Détection de biomarqueurs exosomales par déclenchement électrique induite par champ et évaluation (EFIRM)

JoVE Journal
Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tu, M., Wei, F., Yang, J., Wong, D. Detection of Exosomal Biomarker by Electric Field-induced Release and Measurement (EFIRM). J. Vis. Exp. (95), e52439, doi:10.3791/52439 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Les exosomes sont des structures microvésiculaire qui jouent un rôle de médiateur dans la communication intercellulaire. Il est intéressant d'étudier la cargaison interne des exosomes pour déterminer si elles sont porteuses de maladies biomarqueurs discriminatoires. Pour effectuer une analyse de exosomal, il est nécessaire de mettre au point un procédé d'extraction et d'analyse des exosomes à partir de fluides biologiques cibles sans endommager le contenu interne.

Libération induite de champ électrique et de mesure (EFIRM) est une méthode pour extraire spécifiquement exosomes de biofluides, le déchargement de leur cargaison, et de tester leur contenu ARN / protéines interne. Utilisation d'un anticorps CD63 spécifique microparticule magnétique anti-humain, les exosomes sont tout d'abord précipités à partir de fluides biologiques. Après extraction, basse tension électriques des ondes carrées cycliques (CCF) sont appliqués à rompre la membrane vésiculaire et provoquer déchargement de marchandises. Le contenu de la exosomes est hybridée à des amorces d'ADN ou des anticorps immobilisés sur une surface d'électrode pour quantification du contenu moléculaire.

Procédé de EFIRM est avantageux pour l'extraction des exosomes et déchargement des marchandises pour l'analyse sans tampon de lyse. Ce procédé est capable de réaliser une détection spécifique de deux cibles d'ARN et de protéines biomarqueurs dans le exosomes. EFIRM extrait exosomes spécifiquement en fonction de leurs marqueurs de surface par opposition à des techniques basées sur la taille.

Microscopie électronique en transmission (TEM) et le dosage montrent la fonctionnalité du procédé de capture et d'analyse des exosomes. Procédé de EFIRM a été appliqué à exosomales analyse de 9 souris injectées avec des cellules H640 de cancer du poumon humain (une lignée cellulaire transfectée pour exprimer le marqueur d'exosomes CD63-GFP humain) afin de tester leur profil d'exosomes contre 11 souris recevant témoins de sérum physiologique. Des niveaux élevés de biomarqueurs exosomales (GAPDH du gène de référence et de la protéine de surface marqueurs humaine CD63-GFP) ont été trouvé pour le H640 souris injectées dans les deux échantillons de sérum et de salive. En outre, saliVA et des échantillons de sérum ont été démontré que la linéarité (R = 0,79). Ces résultats suggèrent pour la viabilité des biomarqueurs salivaires exosomes pour la détection de maladies distales.

Introduction

recherche Exosome est un domaine émergent de l'enquête qui examine microvésicules lipidiques qui portent une ARN, l'ADN 2, 3 et en protéines cargaison. Enquêtes précédentes de la biologie exosomes ont conduit à l'identification des exosomes dans biofluides tels que le sang 4, 5 urine, le lait maternel 6, 7 et la salive. Des études ont démontré que les exosomes jouent un rôle dans différentes voies cellulaires, méditant à distance communication entre les différents systèmes du corps 8. En raison du rôle exosomes jouent dans la communication intercellulaire, on suppose qu'elles peuvent conditionner biomolécules cibles (protéines, ARN et ADN) corrélés à des états pathologiques. 3 in vitro et de l'animal modèle 9 études semblent confirmer cette hypothèse. En recherchant la teneur exosomal pour la découverte de biomarqueurs, il est nécessaire de développer une méthodologie pour l'isolement de exosome sélective de fluides biologiques, expulsi induiteen charge des cargaisons d'exosomes, et la quantification de biomolécules d'exosomes. Dans la mesure de ce travail, les exosomes seront définis comme une structure ayant un diamètre d'environ 70 à 100 nm et possédant surface marqueur CD63.

Les chercheurs généralement abord purifier exosomes par ultracentrifugation 10 puis traiter le contenu exosomal grâce à l'utilisation de kits de tampon de lyse. Utilisation de méthodes de tampon de lyse nécessite des temps d'incubation allant de quelques minutes à quelques heures. Ce processus peut potentiellement nuire fret exosomes et conduire à la dégradation de l'échantillon. Par exemple, un ARN exosomes salivaire libéré par le tampon de lyse dans le milieu extracellulaire entourant possède une demi-vie de moins de 1 min, ce qui rend la mesure de l'ARN exosomal post-Lysis Buffer une tâche particulièrement difficile sans l'addition de réactifs de stabilisation 11. L'effet composé de l'ajout de divers réactifs pour la lyse et la stabilisation peut introduire des agents qui compliquent et interférer avec l'analysis du contenu de exosomal. Une autre approche peut être utile pour décharger rapidement le contenu de exosomal et la préservation de la cargaison en toute sécurité pour la caractérisation.

Dans ce travail, nous proposons l'utilisation d'un champ électrique non-uniforme pour la libération de contenu exosomal. Champs électriques ont été connus pour porter la capacité à polariser et perturber la bicouche lipidique qui forme les membranes cellulaires. Notre travail expérimental explore l'utilisation de non-uniformes ondes carrées cycliques (CSW) pour perturber la structure de microvésicule des exosomes et de libérer la cargaison transportée. Cette méthode utilise des tensions dans la gamme de plusieurs centaines de millivolts, ce qui signifie que la plupart des biomolécules ne seront pas perturbés. Nous démontrons que l'utilisation d'une onde cyclique carré est apte à actionner libération des exosomes salivaires contenu de l'ARNm dans l'environnement fluide environnant. Cette version de la teneur en exosomal est parfaitement intégré avec un système d'électrodes qui peut être utilisé pour quantifier les niveaux d'expression de biomarqueur 12,13. Cette méthode proposée permet sensibles, et le tampon de lyse analyse rapide, sans contenu de exosomes.

Figure 1
Figure 1. Vue d'ensemble de EFIRM Workflow.. La méthode de EFIRM est globalement divisé en trois grandes phases qui sont nécessaires pour la purification et l'analyse des exosomes.

Cette teneur en exosomal libération et l'analyse sur la base de la méthode CSW est utilisé en conjonction avec des microbilles magnétiques spécifiques à CD63 pour l'isolement d'exosomes. Ces billes permettent CD63 affinité pour l'isolement sélectif des exosomes à partir d'échantillons salivaires (et d'autres fluides biologiques). Après incubation et d'extraction des exosomes en utilisant les perles magnétisées, les perles sont migrés vers le système de capteur électrochimique pour la CSW de presse basée contenu et la partie de l'analyse de l'expérience. La figure 1 donne un aperçu du travailse écouler de la méthode de EFIRM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Extraction Exosome magnétique à base de perle

  1. Pipeter une solution bien mélangée de 5 ul de microparticules magnétiques revêtues de streptavidine dans 495 pl de tampon phosphate salin (PBS) tampon dans un tube de microcentrifugeuse pour remettre en suspension les billes. Lavez et remettre en suspension les perles avec 500 pi de PBS trois fois en utilisant une grille magnétique. Le rack est un ensemble d'aimants sur le côté d'une unité d'habitation qui peuvent maintenir les tubes échantillons à centrifuger.
    1. Pour chaque lavage, d'abord laisser les tubes se asseoir sur la grille pendant 1 min, puis utilisez une pointe de pipette pour enlever soigneusement le tampon de surnageant sans déranger les perles.
    2. Placer les tubes sur une grille régulière sans aimants sur le côté. Ajouter 500 pi de PBS dans les tubes, et utiliser la pipette pour mélanger la solution et de perles ensemble. Ensuite, mettre les tubes de retour sur la grille magnétique pour séparer à nouveau les perles de la solution.
    3. Effectuez cette élimination de tampon par aimantation et remise en suspension dans un PBStrois fois au total. Ceci effectue un lavage initiale des particules magnétiques.
  2. Remettre en suspension les billes dans 490 pl de tampon PBS, avec le tube placé sur la partie non magnétisée de la crémaillère magnétique. Pipeter 5 ul de l'anticorps CD63 anti-humain de souris biotinylé à 1,0 mg / ml concentration de matière dans le mélange de billes. Utilisez la pipette pour mélanger les perles et l'anticorps en solution.
  3. Placer les microtubes avec perles et mélange d'anticorps biotinylé sur un échantillon rotateurs. Régler les paramètres des rotateurs pour le dispositif de rotation de l'échantillon pour la rotation réciproque de basculement à 90 ° pendant 5 s et vibrant à 5 ° C pendant 1 sec. Faire tourner les tubes de mélange échantillon-bille à ces paramètres pendant 30 min à température ambiante.
  4. Retirer anticorps non lié après conjugaison.
    1. Après 30 min de rotation à la température ambiante, placer les tubes de retour dans le rack magnétique pendant 5 min.
    2. Effectuer trois lavages de perles en supprimant la phase liquide à l'aide d'une micropipette et laver avec 500 μ; L de PBS. Après la triple lavage, remettre en suspension les perles dans 490 ul de caséine-PBS et le lieu sur la partie non magnétisé de la crémaillère.
  5. extraction de Exosome en utilisant des billes revêtues d'anticorps.
    1. Étiqueter chaque tube avec ciblée ID de l'échantillon. Pipeter un échantillon de 10 ul de sérum ou de salive dans le tube de microcentrifugeuse. Utilisez la pipette pour mélanger l'échantillon et des billes magnétiques par pipetage à plusieurs reprises.
    2. Placer les tubes à échantillon et des billes anti-humains d'anticorps anti-CD63 sur la coiffe et faire tourner pendant 2 heures à température ambiante. Utiliser les mêmes paramètres des rotateurs comme décrit à l'étape 1.2.
    3. Suite à 2 h de l'échantillon tournant, effectuer un lavage triple en magnétisant à billes séparées de la solution, en éliminant la phase liquide avec la micropipette, et la remise en suspension des billes dans 500 pl de tampon Tris-HCl. Les perles résultantes sont désormais liés aux exosomes et sont prêts pour la libération du champ électrique et de mesure.

2. Champ électrique induite publié une Mesure de la teneur exosomales

  1. Revêtement préalable initiale de l'électrode avec Primer GADPH
    1. Appliquer une matière plastique et à un réseau d'électrodes afin d'éviter la contamination croisée des électrodes individuelles. Pour cette expérience, en utilisant un réseau d'électrodes 16 du capteur à chaque électrode de l'unité dans la matrice constituée d'un travail, le compteur, et l'électrode de référence en or nu.
    2. Préparer un mélange d'actions de 100 nM sonde d'ADN, 0,3 M de KCl, et 10 mM pyrrole par pipetage des réactifs d'achat d'actions dans un tube avec de l'eau distillée ultra pure. Bien mélanger au vortex.
      NOTE: Pour cette étude, la sonde d'ADN choisie correspond au gène de référence de GAPDH, qui est connu pour exister dans exosomes. La séquence de la sonde utilisée est: 5'-biotine-AGGTCCACCACTGACACGTTG-3 '. Utilisez ce mélange sur toutes les électrodes.
    3. Pipeter 60 ul du mélange de monomère d'ADN-sonde sur la surface de chaque électrode en or. Examinez les électrodes pour se assurer qu'il ya une couverture adéquate du travail, contre, et des électrodes de référence par le mélange liquide.
    4. Electropolymerize mélange monomère-sonde pour créer une couche de polymère conducteur sur la surface de l'électrode par application d'une onde carrée (CSW) le profil cyclique de champ électrique à la surface de l'électrode. Ce champ électrique consiste à appliquer 350 mV pour 9 sec et de commutation immédiatement 950 mV pour 1 sec. Appliquer ce profil cyclique onde carrée à l'électrode pendant 10 cycles, pour un total de 100 secondes de champ électrique appliqué.
    5. Rincer la surface du capteur 3 fois à l'eau distillée et on sèche avec de l'azote gazeux pour éliminer le liquide de la surface de l'électrode. Se assurer que le liquide est correctement supprimé de l'électrode.
  2. Exosome déchargement de la cargaison
    1. Charge 5 ul de 1 uM d'une sonde de détection dans 495 ul du mélange complexe de bourrelet exosomes et en utilisant une pipette pour mélanger.
      REMARQUE: La sonde de détection est une séquence d'amorce d'ADN conjugué à une molécule de fluorescéine à l'extrémité 3 '. Le détecteur de probe séquence utilisée pour cette étude correspond à l'ARNm GAPDH trouvés dans exosomes. La séquence de la sonde de détection conjugué à la fluorescéine est la suivante: 5'-GCAGTGGGGACACGGAAGGCC-fluorescéine-3 '.
    2. Introduire à la pipette 60 ul de la sonde et de perles exosomes mélange complexe sur la surface d'électrode en or avec un réseau d'aimants dessous. Ce réseau d'aimants est constitué de seize 2,54 mm diamètre des aimants en néodyme alignés pour correspondre aux électrodes de travail du capteur. La figure 2A illustre le placement des aimants et solution de bourrelet exosomes.
    3. Une fois que l'échantillon est chargé sur la surface de l'électrode, appliquer 20 cycles du champ électrique CSW avec neuf secondes à -300 mV et 1 s à 200 mV (200 du total sec). La cargaison de exosomal qui est libérée va se hybrider aux amorces sur la surface de l'électrode. Si des marqueurs de surface de la exosomes sont l'objet d'enquête, sauter cette partie de l'expérience. Figure 2B illustre ce processus.
    4. <li> Lavez-off les analytes non liés à la surface de l'électrode par triple rinçage de la surface de l'électrode avec de l'eau distillée. Sécher l'électrode avec de l'azote gazeux.
  3. Reporter anticorps et Lecture
    1. Ajouter 60 ul de 150 unité / anticorps anti-fluorescéine ml conjugué à la peroxydase de raifort (HRP en 1: 1000 dilution) dilués dans caséine / PBS.
    2. Utilisez un champ électrique conjugaison conduit à HRP anti-fluorescéine complexe pour le sandwich de la sonde. Appliquer -200 mV pendant 1 s et 500 mV pendant 1 s à 5 cycles à la surface de l'électrode. La figure 2A montre les complexes de sonde de capture et de détection à la fois une protéine et d'acide nucléique système.
    3. Surface du capteur de lavage Triple utilisant de l'eau distillée et sécher avec de l'azote gazeux.
    4. Après le lavage-off de l'excès de l'anticorps anti-fluorescéine non lié, ajouter 60 ul de 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB). Chargez ce substrat sur chaque surface de capteur à l'aide d'une pipette multicanaux.
    5. Effectuer une lecture ampérométrique du courant par mesure du courant d'électrode à -200 mV pendant 60 secondes en utilisant un potentiostat capable électrochimique de mesure simultanée de 16 canaux. La figure 2C est un exemple de profil de courant lors de la lecture.

Figure 2

Figure 2. Composants de EFIRM méthode. (A) la méthode d'extraction exosomes de biofluide utilisant CD63 anti-humain revêtu microparticules magnétiques et déchargement de la cargaison de exosomes par ondes carrés cycliques appliquées au complexe de particules exosomes. (B) Schéma de l'électrode biocapteur utilisé pour détecter des cibles ARN / ADN / protéine de la exosomes libérés. (C) un exemple représentatif de lecture ampérométrique de la méthodologie de EFIRM, où plus grande ampleur actuelle correspond to niveaux plus élevés d'une biomolécule. Ce chiffre est de Wei et al. 14 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Validation de la capture des exosomes des Perles Utilisation TEM

L'isolement d'exosomes à partir de la salive à l'aide de billes magnétiques anti-CD63 humains a été validée en suivant le protocole d'extraction à l'aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) d'images. TEM montre billes magnétiques avec 70 à 100 nm granules immédiatement adjacentes (voir la figure 3A, et 3B), compatibles avec le profil connu des exosomes. Pas 70-100 granulés nm ont été observés pour les billes magnétiques dans la salive qui ne ont pas d'anticorps CD63 anti-humains conjugués à leur précédemment (voir Figure 3C et 3D).

Figure 3
Figure 3. images TEM de microparticules magnétiques. (A) Image de nanoparticules magnétiques CD63 anti-humains avec de petits granules de 70 à 100 nm adjacente. (B) enlarged vue de nanoparticules magnétiques et granulés observés. (C) Image de billes magnétiques sans anticorps conjugué. (D) de la vue agrandie de billes magnétiques sans anticorps conjugué. Ce chiffre est de Wei et al. 14 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Étude de publication de contenu exosomales Utilisation CSW champ électrique

images TEM de perles de CD63 anti-humains montrent 70-100 nm granulés adjacents à des billes magnétiques (voir la figure 3A). Suite à la capture des exosomes en utilisant les billes magnétiques, les échantillons sont traités avec deux procédés différents en parallèle. La première méthode utilisée était Triton-X 100 détergent pour lyser exosomes et la deuxième méthode était l'onde carrée cyclique (CSW) de champ électrique tampon de lyse méthode libre discuté dans ce travail (détails de Triton-X 100 méthode are décrit par Wei e t al. 14). Ces complexes exosomes perles transformés ont été analysés par TEM et un gène de référence de l'ARNm a été quantifiée en utilisant la méthode électrochimique décrit dans ce travail. Le gène de référence utilisée dans cette étude était de GAPDH, qui est présent dans la plupart des exosomes.

images TEM montrent que dans les deux échantillons Triton-X 100 et le champ électrique CSW traités, il y avait une absence remarquée des structures d'exosomes adhéré aux billes magnétiques après la fois la CSW et Triton-X 100 méthodes de traitement (voir la figure 4B-II et La figure 4B-iv). La mesure des niveaux d'expression de GAPDH dans les deux échantillons Triton-X 100 et le champ électrique CSW traités possédait un profil similaire: à savoir que suivant les différents protocoles de lyse, il y avait une diminution des niveaux de GAPDH mesurées que le temps avançait, indiquant une exposition de exosomal l'ARNm de l'environnement extravésiculaire de la salive (voir la figure 4C).

<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figure 4
Figure 4. Les résultats relatifs aux cyclique onde carrée Exosome Cargo sortie. (A) Schéma de la méthode de libération CSW électrique. (B) des images de TEM exosomes: (i) avant CSW libération, (ii) Après avoir procédé CCF, (iii) Avant Procédé de tampon de lyse, (iv) Après Procédé de tampon de lyse. Fond d'images TEM est un soutien de dentelle. (C) Quantification des exosomes niveaux d'ARNm GAPDH lorsque le tampon de lyse et électrique CSW de champ est appliqué. Ce chiffre est de Wei et al. 14 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Performance de EFIRM d'examen pour la détection des protéines de surface et l'ARNm hébergé

Evaluation de EFIRM et compaRison aux méthodes traditionnelles a été menée. EFIRM a été comparée à la quantification des protéines en utilisant western blot (pour CD63 humain-GFP, un marqueur de surface pour les exosomes) et qPCR pour la quantification de l'ARN (en utilisant la GAPDH comme cible d'ARNm). Parce que la CDP63-GFP était humain sur la surface de la exosomes, CSW n'a pas été appliquée pour décharger la cargaison de exosomes. Les résultats des essais de protéine et d'ARN sont respectivement indiqués à la figure 5A et 5B.

Tests de spécificité ont également été menées pour EFIRM en mélangeant les exosomes humaines exosomes à partir d'échantillons de souris. Ces tests de spécificité impliqués mélanges à différents rapports de la souris pour les échantillons humains. Les résultats de l'expérimentation montrent que lorsque la teneur en exosomal de la souris était cinq fois plus grande que le contenu humain, les protéines humaines et exosomales ARNm peut encore être identifiés et quantifiés (voir la figure 5C et 5D pour les protéines et l'ARN, respectivement).


Figure 5. EFIRM évaluation du rendement pour les niveaux d'ARNm et de protéines en utilisant des échantillons diluées d'exosomes. (A) Comparaison des EFIRM et western blot sur ​​fragment de GFP. (B) Comparaison des EFIRM et qPCR pour GAPDH ARNm. (C) détectées des niveaux de signal relatifs de GFP exosomes humains dilués dans des quantités différentes d'exosomes de la souris. (D) de signal détecté relative pour GAPDH ARNm pour exosomes humains dilués dans des quantités différentes de exosomes de la souris. Ce chiffre est de Wei et al. 14 Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Contenu exosomal quantifié à partir de souris salive

Afin de déterminer la viabilité de détection exoautosomique contenu dans les échantillons salivaires, un modèle de souris nude a été utilisé. Ce modèle de souris nude ont reçu une injection interpleurale de 1 x 10 6 cellules de cancer du poumon humain H460 (une lignée cellulaire qui a été transfectée pour exprimer également le marqueur de exosomes CD63 humain-GFP) ou une solution saline. Il y avait 11 souris qui ont reçu un contrôle négatif de 100 pi de solution saline, et 9 souris ont reçu l'injection de cellules. À la suite de 20 jours, des échantillons de sérum et de salive ont été prélevés dans les deux groupes de souris.

Utilisation de la méthode de EFIRM permis la quantification des niveaux relatifs de la protéine CD63 humaine-GFP dans le sérum de souris et de la salive. Une comparaison des niveaux relatifs entre les deux sérum et la salive des souris a montré une corrélation linéaire entre les deux fluides biologiques (r = 0,79). En outre, la différence significative a été observée dans les niveaux CD63-GFP humains aux H460 injecté les souris contre les souris une solution saline injectée. Ceci suggère que les exosomes de cellules tumorales distales sont victimes into le système vasculaire et la salive. Les résultats comparant le sérum et la salive sont présentés sur la figure 6.

Figure 6
Figure 6. EFIRM évaluation des niveaux relatifs de CD63-GFP dans le sérum humain et la salive. Des études comparatives entre les niveaux relatifs de l'homme CDP63-GFP à partir de souris injectées avec des cellules de cancer du poumon humaines. La linéarité existe entre les échantillons de sérum et de salive pour le CD63 humain-GFP. Les niveaux de CD63 humain-GFP sont élevées chez les souris injectées avec des cellules (par rapport aux souris injectées saline). Ce chiffre est de Wei et al. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Comme les résultats l'indiquent, CD63 anti-humain revêtu nanoparticules magnétiques sont capables de capturer spécifiquement les petites particules qui ont une taille allant de 70 à 100 nm. Cette particule capturée est cohérent avec le profil déjà observé des exosomes. En outre, l'utilisation de la CCF basse tension suivant la capture des particules est indiquée pour les retirer de la surface des billes et causer des profils de dégradation d'ADN similaires à celle d'une méthode traditionnelle de tampon de lyse à base de chargement de presse. Ces données indiquent que le flux de travail de la libération de la cargaison exosomal peut être simplifié grâce à l'application d'une onde carrée cyclique pour la rupture de la membrane lipidique exosomes. Cette méthode simplifiée permet une libération de chargement rapide sans avoir besoin de lyser les tampons qui peuvent nuire à cargaison exosomes, et par conséquent le procédé de EFIRM semble être une méthode préférable pour des études de contenu exosomales par rapport aux méthodes traditionnelles d'ultracentrifugation et de l'utilisation de lysetampons. La sensibilité, la spécificité, et la facilité du procédé de EFIRM rend idéal pour extraire des exosomes à partir d'un fluide biologique et à tester le contenu interne pour les acides nucléiques et les protéines cibles rapidement.

La méthodologie de EFIRM a été appliquée à l'étude d'un modèle de souris nude qui a été injecté avec H460 cellules de cancer du poumon humain. Les cellules de cancer du poumon humain H460 ont été en outre transfectées avec CD63 humain-GFP de sorte que des marqueurs de surface CD63 exosomes aurait une propriété fluorescente. Après une période de 20 jours, le sérum de souris et des échantillons de salive ont été collectés, et la méthode de EFIRM a été utilisé pour analyser leur teneur en exosomal. Cette étude a montré des corrélations linéaires entre les échantillons de sérum et de salive (r = 0,79). Les implications de ces résultats sont de deux ordres: d'abord, la possibilité de capturer des exosomes biofluides suggère que les cellules cancéreuses distales sont capables de transmettre exosomes à d'autres segments du corps, et plus particulièrement dans cette étude la cavité buccale. Second, la linéarité observée entre les échantillons de sérum et de salive suggère que la salive peut être un fluide biologique crédible pour la capture des exosomes qui sont produites dans un état ​​de maladie du corps (c.-à-cancer) et l'analyse de leur contenu moléculaire.

La méthode décrite et les résultats ultérieurs montrent que la méthode est appropriée pour extraire exosomes de biofluides en fonction de leurs marqueurs de surface (dans le cadre de ce travail, CD 63 est le marqueur de surface sélectionnée). Pour les projets futurs, il est du mérite d'examiner si le ciblage des marqueurs de surface supplémentaires exosomes (tels que les CD 9) ou la combinaison de la méthode de EFIRM avec d'autres techniques permettra d'améliorer l'extraction et l'essai de teneur en exosomes.

Exosome la biologie est un domaine prometteur de l'étude pour la médecine translationnelle et les données de l'étude suivante suggère que l'analyse de exosomal salivaire peut être un lieu pour identifier la maladie biomarqueurs discriminatoires. Future enquêtesemble appropriée pour déterminer si les biomarqueurs de la maladie distales peuvent être utilisés pour le diagnostic non invasifs. EFIRM comme méthode peut aider à ouvrir la voie à une analyse plus efficace de ces objectifs dans les exosomes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

David Wong est co-fondateur de RNAmeTRIX Inc., une société de diagnostic moléculaire. PeriRx LLC sous-licence de propriété intellectuelle se rapportant aux diagnostics moléculaires de RNAmeTRIX. David Wong est un consultant pour PeriRx.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1TR000124 (FW); Félix & Mildred Yip Doué chaire et le Fonds famille Barnes (à DTWW), l'Institut national de recherche dentaire et craniofaciale des Instituts nationaux de la santé en vertu Prix Nombre T90DE022734 (MT). Le contenu est de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Helios 16-Channel Reader System with Chip Interface  Genefluidics, USA  RS-1000-16
16x Sensor Chip, Bare Gold, pack of 5 chips Genefluidics, USA SC1000-16X-B
Biotinylated anti-human CD63 Antibody Ancell, USA 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Invitrogen, USA 65601
Neodynium Magnetics (1/10" dia. x 1/32" thick) K&J Magnetics, USA DH101
Ultrapure Distilled Water Life Technologies, USA 10977-023
Mettler Toldeo 3 M KCl Solution Fisher Scientific, USA 1911512
Pyrrole Sigma-Aldrich, USA W338605-100g
Anti-Fluorescein-POD, Fab fragments Roche, Germany 11426346910
3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine substrate (TMB/H2O2, low activity) Neogen, Usa 330175
Phosphate Buffered Saline Solution Life Technologies, USA 10010023
Casein/PBS Fisher Scientific, USA 37532

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rabinowits, G., Gerçel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal MicroRNA: A Diagnostic Marker for Lung Cancer. Clinical Lung Cancer. 10, (1), 42-46 (2009).
  2. Thakur, B. K., et al. Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection. Cell Research. 24, (6), 766-769 (2014).
  3. Lau, C. S., Wong, D. T. W. Breast Cancer Exosome-like Microvesicles and Salivary Gland Cells Interplay Alters Salivary Gland Cell-Derived Exosome-like Microvesicles In. Vitro. PLoS ONE. 7, (3), e33037 (2012).
  4. Bala, S., et al. Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases. Hepatolog. 56, (5), 1946-1957 (2012).
  5. Dear, J. W., Street, J. M., Bailey, M. A. Urinary exosomes: A reservoir for biomarker discovery and potential mediators of intrarenal signalling. Proteomics. 13, (10-11), 1572-1580 (2013).
  6. Lässer, C., et al. Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages. Journal of Translational Medicine. 9, (1), 9 (2011).
  7. Palanisamy, V., et al. Nanostructural and Transcriptomic Analyses of Human Saliva Derived Exosomes. PLoS ONE. 5, (1), e8577 (2010).
  8. Camussi, G., et al. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney International. 78, (9), 838-848 (2010).
  9. Lau, C., et al. Role of pancreatic cancer-derived exosomes in salivary biomarker development. The Journal of Biological Chemistry. 288, (37), 26888-26897 (2013).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids. Current Protocols in Cell Biology. 3, (22), (2001).
  11. Park, N. J., Li, Y., Yu, T., Brinkman, B. M. N., Wong, D. T. Characterization of RNA in Saliva. Clinical Chemistry. 52, (6), 988-994 (2006).
  12. Wei, F., et al. Bio/Abiotic Interface Constructed from Nanoscale DNA Dendrimer and Conducting Polymer for Ultrasensitive Biomolecular Diagnosis. Small. 5, (15), 1784-1790 (2009).
  13. Wei, F., et al. Electrochemical Sensor for Multiplex Biomarkers Detection. Clinical Cancer Research. 15, (13), 4446-4452 (2009).
  14. Wei, F., Yang, J., Wong, D. T. W. Detection of exosomal biomarker by electric field-induced release and measurement (EFIRM). Biosensors and Bioelectronics. 44, 115-121 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics