דור של אגרגטים תא Murine לב קוצב לב בהתבסס על ES-Cell-תכנות בשילוב עם Myh6-יזם-בחירה

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לייצר רקמת קטרי פונקציונלית סינוס מתאי גזע עכבריים pluripotent (PSC). T-Box3 ביטוי יתר (TBX3) בתוספת מבחר אנטיביוטי אמרגן שרירן-כבד-שרשרת לב (Myh6) מוביל לאגרגטים תא קוצב לב טהורים מאוד. אלה "הנוצרים על-sinoatrial-גופים" ("iSABs") מכילים מעל 80 תאי קוצב%, להראות גדלו מאוד שיעורי מכות והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

טיפול ב" תסמונת סינוס החולה "מבוסס על קוצבי לב מלאכותיים. אלה נושאים סכנות כגון כשל סוללה וזיהומים. יתר על כן, הם חסרים את היענות הורמון וההליך הכולל הוא עלות עתיר. "קוצבי לב ביולוגיים" שנוצרו מPSCs עשוי להיות אלטרנטיבה, עדיין התוכן האופייני לתאי קוצב לב בגופים Embryoid (EBS) הוא נמוך ביותר. הפרוטוקול המתואר משלב "תכנות קדימה" של PSCs העכברי באמצעות TBX3 inducer צומת סינוס עם בחירת אנטיביוטיקה מבוססת Myh6-אמרגן. זה מניב אגרגטים cardiomyocyte עקביים של תאי קוצב לב מבחינה פיזיולוגית תפקודיים> 80%. אלה "הנוצרים על-sinoatrial-גופים" ("iSABs") באופן ספונטני הידבקות בתדרים עדיין unreached (400-500 פעימות לדקה) המתאימים לתאי קטרי מבודדים מלב עכבר והם מסוגלים לצעוד שריר לב vivo לשעבר עכברי. באמצעות הפרוטוקול המתואר סינוס הטהור ביותריכולים להיות שנוצרו תאים בודדים קטרי שלדוגמה ניתן להשתמש במבחנת בדיקות סמים. יתר על כן, iSABs שנוצר על פי פרוטוקול זה עלול להפוך לצעד מכריע לקראת הנדסת רקמות לב.

Introduction

"תסמונת סינוס החולה" הטווח מסכמת מחלות מרובות שהובילו להידרדרות מערכת קוצב לב. היא כוללת ברדיקרדיה פתולוגי, סימפטומטי סינוס, בלוק sinoatrial, מעצר סינוס, כמו גם את תסמונת טכיקרדיה-ברדיקרדיה. וכך, "תסמונת סינוס חולה" מלווה לעתים קרובות במחל לב כלליות כגון מחלת לב איסכמית, cardiomyopathies או דלקת שריר לב. נכון לעכשיו, גישות טיפוליות המבוססות על השתלת קוצבי לב של חשמל. עם זאת, זה הולך ביחד עם מספר הסיכונים, כגון זיהומים וכשל סוללה. בסך הכל, השכיחות של סיבוכים היא עדיין גבוהה מאוד בחולים שהושתלו קוצב לב מלאכותי. יתר על כן, בניגוד לקוצב לב אנדוגני, התקנים אלה אינם מגיבים לגירוי הורמונלי.

חלופה עתידית עשויה להסתמך על הזמינות של "קוצבי לב ביולוגיים" שיכול לשמש PSCsכמקור סלולארי מתאים ושיהיה גם יקר מאוד במבחנת בדיקות סמים. עם זאת, בעיה עיקרי טמון בהופעה נדירה מאוד של תאי קטרי סינוס בתוך גופי embryoid (EBS) - זה בדרך כלל אינו עולה על 0.5% ~ 1.

בעבר, ניתן היה לראות כי "תכנות קדימה" לקראת תת cardiomyocyte ספציפי ניתן לביצוע באמצעות ביטוי יתר של גורמים שונים בתחילת שעתוק לב וכלי דם כגון גורם המזודרם ספציפי, אחורי 1 (MesP1) ושעתוק NK2 הקשורים, לוקוס 5 (Nkx2.5) 2, 3. לגודל ותפקוד של צומת sinoatrial (SAN) רגילים, Tbx3 גורם שעתוק T-התיבה הוא חיוני, אשר הוכח כדי ליזום את תכנית גן קוצב לב ולשלוט בידול של 4 SAN. אמנם זה משופר המראה של תאי קוצב פונקציונליים, התוכן עדיין לא עלה על ~ 40% בקרב אוכלוסיית תא cardiomyocytic כולו.

לכן, צעד בחירת אנטיביוטיקה מבוסס Myh6-אמרגן נוסף 5 הוצג על ידינו. זה סופו של דבר מוביל לאגרגטים עד כה לא נצפו cardiomyocyte ("גופים הנגרמים סין-פרוזדורים;" iSABs ") אשר התערוכה גדלו מאוד תדרי מכות (> 400 פעימות לדקה) במבחנה, בפעם הראשונה לאלו של לב עכברי ודומים לטפח במבחנה תאי קטרי סינוס המבודדים מלב עכברי 6. תחת ממשל Isoprenaline אפילו תדרים פועמים של 550 פעימות לדקה מושגות. יש לציין, iSABs מורכב של מעל 80% תאי קטרי פונקציונליים כפי שעולים פיסיולוגי נרחב מנתח 7. לאחרונה, מספר גישות ליצירת תאי סינוס קטרי באמצעות תכנות מחדש ישיר 19, משטח סמני 14 או טיפול תרופתי עם מולקולות קטנות 16,17 תוארה. עם זאת, אף אחת מהשיטות הללו הוביל לטוהר גבוה כל כך של תאי קוצב לב ומכה את תדרים קרובים לעכברי הואאמנות כפי שנצפה בiSABs.

יתר על כן, במודל vivo לשעבר של פרוסות חדרית מעובד עכבר מבוגר שאבדו את פעילות המכות הספונטנית שלהם, iSABs מסוגל להשתלב ברקמה הפרוסה, כך שנותרו פעיל באופן ספונטני ובאופן עמיד צעדה פרוסות לב להתכווצויות 7. פרוטוקול מפורט לדור של iSABs אלה מתואר במאמר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. המלצות לפני שמתחיל

  1. אל תשתמש בPSCs מזוהם בmycoplasma כי הם לא יבדילו כראוי לתאי צומת סינוס. מבחן לזיהום mycoplasma לפני תחילת הפרוטוקול. לעשות את זה באמצעות ערכת PCR לגילוי מהיר, רגיש מאוד של mycoplasmas ולעקוב אחר פרוטוקול manufacturer`s.
  2. לכל צלחת פטרי (צעד 2.3.4), מעיל סנטימטר אחד 10 צלחת תרבות 2 תא עם ג'לטין סטרילי 7 מיליליטר 0.1% מעור דג מים קרים למשך שעת 1 ב 37 ° C. הסר את הג'לטין ולתת יבש מנה בתנאים סטריליים בספסל סטרילי.
  3. לפני שתוכל להתחיל את פרוטוקול הבידול אתה צריך שיבוט כפול עכבר היציב transfected ES קו תא המכיל את התכונות הבאות: i) מכוננת על ביטוי של TBX3 באמצעות וקטור ביטוי יונקים. Ii) גן התנגדות G418 תחת שליטתו של Myh6-האמרגן 5.
  4. התאים שלא עברו התמיינות PSCs צריכים להיות שותף לטפחד עם תאים מזינים המוקרנים בתנאים סטנדרטיים כמתואר 1.

2. בידול נוהל

  1. ימים לפני התמיינות - הסר PSCs מהתאים מזינים.
    1. לשאוב את המדיום, לשטוף את התאים עם מי מלח שנאגרו 10 מיליליטר פוספט PBS, להוסיף 7 מיליליטר פתרון Collagenase IV ודגירת התאים במשך 10 דקות על 37 מעלות צלזיוס. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר.
    2. לשטוף בזהירות את מושבות PSC (להימנע מלהסיר את התאים מזינים) על ידי pipetting פתרון collagenase למעלה ולמטה 5 פעמים.
    3. מעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן שלוש פעמים עם 8 מיליליטר PBS. להסתובב המסנן ולמקם אותו במהופך בצלחת פטרי. הסר את מושבות תאי PSC ידי pipetting 10 מיליליטר PBS לתחתית המסנן.
    4. מעביר את ההשעיה תא צינור 15 מיליליטר ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
    5. הסר את PBS, להשעות את התאים 1 מיליליטר Accutase וincubate על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    6. הוסף 10 מיליליטר PBS, לערבב את פתרון התא על ידי pipetting מעלה ומטה 5 פעמים וצנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x g.
    7. הסר את PBS, להשעות את התאים במדיום גידול 10 מ"ל ולקבוע את מספר התא.
    8. תאי זרע 15,000 / 2 סנטימטר על בקבוק 2 מסנן 75 סנטימטר ולטפח אותם במשך 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. לאחר 2 ימי הבקבוק צריך להיות 50-70% ומחוברות.
  2. יום 0 - התחל של בידול
    1. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם 10 מיליליטר PBS.
    2. לשאוב PBS, להוסיף 2 מיליליטר Accutase ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. מניחים מסנן 40 מיקרומטר סטרילי בשפופרת 50 מיליליטר.
    3. הוסף 10 מיליליטר PBS, להעביר את ההשעיה התא למסנן 40 מיקרומטר, יש לשטוף את המסנן באמצעות תוספת של 10 מיליליטר PBS ו צנטריפוגות הזרימה דרך במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
    4. להשעות את התאים בינוניים בידול 10 מיליליטר ולקבוע את מספר התא.
    5. לדלל tהוא תא השעיה עם מדיום בידול לריכוז סופי של 20,000 תאים / מיליליטר.
    6. פיפטה 20 מיליליטר מים ו -5 מיליליטר תלוי טיפת פתרון (HD) בצלחת פטרי ריבועית, כדי למנוע התייבשות של HDS.
      הערה: לכל 24 iSABs צלחת המכילה גם (ראה סעיף 2.8.6.4/2.8.7) להתחיל עם 16 צלחות פטרי.
    7. פיפטה עד 50 מיליליטר השעיה תא במגש.
    8. להסתובב את המכסה של צלחת פטרי. הנח 180 HDS כל 20 μl המכיל (400 תאים / HD) השעיה תא על המכסה בעזרת פיפטה 12 ערוצים.
    9. הפוך בזהירות מסביב למכסה ומניח אותו על גבי צלחת פטרי.
      הערה: המהירות להסתובב המכסה היא מאוד חשובה. אם המכסה הסתובב לאט מדי או מהר מדי, את המתח של ההשעיה תא השטח אינו גבוה מספיק כדי לשמר את תליית טיפות על המכסה. לפני שאנסה לייצר HDS לאימון בפעם הראשון להסתובב עם המכסה 20 טיפות μl של מדיום.
    10. לטפח את התאים עבור 2 ימים בשעה 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר להם ליצור EBS.
      הערה: מקום צלחת פטרי אחת מלא במים בחלק העליון של ערימה של 5 צלחות פטרי. אחרת HD בצלחת פטרי העליונה יתייבש.
  3. יום 2
    1. הפוך בזהירות מסביב למכסה של צלחת פטרי ריבועית ולהעביר את EBS נגזר משתי צלחות פטרי (360 EBS) לצינור 50 מיליליטר.
    2. חכה 10 דקות כדי לאפשר לEBS להתיישב בחלק התחתון של הצינור (אל צנטריפוגות EBS).
    3. לשאוב באותה המידה בינונית ככל האפשר, להשעות את EBS ב 10 מיליליטר בינוני בידול ולהעביר את ההשעיה לצלחת פטרי 10 סנטימטרים.
  4. תרבות 2-6 השעיה יום
    1. לטפח את EBS בהשעיה למשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, לשנות בינוני לאחר 2 ימים.
      הערה: למרות שצלחת פטרי לא מצופה (בניגוד לצלחת תרבית תאים) EBS לעתים קרובות לצרף אל פני השטח. לשלוט בצלחות פטרי לEBS מצורף בכל יום, ואם יש צורך ניתוק EBSמהמשטח על ידי pipetting העדין. אופציונאלי: לנער את צלחות פטרי ברציפות בתקופת תרבות השעיה. תיזהר עם המהירות של ייקר. EBS צריך לא לצבור באמצע ולא לצוף לגבול של צלחות פטרי.
  5. יום 6
    1. העבר את EBS מאחד צלחת פטרי לג'לטין אחד 10 סנטימטרים מצופים צלחת תרבות 2 תא.
  6. יום 7-12
    1. התאים צריכים להתחיל לנצח לאחר 8-12 ימים. בדקו אם מכה מוקדים של התאים יומיים תחת מיקרוסקופ. התאים מתחילים ליצור שכבה.
    2. שנה בינונית יומי.
      הערה: לאחר השינוי בינוני, התאים דורשים 3-4 שעות להתאושש ולהתחיל להכות שוב.
  7. בחירת 12-15 היום של תאי קטרי סינוס.
    1. שלושה ימים לאחר שהתאים החלו להכות (סביב היום 12-15), לשאוב מיליליטר 10 הבינוני ופיפטה של ​​מדיום בידול טרי המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם לתאים.
  8. הערה: ייתכן ששכבת התאים כבר מנותקת מהשטח.
    1. הסר את המדיום בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים.
    2. להוסיף 10 מיליליטר של PBS ולהסיר את PBS בזהירות מבלי aspirating שכבת התאים.
    3. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת Collagenase IV, להעביר את תאי צינור 50 מיליליטר ו דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    4. במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. השעיה של אשכולות קטנים צריכה להתרחש. אם יש עדיין חלקים עצומים של השכבה עזבה, חזור על שלב 2.8.4 פעמים נוספות.
    5. להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 300 x גרם.
    6. לשאוב PBS בזהירות.
      הערה: אם iSABs הוא להיות שנוצר להמשיך עם צעד 2.8.7. אם תאים בודדים קטרי סינוס נגזר iSAB הם להיות שנוצרו להמשיך בשלב 2.9.
    7. להשעות את התאיםב -12 מיליליטר בינוני בידול המכיל G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג'לטין מצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב).
  9. דור של תא בודד קטרי.
    1. להשעות את התאים מצעד 2.8.6 ב 5 מיליליטר Accutase ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    2. במרץ לערבב את ההשעיה על ידי pipetting למעלה ולמטה 10 פעמים ודגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. להוסיף 20 מיליליטר של PBS ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
    4. להשעות את התאים בינוניים בידול 12 מיליליטר מכילים G418 / מיליליטר 400 מיקרוגרם וזרעם על 6 בארות של ג'לטין המצופה 24 בארות (2 מיליליטר / טוב).
  10. היום 2 לאחר ניתוק, לשאוב את המדיום ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. הוסף 1 מיליליטר בינוני בידול / טוב.
  11. יום 4-8 לאחר הניתוק, לשנות בינוני כל 2 nd יום. ביום 10 אחרי iSABs שימוש דיסוציאציה או בסינוסים נגזרים iSAB קטרי תאים בודדים זמינים לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר מאפשר דור של iSABs בתדירות פעימות סביב 450 פעימות לדקה מPSCs (שמוצג בסרט) שנמצא ליד לתדר פעימות לב עכבר. לאחר הניתוק של iSABs (שלב 2.8.8) תאים בודדים שנצפו להראות את הצורה האופיינית לתאים של צומת סינוס (תאי כישור ועכביש) כפי שמוצג באיור 1. תאים אלה חלבונים מפורשים ביותר שידועים להיות חיוניים לתפקוד של צומת סינוס כמו ערוץ מופעל hyperpolarization המחזורי מגודרת נוקלאוטיד קטיון 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) וMyh6 (איור 2 א - ג). לאחר טיפול בתאי iSAB נגזר עם תרופות, התאים להראות ההתנהגות הצפויה: כמו בצומת סינוס, חוסם ערוץ המצחיק ZD7288 (איור 3 א), כמו גם את carbachol אגוניסט קולטן מוסקריניים (איור 3), שני לגרום מכות מופחתות באופן משמעותי תדירות deriv iSAB תאי ed. Isoprenaline אגוניסט β-adrenoreceptor מוביל לתדירות פעימות גבוהה (איור 3 ג).

איור 1
איור 1: צורה סלולרית של תאי כישור ועכביש צורה סלולרית טיפוסית של ציר iSAB נגזר () ועכביש (B) תא קטרי. בר סולם 20 מיקרומטר.

איור 2
איור 2: ביטוי של סמני צומת סינוס. (א) ביטוי של HCN4 (הצהוב) וCx45 (מג'נטה), ביטוי (B) של Cx45 (מגנטה) וCx30.2 (הצהוב) וMyh6 (מגנטה) (C) בתאי צומת סינוס. Counterstaining של גרעינים (turquois). בר סולם 20 מיקרומטר.

ether.within-page = "תמיד"> איור 3
איור 3: טיפול תרופתי של iSABs נציג להכות תדירות של iSABs לפני (שליטה) ולאחר הטיפול בZD7288 (), Carbachol (B) וIsoprenaline (C). הנתונים מייצגים שמונה iSABs עצמאי ומוצגים כממוצע ± SD. *** P <0.001

איור 4
איור 4: סכמטי של פרוטוקול הבידול. קריקטורה פשוטה המשקפת את תרשים הזרימה הניסיוני לדור iSAB.

סרט:. מכות של מכות iSABs של גוף אופייני מושרה sinoatrial (iSAB) לאחר ניתוק טיעוןse לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

היכולת לייצר תאי גזע קוצב לב תא נגזרים לב עשוי לאפשר הכינון מחדש של קצב הלב התקין, במובן של "קוצבי לב ביולוגיים". כמו כן, בדיקות סמים במבחנה תיהנה מזמינותם. PSCs יכול להצמיח כל סוג תא בגוף של היונקים, כולל שריר לב עם מאפייני תא קוצב לב 8,9,10,11,12,13. עם זאת, בדרך כלל אוכלוסיות התאים בתוך "גופי Embryoid" הן הטרוגנית מאוד, אשר מוביל בהכרח לדרישה של אסטרטגיות בחירה ובידוד אמינות - זה חל במיוחד לסוג התא הנדיר מאוד של תאי קטרי לב. גישות רבות המבוססות על פני השטח אקסוגני ואנדוגני סמני 14, על ממשל תרופתי של מולקולות קטנות 15,16,17 ועל אסטרטגיות תכנות מחדש ישירות 18,19 כבר אחרי. בנוסף, גישות הלא-גזע מבוסס תא שנועדו לחקות קוצבי לב ביולוגייםבאמצעות מניפולציה של מולקולות מפעיל מסוף בסיס אלקטרופיזיולוגיה sarcolemmal במקום דה נובו יצירת תאי קטרי פונקציונליים מלא 20,21.

עם זאת, אף אחד מאלה בא עם התדרים הנחוצים גבוהים ספונטניים התכווצות וטוהר סלולארי. בניגוד לכך, הפרוטוקול שלנו מוביל לתאים שאינו מציגים רק תנודות חשמליות, אלא גם את מאפייני איתות אלקטרו וסידן העדינים, כמו גם תכונות מורפולוגיות ייחודיות של תאי קוצב לב אנדוגני 7. טכנולוגיה זו עשויה להפוך לתנאי חשוב לחלופות למכשירי צעדה אלקטרוניות.

למרות שפרוטוקול זה היה מותאם במהלך פיתוחו, עדיין יש כמה צעדים שעלולים לגרום לבעיות: נקודת ההתחלה לבחירת iSAB היא קריטית של הפרוטוקול. מכות של התאים היא אינדיקטור לαMHC-ביטוי בהבחנת תאים. Myh6-ביטוי הולך יחד עם האקסpression של גן התנגדות G418. החל הבחירה מוקדם מדי יהיה לכבות הרבה תאים שפוטנציאל היה להתמיין cardiomyocytes ולכן להקטין את התשואה הכוללת של תאי קטרי סינוס. עוד צעד קריטי הוא הניתוק של שכבת התאים (שלב 2.8). הסיבה לכך היא שהתאים יוצרים מטריצה ​​תאית חזקה וכוח חזק יש צורך לנתק את שכבת התאים. במידת צורך, צעד 2.8.4 יש לחזור עד אשכולות קטנים של תאים פיתחו משיכבת התאים. הימנע מניתוק ישיר של שכבת התאים על ידי דוגמא טריפסין משום שהתברר להיות של יעילות נמוכה מאוד.

עבור יישומים קליניים בעתיד, המכשולים הבאים עדיין צריכים לטפל: העברה של הגישה לדור של iSABs אדם שעשוי להיות צעד מכריע לקראת טיפול בתאי עתיד ובסמי בדיקות מבחנה. כמו כן, הטכניקה עדיין מבוססת על modifi הגנטי היציבקטיונים של PSCs ולכן צריכים להיות שונה לפני שהוא יכול להיות מיושם על מטופלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, (3), 173-182 (1991).
  2. David, R., et al. MesP1 drives vertebrate cardiovascular differentiation through Dkk-1-mediated blockade of Wnt-signalling. Nat Cell Biol. 10, 338-345 (2008).
  3. David, R., et al. Forward programming of pluripotent stem cells towards distinct cardiovascular cell types. Cardiovasc Res. 84, (2), 263-272 (2009).
  4. Hoogaars, W. M., et al. Tbx3 controls the sinoatrial node gene program and imposes pacemaker function on the atria. Genes Dev. 21, (9), 1098-1112 (2007).
  5. Klug, M. G., Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., Field, L. J. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest. 98, (1), 216-224 (1996).
  6. Marger, L., et al. Pacemaker activity and ionic currents in mouse atrioventricular node cells. Channels (Austin). 5, (3), 241-250 (2011).
  7. Jung, J. J., et al. Programming and isolation of highly pure physiologically and pharmacologically functional sinus-nodal bodies from pluripotent stem cells). Stem cell reports. 2, (5), 592-605 (2014).
  8. Maltsev, V. A., Wobus, A. M., Rohwedel, J., Bader, M., Hescheler, J. Cardiomyocytes differentiated in vitro from embryonic stem cells developmentally express cardiac-specific genes and ionic currents. Circulation research. 75, (2), 233-244 (1994).
  9. He, J. Q., Ma, Y., Lee, Y., Thomson, J. A., Kamp, T. J. Human embryonic stem cells develop into multiple types of cardiac myocytes: action potential characterization. Circ Res. 93, (1), 32-39 (2003).
  10. Yanagi, K., et al. Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels and T-type calcium channels confer automaticity of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem cells. 25, (11), 2712-2719 (2007).
  11. Barbuti, A., et al. Molecular composition and functional properties of f-channels in murine embryonic stem cell-derived pacemaker cells. J Mol Cell Cardiol. 46, (3), 343-351 (2009).
  12. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American journal of physiology. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, (5), H2006-H2017 (2011).
  13. David, R., Franz, W. M. From pluripotency to distinct cardiomyocyte subtypes. Physiology (Bethesda). 27, (3), 119-129 (2012).
  14. Scavone, A., et al. Embryonic stem cell-derived CD166+ precursors develop into fully functional sinoatrial-like cells). Circ Res. 113, (4), 389-398 (2013).
  15. Morikawa, K., et al. Identification, isolation and characterization of HCN4-positive pacemaking cells derived from murine embryonic stem cells during cardiac differentiation. Pacing Clin Electrophysiol. 33, (33), 290-303 (2010).
  16. Wiese, C., et al. Formation of the sinus node head and differentiation of sinus node myocardium are independently regulated by Tbx18 and Tbx3. Circ Res. 104, (3), 388-397 (2009).
  17. Kleger, A., et al. Modulation of calcium-activated potassium channels induces cardiogenesis of pluripotent stem cells and enrichment of pacemaker-like cells. Circulation. 122, (18), 1823-1836 (2010).
  18. Bakker, M. L., et al. T-box transcription factor TBX3 reprogrammes mature cardiac myocytes into pacemaker-like cells. Cardiovasc Res. 94, (3), 439-449 (2012).
  19. Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nat Biotechnol. 31, (1), 54-62 (2013).
  20. Johns, D. C., et al. Adenovirus-mediated expression of a voltage-gated potassium channel in vitro (rat cardiac myocytes) and in vivo (rat liver). A novel strategy for modifying excitability. J Clin Invest. 96, (2), 1152-1158 (1995).
  21. Nuss, H. B., Marban, E., Johns, D. C. Overexpression of a human potassium channel suppresses cardiac hyperexcitability in rabbit ventricular myocytes. J Clin Invest. 103, (6), 889-896 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics