جيل من الفئران القلب منظم ضربات القلب المجاميع خلية استنادا ES-الخلوي البرمجة في الجمع مع Myh6-المروج-اختيار

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج الوظيفية الجيوب الأنفية الأنسجة العقدية من الخلايا الجذعية المحفزة الفئران (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression بالإضافة إلى القلب-الميوسين الثقيلة سلسلة (Myh6) اختيار المضادات الحيوية المروج يؤدي إلى نقية للغاية المجاميع خلية تنظيم ضربات القلب. هذه "التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات" ("iSABs") تحتوي على أكثر من 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب، وتظهر زيادة معدلات عالية الضرب وقادرة على عضلة القلب وتيرة فيفو السابقين.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويستند العلاج من "متلازمة الجيوب الأنفية المرضى" على أجهزة ضبط نبضات القلب الاصطناعي. هذه تحمل مخاطر مثل فشل البطارية والالتهابات. وعلاوة على ذلك، فإنها تفتقر الاستجابة الهرمونات والإجراء العام هو مكثفة من حيث التكلفة. "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية" ولدت من شركات الأمن الخاصة قد يصبح بديلا، إلا أن المحتوى نموذجية من خلايا تنظيم ضربات القلب في الهيئات مضغي الشكل (EBS) منخفضة للغاية. بروتوكول صفها يجمع بين "البرمجة إلى الأمام" الأمنية الخاصة من الفئران عبر العقدة الجيب محفز TBX3 مع اختيار المضادات الحيوية Myh6-المروج مقرها. هذا ينتج المجاميع cardiomyocyte متسقة من> 80٪ خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية من الناحية الفسيولوجية. هذه "التي يسببها الجيبية الأذينية-الهيئات" ("iSABs") والتعاقد بشكل عفوي على ترددات بعد لم يتم الوصول إليها (400-500 نبضة في الدقيقة) المقابلة لخلايا عقدية المعزولة من قلوب الماوس، وتمكن من وتيرة عضلة القلب الفئران خارج الحي. باستخدام بروتوكول وصف الجيوب الأنفية نقية للغايةيمكن توليد الخلايا واحد العقدي الذي مثل يمكن استخدامها لاختبار المخدرات في المختبر. وعلاوة على ذلك، قد تصبح iSABs ولدت وفقا لهذا البروتوكول خطوة حاسمة نحو هندسة الأنسجة القلبية.

Introduction

مصطلح "متلازمة الجيوب الأنفية المرضى" تلخص أمراض متعددة مما يؤدي إلى تدهور نظام تنظيم ضربات القلب القلب. وهي تتألف من المرضي، أعراض بطء القلب الجيبي، كتلة الجيبي الأذيني واعتقال الجيوب الأنفية وكذلك متلازمة عدم انتظام دقات القلب، بطء القلب. وبالتالي، غالبا ما يترافق من "متلازمة العقدة الجيبية المريضة" عن أمراض القلب التي العامة مثل مرض القلب الإقفاري، بعضلة القلب أو التهاب عضلة القلب. في الوقت الحاضر، وتعتمد الطرق العلاجية على زرع أجهزة ضبط نبضات القلب الكهربائية. ومع ذلك، وهذا يسير جنبا إلى جنب مع عدد من المخاطر مثل الالتهابات وفشل البطارية. وعموما، فإن نسبة حدوث مضاعفات لا يزال مرتفعا جدا في المرضى بعد زرع جهاز تنظيم ضربات القلب الاصطناعي و. وعلاوة على ذلك، خلافا لتنظيم ضربات القلب الذاتية، وهذه الأجهزة لا تستجيب لتحفيز الهرمون.

وثمة بديل في المستقبل قد تعتمد على توفر "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية" التي يمكن أن تكون الأمنية الخاصةكمصدر الخلوي مناسبة والتي من شأنها أيضا أن تكون ذات قيمة للغاية لفي المختبر اختبار المخدرات. ومع ذلك، ومشكلة كبيرة تكمن في ظهور نادر جدا من الخلايا العقدية الجيوب الأنفية داخل هيئات مضغي الشكل (EBS) - وهذا عادة لا تتجاوز 0.5٪ ~ 1.

سابقا، فقد تبين أن "البرمجة إلى الأمام" نحو فرعية cardiomyocyte محددة أمر ممكن التحقيق عبر overexpression من أوائل متميزة عوامل النسخ القلب والأوعية الدموية مثل عامل الأديم المتوسط ​​محددة-الخلفي 1 (MesP1) وNK2 النسخ ذات الصلة، موضع 5 (Nkx2.5) 2، 3. لالحجم العادي وظيفة العقدة الجيبية الأذينية (SAN)، وT-مربع عامل النسخ Tbx3 أمر بالغ الأهمية، وهو ما ثبت لبدء برنامج الجين تنظيم ضربات القلب والسيطرة على التفريق بين SAN 4. في حين أن هذا عزز ظهور خلايا تنظيم ضربات القلب وظيفية، والمحتوى لا يزال لم تتجاوز ~ 40٪ خلال كامل سكان الخلية cardiomyocytic.

لذلك، تم إدخال خطوة اختيار المضادات الحيوية إضافي Myh6-المروج استنادا 5 من قبلنا. هذا يؤدي في النهاية إلى المجاميع cardiomyocyte بعد غير ملحوظة ("الهيئات التي يسببها صينية الأذيني." iSABs ") والتي تظهر زيادة شديدة الترددات الضرب (> 400 نبضة في الدقيقة) في المختبر، للمرة الأولى تقارب تلك التي في القلب الفئران وقابلة للمقارنة لزراعتها في المختبر الجيوب الأنفية الخلايا العقدية معزولة من قلب الفئران 6. تحت الإدارة إيزوبرينالين تتحقق حتى الترددات الضرب من 550 نبضة في الدقيقة. والجدير بالذكر أن تتكون iSABs لأكثر من 80٪ خلايا عقدية وظيفية واضحة اعتبارا من الفسيولوجية واسعة يحلل 7. في الآونة الأخيرة، عدة نهج لتوليد الجيوب الأنفية الخلايا العقدية باستخدام برمجة المباشرة 19، السطح علامات 14 أو العلاج الدوائي مع جزيئات صغيرة وصفت 16،17. ومع ذلك، وأيا من هذه الطرق أدت إلى مثل هذه نقاء عالية من خلايا تنظيم ضربات القلب وينبض ترددات قريبة من الفئران انهالفن كما لوحظ في iSABs.

وعلاوة على ذلك، في نموذج المجراة سابقا من المزروعة شرائح البطين الماوس الكبار التي فقدت النشاط الضرب العفوي بهم، وiSABs هي قادرة على الاندماج في نسيج شريحة، وبالتالي تبقى نشطة بشكل عفوي وبقوة سرعة شرائح القلب لتقلصات 7. ووصف بروتوكول مفصلة لتوليد هذه iSABs في هذه الورقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. التوصيات قبل بدء

  1. لا تستخدم الأمنية الخاصة ملوثة الميكوبلازما لأنها لن تفرق بشكل صحيح إلى خلايا عقدة الجيوب الأنفية. اختبار لتلوث الميكوبلازما قبل البدء في البروتوكول. القيام بذلك باستخدام مجموعة PCR للالسريع، والكشف عن درجة عالية من الحساسية مسببة واتبع بروتوكول الشركة المصنعة.
  2. لكل طبق بتري (الخطوة 2.3.4)، ومعطف واحد 10 سم صحن الثقافة 2 زنزانة مع معقمة 7 مل 0.1٪ الجيلاتين من الجلد أسماك المياه الباردة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. إزالة الجيلاتين والسماح للطبق الجافة تحت ظروف معقمة في مقعد العقيمة.
  3. قبل أن تتمكن من بدء تشغيل بروتوكول التمايز كنت في حاجة الى مضاعفة transfected الماوس مستقر ES خط الخلية استنساخ تحتوي على الميزات التالية: ط) التأسيسي الإفراط في التعبير عن TBX3 باستخدام ناقلات التعبير الثدييات. ب) إن الجينات المقاومة G418 تحت سيطرة Myh6-المروج 5.
  4. يجب ك-زراعة الخلايا غير متمايزة الأمنية الخاصةد مع الخلايا المغذية المشع في ظل ظروف قياسية كما هو موضح 1.

2. التمايز الداخلي

  1. قبل يومين من التمايز - إزالة الأمنية الخاصة من الخلايا المغذية.
    1. نضح المتوسطة، وغسل الخلايا مع 10 مل الفوسفات مخزنة المالحة PBS، إضافة 7 مل كولاجيناز الرابع حل واحتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وضع مرشح 40 ميكرون العقيمة في أنبوب 50 مل.
    2. شطف بعناية المستعمرات PSC (تجنب لإزالة الخلايا المغذية) من قبل pipetting الحل كولاجيناز صعودا وهبوطا 5 مرات.
    3. نقل تعليق خلية إلى تصفية 40 ميكرون، وشطف الفلتر ثلاث مرات مع 8 مل PBS. بدوره حولها مرشح ووضعه رأسا على عقب في طبق بتري. إزالة المستعمرات خلية PSC من قبل pipetting 10 مل PBS إلى الجزء السفلي من مرشح.
    4. نقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    5. إزالة PBS، تعليق الخلايا في 1 مل Accutase وأناncubate عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    6. إضافة 10 مل PBS، مزيج حل الخلية بواسطة pipetting انها صعودا وهبوطا 5 مرات وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    7. إزالة PBS، تعليق الخلايا في 10 مل زراعة المتوسطة وتحديد عدد الخلايا.
    8. البذور 15،000 خلية / سم 2 على 75 سم 2 فلتر القارورة وزراعتها لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO2. بعد 2 أيام ينبغي أن تكون قارورة 50-70٪ متموجة.
  2. يوم 0 - بدء التمايز
    1. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 10 مل PBS.
    2. نضح في برنامج تلفزيوني، إضافة 2 مل Accutase واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وضع مرشح 40 ميكرون العقيمة في أنبوب 50 مل.
    3. إضافة 10 مل PBS، ونقل تعليق خلية إلى 40 ميكرون فلتر، وشطف التصفية عن طريق إضافة 10 مل PBS وأجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    4. تعليق الخلايا في 10 مل التمايز المتوسطة وتحديد عدد الخلايا.
    5. تمييع رانه الخلية تعليق مع التمايز المتوسط ​​إلى تركيز النهائي من 20،000 خلية / مل.
    6. ماصة 20 مل من الماء و 5 مل قطرة (HD) حل في طبق بيتري الدرجة الثانية لتجنب تجفيف التدريجي من ويي شنقا.
      ملاحظة: لكل 24 لوحة تحتوي أيضا iSABs (انظر القسم 2.8.6.4/2.8.7) تبدأ مع 16 أطباق بتري.
    7. ماصة ما يصل الى 50 مل تعليق خلية في علبة.
    8. بدوره حولها غطاء طبق بتري. وضع 180 ويي تحتوي كل منها على 20 ميكرولتر (400 خلية / HD) تعليق الخلية على الغطاء باستخدام ماصة 12 قناة.
    9. تحويل بعناية حول الغطاء وضعه على طبق بيتري.
      ملاحظة: سرعة الدوران في المكان غطاء مهم جدا. إذا تم تشغيل الغطاء حول بطيئة جدا أو سريع جدا، والتوتر السطحي للتعليق الخلية ليست عالية بما فيه الكفاية للاحتفاظ قطرات شنقا على الغطاء. قبل محاولة إنتاج ويي لممارسة مرة الأولى الدوران في المكان الغطاء مع 20 قطرات ميكرولتر من المتوسط.
    10. زراعة الخلايا لمدة 2 أيام في 37 ° C، 5٪ CO 2 إلى السماح لهم بتشكيل EBS.
      ملاحظة: مكان طبق بتري واحد مملوء بالماء في الجزء العلوي من كومة من 5 أطباق بتري. وإلا فإن HD في طبق بتري العلوي سوف تجف.
  3. يوم 2
    1. تحويل بعناية حول غطاء طبق بيتري من الدرجة الثانية ونقل EBS المستمدة من اثنين من أطباق بتري (360 EBS) إلى أنبوب 50 مل.
    2. انتظر 10 دقيقة للسماح للEBS تستقر في قاع الأنبوب (لا الطرد المركزي EBS).
    3. نضح مثل كثير المتوسطة وقت ممكن، تعليق EBS في 10 مل التمايز المتوسطة ونقل تعليق إلى 10 سم طبق بتري.
  4. يوم 2-6 تعليق الثقافة
    1. زراعة EBS في تعليق لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO وتغيير المتوسطة بعد 2 أيام.
      ملاحظة: حتى لو طبق بتري لا المغلفة (على العكس من طبق ثقافة الخلية) وEBS غالبا ما نعلق على السطح. السيطرة على أطباق بتري لEBS تعلق كل يوم، وإذا فصل ما يلزم من EBSمن على سطح الأرض من قبل pipetting لطيف. اختياري: يهز أطباق بتري بشكل مستمر خلال الفترة الثقافة تعليق. كن حذرا مع سرعة شاكر. ينبغي أن EBS لا تتراكم في منتصف ولا تطفو إلى حدود أطباق بتري.
  5. اليوم 6
    1. نقل EBS من واحدة طبق بيتري لالجيلاتين واحد المغلفة صحن 10 سم ثقافة 2 الخلية.
  6. يوم 7-12
    1. الخلايا ينبغي أن تبدأ للفوز على بعد 8-12 أيام. تحقق لضرب بؤر الخلايا يوميا تحت المجهر. تبدأ الخلايا لتشكيل طبقة.
    2. تغيير المتوسطة يوميا.
      ملاحظة: بعد تغيير المتوسطة، والخلايا تتطلب 3-4 ساعة لاستعادة والبدء في الضرب مرة أخرى.
  7. يوم 12-15 اختيار الخلايا العقدية الجيوب الأنفية.
    1. بعد ثلاثة أيام بدأت خلايا الضرب (حوالي 12-15 يوم)، نضح 10 المتوسطة وماصة مل من المتوسط ​​التمايز الطازجة التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 إلى الخلايا.
  8. ملاحظة: من الممكن أن طبقة الخلايا يتم فصل بالفعل من على سطح الأرض.
    1. إزالة المتوسطة بعناية دون الشفط طبقة الخلايا.
    2. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني وإزالة PBS بعناية دون الشفط طبقة الخلايا.
    3. إضافة 10 مل من كولاجيناز IV حل، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. مزيج بقوة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يجب أن يحدث تعليق مجموعات صغيرة. إذا لا تزال هناك أجزاء كبيرة من طبقة اليسار، ثم كرر الخطوة 2.8.4 مرتين أخريين.
    5. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 ز س.
    6. نضح PBS بعناية.
      ملاحظة: إذا iSABs هي أن تتولد المضي قدما في خطوة 2.8.7. إذا iSAB الجيوب الأنفية المستمدة الخلايا واحد العقدي هي أن تتولد على المضي قدما مع خطوة 2.9.
    7. تعليق الخلايافي 12 مل التمايز متوسطة تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 والبذور منها في 6 آبار من الجيلاتين المغلفة 24 بئرا (2 مل / جيد).
  9. جيل من الخلايا العقدية واحدة.
    1. تعليق الخلايا من الخطوة 2.8.6 في 5 مل Accutase واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. مزيج بقوة تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا 10 مرات واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    3. إضافة 20 مل من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
    4. تعليق الخلايا في 12 مل التمايز المتوسطة التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل G418 والبذور منها في 6 آبار من الجيلاتين المغلفة 24 بئرا (2 مل / جيد).
  10. يوم 2 بعد التفكك، نضح المتوسطة ويغسل خلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل التمايز المتوسطة / جيد.
  11. يوم 4-8 بعد التفكك، وتغيير المتوسطة كل الثانية يوم 2. في يوم 10 بعد iSABs استخدام التفكك أو iSAB الجيوب الأنفية المستمدة العقدي متاحة لمزيد من التحليل الخلايا واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بروتوكول صفها يسمح جيل من iSABs مع تواتر الضرب من حوالي 450 نبضة في الدقيقة من شركات الأمن الخاصة (كما هو موضح في الفيلم) التي تقع بالقرب من وتيرة الضرب الماوس القلب. بعد تفكك iSABs (الخطوة 2.8.8) تظهر الخلايا واحد المرصودة شكل نموذجي للخلايا العقدة الجيب (خلايا المغزل والعنكبوت) كما هو مبين في الشكل (1). هذه الخلايا البروتينات صريحة للغاية والتي هي معروفة ليكون أساسيا لوظيفة من العقدة الجيب مثل تنشيط فرط الاستقطاب دوري بوابات النوكليوتيدات الموجبة قناة 4 (Hcn4)، Connexin45 (Cx45)، Connexin30.2 (Cx30.2) وMyh6 (الشكل 2A - C). بعد العلاج من iSAB المستمدة الخلايا مع المستحضرات الصيدلانية، وتظهر الخلايا السلوك المتوقع: كما هو الحال في العقدة الجيبية، ومضحك قناة مانع ZD7288 (الشكل 3A) وكذلك كرباكول المسكارينية ناهض مستقبلات (الشكل 3B)، وكلاهما يؤدي إلى انخفاض كبير في الضرب تواتر deriv iSAB خلايا إد. ناهض إيزوبرينالين β-مستقبلة أدرينية يؤدي إلى تردد الضرب مرتفع (الشكل 3C).

الشكل (1)
الشكل 1: شكل الخلوي من المغزل والعنكبوت خلايا الشكل الخلوي نموذجي من iSAB المغزل المشتقة (A) والعنكبوت (B) خلية عقدية. شريط نطاق 20 ميكرون.

الشكل 2
الشكل 2: التعبير عن علامات عقدة الجيوب الأنفية. (A) التعبير عن HCN4 (الصفراء) وCx45 (قرمزي)، (B) التعبير عن Cx45 (أرجواني) وCx30.2 (أصفر) و (C) Myh6 (أرجواني) في خلايا العقدة الجيب. Counterstaining من نوى (turquois). شريط نطاق 20 ميكرون.

ether.within صفحة = "دائما"> الشكل (3)
الشكل 3: العلاج الدوائي من iSABs الممثل الضرب تردد من قبل iSABs (السيطرة) وبعد العلاج مع ZD7288 (A)، كرباكول (B) وإيزوبرينالين (C). تمثل البيانات ثمانية iSABs مستقلة ويتم عرضها كما يعني ± SD. *** P <0.001

الشكل (4)
الشكل 4: رسم تخطيطي للبروتوكول التمايز. الكرتون مبسطة تعكس تدفق الرسم البياني تجريبي لتوليد iSAB.

فيلم: الضرب من iSABs الضرب من الجسم التي يسببها الجيبي الأذيني نموذجي (iSAB) بعد التفكك نداءحد ذاته انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

القدرة على إنتاج الخلايا الجذعية المستمدة خلايا تنظيم ضربات القلب القلب قد تسمح إعادة تشكيل إيقاع القلب السليم بمعنى "أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجية". وبالمثل، فإن اختبار المخدرات في المختبر تستفيد من توافرها. يمكن الأمنية الخاصة تؤدي إلى أي نوع من الخلايا في الجسم الثدييات بما في ذلك العضلية مع خصائص خلية تنظيم ضربات القلب 8،9،10،11،12،13. ومع ذلك، وعادة السكان خلية داخل "الهيئات مضغي الشكل" هي غير متجانسة للغاية، الأمر الذي يؤدي حتما لمتطلبات استراتيجيات اختيار والعزلة موثوقة - وهذا ينطبق بشكل خاص إلى نوع من الخلايا نادرة جدا من الخلايا العقدية القلب. النهج المتعددة المبنية على سطح خارجية وداخلية علامات 14، على الإدارة الدوائية من جزيئات صغيرة 15،16،17 وعلى استراتيجيات إعادة برمجة المباشرة اتبعت 18،19. وبالإضافة إلى ذلك، النهج القائمة على غير الجذعية خلايا-تهدف إلى محاكاة أجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجيةعبر التلاعب من الجزيئات المستجيب النهائية الكامنة sarcolemmal الكهربية بدلا من دي نوفو توليد خلايا عقدية تعمل بكامل طاقتها 20،21.

ومع ذلك، وجاء أيا من هذه بركب اللازمة عالية الترددات انكماش عفوية ونقاء الخلوية. في المقابل، لدينا بروتوكول يؤدي إلى الخلايا التي لا تظهر إلا التذبذبات الكهربائية ولكن أيضا خصائص الإشارات الكهربية والكالسيوم خفية فضلا عن الميزات المورفولوجية المميزة لخلايا تنظيم ضربات القلب الذاتية 7. قد تصبح هذه التكنولوجيا شرط هام عن بدائل لأجهزة سرعة الإلكترونية.

وعلى الرغم من هذا البروتوكول الأمثل خلال تطورها، لا تزال هناك بعض الخطوات التي قد تسبب مشاكل: إن نقطة البداية لاختيار iSAB أمر بالغ الأهمية للبروتوكول. ضرب الخلايا هو مؤشر لαMHC-التعبير في تمييز الخلايا. Myh6-التعبير يسير جنبا إلى جنب مع السابقينPRESSION من الجينات المقاومة G418. والبدء في اختيار من السابق لأوانه اطفاء الكثير من الخلايا التي يحتمل أن تفرق في العضلية وبالتالي سيقلل من العائد الكلي للخلايا عقدية الجيوب الأنفية. خطوة حاسمة أخرى هي تفكك طبقة الخلايا (الخطوة 2.8). والسبب في ذلك هو أن الخلايا تشكل المصفوفة خارج الخلية قوية وقوة قوية ضروري لفصل طبقة الخلايا. إذا لزم الأمر، خطوة 2.8.4 ينبغي تكرار حتى وضعت مجموعات صغيرة من الخلايا من طبقة الخلايا. تجنب التفكك المباشر للطبقة الخلايا التي كتبها مثل التربسين لأنه تبين أن كفاءة منخفضة جدا.

لالتطبيقات السريرية في المستقبل، والعقبات التالية لا تزال بحاجة إلى معالجة: انتقال للنهج لتوليد iSABs البشرية التي قد تصبح خطوة حاسمة نحو العلاج بالخلايا المستقبل في المختبر لاختبار المخدرات. أيضا، هذه التقنية لا تزال تعتمد على modifi الجيني مستقرسوف الكاتيونات من شركات الأمن الخاصة، وبالتالي تحتاج إلى تعديل قبل أن يمكن تطبيقها على المرضى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, (3), 173-182 (1991).
  2. David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
  3. David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84, (2), 263-272 (2009).
  4. Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21, (9), 1098-1112 (2007).
  5. Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98, (1), 216-224 (1996).
  6. Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5, (3), 241-250 (2011).
  7. Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2, (5), 592-605 (2014).
  8. Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75, (2), 233-244 (1994).
  9. He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93, (1), 32-39 (2003).
  10. Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25, (11), 2712-2719 (2007).
  11. Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46, (3), 343-351 (2009).
  12. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, (5), H2006-H2017 (2011).
  13. David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27, (3), 119-129 (2012).
  14. Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113, (4), 389-398 (2013).
  15. Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33, (33), 290-303 (2010).
  16. Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104, (3), 388-397 (2009).
  17. Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122, (18), 1823-1836 (2010).
  18. Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94, (3), 439-449 (2012).
  19. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31, (1), 54-62 (2013).
  20. Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96, (2), 1152-1158 (1995).
  21. Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103, (6), 889-896 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics