Generierung von murinen Herzschrittmacher Zellaggregate Basierend auf ES-Zell-Programmierung in Kombination mit Myh6-Promoter-Auswahl

Developmental Biology

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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Funktionssinusknotengewebe von Maus pluripotente Stammzellen (PSC) zu produzieren. T-Box3 (TBX3) Überexpression sowie Herz-Myosin-Schwerketten (Myh6) Promoter Antibiotika-Selektion führt zu hochreinem Schrittmacher Zellaggregate. Diese "Verursachen-Sinusknoten-Stellen" ("iSABs") enthalten mehr als 80% Schrittmacherzellen, zeigen stark erhöhte schlagRaten und können Myokard ex vivo zu stimulieren.

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

Die Behandlung des "Sick-Sinus-Syndrom" wird auf Kunstherzschrittmachern basiert. Diese mit Gefahren, wie zB Batterieausfall und Infektionen. Außerdem fehlt ihnen Hormonempfindlichkeit und das gesamte Verfahren ist kostenintensiv. "Biologische Herzschrittmacher" von PSCs erzeugt wird, kann eine Alternative sein, aber der typische Inhalt der Schrittmacherzellen in embryonale Körper (EVG) ist extrem niedrig. Die beschriebenen Protokoll verbindet "forward-Programmierung" von murinen PSCs über den Sinusknoten Induktor TBX3 mit Myh6-Promotors auf der Basis Antibiotika-Selektion. Dies führt zu Kardiomyozyten Aggregate konsequent von> 80% physiologisch funktionellen Schrittmacherzellen. Diese "induzierten Sinusknoten-Stellen" ("iSABs") werden spontan kontra bei noch unerreichten Frequenzen (400-500 bpm), die Knoten Zellen aus Mäuseherzen isoliert und können murine Myokard ex vivo zu stimulieren. Mit dem beschriebenen Protokoll hochreines SinusKnoteneinzelzellen erzeugt werden, die beispielsweise für in vitro Arzneimitteltests verwendet werden kann. Weiterhin können die nach diesem Protokoll erzeugt iSABs ein entscheidender Schritt in Richtung Herzgewebetechnik geworden.

Introduction

Der Begriff "Sick-Sinus-Syndrom", fasst mehrere Erkrankungen, die zu einer Verschlechterung der Herzschrittmacher-System. Es besteht aus pathologischer, symptomatische Sinusbradykardie, Sinusknoten-Block, Sinusstillstand sowie die Tachykardie Bradykardie-Syndrom. Dadurch wird ein "krankes Sinus-Syndrom" oft durch allgemeinen Herzerkrankungen begleitet, wie eine koronare Herzkrankheit, Herzmuskelerkrankungen oder Herzmuskelentzündung. Derzeit werden therapeutische Ansätze über die Implantation elektrischen Schrittmacher basiert. Allerdings geht dies zusammen mit einer Reihe von Risiken wie Infektionen und Batterieausfall. Insgesamt ist die Häufigkeit von Komplikationen wie vor sehr hoch bei Patienten mit einem Herzschrittmacher implantiert. Weiterhin, im Gegensatz zu dem endogenen Schrittmacher, diese Geräte nicht auf Hormonstimulation reagieren.

Eine zukünftige Alternative kann von der Verfügbarkeit von "biologischen Schrittmacher" für die PSCs dienen könnte verlassenAls geeignetes Zellquelle und dem auch für In-vitro-Drogen-Test von hohem Wert sein. Dennoch liegt ein großes Problem in der sehr seltenen Auftreten von Sinusknotenzellen in embryonale Körper (EVG) - dies in der Regel nicht ~ 0,5% 1 überschreitet.

Zuvor wurde gezeigt, dass "zukunfts Programmierung" auf bestimmte Subtypen Kardiomyozyten möglich ist über die Überexpression von verschiedenen frühen Herz-Kreislauf Transkriptionsfaktoren wie Mesoderm spezifische-posterior 1 (MesP1) und NK2 Transkriptionsfaktor bezogen, locus 5 (Nkx2.5) 2, 3. Für normale Größe und Funktion der Sinusknoten (SAN) ist der T-Box-Transkriptionsfaktor TBX3 entscheidend, was gezeigt worden ist, um den Schrittmacher-Gen-Programm zu initiieren und Differenzierung des SAN 4 steuern. Obwohl diese verbesserte das Aussehen des Funktionsschrittmacherzellen, deren Inhalt noch nicht ~ 40% in der gesamten Zellpopulation cardiomyocytic überschreiten.

Daher wurde eine zusätzliche Myh6-Promotor basiert antibiotische Selektion Schritt 5 von uns vorstellen. Dies führt letztlich zu noch unbeobachtet Kardiomyozyten Aggregate ("induzierte sinuatrialer Stellen;" iSABs "), die stark erhöhte schlagen Frequenzen (> 400 min) in vitro zeigen, zum ersten Mal die denen eines murinen Herzen und vergleichbar mit in vitro kultivierten Sinusknotenzellen aus einer Maus-Herz 6 isoliert. Unter Isoprenaline Verwaltung selbst schlagen Frequenzen von 550 Schlägen pro Minute erreicht. Bemerkenswert ist, iSABs bestehen aus mehr als 80% Funktionsknotenzellen, wie aus physiologischen umfangreiche Analysen 7. Kürzlich wurden mehrere Ansätze für die Sinusknotenzellen erzeugen mit Gleich Umprogrammierung 19, Oberflächenmarkierungen 14 oder pharmakologische Behandlung mit kleinen Molekülen 16,17 wurden beschrieben. Doch keines dieser Verfahren führte zu einer so hohen Reinheit von Schrittmacherzellen und Schlagen Frequenzen nahe dem murinen erKunst als in iSABs beobachtet.

Darüber hinaus wird in einem ex vivo Modell der kultivierten adulten Maus ventrikuläre Scheiben, die ihren spontanen Schlagaktivität verloren haben, sind die iSABs Lage die Integration in die Scheibe Gewebe und damit spontan aktiv bleiben und kräftig Tempo der Herzscheiben zu Kontraktionen 7. Ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung dieser iSABs ist in diesem Papier beschrieben.

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Protocol

1. Empfehlungen Vor dem Start

  1. Verwenden Sie keine PSCs mit Mykoplasmen kontaminiert, weil sie nicht richtig in Sinusknotenzellen differenzieren. Test auf Mykoplasmen-Kontaminationen vor dem Start des Protokolls. Tun Sie dies mit Hilfe eines PCR-Kits für die schnelle, hochempfindlichen Nachweis von Mykoplasmen und folgen Sie dem Hersteller `Protokoll.
  2. Für jede Petrischale (Schritt 2.3.4), Wappen eine 10 cm 2 Zellkulturschale mit sterilem 7 ml 0,1% Gelatine aus Kaltwasserfischen Haut für 1 Stunde bei 37 ° C. Entfernen Sie die Gelatine und lassen Sie die Schale trocken unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank.
  3. Bevor Sie die Differenzierung Protokoll zu starten benötigen Sie einen Doppel transfiziert stabile Maus-ES-Zelllinie, Klon, der die folgenden Merkmale: i) Die konstitutive Überexpression von TBX3 mit einem Säugetier-Expressionsvektor. Ii) Der G418-Resistenz-Gen unter der Kontrolle des Myh6-Promotor 5.
  4. Die undifferenzierten Zellen PSCs sollten zusammen pflegen werdend mit bestrahlten Feeder-Zellen unter Standardbedingungen wie beschrieben ein.

2. Differenzierung Vorgehens

  1. Zwei Tage vor der Differenzierung - entfernen PSCs von Feeder-Zellen.
    1. Saugen Sie das Medium, waschen Sie die Zellen mit 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung PBS, 7 ml Collagenase IV-Lösung und Inkubation der Zellen für 10 min bei 37 ° C. Legen Sie eine sterile 40 um Filter in ein 50 ml Röhrchen.
    2. Die PSC Kolonien vorsichtig spülen (zu vermeiden, um die Feeder-Zellen zu entfernen) durch Pipettieren der Collagenase-Lösung auf und ab 5 mal.
    3. Übertragen der Zellsuspension auf eine 40 & mgr; m-Filter, spült das Filter dreimal mit 8 ml PBS. Drehen Sie sich um den Filter und stellen Sie es auf den Kopf in einer Petrischale. Entfernen Sie die PSC Zellkolonien durch Pipettieren von 10 ml PBS, um den Boden des Filters.
    4. Übertragen der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und für 5 min bei 300 x g.
    5. Entfernen Sie die PBS, die Zellen zu suspendieren in 1 ml Accutase und incubate bei 37 ° C für 5 min.
    6. 10 ml PBS, mischen Sie die Zell-Lösung pipettiert es nach oben und unten 5-mal und Zentrifuge für 5 Minuten bei 300 x g.
    7. Entfernen Sie die PBS, die Zellen in 10 ml Kultivierungsmedium zu suspendieren und bestimmen die Zellzahl.
    8. Seed 15.000 Zellen / cm2 auf einem 75 cm 2 Filterkolben und pflegen sie für 2 Tage bei 37 ° C, 5% CO2. Nach 2 Tagen sollte der Kolben 50 bis 70% konfluent sein.
  2. Tag 0 - Beginn der Differenzierung
    1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS.
    2. Saugen Sie das PBS, 2 ml Accutase und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 min. Legen Sie eine sterile 40 um Filter in ein 50 ml Röhrchen.
    3. 10 ml PBS, übertragen Sie die Zellsuspension auf die 40-um-Filter, spülen Sie den Filter durch die Zugabe von 10 ml PBS und zentrifugieren die Durchfluss für 5 Minuten bei 300 x g.
    4. Die Zellen in 10 ml Differenzierungsmedium und Bestimmung der Zellzahl.
    5. Verdünnen ter Zellsuspension mit Differenzierungsmedium bis zu einer Endkonzentration von 20.000 Zellen / ml.
    6. Je 20 ml Wasser und 5 ml hängenden Tropfen (HD) Lösung in einer quadratischen Petrischale zur Austrocknung des HDs vermeiden.
      HINWEIS: Bei allen 24 Well-Platte mit iSABs (siehe Abschnitt 2.8.6.4/2.8.7) beginnen mit 16 Petrischalen.
    7. Pipettieren von bis zu 50 ml Zellsuspension in ein Fach ein.
    8. Drehen um den Deckel der Petrischale. Zeigen 180 HDs, jede mit 20 ul (400 Zellen / HD) Zellsuspension auf dem Deckel mit einem 12-Kanal-Pipette.
    9. Vorsichtig um den Deckel ab und legen Sie sie auf die Petrischale.
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Drehung um die Deckel von großer Bedeutung. Wenn der Deckel in der Umgebung zu langsam oder zu schnell gedreht wird, ist die Oberflächenspannung der Zellsuspension nicht hoch genug ist, um zu halten den hängenden Tropfen auf dem Deckel. Bevor Sie versuchen, HDs erstmals Praxis Drehen um den Deckel mit 20 ul Tropfen Medium zu erzeugen.
    10. Kultivieren der Zellen für 2 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2 lassen sich bilden EBs.
      HINWEIS: Legen Sie eine Petrischale mit Wasser auf der Oberseite eines Stapels von 5 Petrischalen gefüllt. Andernfalls ist die HD im oberen Petrischale wird trocknen.
  3. Tag 2
    1. Vorsichtig um den Deckel des quadratischen Petrischale ab und übertragen Sie die EBs aus zwei Petrischalen (360 EVG) abgeleitet, um ein 50 ml Röhrchen.
    2. Warten Sie 10 min die EVG am Boden des Röhrchens absetzen zu lassen (Sie Zentrifuge nicht die EVG).
    3. Saugen Sie so viel Medium wie möglich auszusetzen, die EVG in 10 ml Differenzierungsmedium und übertragen Sie die Suspension auf eine 10 cm Petrischale.
  4. Tag 2-6 Suspensionskultur
    1. Pflegen Sie die EVG in Suspension für 4 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2, zu ändern Medium nach 2 Tagen.
      HINWEIS: Auch wenn die Petrischale ist nicht beschichtet (im Gegensatz zu einer Zellkulturschale) Das EBS legen oft an die Oberfläche. Kontrollieren Sie die Petrischalen für angebracht EVG jeden Tag und bei Bedarf nehmen Sie den EVGvon der Oberfläche durch vorsichtiges Pipettieren. Optional: Schütteln Sie die Petrischalen kontinuierlich während der Suspensionskulturperiode. Seien Sie vorsichtig mit der Geschwindigkeit der Shaker. Die EVG sollte weder zu akkumulieren in der Mitte noch schweben an der Grenze der Petrischalen.
  5. Tag 6
    1. Übertragen Sie die EVG aus einer Petrischale mit einem Gelatine beschichtete 10 cm 2 Zellkulturschale.
  6. Tag 7-12
    1. Die Zellen sollten beginnen, nach 8-12 Tagen zu schlagen. Überprüfen Sie für den Sieg gegen Schwerpunkte der Zellen täglich unter dem Mikroskop. Die Zellen beginnen, um eine Schicht zu bilden.
    2. Ändern Medium täglich.
      HINWEIS: Nach dem Ändern Medium, die Zellen benötigen 3-4 Stunden zu erholen und wieder anfangen zu schlagen.
  7. Tag 12-15 Auswahl der Sinusknotenzellen.
    1. Drei Tage, nachdem die Zellen fingen (um Tag 12-15), saugen die mittel- und Pipette 10 ml frischem Differenzierungsmedium, das 400 ug / ml G418 zu den Zellen.
  8. HINWEIS: Es ist möglich, dass die Zellschicht bereits von der Oberfläche abgelöst.
    1. Entfernen Sie das Medium vorsichtig ohne Absaugen der Zellschicht.
    2. 10 ml PBS und entfernen Sie die PBS vorsichtig ohne Absaugen der Zellschicht.
    3. 10 ml Kollagenase IV Lösung, übertragen die Zellen in ein 50 ml-Röhrchen und Inkubation der Zellen bei 37 ° C für 5 min.
    4. Gründlich mischen die Suspension durch Auf- und Abpipettieren 10 Mal und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 min. Eine Suspension von kleinen Clustern auftreten sollte. Wenn es noch große Teile der Schicht nach links, dann 2.8.4 noch zwei weitere Male wiederholen Schritt.
    5. Mit 20 ml PBS und zentrifugieren für 10 min bei 300 x g.
    6. Saugen Sie die PBS sorgfältig.
      HINWEIS: Wenn iSABs sind erzeugt mit Schritt 2.8.7 werden. Wenn ISAB abgeleitete Sinusknoteneinzelzellen erzeugt werden sollen weiter mit Schritt 2.9.
    7. Suspend die Zellenin 12 ml Differenzierungsmedium, das 400 ug / ml G418 und entkernen auf 6 Vertiefungen von Gelatine 24 Vertiefungen (2 ml / Vertiefung).
  9. Generierung von Einzelknotenzelle.
    1. Aussetzung der Zellen aus Schritt 2.8.6 in 5 ml Accutase und bei 37 ° C für 5 min.
    2. Gründlich mischen die Suspension durch Auf- und Abpipettieren 10 Mal und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C für 5 min.
    3. Mit 20 ml PBS und Zentrifuge 5 min bei 300 x g.
    4. Die Zellen in 12 ml Differenzierungsmedium, das 400 ug / ml G418 und entkernen auf 6 Vertiefungen einer Gelatine 24 Vertiefungen (2 ml / Vertiefung).
  10. Tag 2 nach der Dissoziation, saugen Sie den mittleren und waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. 1 ml Differenzierungsmedium / well.
  11. Tag 4-8 nach der Dissoziation, jeden 2. Tag ändern Medium. Am Tag 10 nach der Dissoziation Verwendung iSABs oder ISAB abgeleitete Sinusknoteneinzelzellen sind zur weiteren Analyse zur Verfügung.

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Representative Results

Das beschriebene Protokoll ermöglicht Generation iSABs mit einer Schlagfrequenz von etwa 450 bpm von PSCs (im Film dargestellt), die in der Nähe ist es, die Maus Herzschlagfrequenz. Nach Dissoziation iSABs (Schritt 2.8.8) die beobachteten Einzelzellen zeigen eine typische Form der Zellen der Sinusknoten (Spindel und Spinnenzellen), wie in Abbildung 1 dargestellt. Diese Zellen hoch Proteine ​​exprimieren, die bekannt sind für die Funktion zu sein, des Sinusknotens wie hyperpolarisations-aktivierten durch zyklische Nukleotide gesteuerten Kationenkanal 4 (HCN4) Connexin45 (Cx45) Connexin30.2 (Cx30.2) und Myh6 (2A - C). Nach der Behandlung des ISAB abgeleiteten Zellen mit Arzneimitteln, die Zellen zeigen das erwartete Verhalten: wie im Sinusknoten, der lustige Kanalblocker ZD7288 (3A) sowie die Muscarin-Rezeptor-Agonist Carbachol (3B), die beide zu einer deutlich reduzierten Schlagen Häufigkeit des ISAB derivED-Zellen. Die β-Adrenorezeptoragonisten Isoprenalin führt zu einer erhöhten Schlagfrequenz (3C).

Figur 1
Abbildung 1: Cellular Form der Spindel und Spinnenzellen Typische Zellform des ISAB abgeleitet Spindel (A) und Spinne (B) Knotenzelle. Maßstabsbalken 20 um.

Abbildung 2
Abbildung 2: Die Expression von Sinusknoten-Marker. (A) Expression von HCN4 (gelb) und Cx45 (magenta), (B) Expression von Cx45 (magenta) und Cx30.2 (gelb) und (C) Myh6 (magenta) in Sinusknotenzellen. Gegenfärbung der Zellkerne (türkis). Maßstabsbalken 20 um.


Abbildung 3: Pharmakologische Behandlung iSABs Repräsentative Schlagfrequenz des iSABs vor (Kontrolle) und nach der Behandlung mit ZD7288 (A), Carbachol (B) und Isoprenalin (C). Die Daten stellen acht unabhängige iSABs und sind als Mittelwert ± SD dargestellt. *** P <0,001

4
Abbildung 4: Schematische Darstellung der Differenzierung Protokoll. Vereinfachte Cartoon spiegelt die experimentellen Flussdiagramm für ISAB Generation.

Film:. Beating von iSABs Schlagen eines typischen induzierten Sinuskörper (ISAB) nach der Dissoziation Please klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen.

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Discussion

Die Fähigkeit zur Produktion von Stammzell eine Herzschrittmacherzellen kann Rekonstitution der richtigen Herzrhythmus in dem Sinne von "biologischen Schrittmacher" ermöglichen. Ebenso wird Drogentests in vitro von deren Verfügbarkeit profitieren. PSCs können zu jedem Zelltyp des Säugetierkörpers einschließlich Herzmuskelzellen mit Herzschrittmacher Zelleigenschaften 8,9,10,11,12,13 geben. Allerdings, in der Regel die Zellpopulationen im "Embryoid Bodies" sind sehr heterogen, was zwangsläufig zu der Forderung nach zuverlässigen Selektion und Isolierung Strategien - das gilt insbesondere für die sehr seltenen Zelltyp von Herzknotenzellen. Zahlreiche Ansätze, die auf exogene und endogene Oberflächenmarkierungen 14, auf pharmakologische Verabreichung von kleinen Molekülen 15,16,17 und auf direkte Umprogrammierung Strategien 18,19 befolgt wurden. Außerdem Nichtstammzell-basierte Ansätze zu emulieren biologischen Schrittmacher gerichtetüber Manipulation von Terminal statt de novo sarkolemmalen Elektro zugrunde liegenden Erzeugung voll funktionsfähige Knotenzellen 20,21 Effektormoleküle.

Doch keine der beiden kam mit den erforderlichen hohen spontanen Kontraktion Frequenzen und Mobilfunk Reinheit. Im Gegensatz dazu führt unser Protokoll zu Zellen, die nicht nur nicht aufweisen elektrische Schwingungen, sondern auch die feinen elektrophysiologischen und Calcium-Signalgebung Eigenschaften sowie Scheidungs ​​morphologischen Merkmale endogenen Schrittmacherzellen 7. Diese Technologie kann eine wichtige Voraussetzung für Alternativen zur elektronischen Stimulationsgeräte zu werden.

Obwohl dieses Protokoll wurde während seiner Entwicklung optimiert, gibt es noch einige Schritte, die zu Problemen führen kann: Der Ausgangspunkt für die Auswahl von ISAB kritisiert das Protokoll. Schlagen der Zellen ist ein Indikator für die & alpha; MHC-Expression in differenzierenden Zellen. Myh6-Expression geht einher mit Ex-pression der G418-Resistenz-Gen. Starten Sie die Auswahl noch zu früh, eine Menge der Zellen, würde möglicherweise zu Kardiomyozyten zu differenzieren und daher die Gesamtausbeute des Sinusknotenzellen verringern löschen. Ein weiterer wichtiger Schritt ist die Dissoziation der Zellschicht (Schritt 2.8). Der Grund dafür ist, dass die Zellen bilden eine robuste extrazellulären Matrix und eine starke Kraft notwendig ist, um die Zellschicht zu trennen. Falls erforderlich, sollte Schritt 2.8.4 bis kleine Gruppen von Zellen aus der Zellschicht entwickelt wiederholt werden. Vermeiden Sie direkte Dissoziation des Zellschicht von zB Trypsin, weil es erwies sich als eine sehr geringe Effizienz sein.

Für zukünftige klinische Anwendungen, müssen die folgenden Hindernisse noch zu richten an: die Übertragung des Konzepts auf die Herstellung von menschlichen iSABs die ein wichtiger Schritt in Richtung Zukunft Zelltherapie und in-vitro-Drogen-Tests werden kann. Auch ist die Technik noch auf stabile genetische modifi basierendKationen von PSCs und daher müssen geändert werden, bevor sie den Patienten aufgebracht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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