在免疫抑制剂他克莫司对干血斑使用LC-MS / MS定量

1iC42 Clinical Research and Development, University of Colorado, Anschutz Medical Campus, 2Division of Clinical Pharmacology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Food and Drug Administration (FDA), Center of Drug Evaluation Research - Office of Generic Drugs, 4Transplant Clinical Research, University of Cincinnati
Published 11/08/2015
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Medicine

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Shokati, T., Bodenberger, N., Gadpaille, H., Schniedewind, B., Vinks, A. A., Jiang, W., et al. Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS. J. Vis. Exp. (105), e52424, doi:10.3791/52424 (2015).

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Abstract

钙调神经磷酸酶抑制剂他克莫司是在美国实体器官移植后的免疫抑制大多数治疗方案的基石。他克莫司是一个窄的治疗指数的药物,因此需要治疗药物的监测,并根据它的全血谷浓度调整剂量。为方便家庭治疗药物,并坚持监测,干血斑的集合是一个有吸引力的概念。手指棒后,病人收集在滤纸上血滴在家里。血后进行干燥,则邮寄到分析实验室,其中他克莫司是用高效液相色谱法 - 串联质谱法量化(HPLC-MS / MS)在一个简单的手动蛋白质沉淀步骤和在线柱萃取组合。

他克莫司分析,一个6毫米光盘从血液点的饱和点刻。血斑用一颗子弹搅拌机均质第二然后蛋白沉淀,用甲醇/ 0.2M的硫酸锌含有内标D 2,13 C-他克莫司。涡旋和离心后,将100μl上清液注入到一个在线萃取柱中,用5毫升/分钟0.1甲酸/乙腈(7:3,体积比),持续1分钟。此后,切换阀被激活,分析物被反冲洗到分析柱(并用0.1%甲酸/乙腈梯度分离)。他克莫司被量化中使用的串联质谱仪的阳性反应的多模式(MRM)。

该测定是从1至50ng / ml的线性。批间变异性(3.6%-6.1%)和准确度(91.7%-101.6%)的评估20天以上达到验收标准。平均提取回收率为95.5%。有没有相关的结转,基质干扰和基体效应。他克莫司是稳定的干血斑在RT和在4℃下1周。在提取样本自动进样器是稳定的,在4℃下至少72小时。

Introduction

他克莫司是一种强效immonosuppressant 1-7具有一个大环内酯结构8( 图1)。由于 -该CN键的反异构它形成在溶液9两种旋转异构体,可通过反相高效液相色谱法进行分离(HPLC),他克莫司是亲脂性和可溶于醇(甲醇653克/升,乙醇:355克/升),卤代烃(氯仿:573克/升)和乙醚。它是难溶于脂族烃(己烷:0.1克/升和水(pH 3:0.0047克/升)9所述的分子不包含任何发色团并且其紫外吸收最大值是通过抑制神经钙的192纳米的他克莫司的行为。其作用的机制已经在参考文献10,11综述。它是目前使用在80%以上的固体器官移植患者的在美国12。

他克莫司的治疗指数是considered可窄13。此外,他克莫司的剂量和血液浓度之间的相关性差和药代动力学是可变14,15。治疗药物监测指导剂量的他克莫司在移植患者因此一般的临床实践16-20。的目标是保持他克莫司血液中的浓度的预定义治疗范围内。下面的治疗范围他克莫司血液中的浓度可导致慢性或急性同种异体免疫反应的活性增加,而浓度大于治疗窗口增加用于过免疫抑制,癌症和毒性,如肾毒性,神经毒性,高血压和糖尿病的风险。他克莫司的药代动力学高个体内的变化可能是有害的既移植器官和患者存活21,22。而他克莫司的药代动力学的个体间变异主要是由CYP3A5基因多态性,原因个体内变异包括但不限于,药物与药物,疾病-药物和食品药物相互作用14,15。也缺乏坚持免疫抑制治疗药物治疗是一个促进因素,一个重要原因移植损失23,24。

这些考虑表明,频繁家治疗药物和他克莫司的全血浓度的粘附监测可能是有益的,以确保患者在任何时候所需治疗窗口内的他克莫司的曝光。但是,物流和更频繁的治疗药物监测的成本,因为它是目前的临床实践15是令人望而却步。其中一个原因是,该患者具有看到一个抽血有绘制所需的静脉血样。干血斑最近成为一个有吸引力的概念25-28。经过简单的手指贴在病人聚集在一个特殊的过滤纸卡,后血斑有d血滴里德,它可以邮寄到中心实验室用于他克莫司的分析和任何其他的免疫抑制剂,该患者可能目前服用。这已经成为可能的,因为高度敏感和特异的LC-MS / MS测定法他克莫司和其他免疫抑制剂的定量在非常小的血液量的发展,如干燥血点(通常是20微升血液)25,29-43。另一个优点是,微创,低体积的样品收集策略诸如干血斑大大方便治疗药物的监测和药代动力学研究中的儿童小28。

他克莫司通常以静脉EDTA全血15。原因是他克莫司广泛分布成血细胞和临床研究报道他克莫司谷浓度在血液之间有更好的相关性比血浆的临床事件15,18。相比较而言,Ta的分析crolimus在干燥血点是基于毛细血与该滤纸基质混合。此呈现在他克莫司和潜在的干扰与LC-MS / MS分析的溶解方面的挑战。这里,我们提出基于使用结合的子弹搅拌器具有高流动性的在线列取样清理过程和LC-MS / MS分析的干燥血点的均质建立和验证实验。到今天为止,此法已成功地用于五千余他克莫司干血斑样本的定量分析在临床试验中坚持监测。

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Protocol

从健康人不标明身份的血液样本分别来自美国科罗拉多州大学医院(科罗拉多州Aurora)。使用去鉴定血库样本进行验证研究,以及对标准品和质量控制样品的制备被视为“豁免”是由美国科罗拉多州的多机构审查委员会(COMIRB,极光,科罗拉多)。

1.准备参考和解决方案

  1. 购买他克莫司和内部标准的D 2,13 C-他克莫司从材料清单中所列的供应商。
    1. 制备储备溶液中的纯甲醇以1mg / ml的他克莫司的浓度为10微克/毫升为D 2,13 C-他克莫司的浓度。请参考材料基于三个独立的权重的股票解决方案。等分储备溶液并储存在-70℃或以下。
  2. 制备溶液以沉淀蛋白并提取使用甲醇/ 0.2M的硫酸锌的他克莫司在水(7:3,体积比)。这个溶液还含有内标D 2,13 C-他克莫司在2.5纳克/毫升的浓度,并用于除空白样品的提取所有样品(请参见1.3.3)的提取。
    1. 新鲜制备这种蛋白沉淀溶液每个萃取天并设置溶液期满在12小时。
  3. 校准曲线和质量控制(QC)样品的制备
    1. 通过执行使用纯甲醇原液适当稀释制备储备溶液的他克莫司。
    2. 以制备校准品和质量控制样品,穗20微升适当稀释的原液进入EDTA全血,孵育在37℃下轻轻摇动的水浴中,以允许均匀分布的他克莫司成血细胞成分20分钟,等分到1.5毫升息肉与锥底ropylene管和单元的盖子。确保有机溶剂的相对量不超过5%。
    3. 点50微升加标全血的插入用吸管滤波器卡每一圆圈的中间。
    4. 干燥血斑点滤波器卡在RT搅拌3小时。
    5. 制备在人EDTA全血的他克莫司校准标准以1,2.5,5,10,25,和50ng / ml的他克莫司的浓度。准备提取样校准标准,包含内标D 2,13 C-他克莫司(“零样本”)的蛋白质沉淀溶液空白样品。
    6. 制备QC样品中人类EDTA全血,在0,2,4,20,40纳克/毫升的浓度。准备一个空白样品。在对比的是与含有内标D 2沉淀中提取的QC样品,13 C-他克莫司,提取液用蛋白沉淀溶液,这是否空白样品不包含内标D 2,13 C-他克莫司(“空白样品”)。
  4. 采集临床样品
    1. 43,44描述收集干血斑。

2.他克莫司的提取干血斑样本

  1. 目视检查干燥血点,以确保可接受的样品的质量和体积45。
  2. 冲压中心过滤卡用6毫米的打孔机上的血点。
    注意:冲头的质量可能通过称重来监测。所涉及的冲压饱和滤片的重量平均5.02毫克±0.09毫克(范围:4.83- 5.14毫克,N = 12)。
  3. 将光盘插入1.5毫升聚丙烯管与锥形底和管理单元的盖子。
  4. 添加20〜30发子弹,每管。
  5. 加入500微升蛋白沉淀溶液(甲醇:0.2M的硫酸锌,7:3,体积:体积,用2.5毫微克/毫升内标)到每个管中。对于抽空白样品的作用,可使用蛋白质沉淀溶液而无需内部标准。
  6. 均质光盘中的子弹搅拌机1分(最高速度,设置为“10”)。
  7. 摇晃样品在RT上多管涡旋(最大速度,设置为“10”)10分钟。
  8. 离心样品在16000×g离心4℃10分钟。
  9. 转移上清液到装有300微升插入玻璃HPLC小瓶。使用预切口特氟隆密封。
    注意:提取样品可以贮存于-20℃或以下直到LC-MS / MS分析。

3,LC-MS / MS分析

  1. 负载100微升所提取样品的上清液到C8盒萃取柱,并用一个7:在水3比为0.1%甲酸:乙腈以5ml /分钟的流量为1分钟。切换阀的连接示于图2和梯度由提取泵 1运行
  2. 此后,激活导致从预柱的分析物的反冲洗到分析柱切换阀。
  3. 设置柱温箱到65℃。
  4. 洗脱来自分析柱使用表1中所示的流速和梯度的分析物。
  5. 经由涡轮电喷雾离子源连接分析柱到一个串联质谱仪。 根据2调整质谱仪的关键参数。
  6. 检测正离子([M +的Na] +)的多反应模式(MRM)。使用下面的离子转换为量化:他克莫司:M / Z(质量/电荷)= 826.6→616.2和D 2,13 C-他克莫司:M / Z = 829.6→619.2。
    注:总运行时间为4.6分钟。

4.定量

  1. 对于每次运行,基于在1.3.5和制备的校准器产生标准曲线包括在每一个分析运行。
    1. 生成绘制名义浓度分析物的响应因子(峰面积[分析物] /峰面积[内标])使用质谱仪软件校准曲线。
    2. 使用二次拟合结合1 / X加权拟合校准。
  2. 要量他克莫司在干血斑融入提取的MRM色谱图的他克莫司和内标峰。计算响应因子的他克莫司(峰面积[分析物] /峰面积[内标]),并利​​用质谱分析软件的标准曲线进行比较。

5.验证程序

  1. 检测(LLOD)下限和定量(LLOQ)下限。
    1. 考虑的最低他克莫司浓度的峰值 - 噪声比为4:作为检测(LLOD)的下限1。定义量化(LLOQ)的下限为与精确度等于或小于±20%的偏差更好从标称浓度和精度等于或优于20%(变异系数)校正曲线的最低浓度。
  2. 区域内和日间准确度和精密度。
    1. 测试的准确度和精确度以2纳克/毫升(QC1),4纳克/毫升(QC2),20纳克/毫升(QC3)和40纳克/毫升(QC4)4的浓度水平。
    2. 准备在每个验证一天质控样品中人类EDTA全血,干的过滤器卡,提取,并按上述方法进行分析。
    3. 确定日内准确度和精密度,每个QC浓度水平6个样品。
    4. 评估日间精密度和准确度超过20天。测量每个QC水平每天4个样品。
    5. 对每一天的质控样品分析两个校准曲线在一起。
    6. 计算日内准确性标称浓度%(每浓度水平六个样本,请参见5.2.2节)。计算器乌拉特精度的方差(CV%)的系数。
    7. 考虑日内精度上可接受的,如果它落入接受限制的85%至115%的标称浓度。考虑日内精密度接受的,如果它等于或优于15%的CV(变异系数)。
    8. 计算日间准确度和精密度的平均值在20天的验证分析每个QC浓度水平。
    9. 考虑平均日间精度上可接受的,如果它落入接受限制的85%至115%的标称浓度。考虑日间精密度接受的,如果它等于或优于15%的CV(变异系数)。
  3. 排除基质干扰。
    1. 对于可能由矩阵信号造成干扰的排除,分析空白干血斑(8种不同的个人,最好是4男4女)。
    2. 目测离子色谱图。如果保留时间内的峰检测他克莫司的窗口,整合并与空白试样中他克莫司峰的曲线下比较各自领域掺入他克莫司在LLOQ。空白样品中的峰的面积是不应该超过这些他克莫司在LLOQ的15%。
  4. 离子抑制/离子增强。
    1. 使用柱后输注方案所描述45,以评估所造成的共洗脱基质组分离子抑制/离子增强的潜在干扰。
    2. 注入他克莫司以溶解在0.1%甲酸10微克/ ml的浓度:甲醇(30:70,体积/体积)柱后,以10微升/分的速度。
      1. 连接通过分析柱和质谱仪的电源之间T形管的注射器泵。
      2. 监测MRM离子的MS / MS信号强度为他克莫司和它的内部标准(M / Z = 826.6→616.2和m / z = 829.6→619.2)注射为Extrac的后泰德空白样品(n =来自不同个体的8个样本)。
        注:在没有离子抑制/离子增强引起输注分析物的连续信号不应该受注射空白基质,同时离子抑制使信号和离子增强的峰值的倾角。
  5. 结转。
    1. 通过分析提取的最高校准后的空白样品评估潜在的结转(50纳克/毫升,N = 6)。
    2. 目测离子色谱图。如果他克莫司的保留时间窗内的峰被检测到,集成和与那些空白样品在他克莫司的峰的曲线下比较它们的区域掺入他克莫司在LLOQ。空白样品中的峰的面积是不应该超过这些他克莫司在LLOQ的15%。
  6. 提取回收率。
    1. 通过提取QC SAM后比较分析的信号来确定回收率普莱斯在所有四个浓度(每组n = 6浓度)与那些空白干血斑掺有提取后相应的金额的他克莫司。
    2. 准备四组的QC(浓度水平:2,4,20日,40纳克/毫升)。
    3. 准备另4套相应的“回收试验样品”通过发现50微升的空白EDTA全血到滤纸卡和干燥2小时的。
    4. 此后来说,无论是质量控制和空白“回收试验样品”,切出整个血斑过滤卡上用剪刀将得到的光盘插入聚丙烯管,锥底和管理单元的盖子。
    5. 抽取的所有样品。
    6. 转移上清液(400微升)到玻璃HPLC小瓶。
    7. 他克莫司添加原液到空白“提取的恢复试验样品”,达到2,4,20和40纳克/毫升(4微升200,400,2000,4000纳克/毫升的他克莫司的库存溶胶浓度utions 400微升上清液)。
    8. 后的LC-MS / MS分析,二者QC样品和“恢复试验样品”相应的浓度在比较的信号(恢复(%)=信号样品添加后萃取×100之前提取/信号样品添加)。
  7. 稀释的完整性。
    1. 使用建立稀释完整性样品掺入分析物,在500,250和100纳克/毫升。
    2. 提取后,使用稀释的蛋白沉淀溶液样品(1:10,每组n =浓度级别3)。
    3. 计算从标称浓度的偏差。考虑落入85%的名义接受-115%的结果。
  8. 稳定性。
    1. 调查使用QC样品在所有四个浓度(n = 4时每个浓度)在不同时间点和不同的存储条件下分析稳定性。
    2. 比较存储与标称值后的结果。考虑řesults落在85%的名义接受-115%的。
    3. 建立样品稳定性1周在环境温度下,1周,在4℃,1个月-20℃1个月-80℃。
    4. 过三个周期测试冻融稳定性(-20℃)。测试样品中提取和自动进样器的稳定性通过将样品放入恒温自动进样器调节到4℃。 72小时后注射样品。

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Representative Results

空白样品的代表离子色谱,样品掺入在量化和患者样品的下限示于图3。

校准曲线

检测的下限为0.5 ng / ml和定量的下限为1.0毫微克/毫升。把15ng / ml的被选为最高校准器更高的浓度不太可能在临床上正常的情况下达成。

校准曲线在每个验证天在人EDTA全血新鲜制备的,在过滤器上卡干燥和用萃取甲醇/ 0.2M的硫酸锌(70:30体积/体积)+内标(内部标准终浓度:2.5纳克/毫升)。为天1验证(每组6为校准和n = 6的QC水平)和天2 - 20(n = 2的用于校准和n = 4的每个QC水平)与浓度1,2.5,5分析10,25,50纳克/毫升为CALIB符之一。典型的校准曲线示于图4中 ,平均85%的精度,以标称115%,工作范围的校准的2/3(以最小的6非零校准)内被认为是可以接受的。相关的平均系数为(R)= 0.999(N = 40校准曲线)。

准确度和精度

其结果详细示出表3中。

提取回收率

平均回收率分别为98.2%(2纳克/毫升),92.2(4纳克/毫升),95.5(20毫微克/毫升),96.2(40毫微克/毫升)。

基质干扰,离子抑制/离子强化试验连续使用柱后输液和结转

从八个不同的个体(n = 4的雌性和n = 4的男性)的保留时间显示信号的LLOQ(1ng / ml的)小于15%对应于所分析的空白样品的他克莫司峰指示该检测他克莫司的峰值可以被认为是特定的。的代表性示例于图3。潜在干扰由离子抑制/离子增强用空白干燥血样从八个不同的健康个体进行测试。代表性实验于图5。显著离子抑制/离子增强未有迹象进行观察。进行检测造成的峰值超过了信号的15%LLOQ没有相关的结转。

稀释诚信

稀释完整性通过分析制备的浓度高于最高校准器(100,250和500毫微克/毫升),并提取后1:10稀释在蛋白质沉淀溶液达到目标浓度的样品研究:10,25,和50毫微克/毫升。平均数精度必须的85%的接受标准内下降到名义浓度的115%。所有的稀释工商业污水附加费泰德满足验收标准表4)。

稳定性

他克莫司在干燥血点的稳定性通过分析QC样品,在所有四个级别(N = 4 /浓度水平),其储存在不同条件下的影响。

平均数精度必须的85%的接受标准内下降到名义浓度的115%。结果示于细节表5中。 1周存储在RT后没有损失,贮存1周后,在4℃,储存1个月后,在-20℃下,储存1个月后,在-80℃下,经过3冻融循环,并且在4℃下72小时在自动取样提取的样品后是显而易见的。

提取泵 分析(洗脱)泵
水+ 0.1%甲酸 乙腈 流速[微升/分钟] 时间[分钟] 水+ 0.1%甲酸 乙腈 流速[微升/分钟]
0 70 三十 5000 0 13 87 1000
1 70 三十 5000 2 2 98 1200
1.1 2 98 100 3.5 2 98 1200
3 2 98 100 3.6 13 87 1000
3.1 20 80 2000 4.6 13 87 1000
4 70 三十 5000
4.6 70 三十 5000

表1.梯度程序的提取和分析HPLC泵。

参数 设置
碰撞气(CAD) 10
窗帘气(CUR)(PSI) 三十
离子源气体1(GS1)(psi)的 50
离子源气体2(GS2)(psi)的三十
雾化器电流(NC)(V) 1
温度(TEM)(℃) 600
离子喷雾电压(IS)(V)的 5500
接口加热器(IHE)
去聚电势(DP)(V)的 136
入口电势(EP)(V)的 10
碰撞能量(CE)(V)的 47
碰撞单元出口潜力(CXP)(V) 16

表2.涡轮增压电接口和质谱仪参数的命名对应于在质谱软件中使用(生产厂家的详细信息,请参阅材料清单)。

<TD> 106
验证日 QC等级[%标称浓度]
2 4 20 40
第1天 93.0 86.3 88.9 93.4
101 90.4 95.3 100
85.6 95.9 99.0 97.5
88.6 93.6 105 103
85.0 97.4 97.2 109
89.1 96.7 100 101
日内精度[%] 90.4 93.4 97.6 100.7
日内不精确[CV%] 6.6 4.6 5.5 5.2
第2天 92.8 86.0 103
91.1 88.8 94.7 87.0
88.6 90.9 92.8 94.2
97.2 93.7 94.2 115
日内精度[%] 92.4 89.9 96.2 97.9
日内不精确[CV%] 3.9 3.6 4.8 12.2
第3天 97.6 101 98.4 112
104 85.6 102 110
99.2 88.4 99.4 105
96.3 87.2 108 117
日内精度[%] 99.3 90.6 102.0 111.0
日内不精确[CV%] 3.4 7.8 4.2 4.5
第4天 95.2 88.6 112 94.5
105 87.3 93.2 116
99.8 96.2 103 103
100 104 97.2 99.4
日内精度[%] 100.0 94.0 101.4 103.2
日内不精确[CV%] 4 8.2 8.1 8.9
第5天 106 90.4 101 106
108 89.0 100
102 101 96.6 128
105 88.8 105 107
日内精度[%] 105.3 92.3 102.2 110.3
日内不精确[CV%] 2.4 6.3 4.2 11.1
6天 90.9 93.7 119 106
98.8 88.1 96.4 110
94.6 96.3 99.1 108
108 100 102 102
日内精度[%] 98.1 94.5 104.1 106.5
7.5 5.3 9.8 3.2
7天 85.1 87.5 99.5 95.4
86.4 85.4 94.7 101
94.5 87.3 98.9 94.6
85.5 97.0 101 99.6
日内精度[%] 87.9 89.3 98.5 97.7
日内不精确[CV%] 5.1 5.8 2.7 3.2
8天 86.1 92.5 91.9 102
87.5 91.5 95.2 88.5
115 85.6 92.1 102
85.8 85.9 95.4 108
日内精度[%] 93.6 88.9 93.7 100.1
日内不精确[CV%] 15.3 4.1 2.0 8.2
9日 88.9 91.4 96.9 100
90.0 89.8 95.0 100
69.7 85.9 95.8 109
91.9 87.0 105 101
日内精度[%] 85.1 88.5 98.2 102.5
日内不精确[CV%] 12.2 2.9 4.7 4.3
第10天 90.9 91.3 96.2 100
97.7 89.5 94.4 100
99.9 109 98.7 96.8
99.1 90.0 95.7 96.1
日内精度[%] 96.9 95.0 96.3 98.2
日内不精确[CV%] 4.2 9.9 1.9 2.1
第11天 92.7 91.9 88.2 104
96.6 91.2 97.0 110
109.0 92.8 970.6 102
98.3 107 93.7 111
日内精度[%] 99.2 95.7 94.1 106.8
日内不精确[CV%] 7 7.9 4.6 4.1
第12天 87.7 85.5 105 95.3
112 88.1 101 96.1
102 89.1 89.7 97.5
106 92.5 102 104
日内精度[%] 101.9 88.8 99.4 98.2
日内不精确[CV%] 10.1 3.3 6。7 4
13天 失败 85.7 93.3 102
101 105 88.0 93.9
112 98.0 91.4 102
104 113 104 101
日内精度[%] 105.7 100.4 94.2 99.7
日内不精确[CV%] 5.4 11.5 7.3 3.9
14天 91.5 89.1 97.4 93.1
90.4 87.1 93.9 99.8
89.7 97.0 94.8 106
97.4 86.8 89.9 失败
日内精度[%] 92.3 90.0 94.0 99.6
日内不精确[CV%] 3.8 5.3 3.3 6.5
第15天 92.8 92.8 92.5 95.4
97.5 96.3 96.2 95.5
95.5 108 97.3 99.3
110 109 115 113
日内精度[%] 99.0 101.5 100.3 100.8
日内不精确[CV%] 7.7 8.1 10.0 8.3
第16天 93.7 97.8 90.7 112
90.3 87.1 失败 101
97.9 88.3 95.5 107
91.4 85.7 89.3 96.7
日内精度[%] 93.3 89.7 91.8 104.2
日内不精确[CV%] 3.6 6.1 3.5 6.4
第17天 88.0 86.0 93.7 103
89.8 90.8 94.8 93.2
85.9 91.1 99.7 94.8
86.7 88.1 95.6 91.7
日内精度[%] 87.6 89.0 96.0 95.7
日内不精确[CV%] 1.9 2.7 2.7 5.3
18天 89.6 85.8 91.0 98.3
89.6 86.2 88.3 93.6
失败 86.7 96.8 104
88.1 85.8 95.2 111
日内精度[%] 89.1 86.1 92.8 101.7
日内不精确[CV%] 1.0 0.5 4.2 7.4
19天 98.0 </ TD> 89.7 94.2 102
88.3 86.0 97.6 102
91.6 88.1 95.8 97.5
90.7 90.1 92.8 88.3
日内精度[%] 92.2 88.5 95.1 97.5
日内不精确[CV%] 4.5 2.1 2.2 6.6
20天 93.0 87.0 99.4 101
97.3 87.6 95.5 91.9
89.0 88.4 91.2 93.5
104 90.7 97.7 115
日内精度[%] 95.8 88.4 96.0 100.4
日内不精确[CV%] 6.7 1.8 3.7 10.5

日间准确度和不精确
日间精度 95.2 91.7 97.2 101.6
日间不精确 6.1 4.5 3.6 4.2

表中的质量控制样品3,结果在20天。数据表示为%的名义上的。列为“失败”样本丢失实验室/仪器误差的样本。在大多数CASES,无峰在所有的检测或内标峰失踪了。

稀释 1:10
稀释后的名义目标浓度 50ng / ml的
98.6
94.5
91.4
精度[%] 94.8
不精确[CV%] 3.6
稀释 1:10
稀释后的名义目标浓度 10ng / ml的
103
99.5
101
精度[%] 101.2
不精确[CV%] 1.8
稀释 1:10
稀释后的名义目标浓度 25纳克/毫升
91.7
98.2
103
精度[%] 97.6
不精确[CV%] 5.7

表4.稀释完整性检测,数据结果表示为%的名义。

一个
在室温稳定,1天
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
91.9 85.8 86.0 102
86.7 85.7 88.5 102
86.0 85.9 90.1 103
89.2 98.0 90.8 112
%标称浓度 88.5 88.9 88.9 104.8
不精确[%简历] 2.7 6.1 2.1 4.9
在室温下稳定,第3天
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
88.6 105 101 113
94.1 100 98.5 103
100 101 106 109
99.5 102 102 108
%标称浓度 95.6 102.0 101.9 108.3
不精确[%简历] 5.3 2.2 3.1 4.1
在室温下稳定,第7天
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
105 103 91.7 109
101 107 100 110
102 108 107 105
93.8 105 109 111
%标称浓度 100.5 105.8 101.9 108.8
不精确[%简历] 4.7 2.2 7.8 2.6
在+ 4°C,日1稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
101 89.9 95.8 100
88.9 91.0 94.1 99.0
96.2 100 102 96.7
89.5 87.8 95.4 88.6
%标称浓度 93.9 92.2 96.8 96.1
不精确[%简历] 5.8 5.4 3.5 5.2
在+ 4℃,3日稳定
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
87.3 85.2 105 95.3
失败 87.8 101 96
101 88.8 89.6 97.5
106 92.2 102 104
%标称浓度 98.1 88.5 99.4 98.2
不精确[%简历] 9.7 2.9 6.8 4
在+ 4℃,7日稳定
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
94.0 98.5 96.1 110
92.9 96.4 109 109
91.7 96.3 97.9 115
94.7 96.9 99.8 113
%标称浓度 93.3 97.0 100.7 111.8
不精确[%简历] 1.3 1.0 5.7 2.8
C
在-20℃,3天的稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
87.3 98.7 111 111
93.5 89.6 108 105
89.5 91.5 107 112
88.2 99.1 108 92.4
%标称浓度 89.6 94.7 108.5 105.1
不精确[%CV] 2.7 4.9 1.7 9
在-20℃下,7天的稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
96.5 98.7 102 109
94.8 94.6 114 106
95.5 102 98.1 108
107 99.5 115 105
%标称浓度 98.5 98.7 107.3 107
不精确[%简历] 5.7 3.1 8.5 1.8
</ TD>
在-20°C,30天稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
82.3 83.1 90.4 93.2
87.9 85.8 85.3 97.9
85.7 88.6 98.3 98.0
92.0 95.6 110 103
%标称浓度 87.0 88.3 96.0 98.0
不精确[%简历] 4.1 5.4 10.8 4
ð</ TD>
在-80℃,3天的稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
87.5 96.5 96.7 失败
失败 97.6 98.7 110
88.8 96.4 106 109
87.3 101 96.5 109
%标称浓度 87.9 97.9 99.5 109.3
不精确[%简历] 0.8 2.2 4.5 0.6
在-80℃下,7天的稳定性 QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
失败 98.0 105 99.8
97.1 106 104 105
99.7 102 99.3 102
101 99.9 109 106
%标称浓度 99.3 101.5 104.3 103.2
不精确[%简历] 2.0 3.4 4 2.8
在-80°C,30天稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 20 40
88.2 85.3 89.6 96.7
96.2 92.6 85.8 94.1
83.9 93.7 91.0 105
95.6 94.0 98.9 102
%标称浓度 91.0 91.4 91.3 99.5
不精确[%简历] 6 4.1 5.5 4.9

Ë
冻融稳定性,-20℃,1个循环
QC水平[毫微克/毫升] </ TD> 2 4 20 40
92.5 86.2 90.2 94.3
89.8 90.5 85.4 104
94.7 88.6 93.4 104
101 89.2 93.7 96.3
%标称浓度 94.5 88.6 90.7 99.7
不精确[%简历] 4.8 1.8 3.9 5.1
冻解冻稳定性,-20℃,2个循环
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
99.1 97.6 失败 85.3
93.1 88.1 93.4 92.0
94.9 91.5 85.8 93.9
失败 90.5 86.8 85.4
%标称浓度 95.7 91.9 88.7 89.2
不精确[%简历] 3.1 4 4.1 4.5
冻融稳定性,-20℃,3个周期
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
95.7 失败 86.0 93.3
95.5 87.4 85.0 91.3
90.5 89.1 86.0 86.0
96.9 85.7 90.2 失败
%标称浓度 94.7 87.4 86.8 90.2
不精确[%简历] 2.8 1.7 2.3 3.8
F
在+ 4℃,24小时提取的样本稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
122 112 91.0 104
93.5 106 91.8 96.1
111 94.8 98.2 93.5
98.4 97.6 91.3 89.8
%标称浓度 106.2 102.6 93.1 95.9
不精确[%简历] 12.8 7.9 3.4 6
在+ 4°C,48小时提取的样本稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
106 108 93.7 110
105 98.1 94.6 98.9
103 98.4 95.0 92.6
108 93.1 89.7 85.5
%标称浓度 105.5 99.4 93.3 96.8
不精确[%简历] 2.1 6.2 2.4 10.4
在+ 4°C,72小时提取的样本稳定性
QC水平[毫微克/毫升] 2 4 20 40
96.5 112 96.4 104
101 95.3 103 95.2
94.2 105 93.5 99.5
100 96.9 92.6 89.3
%标称浓度 97.9 102.3 96.4 97.0
不精确[%简历] 3.1 7.7 4.7 6.3

表5.稳定性测试的结果。答:他克莫司的稳定干血斑在室温超过7天​​,B:他克莫司对干血斑在冰箱(+ 4°C)超过7天 ​​,稳定性C:他克莫司对干血斑稳定在-20℃下在1月,D:他克莫司对干血斑稳定在-80℃下1个月,E:他克莫司对干血斑稳定性在三个冻融(-20℃),F :提取样品/自动进样器的稳定性,在+4℃,72小时。数据表示为%标称浓度的。列为“失败”样本丢失实验室/仪器误差的样本。在大多数情况下没有峰均在所有检测或内标峰失踪。

图1
他克莫司,原子编号。图1.结构如下理论和应用化学(IUPAC)命名的国际联盟。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.连接的开关阀。424fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3。 代表离子色谱图。(A)的斑点在滤纸上的空白血样代表离子色谱(生产厂家的详细信息,请参阅材料清单)和干燥。箭头标志着他克莫司峰,(B)的一个空白血样掺加在定量(1纳克/毫升)的下限代表离子色谱点斑至滤纸上并干燥, (C)代表的离子色谱的保留时间通过在滤纸上移植患者采集的样品。这是一个槽样品和测量的他克莫司的浓度为2.1毫微克/毫升。该样品在家里收集患者和距离,这是一个临床试验经辛辛那提机构审查委员会的大学(辛辛那提)。所有患者均给予其相应的书面同意。离子色谱图是原始打印输出的质谱分析软件生成的(生产厂家的详细信息,请参阅材料清单)。离子色谱蓝色和红色线条描绘的内标D 2,13 C-他克莫司和他克莫司,分别。峰洗脱主他克莫司和内标峰前是旋转异构体。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
一个原装打印出的质谱分析软件产生的如图4。代表性的校正曲线。424 / 52424fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5.代表性的离子色谱测定在他克莫司柱后输液的空白提取血液样本,并注入来评估潜在的基质效应(离子抑制/离子增强)的箭头标记的他克莫司峰的保留时间。基体效应测试是基于在46描述的过程。检测效果没有相关矩阵。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

虽然,如上所述,基于干血斑的治疗药物和他克莫司的粘附监测的概念是有吸引力的,也有超出那些通常与他克莫司的静脉EDTA全血样品中的LC-MS / MS分析相关联的分析挑战。这些包括,但不限于一个事实,即基质是毛细管全血浸透到这里使用的过滤卡材料和低血容量(20微升)的棉短绒材料。尽管如此,在中心实验室高通量分析需要快速和可靠的提取方法,其导致缺乏基质干扰和基质效应结合一个健壮的,特定的和高度敏感的LC-MS / MS的测定样品。该测定的可靠性是至关重要的,因为通常没有足够的材料上的已冲裁过滤卡放置重新分析的情况下的提取/ LC-MS / MS分析失败。

该网络在本研究中使用的过滤卡(生产厂家的详细信息,请参阅材料清单)被选为这是FDA批准的II类设备,皆符合NCCLS指导LA4-A5 44,并带有CE标志在欧洲。如果完全充满,一圈的滤纸903过滤卡上保存≈50微升血液46。然而,通过个别患者采集的血液滴的大小而变化,并训练在适当的采样技术是必不可少的46。

提取冲出干血斑样本的第一个重要步骤就是同质化。根据我们的经验,使用了子弹搅拌器的是更有效的,比用于提高提取效率,如超声处理的其他方法更好再现性。使用子弹搅拌器是必不可少的持续实现90%以上的回收率。用于萃取过程的可靠性,也很重要,以确保所有的离心机被Temperat .. [温度URE控制(4℃),并且所述涡旋步骤是不小于10分钟,这导致更多的变量和下提取回收率。此外,重要的是在甲醇/ 硫酸锌比率不会改变他克莫司是恢复至蛋白沉淀溶液的正确组合物非常敏感。

下一个挑战是获得一种纯提取理想地不含材料可能导致基质干扰和影响。因此,如通常用于他克莫司从EDTA血液样品中提取一个简单的一步蛋白质沉淀步骤不被认为是可行的选择。使用硫酸锌(包括加成同位素标记的内标物)的蛋白质沉淀,涡旋和离心后,将上清液注射到一个2D HPLC系统并到达一个在线提取柱。使用的常规预柱墨盒5毫升/分钟的高流量使用简单的6端口在线柱提取对于他克莫司的分析切换 47之前已被描述。流动相被选择,使得他克莫司及其内部标准集中在萃取塔的前端和列在清除步骤未迁移过来。在本协议中所使用的在线提取有几个优点,包括注射比较大的样本量不会产生负面影响HPLC分析。丰富的分析物的萃取塔的顶部后,反冲洗(“峰值对焦”)造成更尖锐的峰从而更可靠的集成的软件算法,特别是对低他克莫司浓度的样品48网上清理的步骤并不仅能去除潜在的干扰矩阵的化合物,但也脱盐样品。为高容量,高通量的LC-MS / MS的测定法的一个重要但很少讨论的问题是在LC-MS / MS系统的灵敏度由于增加逐渐丧失在污染大批量分析电源。没有显著基体效应(离子抑制/离子增强)进行观察。潜在的基质效应的负面影响分别减少/避免组合如下:16,000 XG,高流量的在线提取,他克莫司的潜在干扰早流出明显的色谱分离,用甲醇/ 硫酸锌,离心沉淀蛋白后,有效的蛋白沉淀来自分析柱和用同位素标记的他克莫司作为内标,而不是结构相关的内部标准,例如子囊。

定量的下限为1毫微克/毫升,并因此比大多数免疫测定法,目前经常使用的他克莫司在EDTA血样治疗药物监测都较低。量化的这个下限是足够甚至对于所谓的低神经钙蛋白抑制剂长期immunosuppres西伯维护协议。

在与前述的LC-MS / MS测定法的比较定量他克莫司在干燥血液掩护29-34,36,39,41,42,本测定法的匹配或超过的下限定量,提取回收率,准确度方面它们的性能和精度,同时避免潜在危险的概念,例如一步法蛋白质沉淀过程和超短色谱倍,是根据来自健康个体的血液样品的验证过程中通常给出可接受的结果。然而,移植患者是一个高度复杂的群体中谁具有影响血液的组成和谁采取多种药物治疗疾病的病人。这使得实际上不可能排除在验证期间可存在于个体患者的唯一可行的战略是设置在测定的方式,它最大限度地减少了这种潜在的干扰的危险的所有潜在的干扰。干血SPOTS具有如血液粘度的血细胞比容的影响,从而涂敷在滤纸49的血液的扩散性质的挑战。这不是这里再次测试作为这样的效果已经描述不影响他克莫司分析在干燥血点在血细胞比容和他克莫司浓度的内临床上合理的限度29,32。在干燥血点在高温下也他克莫司的稳定性已经研究了其他和他克莫司在干燥血点被发现是稳定5天,在37℃,甚至60℃32,这是干血装运重要特别是在夏季不控制温度的条件下的斑点。

基于对子弹搅拌器均化组合该测定中,高流量的在线柱清理和LC-MS / MS分析可以提供一个平台策略生物分析测定法的发展,为的其他IMM量化unosuppressants,单独或同时的,以及其他药物干燥血点样品中。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tacrolimus U.S. Pharmacopeial Convention 1642802
D2,13C-Tacrolimus Toronto Research Chemicals Inc. F370002
Red blood cells University of Colorado Hospital W20091305500 V
Plasma University of Colorado Hospital W2017130556300Q
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥99,9% Sigma-Aldrich 439126-4 L
Acetonitrile Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific A955-4
Isopropanol 99.9%, HPLC Fisher Scientific BP2632-4
Methanol Optima LC/MS Thermo Fisher Scientific A452-4
Water Optima LC/MS, UHPLC-UV Thermo Fisher Scientific W6-4
Formic acid Thermo Fisher Scientific A118P-500
Phosphate-buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich D8537
Zinc sulfate Thermo Fisher Scientific Z68-500
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008649
1.5 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-682-550
10 – 100 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008651
10 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 10XLS3
100 – 1,000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008653
100 μl pipet tips with filter, sterile Neptune BT 100
1,000 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2940
2 – 20 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008650
2 ml Eppendorf tube Thermo Fisher Scientific 02-681-258
20 – 200 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS Mettler Toledo 17008652
20 μl pipet tips with filter, sterile GeneMate P-1237-20
200 μl pipet tips with filter Multimax 2938T
200 μl pipet tips with filter, sterile Multimax 2936J
50 ml Falcon tube BD Falcon 352070
300 μl inserts for HPLC vials Phenomenex ARO-9973-13
Balance PR2002 Mettler Toledo 1117050723
Balances AX205 Delta Range Mettler Toledo 1119343379
Bullet Blender Homogenizer Next Advance BBX24
Centrifuge Biofuge Fresco Heraeus 290395
Disposable Wipes PDI Q55172
Glass v ials, 4 ml Thermo Fisher Scientific 14-955-334
Glass vials, 20 ml Thermo Fisher Scientific B7800-20
Gloves, nitrile Titan Brand Gloves 44-100S
HPLC vials, 9 mm, 2 ml, clear Phenomenex ARO- 9921-13
Lids for HPLC vials Phenomenex ARO- 8952-13-B
Needle, 18 G 1.5 Precision Glide 305196
Rack for Eppendorf tubes Thermo Fisher Scientific 03-448-11
Rack for HPLC Vials Thermo Fisher Scientific 05-541-29
Steel beads 0.9 – 2 mm Next Advance SSB14B
Storage boxes for freezers / refrigerators Thermo Fisher Scientific 03-395-464
Standard multi-tube vortexer VWR Scientific Products 658816-115
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK GE Whatman  2016-05
Autosampler CTC PAL  PAL.HTCABIx1
Binary pump, Agilent 1260 Infinity Agilent Technologies 1260 G1312B
Binary pump, Agilent 1290 Infinity Agilent Technologies 1290 G4220A
Micro vacuum degasser, Agilent 1260 Agilent Technologies 1260 G13798
Column oven,  Agilent 1290 with 2 position  Agilent Technologies 1290 G1216C
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve Agilent Technologies 1290 G1316C
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm Phenomenex 820950-926
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm Phenomenex 993967-906
Tandem Mass Spectrometer
API5000 MS/MS with TurboIonspray source AB Sciex 4364257
Mass spectrometry software AB Sciex Analyst 1.5.1

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References

  1. Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19, (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
  2. Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40, (9), 1249-1255 (1987).
  3. Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2, (8670), 1000-1004 (1989).
  4. Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344, (8920), 423-428 (1994).
  5. A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331, (17), 1110-1115 (1994).
  6. Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64, (3), 436-443 (1997).
  7. Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group. Transplantation. 15, (7), 977-983 (1997).
  8. Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14, ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
  9. Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54, (6), 925-975 (1997).
  10. Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357, (6380), 695-697 (1992).
  11. Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23, (10), 563-585 (2013).
  12. Annual Data Report. Department of Health and Human Services, Health Resources and Services Administration, Healthcare Systems Bureau, Division of Transplantation. Available from: http://optn.transplant.hrsa.gov/data/annualreport.asp (2014).
  13. Draft Guidance on Tacrolimus. Food and Drug Administration, Office of Generic Drugs. Available from: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/UCM181006.pdf (2012).
  14. Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41, (11), 813-851 (2002).
  15. Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. ebb 4th Edition, Lipincott, Wiliams, and Wilkins. =Baltimore. 529-562 (2005).
  16. Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24, (1), 59-67 (2002).
  17. Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18, (4), 362-367 (1996).
  18. Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17, (6), 606-614 (1995).
  19. Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31, (5), 309-316 (1998).
  20. Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313, (1-2), 241-253 (2001).
  21. Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11, (6), 1122-1131 (2000).
  22. Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62, (5), 599-606 (1996).
  23. Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10, (6), 712-720 (2006).
  24. Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28, (1), 96-104 (2014).
  25. Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44, (1), 14-20 (2011).
  26. Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31, (3), 327-336 (2009).
  27. Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5, (17), 2187-2208 (2013).
  28. Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3, (7), 779-786 (2011).
  29. Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115, (Oct 15), 47-54 (2013).
  30. Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51, (Pt 1), 106-109 (2014).
  31. Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926, ((May 1)), 54-61 (2013).
  32. Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421, ((Jun 5)), 152-156 (2013).
  33. Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27, (3), 327-334 (2013).
  34. Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884, ((Feb 1)), 102-107 (2012).
  35. Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9, (6), 729-733 (2005).
  36. Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46, (Pt 2), 144-145 (2009).
  37. Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20, (2), 221-225 (2006).
  38. Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24, (6), 757-767 (2002).
  39. Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83, (2), 237-238 (2007).
  40. Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50, (4), 664-670 (2009).
  41. Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21, (2), 140-145 (2008).
  42. Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44, (3), 658-664 (2007).
  43. Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (14-15), 1595-1598 (2009).
  44. Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
  45. Hannon, H. W., et al. Blood collection on filter paper for neonatal screening programs, approved standard LA4-A5. Clinical Laboratory and Standards Institute. Available from: http://www.clsi.org (2007).
  46. Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773, (1), 47-52 (2002).
  47. Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400, (1-2), 103-106 (2009).
  48. Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748, (1), 41-53 (2000).
  49. Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877, (29), 3506-3514 (2009).
  50. Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131, (5), S1631-S1636 (2001).

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