche Höhe von Medien, die für eine schlankere Videoakquisitionsprozess ermöglicht.
    2. Wachsen die verschiedenen RNAi-Klone in ~ 1 ml LB + 50 ug / ml Ampicillin, O / N bei 37 ° C und 250 Umdrehungen pro Minute.
    3. Am nächsten Tag, induziert die Expression der dsRNA mit 1 mM IPTG für 3 Stunden. Samen, die Platten mit 150 ul jeder RNAi bakterielle Klon, zu einer dünnen Schicht ausgebreitet. Lassen Sie die Bakterien trocken 2 Tage bei RT im Dunkeln. Bereiten Sie 3 Platten pro RNAi-Klon.
    4. Synchronisieren Sie die Wurmpopulation durch Bleichen nach Standardverfahren 50 (siehe Abschnitt 1.2), und lassen Sie die Eier ausbrüten O / N in M9-Medium.
    5. Nehmen Sie eine Probe des Wurms Federung und bestimmen die Höhe der nematodes pro ul bei dem Stereomikroskop. Dann pipettieren das richtige Volumen der M9 und Würmer in jedem Versuchsplatte, so dass es 25 enthält - 30 L1 Würmer. Wachsen die Nematoden bei 20 ° C für 4 Tage, bis die Würmer erreichen Tag 2 des Erwachsenseins.
  2. Die quantitative Analyse der Wurm Motilität mit der wrMTrck Plugin für ImageJ
    HINWEIS: Die Videos wurden mit einem Stereomikroskop bei 10-facher Vergrößerung mit einem Hamamatsu Orca-R2 Digitalkamera C10600-10B und Hamamatsu einfache PCI-Imaging-Software erfasst.
    1. Schalten Sie die Kamera und das Simple PCI-Imaging-Software. Klicken Sie auf "Live", um zur Einstellung der Bilderzeugungsbedingungen zu ermöglichen.
    2. Richten Sie die Videobedingungen wie folgt: Gain = 0; Light Mode = High; Speedindex = 1; Binning = 2. Klicken Sie auf "Auto Expose" und passen Sie die Lichtverhältnisse, Bewegung der Mikroskopspiegel und die Helligkeits- und Kontrastwahl.
      HINWEIS: Das Video muss einen hohen Kontrast ohne ÜBERBEL habenosed, so dass die Tiere wie schwarze Gestalten auf einem hellen Hintergrund erscheinen.
    3. Klicken Sie auf "Zeit Scan" und wählen Sie einen Ordner und einen Dateinamen ein. Set "Feld Delay" auf 20 ms und "Stopp bei Time" um 30 Sekunden. Drücken Sie auf "Live Review", um den Bereich der Platte wählen zu erfassen (wo die meisten Würmer sind). Tippen Sie auf die Platte 3 oder 4 mal auf der Bühne, schnell bestätigen ihre Position im Sichtfeld ein und drücken Sie "Start".
    4. Nachdem der Film endet die Aufzeichnung der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie "Export Montage Sequence", um den Film von einem Format in ein .cxd .avi exportieren.
  3. Die Analyse der Motilität Videos
    1. Öffnen Sie die ImageJ-Software, gehen Sie zur Registerkarte "Plugins", dann "wrmtrck" und wählen Sie "wrMTrck Batch". Wählen Sie das Verzeichnis alle Dateien, die analysiert werden soll.
    2. In der Haupteingabefenster wrMTrck_Batch, laden Sie die Eingabewerte wie in Figur detaillierte 5C. Erläuterung der einzelnen Parameter finden Sie in den Anweisungen, die das Plugin begleiten zu finden. Klicken Sie auf "OK", und lassen Sie die Bewegungsanalyselauf.
    3. Um die Ergebnisse zu kuratieren und bestätigen Sie, dass alle erkannten Tracks sind von den tatsächlichen C. elegans und beseitigen Artefakte, öffnen Sie jede der TXT-Dateien für jeden Film geschaffen und kopieren Sie die Daten auf eine Datenanalyse-Software-Datei. Öffnen Sie die "* _labels.zip" erstellten Dateien und führen Sie die daraus resultierende "* _labels.tif" von Hand überprüfen und zu beseitigen falsche Wurmspuren.

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Representative Results

Überwachung interzelluläre Ausbreitung von Prionen-ähnlichen Proteinen durch In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung

Transgenen C. elegans Linien die Prion-Domäne exprimieren, sind besonders gut für die Analyse von bestimmten Aspekten der Prion-ähnlichen Proteine, zB Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität geeignet. Die Transparenz der Tiere ermöglicht Verfolgung von fluoreszenzmarkierten Proteine ​​aus dem lebenden Organismus in jeder Phase des Lebens. Unter Ausnutzung dieser Bewegung des Prion-ähnlichen Proteinen durch Zellen und Gewebe unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops sichtbar gemacht. A 63X oder 100X / 1.4NA Öl Ziel ist notwendig, um die vesikuläre Strukturen aufzulösen. Wichtiger ist, dass das Prion-Domäne mit mRFP markiert werden, um Fluoreszenz sichtbar innerhalb dieser vermutlich sauren Vesikeln 40 verbleiben. Gelb fluoreszierendes Protein (YFP), die oft als eine Markierung verwendet wird, iist nicht geeignet, weil es in einer Umgebung mit niedrigem pH 40,55 abgeschreckt. Stamm AM815 drückt RFP-tagged R2E2 (ein stark zur Aggregation neigen und toxischen Form des Prion Domäne NM), die in röhrenförmigen Vesikeln akkumuliert, während die RFP Tag allein löslich (1A und B) verbleibt. Mit In-vivo-Zeitraffer-Bildgebung konnte festgestellt, dass diese Rohrblasen sind innerhalb und zwischen den Zellen 40 (1C und D, Video 1 und 2) [Ort Links zu Video transportiert werden 1 und 2 hier].

Mit Klapp Sensoren und Stress Reportern zu Zelle autonom und nicht-Zell-autonome Auswirkungen auf Proteostase und Toxizität zu untersuchen

Prionen sind in der Lage, Samen verwandte Proteine ​​überqueren und stören die zelluläre Proteinfaltung Umwelt. Dies kann durch die Co-Expression von geeigneten Faltung senso offenbart werdenrs. Folding-Sensoren sind nicht wesentlicher metastabilen Proteine, die auf einem Funktions Proteostase Netzwerk ab, an korrekt zu falten. Einige Beispiele sind die bekannten Leuchtkäfer-Luciferase und den Proteinen, die temperaturempfindliche (ts) Mutation 56-66. Eine Störung Proteostase führt zu Fehlfaltung des Reporters, die durch visuelle Überprüfung von Aggregaten oder durch Bestrahlen der jeweiligen ts Mutantenphänotyp bei permissiven Temperaturen erfasst werden können. Strecken von Polyglutamin (polyQ) mit einer Länge an der Schwelle Aggregation (rund 40 Rückstände) werden auch oft verwendet, weil sie eine altersabhängige Aggregation 67-69 aufweisen. Früheren Beginn der Aggregation zeigt eine kompromittiert Klapp Umwelt. Dabei beschäftigten wir Prion Mutante RΔ2-5, die löslich bleibt, wenn in C ausgedrückt elegans Körperwandmuskel (BWM) Zellen und Darm 40 (2A und C). Bei der gleichzeitigen Expression mit R2E2 in BWM Zellen, RΔ2-5 readily Aggregate (2B) auf, und ein Zell autonomer Wirkung R2E2 an der Proteinfaltung Umwelt. Die Breitenwirkung unter Proteostase und Induktion von Fehlfaltung in Geweben kann durch Expression des Klapp Sensor in einer unterschiedlichen Gewebeproben, die stark zur Aggregation neigende Form des Prion-Domäne exprimiert, ausgewertet werden. R2E2 wurde unter einem BWM zellspezifischen Promotor (Myo-3p) exprimiert, während RΔ2-5 wurde unter einer Darmspezifischen Promotor (VHA-6p) ausgedrückt. Aggregation von Darm RΔ2-5 zeigt, dass R2E2 betrifft Proteinfaltung in einem nicht Zelle autonom 40 (2D). Anstelle der Verwendung RΔ2-5, wo Aggregate können nur bei hoher Auflösung erfasst werden, die Verwendung von polyQ44 im Darm exprimiert (Q44i) ermöglicht die Visualisierung von Aggregaten mit einer niedrigen Auflösung unter einem Stereomikroskop (2E und F). Außerdem ermöglicht dies eine Quantifizierung der animals mit Zuschlagstoffen, sowie eine Quantifizierung der Anzahl der Aggregate.

An nichtzellautonomen Toxizität des Prion Domäne zu untersuchen, haben wir vorher geprüft benachbarte Gewebe nicht R2E2 exprimieren durch Elektronenmikroskopie und festgestellt, dass die Expression des Prion Domäne in Muskelzellen führt zu einem nicht zellautonomen Störung der mitochondrialen Integrität in benachbarte Gewebe, wie als Darm 40. Mitochondriale Dysfunktion führt zu erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) Herstellung und oxidativem Stress. Eine nicht-invasive Art und Weise, um die Induktion des oxidativen Stress-Reaktion sichtbar ist, ein oxidativer Stress induzierbaren Reporter 70 zu verwenden. Die Belastung CF1553 drückt das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter dem oxidativen Stress induzierbaren Promotor SOD-3 70. Wenn an Tiere, die Prion-Domäne R2E2 in BWM exprimierenden Zellen gekreuzt wurde die Reporter signifikant BWM Zellen hochreguliert sowie in zahlreichen nicht-BWM Geweben ( Tabelle 1 enthält eine Liste von C elegans Stämme, Klapp Sensoren und Stress Reportern, dass analog verwendet werden können.

Genomweite Bildschirm zur Unterdrückung von Prion-induzierte Toxizität in C. elegans

Der Komplex Toxizität Phänotyp des Prion-Domäne in C ausgedrückt elegans ist wegen des Mangels an in den meisten in-vitro-Modellen Prion 71 beobachtet erkennbare Toxizität besonders interessant. Dieses Modell könnte einen neuen Weg, dass die Toxizität mit Prionen in Metazoen verbunden beeinflussen können offenbaren. Um dieses Problem anzugehen, die wir für Gene, die bei RNAi-verarmten, würde die Beweglichkeit Defekt R2E2 transgenen Tieren zu verbessern kontrolliert wurden. Kontrolle behandelten WT Würmer können als positive Zusammenarbeit verwendet werdenntrol wird, obwohl die meisten Kandidatengene liefern keine vollständige Bewegung Phänotyp Rettung, aufgrund der variablen RNAi Penetranz und der hohen Toxizität des Transgens. Die Tiere wurden für 4 Tage mit RNAi zu Tag 2 des Erwachsenenalters behandelt, von der ersten Larvenzustand L1. Zu diesem Zeitpunkt ist die Tracht Prügel von unbehandelten Tieren R2E2 deutlich langsamer als die Prügel von WT-Tieren, was wichtig ist, weil wir das Screening auf eine Verbesserung der Beweglichkeit. F1-Nachkommen anwesend (~ L1s) sein, ist aber leicht von der P0 Generation unterscheiden. Nur die P0 Generation erzielt. Dieser Einstieg ist visuelle und nicht quantitative und deshalb wurde eine niedrige Schwelle zur vorläufigen Treffern zu identifizieren, was bedeutet, dass jede bakterielle RNAi-Klon, der die Prügel von Prion-exprimierenden Tieren zu erhöhen schien in quantitativer Crawling-Assay getestet. Abbildung 4 beschreibt die Hauptschritte des Bildschirms Setup. Die hohe Auflösung des Falcon 4M60 Kamera aktiviert eine visuelle Durchmusterung einer quarter der Platte zu einem Zeitpunkt auf einem Computerbildschirm, der auf dem Bildschirm, effizienter durchgeführt werden dürfen. Obwohl hilfreich, ist dies nicht notwendig. Die visuelle Untersuchung der Schnecken Thrashing kann auch durch Verwendung eines Stereoskop bei geringer Vergrößerung (10X) durchgeführt werden.

Bestätigung der vorläufigen Bildschirm Hits

Hochdurchsatz-Screens werden als ein Ansatz, der die Analyse genomweite Effekte, um einen primären Liste von Kandidatengenen, die durch komplementäre Methoden verfeinert werden können erhalten können durchgeführt werden. Die Validierung der Bildschirm Ergebnisse ist daher unerlässlich, um mögliche falsche Positive, die aus der Durchführung einer Bildschirm mit nur einer Versuchsprobe pro RNAi führen könnten, zu beseitigen. R2E2 transgene Tiere mit dem RNAi-Klone von primären Treffer zugeführt und gemessen wird ihre Geschwindigkeit auf NGM-Platten am zweiten Tag der Erwachsenenalter, von einer quantifizierbaren Auslesen der Motilität und verringerte Toxizität. Wir nutzten die wrMTrck Plugin für ImageJ, in entwickelten unsereLabor, das genau identifiziert C. elegans in Videos und folgt deren Bewegungen. Die wrMTrck Plugin und Skripte für die automatisierte Analyse sind Open-Source und http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html öffentlich zugänglich, zusammen mit detaillierten Anweisungen, wie man es benutzt. Nach dem Herunterladen, kopieren Sie den gesamten wrMTrck Ordner in den Plugins-Ordner von ImageJ. Dieses Protokoll beschreibt die wrMTrck_Batch Verfahren, bevorzugt für die Analyse einer großen Anzahl von Videos in einer Zeit, aber Anweisungen für eine manuelle, Film nach Film, Analyse sind auch mit dem Plugin herunterladen. WrMTrck_Batch wandelt ein Originalvideo (5A) in ein binäres Format mit Hintergrundsubtraktion und jede Schnecke eine Spur zugewiesen. Jede der verarbeiteten Videos können später mit diesen Tracks übereinander angezeigt werden, um jegliche Artefakte, die fälschlicherweise als Würmer (e. G., Spur 1 in 5B) identifiziert wurden manuell zu beseitigen. Ein effektiver Weg, um Stand der Technik zu beseitigen ifacts (mit einem Pfeil in Figur 5B angezeigt) ist sorgfältig zu wählen, die minimale und die maximale Größe der zu identifizierenden Gegenstände (5C). Von den verschiedenen Ausgängen des wrMTrck Plugin, verwenden wir die Körperlängen pro Sekunde Parameter (BLPS), die die Durchschnittsgeschwindigkeit der einzelnen Tiere, die durch die Länge jeder Spur geteilt durch die Körperlänge jedes Objekt dargestellt mißt, wodurch die Normalisierung für Potentialdifferenzen Größe der Nematoden (5D). Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir 35 Suppressoren Prionen Toxizität (sopt), die die Motilität Phänotyp exprimieren R2E2 C erhöht identifizierten elegans von mindestens 133% und bis zu 256% im Vergleich zu einem leeren Vektor behandelten Schnecken (6). Diese sopt Gene repräsentieren die letzte bestätigte Hits, die von unseren Hochdurchsatzscreening Bemühungen führten.

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Abbildung 1. Das Prion Domain Spreads zwischen Zellen und Geweben in C. elegans durch vesikulären Transport. (A) Collapsed konfokalen z-Stapel von Nematoden RFP in Körperwand Muskel Ausdruck (BWM) Zellen (RFPm). (B) Collapsed konfokalen z-Stapel von Nematoden der hochgiftigen und Aggregation neigen NM Variante R2E2 Ausdruck , in BWM-Zellen (R2E2m). Die Pfeile zeigen die Rohrblasen, Pfeilspitze zeigt Aggregat. (C + D) Zeitraffer-Serie von Tieren zum Ausdruck RFPm (C) und R2E2m (D). Die Pfeile zeigen die Bereiche der Blasenbewegung. RFPm weist meist eine diffuse Färbung. Auch wenn RFPm in Vesikeln gefunden, werden diese kaum bewegen. R2E2m lokalisiert zahlreiche Bläschen, die innerhalb und zwischen den Zellen transportiert werden. Maßstabsbalken: 10 um. Die begleitenden Videos 1 und 2 [Ort Links zu Video 1 und 2 hier] entsprechen den 1C und D,jeweils.

Abbildung 2
Abbildung 2. Folding Sensoren zeigen die Breitenwirkung des Prion-Domäne auf Proteostase. (A + B) Coexpression R2E2m fördert RΔ2-5m Aggregation. Konfokale Bilder von (A) RΔ2-5m Kontrolle und (B) mit RΔ2-5m R2E2m coexprimiert in BWM Zellen. (C + D) Muskel exprimiert R2E2m fördert Darm RΔ2-5i Aggregation. (C) konfokale Bild des Kontrolltier exprimieren RΔ2- 5i in Darmzellen. (D) Konfokale Bild von Tieren exprimieren R2E2m in BWM Zellen und RΔ2-5i im Darm. Maßstabsbalken: 10 um (E + F) R2E2m induziert nicht zellautonomen Aggregation Q44i (E) Vertreter Fluoreszenzbilder von Q44i und Q44i; R2E2m Tieren 4 Tage nach der Übertragung synchronisiert L1 lar..vae auf frische OP50 ausgesät NGM-Platten. Die Expression R2E2 in BWM Zellen führt zu einer früheren Beginn der Q44i Aggregation im Darm. (F) Quantifizierung von Tieren mit Zuschlagstoffen (in%) an Tagen nach der Synchronisation. Fehlerbalken stellen SD Diese Zahl hat sich von 40 modifiziert.

Figur 3
Abbildung 3. Die SOD-3p :: GFP Transkriptions Stress Reporter zeigt, dass die Prion-Domäne verursacht Zell autonomen und nicht autonomen Zell Induktion von oxidativem Stress. (A + B) Vertreter Fluoreszenzbilder (mit der gleichen Belichtungszeit) von SOD-3p :: GFP-exprimierenden Kontrolltieren (A) und SOD-3p :: GFP;. R2E2m Tiere (B) am 2. Tag des Erwachsenenalters (C) Die Expression R2E2 in BWM Zellen führt zu einer Induktion des Reporter nicht nur in BWM Zells (I), sondern auch im Darm (II), Nervenstrang (III), des Rachens und der Kopf Neuronen (IV).

Abbildung 5
Abbildung 5. Analyse der Schneckenbewegung mit der wrMTrck Plugin für ImageJ. (A) Beispiel eines Eingangs Film unter Verwendung einer geeigneten Vergrößerung (~ 10X), mehrere Tiere auf einmal überwachen erzeugt. (B) "* _labels.tif" Dateien sind ein Ausgang wrMTrck_Batch und ermöglichen manuelle Kuration der Analyseergebnisse. Pfeil zeigt ein Objekt, das vollständig von der Analyse ausgeschlossen wurde durch eine geeignete Wahl der minimalen und maximalen Größenparameter. (C) Eingabefenster von wrMTrck_Batch, welche Parameter für dieses Protokoll verwendet. Diese Parameter müssen angepasst werden, je nach den individuellen Mikroskop und Filmeinstellungen. (D) Ausgangs Ergebnisse movement Analyse (B), die mit der Spalte BLPS gelb markiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Figur 1
Abbildung 6. R2E2 Würmer mit RNAi-Klone, die supressors von Prion-induzierte Toxizität (sopt) sind behandelt zeigen eine verbesserte Beweglichkeit. Motilität wird als relative BLPS gezeigt im Vergleich zu der Negativkontrolle (Leervektor). Sind alle Familien statistisch signifikant (Student t-Test) RNAi-Klone in der HTP-Bildschirm identifiziert. black star steht für die als Beispiel in Abbildung 5 dargestellt Hit. Die Ergebnisse stammen aus drei Filmen, mit 17 <n <53 Titel pro Bedingung. Fehlerbalken stellen SEM. </ P>

Tabelle 1 C. elegans Stämme, Klapp Sensoren und Stress Reportern.

Dehnungs Namen Genotyp Kommentare Dehnungsquelle
Folding Sensoren
Transgene
AM140 unc-54p :: polyQ35 :: YFP muskelspezifische Expression polyQ35, Alter abhängige Aggregation CGC oder Morimoto Labor
AM141 unc-54p :: polyQ40 :: YFP muskelspezifische Expression polyQ40, age abhängige Aggregation CGC oder Morimoto Labor
AM801 unc-54p :: RΔ2-5 :: YFP muskelspezifische Expression Keim inkompetenten Prion Domäne Morimoto Labor
OG412 VHA-6p :: polyQ44 :: YFP Darm-spezifische Expression von polyQ44, Alter abhängige Aggregation CGC
AM809 VHA-6p :: RΔ2-5 :: gfp; Myo-2p :: mCherry Darm-spezifische Expression von Keim inkompetent Prion-Domain Morimoto Labor
AM47 F25B3.3p :: polyQ40 :: cfp neuronenspezifische Expression polyQ40, Zelltyp-spezifische Aggregation Morimoto Labor
AM982 unc54p :: Luciferase :: YFP muskelspezifische Expression von WT Glühwürmchenluciferase Morimoto Labor Myo-3p :: Luciferase :: gfp; rol-6 muskelspezifische Expression von WT Glühwürmchenluciferase Behl Labor
SNG-1p :: Luciferase :: gfp; rol-6 muskelspezifische Expression von WT Glühwürmchenluciferase Behl Labor
FUH55 unc54p :: FLUC :: egfp; rol-6 muskelspezifische Expression von WT Glühwürmchenluciferase Hartl Labor
FUH134 unc54p :: FLUCSM :: egfp; rol-6 muskelspezifische Expression R188Q mutierten Luciferase Hartl Labor
FUH135 unc54p :: FLUCDM :: egfp; rol-6 muskelspezifische Expression R188Q + R261Q Doppelmutante Glühwürmchenluciferase Hartl Labor
FUH48 F25B3.3p :: FLUC :: egfp; rol-6 Neuron-spezifische Expression von WT Glühwürmchen luciferase Hartl Labor
FUH136 F25B3.3p :: FLUCSM :: egfp; rol-6 neuronenspezifische Expression R188Q mutierten Luciferase Hartl Labor
FUH137 F25B3.3p :: FLUCDM :: egfp; rol-6 neuronenspezifische Expression R188Q + R261Q Doppelmutante Glühwürmchenluciferase Hartl Labor
ts-Mutanten
CB1402 unc-15 (e1402) I Paramyosin (ts), temperaturempfindliche Unc-gelähmt Lassen CGC
CB1157 unc-54 (e1157) I Myosin (ts), temperaturempfindliche Uncs CGC
CB1301 unc-54 (e1301) I Myosin (ts), temperaturempfindliche Uncs CGC
CB286 unc-45 (E286) III Unc-45 (ts), temperaturempfindlich, langsam fahr Unc, Egl CGC
HE250 unc-52 (e669su250) II Perlecan (ts), temperaturempfindliche Unc, steife Lähmung CGC
SD551 let-60 (ga89) IV Ras (ts), temperaturempfindliche Muv, Ste, Lassen, Lva, Osm CGC
CX51 dyn-1 (ky51) X Dynamin (ts), temperaturempfindliche Unc CGC
CW152 Gas-1 (FC21) X Gas-1 (ts), temperaturempfindliche EtOH Empfindlichkeit CGC
ZZ26 unc-63 (x26) I Acetylcholinrezeptor (ts), temperaturempfindliche Widerstands Levamisol CGC
Stress Reporter
CL2070 hsp-16.2p :: gfp; rol-6 thermische Belastung; UPR Zyto CGC
TJ375 hsp-16.2p :: gfp thermische Belastung; UPR Zyto CGC
TJ3000, TJ3001 hsp-16.2p :: gfp; Cbr-unc-119 (+) thermische Belastung; UPR Zyto CGC
AM446 hsp70p :: gfp; rol-6 thermische Belastung; UPR Zyto Morimoto Labor
AM722 hsp70p :: mCherry; Myo-2p :: cfp thermische Belastung; UPR Zyto Morimoto Labor
AM799 hsp90p :: gfp thermische Belastung; UPR Zyto Morimoto Labor
OG497 HSF-1p :: HSF-1 :: gfp; Cbr-unc-119 (+) thermische Belastung; UPR Zyto CGC
CF1553 SOD-3p :: gfp; rol-6 oxidativen Stress CGC
KN259 SOD-3p :: gfp; rol-6 oxidativen Stress CGC
CL2166 gst-4p :: gfp :: nls oxidativen Stress CGC
LD1171 gcs-1p :: gfp; rol-6 oxidativen Stress CGC
LD1 SKN-1p :: SKN-1 :: gfp; rol-6 oxidativen Stress CGC
IG274 NLP-29p :: gfp osmotischer Stress CGC
BC20309 mtl-1p :: gfp Metallstress Baillie Labor
BC20342 mtl-2p :: gfp Metall stress Baillie Labor
BC20314 elt-2p :: gfp Metallstress Baillie Labor
SJ4005 hsp-4p :: gfp UPR ER CGC
SJ4100 hsp-6p :: gfp UPR mito CGC
SJ4058 hsp-60p :: gfp UPR mito CGC

CGC: Caenorhabditis Genetics-Center; ts = temperaturempfindlich; UPR = entfaltete Protein Reaktion; Zyto = cytosolische; mito = Mitochondrien; ER = Endoplasmatischen Retikulum.

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Discussion

Die hier beschriebenen Methoden helfen, um zu veranschaulichen die Verbreitung und der komplexen Zell autonomen und nicht autonomen Zelltoxizität von Prion-ähnlichen Proteinen. Wir haben vor kurzem festgestellt, dass eine Aggregation neigende cytosolische Prion-Domäne wird in membrangebundene Vesikel in einer Autophagie bezogenen Prozess übernommen. Eine spezielle Untergruppe dieser Vesikel transportiert das Prion-Domäne innerhalb und zwischen den Zellen und Gewebe 40. Der Schlüssel, um ihre Bewegung im lebenden Tier zu überwachen ist, dass das Protein mit mRFP markiert werden, da nur mRFP-markierten Proteine ​​in diesen vermutlich sauren Vesikeln sichtbar waren. Mit dem gleichen Ansatz, untersuchen wir derzeit die Möglichkeit Prion-ähnlichen Verhalten bestimmter krankheitsbezogene Proteine, wie Superoxid-Dismutase 1 (SOD1) (ALS verbunden sind), Alpha-Synuclein (PD verbunden) oder TAR DNA-bindendes Protein 43 (TDP-43) (an ALS verbunden). Obwohl diese interzellulären Transport in Vesikeln scheint von mehreren anderen Proteinen verwendet werden, gibt es vielleicht einW eitere Wege, die Verbreitung zu ermöglichen.

Die Verwendung von gut charakterisierten Faltung Sensoren ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Effekte auf die zelluläre Proteinfaltung Umgebung in C. überwachen elegans 63-66. Hier haben wir gezeigt, wie man die altersabhängige Anreicherung von fluoreszenz verwenden tagged Aggregation neigen Proteine ​​unter gewebespezifische Promotoren exprimiert, um die Faltung Kapazität von verschiedenen Geweben gleichzeitig visuell überprüft werden. Andere Möglichkeiten, den organismal Proteostase Netzwerk untersuchen umfassen die Verwendung von endogenen ts mutierten Proteine. Diese metastabilen Proteine ​​werden normalerweise bei der permissiven Temperatur (15 ° C) zu funktionieren, aber misfold und werden nicht funktionellen bei der restriktiven Temperatur (25 ° C), ihre charakteristischen mutanten Phänotyp zeigt. In Gegenwart einer Aggregation neigen Protein oder während des Alterns, die ts Mutantenphänotyp auch bei permissiven Bedingungen 63-66 ausgesetzt wird. Einige dieser ts-Mutanten werden in o ausgedrücktur eine Teilmenge von Geweben oder gewebespezifische Ausstellungs Phänotypen, so dass diese besonders nützlich für die Zell autonomen und nicht autonomen Zell proteotoxic Effekte zu testen. Zum Beispiel kann ein ts-Mutante von LET-60, ein Mitglied der GTP-bindenden RAS Protoonkogen-Familie, Ras (ts) wird ubiquitär exprimiert, zeigt jedoch gewebespezifische Mutantenphänotypen 63,66. Durch die Verwendung von diesen TS-Mutante, wurde die Wirkung von polyQ Erweiterungen auf zellulärer Proteostase gezeigt Zelle autonom 63 sein. Expression von polyQ in den genetischen Hintergrund von ras (ts) zeigte nur die Mutantenphänotyp spezifischen Gewebe, in denen das Protein exprimiert wurde. Die Exposition von mehreren Mutantenphänotypen würde bedeuten, dass ein Protein nicht-zellautonomen proteotoxic Wirkungen.

Zusätzlich zu den Wirkungen auf die zelluläre Stresssignalwege zu testen, gibt es eine große Auswahl an in vivo Fluoreszenz-Stress Reportern in C. elegans 72. Diese sind meist Transkriptionsal Reportern, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter einem stressinduzierbaren Promotors exprimieren, wie beispielsweise hsp-16.2p oder SOD-3p, die auf thermischen oder oxidativen Stress bzw. 72 zu melden. Durch Verwendung geeigneter Reporter in Kombination mit Prionen-ähnlichen Proteine, kann man eine potentielle Induktion von Streßreaktionen in andere als die der entsprechenden Transgen exprimierenden Geweben überwachen. Eine Warnung ist allerdings, dass diese Spannungs Reporter sind oft nicht empfindlich genug, um subtile Aufregulierung eines gegebenen Weges (unveröffentlichte Beobachtungen) offenbaren.

Auf unserer Suche zu prüfen, ob Gene, die die nicht-zellautonomen Toxizität auswirken, wirken sich auch auf Protein verbreiten, durch Screening nach Genen, die, wenn abgerissen würde Bewegung Mängel zu verbessern haben wir begonnen. Mit visuellen Beurteilung der Schwimmkurse als Auslese, waren wir in der Lage, bequem Assay ~ 25 Platten pro Sitzung und führen Sie zwei Runden dieses Protokolls pro Woche, was zur Fertigstellungvon dem Einstiegsbild innerhalb von 6 Wochen. Die Bestätigung der Ergebnisse durch quantitative Analyse der Schneckengang auf Festplatten, in Triplikaten mit wrMTrck wurde weitere 3 Wochen Behandlung statt. Ein Nachteil ist jedoch, dass durch die Verwendung kriechen in Platten statt schwimmen in flüssigen Medien als Auslese könnte man bestimmte Kandidatengene zu verlieren, wie Schwimmen und kriecht nicht identisch Bewegungen und kann durch verschiedene Wege 73 beeinflusst werden. Wenn also einige Kandidatengene ist nicht auf feste Platten bestätigt werden, sollten sie in flüssigen Medien, in dem Schwimmen kann durch Zählen der Prügel Frequenz innerhalb eines bestimmten Zeitraums quantifiziert werden erneut getestet werden.

Die hier beschriebene Screening-Protokoll verwendet automatisierte Liquid Handling Workstations, die stark reduziert die Variabilität. Der Nachteil ist, dass ein Überschuss von Fluiden für das Reservoir der Roboter erforderlich ist, was nicht immer durchführbar sein könnte. Dieses Screening-Setup kann leicht für andere Bildschirme in C angepasst werden elegans </ Em>, dass die Verwendung Prügel als schreib out.This Bildschirm wurde nicht entwickelt, um direkt Gene, die die Verbreitung oder nicht zellautonomen Toxizität des Prion-Domain beeinflussen, da genomweite Screens sollte einfach aufgebaut sein zu identifizieren, um so durchgeführt werden, in einer angemessenen Zeitspanne. Bewegungsdefekte können nicht nur aus Muskel, sondern auch von neuronalen Schäden und von einer Reihe von anderen Gendefekten 53 stammen. Somit ist es durch Verwendung dieses Auslese, könnten wir nicht nur Modifikatoren muskelspezifische Toxizität zu finden. Derzeit testen wir die Kandidatengenen für deren Auswirkungen auf die Prion-Domain verbreiten und nicht autonomen Zelltoxizität mit den oben beschriebenen Methoden. Diese Experimente werden schließlich aufdecken, ob trans Ausbreitung von Proteinaggregaten ist direkt mit dem in anderen Geweben oder Zell-zu-Zell-Übertragung und nicht zellautonomen Toxizität abkuppelbar beobachtete Toxizität verbunden.

Zusammengenommen können die beschriebenen Verfahren verwendet werden, um das Potenzial pr untersuchenIonen-ähnliches Verhalten von Proteinen an der zellulären und organismischen Ebene mit C. elegans.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm ThermoScientific 3100A
Levamisole Sigma L-9756
IPTG Sigma 15502-10G
Ahringer RNAi library Source BioScience LifeSciences  http://www.lifesciences.sourcebioscience
.com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC ThermoScientific 75004521 http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_
XTR_Refrigerated_Centrifuge_120
VAC/EW-17707-60
96 pin replicator  Scionomix   http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker  Digilab http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser  Titertrek http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation  Beckman Coulter http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker New Brunswick http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec
04&action=products&contentid=1&
catalognode=83389
M205 FA  Leica http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera Hamamatsu http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope  Leica http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera  Teledyne Dalsa  http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software Meyer Instruments http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ NIH http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT) Caenorhabditis Genetics Center (CGC) http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] Morimoto lab available from our laboratory 
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains

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References

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