マウスにおける胆管結紮:閉塞性胆汁うっ滞による炎症性肝障害と線維症の誘発

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Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Weiskirchen, S., Borkham-Kamphorst, E., Tolba, R. H., Tacke, F., Weiskirchen, R. Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis. J. Vis. Exp. (96), e52438, doi:10.3791/52438 (2015).

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Abstract

ほとんどの脊椎動物では、肝臓は吸収された脂肪を乳化し、ビリルビンおよび他の代謝産物を排泄するだけでなく、小腸での脂質の消化を可能にするために必要である胆汁を生成します。肝臓では、肝外胆管系の実験的な障害物が門脈周囲の分野から生じる強い線維化反応で生じた胆汁うっ滞や炎症につながる病理学的事象の複雑なカスケードを開始。そのため、総胆管の外科的結紮はげっ歯類における閉塞性胆汁うっ滞の傷害を誘導すると、不適切な胆汁の流れによって誘発されるこれらの病態生理学的メカニズムの根底にある分子的および細胞事象を研究するために最も一般的に使用されるモデルとなっている。近年では、別の外科技術は、特定の研究課題のための再接続または再吻合、胆管結紮(BDL)の後に、 例えば 、部分BDL、または他の顕微法を可能にするいずれかのことが記載されている。しかし、最も頻繁に使用されるモデルは、21〜28日後に、強力な線維化反応を誘導する総胆管の完全な閉塞である。死亡率が原因の感染性合併症や技術的な誤りに高くなることがあります。ここでは、1959年にラッセルとバーチによって仮定動物福祉のための3Rルールに基づいて再現性の高い線維性応答を誘導するマウスでのBDLモデルの詳細な外科的手技を提供する。

Introduction

肝線維症は、マトリックス産生肝星細胞の相互作用の複雑なネットワークおよび肝臓常駐し、浸潤細胞、血液細胞、1,2-多種多様な由来する過剰な産生と細胞外マトリックス(ECM)の蓄積として定義される。肝線維症は、異なる刺激の多数によって引き起こされる可能性があるが、線維症の根底にある分子メカニズムは、一般的に非常に類似している。肝臓の損傷に続いて、分子·細胞変化の高度に組織化プログラムが開始されます。このプログラムでは、炎症性シグナル、単球/マクロファージおよび肝星細胞の間の密接な相互作用が発生し、その筋線維芽細胞、ECM沈着および肝組織の完全性3の連続した解剖学的および機能的変化の星状細胞活性化および分化における最終結果で。肝星細胞の活性化は、特に肝臓による炎症シグナルとの相互作用によって駆動されるresidentalマクロファージ(クッパー細胞IE)。病原体関連分子パターンは、炎症プロセス3を駆動 、炎症性サイトカインおよびケモカインの多数の発現および分泌を誘発する種々の経路の複雑なネットワークを介して信号を活性化Toll様受容体のような特殊なパターン認識受容体によって認識される。疾患生産要因が除去されると炎症反応と形成された肝臓の侮辱は一時的なものです。怪我が解決しない場合はこれとは対照的に、慢性炎症は、肝臓や瘢痕組織形成することにより、正常肝実質の進行置換をもたらすフォアグラウンドでのECM群衆の発現および蓄積の中に進化。

ヒトにおける肝線維化が世界的に臨床的問題であるため、急性および慢性肝不全のいくつかの実験的なげっ歯類モデルは、最後の数十年の間に確立されている。ムーで例えばRINEシステム、一般的なモデルは、重要な影響を与える遺伝子の過剰発現の異なる肝臓毒の種々の投与、総胆管の結紮、免疫媒介性肝臓傷害の誘導、および標的遺伝子の欠陥の導入、またはその逆である肝線維4の病因に関与するシグナル伝達経路。

げっ歯類における総胆管の結紮は、長年5-8ための研究実験手順として実施されている。げっ歯類における長期の胆管結紮(BDL)のための最初の再現性の高いプロトコルでは、すでに30年以上も前9今発表されました。このプロトコルで挿管/閉塞およびライゲーション、ヒト胆汁性肝硬変9において観察されたものに匹敵した形態学的変化を有するラットにおける肝硬変の高収率を誘導した。それぞれのプロトコルは、外科手術が比較的迅速に適用可能であり、単純である、および動物の生存率は95%以上と高い。古典的なカニューレ挿入ラット/閉塞プロトコルでは、2cmの短い切開だけで剣状突起の下に行われる。その後、カニューレは、胆管の基端部に挿入され、絹縫合糸と、その位置に固定される。次のステップでは、カニューレの遠位部は右下腹部9皮下正中切開の下端部に通し、埋め込 ​​み、3ノットで阻害される。最後に、腹部を閉じ、動物を回復させる。ライゲーションプロトコールでは、ラットを伴うまたは結紮糸9との間の胆管の解剖もしなくても、総胆管を二重結紮に供される。

この実験モデルは、よく受け入れられ、肝胆汁うっ滞及び線維症を誘導するために研究室の何百もの世界中で使用されている。これは、肝内胆管上皮細胞増殖、筋線維芽細胞differentiatioを誘導ポータル線維芽細胞のnは周りのECM 10,11の再現性の高い、大規模な表現と沈着で、その結果、胆管上皮細胞を増殖。したがって、ラットとマウスで、このモデルの適用は、肝臓の炎症や線維症の病因を理解することを目的と科学者の間で人気がある中である。

私たちの研究室では、広範囲に肝線維の特殊な分子や細胞の側面を調査し、新たな抗線維概念や医薬品12-15をテストすることを目的といくつかの実験的研究において、ラットで、過去にこのプロトコルを使用している。

最近、我々は、マウス系にこの方法論を適合さ胆管結紮術はまた、マウス16-18における低い変動率と死亡率の時間依存性線維症を確立するための魅力的な平均であることを見出した。動物の小さなサイズに、しかし、麻酔に関していくつかの重要な変更、外科intervによるention及び治療後の観察は、このモデルでは、信頼性と再現性のある結果を得るために必要である。完全な適合は、以下のプロトコルで、添付のビデオのドキュメントにまとめられている。

Protocol

注:全ての実験は、公式の状態の動物管理使用委員会(LANUV、レックリングハウゼン、ドイツ)によって承認された。マウスは実験動物学協会のための連合(FELASA)のガイドラインに従って特定病原体を含まない条件下で飼育されている。すべての実験は、動物の保護に関するドイツの連邦法に従って実施し、「実験動物の管理と使用に関する指針」(厚生公報の国立研究所 8版、2011)であった。

1.術前の準備

注:クリーンが、非無菌条件下ですべての手続きを行ってください。手術を実行するために使用されているような外科鉗子、はさみ、およびコリブリリトラクターなどのすべての楽器やその他の再利用可能な機器は、動物で手術を実施するための施設のガイドラインに厳密に準拠しているプロトコルに従って、使用前に滅菌されなければならない。、必要な試薬、資機材の詳細なリストについては、特定の材料/機器の一覧を参照してください。

  1. 完全な実験の間に、流体不透過性、自己接着性ドレープで全体的なカバーの操作領域を永久に麻酔システムに接続された37°Cの温度で加温プレート上に動物を維持し、。適切に手術前の実験( 図1)中に使用されているすべての計装ソリューションを手配。
  2. 麻酔の誘導のために4リットル/分の流速で100%酸素中4体積%のイソフルランの吸入で、マウスを麻酔。以下の重要な基準に達したときに麻酔の深さは十分です:定期的な自発呼吸、足の指の間の疼痛刺激の設定後に無反射し、痛みに応答がない。
  3. 電気毛皮のシェーバーでマウスの腹部毛皮を剃ると目とnの使用によって乾燥から目を守る大証軟膏。
  4. 、37℃で加熱したホットプレート上にマウスを置きFluovac麻酔システムのFluovacマスクのマウスの鼻を挿入し、シルクテープのストライプを用いて動物の足を固定します。
  5. 1 L /分の流速で100%酸素で1.5~3体積%のイソフルランの吸入によりマウスを麻酔を維持し、ブプレノルフィン溶液の腹腔内注射(0.9%NaCl溶液中に溶解さは0.1mg / kg体重)を介して、周術期の鎮痛を誘導する。
  6. 皮膚の術前治療のためにアルコール溶液を使用する準備ができて防腐標準、で湿らせたガーゼ綿棒で剃毛腹部の皮膚を滅菌する。注:私たちのプロトコルでは、ポリアルコールスキンantisepticumを使用しています。これは動物や実験動物学協会のための連合会のガイドラインの保護に関するドイツの連邦法に完全に準拠しています。この防腐剤は、70%(v / v)の2-プロパノール、ブタン1,3.diol及びキノリンイエローの痕跡を含み、perfumE。

2.外科的処置

  1. 11.5センチメートル外科はさみで同時に真皮プラス筋膜を切断して約2cmの長さの正中開腹で腹部を開きます。
  2. スプレッダとしてハサミを使用して、腹膜の上結合組織を解剖する。
  3. 腹膜腔を開くために白線に沿って腹膜をカット。
  4. 、胸骨の保持縫合糸を挿入糸のフィラメントを高め、かつFluovacマスクの上に固定することにより、空洞を拡大。
  5. 腹腔( 図2)にコリブリリトラクタを挿入して操作領域を広げる。
  6. それの腹側が振動板に付着し、へそがはっきりと見えるようにしっとり(0.9%NaCl溶液)綿棒で肝臓を持ち上げます。
  7. 腸の尾側の動き( 図3)により胆管を公開します。
  8. から慎重に胆管を分離マイクロセレーション鉗子(図4A)を使用して、門脈と肝動脈に隣接する。
  9. 胆管周囲に5-0縫合糸を置き、2外科ノットで固定します。結び目をすると胆管( 図4B)を切断することなく、効果的な障害物を確実にするために継続的に牽引力を増加させる。
  10. 同様に、第二頭蓋ライゲーションを追加したが( 図4C)の間での胆管を解剖しないでください。それ以外の場合は胆汁が漏れ1結び目が確保されていない場合、および動物がない胆汁うっ滞を経験していないが、深刻な腹膜炎を発症することをかなりのリスクがある。
  11. 縫合糸( 図4D)の端をカットし、胸骨を下げ、リトラクタを削除します。
  12. 0.9%NaCl溶液で腹腔をすすぎ、生理的な位置に腹部臓器を交換してください。
  13. 6-0 Mersilkと独立した実行中の縫合糸で閉じる両方腹部層(腹膜及び真皮プラスフェイシア)。
  14. 電子をカット縫合糸のNDSと消毒液で湿らせたガーゼ綿棒で操作エリアを殺菌すること。
    注:初めての手術を行う場合は、16X-20Xの倍率で手術用顕微鏡の下ですべての手順を実行する。これは、胆管のより良い認識を可能にし、明らかに、門脈及び肝動脈( 図5および6)から区別する。いくつかの研究室は2合字間における胆管の解剖をお勧めします。胆管を解剖されたときに結び目の1の潜在的な漏れが重度の急性腹膜炎、腹水、および全身毒素血症になりますので、そのまま胆管のままにしておきます。

3.術後治療とフォローアップ

  1. マウスが完全に目を覚まし、アクティブになるまで、マウスは赤外線ランプによって暖められケージで回復できるようにします。
  2. その後、通常のケージにマウスを移動し、水や食料への不断のアクセスを提供します。
  3. AFTER手術、一定の間隔で、動物を監視し、内部の動物の管理と使用委員会の現地推薦下記の適切な鎮痛( 例えば 、ブプレノルフィン溶液)とのフォローアップ術後の治療を行っています。
    注:3日間の鎮痛治療を行う。任意の異常行動は、腹膜炎、敗血症や内出血などの珍しい合併症を示すことが、実験を終了するために、人間のエンドポイントとして扱われるべきである。
  4. 動物は、実験終了まで、食物と水を自由に自由にアクセスして保存されます。進行中の線維は、黄疸で示されているので、採血を必要としない。
  5. 動物を屠殺したときに、血液が(ビリルビンなど AST、ALT)臨床化学パラメータの測定のために収集され、肝臓組織化学的および生化学的分析のために取り出される。

Representative Results

典型的な実験ではBDLは約18〜20グラムの重み付け40雄C57BL / 6野生型マウスで行った。この実験は、16開始段階(3および7日)において、進行(10、14、および20日間)、および長期(30日およ ​​び60日)の間、肝臓の線維形成を調査するために行った。永久実験の終了まで増加門脈周囲の線維症が完全に20日後に開発されたが、このモデルでは、persinusoidal線維症は、既に、手術後10日目に開発し​​た。上記の実験では、簡単な偽手術を受けたすべての動物が生き残った、とだけBDLを受けた40匹のマウス(5%)の2が悪い全身状態を開発し、したがって、早期に実験の計画されたエンドポイントの前に犠牲にした。 BDLを受けた動物のほとんどは最初の3日間に減少した活性を示した偽手術動物の活性は、すでに例外なく開腹後に通常の1日でした。 Jaundiced皮膚は1日か2日BDL 16の設定後にすべてのBDL動物ですでに明らかだった。

肝障害の十分に確立された血清マーカーを表し、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)の両方の値が急激に増加し、7日目及びBDL(表1)20日後の間にピークに達した。その後、ALTおよびASTは30日目まで着実に減少し、60日手術後まで安定していた。胆汁うっ滞性傷害に伴い、総ビリルビンの血清濃度は着実に上昇していたと7日16後にプラトーに達した。 ALTおよびAST血清活動の同様の時間のコースも、BDLを受けたラットで報告された。最近の研究では、血清ASTおよびALTレベルがBDL手術後1週間で正常値の5〜10倍まで増加し、二週間後に19低下したことを実証した。

一般的に、偽手術動物の肝臓はまだスムートを見て実験の終了時の時間、BDLを受けた動物の肝臓は、主に肝臓及び大量の充填されている胆嚢水腫の対応する表面に浮腫および線維性小結節の形成を特徴とする建築の変化を示しているが胆汁( 図7)。 BDL手術によって誘導される肝の特徴的な形態学的変化は、標準的な組織学的分析( 図8)においても実証され。

実験の同じセットでは、肝線維症の発症は、半定量的に門脈周囲の線維症が最大を与え、0〜2 0-4及び類洞周囲線維症からステージングされたスコアリングシステムを使用して、盲検病理学者によって評価した肝臓組織学に基づいて評価した。予想されたように6の肝硬変に相当した値は、偽手術動物の群の平均線維化スコアは0.00±0.00であった。トン動物群では対照的に帽子はBDLが、スコアは4.83±0.17の値に60日まで、着実に増加した。門脈周囲線維症のための3の最大値は分析した全ての動物において20日目で到達した、類洞周囲線維症は、実験の最初の10日間、欠席した2週間後に、最初に顕著であった。その後、それは1.8±0.17( 表1)の値と実験終了まで着実に増加した。

また行われたいくつかの他の独立した動物実験では、線維症の形成は、進行中の線維形成の結果として肝臓内のコラーゲンの発現及び堆積の時間依存的増加( 図9)を示す高度に再現可能であることが観察された。同様に、進行中の線維のプロセスは、線維芽細胞のマーカーを表し、α平滑筋アクチン(α-SMA)の発現の上昇が顕著である、 すなわち 、肝星細胞とポータル筋線維芽細胞を活性化し、肝ヒドロキシプロリン、豊富コラーゲンマトリックス18( 図9)に見出されるアミノ酸。さらに、筋線維芽細胞または線維芽細胞の量を増加させる示しビメンチンの発現は、BDL手術20の設定後に増加する。負傷した肝臓における炎症の併存は、さらに強く、急性および慢性肝障害の間に誘導し、急性肝障害21,22の間に肝保護効果を進化さリポカリン2(LCN2)の発現増加によって反映されます。

BDLを受けた動物の肝臓に浸潤する炎症性細胞は、CD45( 図10)に特異的な抗体を用いて特異的染色によって検出することができる。またPTPRC(タンパク質チロシンホスファターゼ、レセプタータイプ)として知られているこの細胞表面マーカーは、特に、赤血球と血漿細胞を除く全ての分化した造血細胞で発現される。

<TD> 14.38±2.14±
胆管結紮後の時間(日) 総ビリルビン AST(U / L) ALT(U / L) ポータル線維症 類洞周囲線維症 総得点
量(mg / dL)で
0(n = 3)の 0.17±0.06 192.67±30.50 50.33±6.03 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
3(n = 5)の 6.85±2.21 1159.25±319.27 566.50±335.25 0.0±0.0 0.0±0.0 0.0±0.0
7(n = 5)の 976.60±477.16 448.20±259.47 0.60±0.25 0.0±0.0 0.60±0.25
10(n = 5)の 15.92±2.60 1916.60±868.25 560.40±80.88 1.40±0.25 0.25±0.25 1.67±0.25
14(n = 5)の 17.90±3.84 1088.60±276.32 505.00±96.15± 2.4±0.25 1.0±0.0 3.40±0.24
20(n = 4)の 18.00±2.12 1072.67±364.27 404.00±195.48 3.0±0.0 1.0±0.0 4.0±0.0
30(n = 5)の 16.04±4.79 446.40±169.75 260.20±126.97 2.8±。 0.2 1.4±0.25 4.20±0.20
60(n = 6)の 16.02±1.19 484.67±117.79 257.17±50.97 3.0±0.0 1.8±0.17 4.83±0.17

使用される略語は以下のとおりです。ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ。 AST、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。

表1:線維症は、代表的な実験で得点この表のデータは、肝線維症は、C57BL / 6マウス16内胆管結紮により誘発された研究から再現された本研究では、BDL手術後の死亡率は5%であった(2 40の動物は、早期に悪い動物条件が開発されているために屠殺した)。

図1
図1:胆汁を行うための実験装置管結紮動物は37°Cの温度で加温プレート上に保持され、操作領域は、流体不透過性、自己接着性ドレープで全体的に覆われている。完全な外科手術の間、動物は、麻酔システムに恒久的に接続されている。すべてのインスツルメンテーションおよび溶液(鎮痛薬、麻酔薬、消毒液、0.9%NaCl)を明らかに配置されている。

図2
図2:手術エリアの調製腹膜腔の前に開口部、腹部の皮膚は、電気毛皮のシェーバーで剃毛し、防腐ガーゼ綿棒で消毒する必要があります。手術領域は、次いで、流体不透過性、自己接着性ドレープで覆われている。腹部を正中開腹(長さ約2センチ)で開かれている。キャビティは、胸骨の保持縫合によって拡散操作領域を挿入することによって拡大される手術中に妨害されていない実験を可能コリブリリトラクターを挿入する。

図3
図3:胆管の露出。それはダイアフラムに固執することができ、肝門部がはっきり見えるように胆管結紮を行ってください(A)は 、肝臓の腹側を持ち上げた。(B)より良い胆管を露出させるために、腸の尾側に移動する加湿綿棒。胆管を矢印でマークされます。

図4
図4:胆管を結紮。 (A)最初のステップでは、胆管に隣接門脈マイクロセレーション鉗子を用いて、肝動脈から慎重に分離されている。(B)続いて、縫合糸の周りに配置されている胆管および外科的結び目で固定。(C)その後、第2の縫合糸は、第1の縫合糸に近接して配置され、胆管の周りに結ばれる。(D)縫合糸が短くなり、キャビティが0.9%NaCl溶液で濯ぎ、およびすべての器官は、それらの生理学的位置に置き換える。

図5
図5:。。と胆管の結びの正確な表現縫合糸の配置や胆汁の流れを妨げる2ノットの設定を文書化するためには、図4に概説したものと同じ手順が両眼の下に記載されていました(A)閉じ込め第1の縫合糸の第1の縫合糸。(B)結び、(C)第2の縫合糸と胆管の閉じ込め。(D)第2の縫合糸の結び。(E)二重ライゲーション胆汁dはUCT過剰縫合糸の短縮後に。(E ')このパネルは、(E)のスケッチを描く。肝臓の左から右(RL)、(llの)の位置と中央値(ml)のローブならびに胆管、胃、十二指腸の文字を付している。スケッチで胆管を二重2本の縫合糸により結紮する。

図6
図6:。胆管、門脈とマウスでは肝動脈の解剖学 、総胆管のより良い解剖学的位置については、門脈と肝動脈は、スキームとして示されている。マークも右(RL)の位置で、左(LL)中央値(ml)及び肝臓の尾状核(CL)のローブ。

図7
図7:代表appeara2週間偽手術とBDL後の肝臓のNCE。 C57BL / 6マウスを操作またはBDL手術を偽に供した。 2週間後、内臓キャビティが開かれた。偽手術動物の肝臓は、線維症の兆候を示さなかったが、胆管の結紮を受けた動物の肝臓は、対応する肝臓の表面上の浮腫と線維性結節の形成を伴う不規則な表面構造を持っていた。

図8
図8:ヘマトキシリンおよびエオシン染色肝臓切片(A)偽手術た3週間(B)が BDLを受信C57BL / 6野生型マウスから調製した。切片は、標準的な手順に従ってヘマトキシリン​​およびエオシンで染色した。炎症の徴候(浸潤細胞)、実質(肝を含むBDL肝臓内の典型的な変化に注意してくださいcyte)壊死、及び胆管の増殖。各図のパネル中のスケールバーは、50μmを表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9
図9:肝線維化のための組織学的および生化学的な読み出し。 (A)肝臓切片を2週間偽手術またはBDLを受けた動物から調製し、( 上のパネル、赤のコラーゲン繊維 )シリウスレッドで染色し、またはα平滑筋アクチン(α-SMA)の発現について分析した( 下のパネル免疫組織化学による茶色で、α-SMA陽性細胞 )。各図のパネル中のスケールバーは、100μmを表す。(B)は肝臓からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットにかけ、expreについて分析したよく肝線維のマーカーを確立しているコラーゲンI型、α-SMA、およびビメンチンのssion。リポカリン-2(LCN2)の発現は、進行中の線維に関連付けられている炎症反応を示している。この分析では、等しいタンパク質負荷は、βアクチンに特異的な抗体とブロットをプローブすることによって実証された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10
図10:炎症細胞浸潤の免疫学的染色シリアル肝臓切片は、3週間の胆管結紮を受けた動物の肝臓から調製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン(A)またはCD45(B)に特異的な抗体で染色した。ご注意ください、胆管周囲のCD45陽性細胞の数が多い。炎症を示すこれらの大規模な浸潤が、偽手術動物由来の肝臓切片には表示されません(図示せず)。各図のパネル内のスケールバーは500μmで表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

胆汁うっ滞性肝傷害、慢性肝疾患患者における肝線維症及び肝硬変の発症の主要な原因因子の一つである。これらの疾患はimponderable医療費を生成するという事実に基づいて、多くの研究が進行中の肝線維症の発症機序を理解しようとしていることを理解できるである。したがって、実験的なモデルは、肝臓の炎症、線維症および肝硬変1につながる複雑な機構の様々な局面を模倣するように生成されている。

外科BDLは、マウスおよびラット4,23,24における閉塞性胆汁うっ滞性傷害を誘導するために使用される最も普及している実験的なモデルの1つである。プロトコルのほとんどでは、動物を麻酔し、中央部の開腹が行われる。続いて、胆管、腹腔から露出すると、外科用ひもを使用して二回連結した。結果として、マウス、ラット、この手術dを受信したevelop最初は門脈周囲のフィールド25から発信強い線維性反応。年の間に、複数の異なる外科技術および修正が記載されている。特別手順さえBDL 23の後に再接続または再吻合を可能にします。他の技術は、部分著しく少ない壊死の形成をもたらすBDL、その結果、肝細胞増殖24に基づいている。胆嚢炎の形成を防止胆嚢(胆嚢摘出術)のその後の除去と組み合わせた部分BDLはまた、急性胆汁うっ滞のための優れた実験モデルを表す。これは、ヒトの状況24に近いモデルであることが提案された。実際、このモデルの確立中に、それがすでにそれは再現性、最小限の組織学的組織損傷にうっ滞を引き起こし、慢性胆汁うっ滞25に進行しないことが実証された。したがって、このモデルは、緯度研究するために理想的であることが示唆された逆に胆汁うっ滞24のEの影響。でも、より洗練された方法には、マイクロサージェリーに基づいており、唯一の肝臓26の選択された部分に胆汁うっ滞性肝傷害を負わせるための迅速かつ再現性のある方法を許可している。

オリジナルBDLプロトコルからのこれらの洗練された修正は、特定の研究課題を調査中で非常に有用証明されてきたが、多くの研究室は、世界中基本的に胆汁うっ滞性肝線維症のための再現性の高い、信頼性の高いモデルとしてBDLモデルを採用することを目指しています。しかし、多くの合併症には、技術的に不適切な回避されていない場合には、実質的に、このモデルによって得られた結果の再現性と信頼性を変える可能性が発生する可能性があります。中または急速に手術後に発生する可能性があります-例えば、胆管に伴う血管の損傷に関連する出血性合併症(4図3参照)。その後のcardiodepressionまたはrの麻酔の過剰投与espiratory失敗も手続きの回避合併症である。縫合糸を正確に腹腔内に行われ、胆汁が漏れていない場合、腹膜炎から敗血症に至るまで重度の感染症は、、、実験の全期間中に発生する可能性があります。手術中の腸への偶発的な損傷はまた腹膜炎につながる可能性があります。したがって、厳密な取り扱いのガイドラインに準拠している標準化されたプロトコルが強く要求されていることは明らかである。この規定は、最近2013年1において新たな動物福祉の規則を実施し、欧州連合(EU)、の国の中に要求した。この規則に関連付けられているそれぞれの要件は新しいものではないし、すでに1959年に提案され、ラッセルとバーチが倫理を提案したとき主に交換、洗練と削減(3R)原則27に基づいている動物と科学実験を行うためのフレームワーク。

outlinに従う場合EDプロトコル、技術的に不適切な記述から生じる可能性がある唯一の少数の合併症があります。 3つの特定の問題がなく、低頻度で発生する可能性があります。

すべての外科的処置と同様に、麻酔薬の過剰摂取は、特に低体温との組み合わせで、動物への危険の潜在的な供給源である。手術中に心血管合併症が発生した場合は、麻酔薬の供給が直ちに停止されるべきであり、オペレータがマウスに可能な酸素などの多くを提供するようにしてください。これは、空気で満たされ、損なわれた動物の口に圧送される小さなプラスチック製シリンジを用いて行うことができる。代わりに、影響を受けた動物の換気用の小Peleusballの使用は、多くの場合、活性化プロセスのために有用です。

創傷治癒の問題点

BDL手術後、マウスは、自分の痛みの継ぎ目または他の動物のものを噛むことができる。この問題が発生した場合、それぞれのマウスは、別途でなければなりませんケージ。開放創との動物は、傷の周囲の領域を静かに、標準的な防腐剤で殺菌し、傷が再び縫い付けする必要があり、麻酔をする必要があります。次の3日間、これらの動物の傷は、定期的に(2〜3回日)を点検してください。

腹部や腹水の形成の膨満は、細菌感染症の指標となる。これらは、手術中に起因する非滅菌作業に発生する可能性があります。感染症のすべての種類は、人道的なエンドポイントとして例外なく処理する必要があり、影響を受けた動物を犠牲にする必要があります。

私たちは簡単には実装が簡単で、高い再現性と組み合わせるだけ低い動物の死亡率を連想させる、マウスにおけるBDLのパフォーマンスを可能にするプロトコルに従うことを提供した。外科のプロトコルのすべてがすぐに熟練した科学者によって逮捕することができます。完全な実験の間、動物を37℃で加温プレート上に保持され、恒久的に接続されている麻酔システムに痛みや苦痛を最小限に抑える。手術のために、腹部を正中開腹し、それを解剖せずにダブルライゲート胆管で開かれている。ここで議論された代表的な結果は、肝臓の形態(炎症、線維症、肝硬変)に関しては表現型の変化が非常に再現性があり、線維のさまざまな側面を研究するために許可されていることを実証する( 例えば 、開始、炎症、進行、末期疾患)定義された時点での。

私たちは、プロトコルの概要が正常に他の研究室ではこの線維症モデルを確立し、異なる場所で信頼性と再現性のある結果を保証する必要がある学習曲線を短縮するために役立つことを願っています。これにより我々は、提示プロトコルは1959年にラッセルとバーチによって仮定された3Rの原則をサポートしており、現在多くの国ののWiに実装されている新たな動物福祉規則の基礎を表していると思う薄いヨーロッパのフレームワーク。

Acknowledgments

著者は、ドイツの研究財団(SFB / TRR57、Q3とQ2)の金融支援を承認したいと思います。著者は、写真を準備中で彼らの助けをMareikeシュルツ、パスカルPaschenda、とクローディアWarzechaに感謝。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane Forene Abbott B 506
Shaver Favorita II Aeskulap GT104
Cutter head Aeskulap GT730
Bepanthen eye and nose ointment Bayer Vital GmbH 6029009.00.00
Warming plate and controller Labotect HP 062
Fluovac anesthesia system Harvard Apparatus 34-1030
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser Eickemeyer 4802885
Scotch Tape commercially available
Tissue paper commercially available
Durapore silk tape 3M 1538-1
Cotton Gauze swabs Fuhrmann GmbH 32014
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum Antiseptica GmbH 72PAH200
Raucodrape OR adhesive drapes Lohmann & Rauscher GmbH 33013
Scissor Fine Science Tools Inc. 14074-11
Graefe forceps straight Fine Science Tools Inc. 11050-10
6-0 Mersilk suture Ethicon K889H Silk, non-absorbable/Abdominal closure
Needle holder Mathieu Fine Science Tools Inc. 12010-14
Colibri retractor Fine Science Tools Inc. 17000-03
Cotton swabs Noba Verbandmittel 974202
Cotton swabs Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH 1032238
25mL beaker Schott Duran 50-1150
Isotonic (0.9%) NaCl solution DeltaSelect GmbH PZN 00765145
Micro-serrations forceps Moria MC31 Fine Science Tools Inc. 11370-31 Bile duct separation
5-0 Mersilene suture Ethicon EH6731H Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation
5mL syringe BD Discardit II 300296
1mL syringe BD Plastipak 300013
Sterican needle 26 G x 1 B. Braun 4657683
Buprenorphine Essex Pharma 997.00.00 Analgeticum, 0.1 mg/kg
Infrared lamp Petra Electric IR 11

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References

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