Myh6 발기인 - 선택과 함께 ES-세포 프로그래밍을 바탕으로 설치류 심장 페이스 메이커 세포 집합체의 생성

Developmental Biology

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Summary

이 프로토콜은 쥐의 다 능성 줄기 세포 (PSC)에서 기능 동 노드 조직을 생성하는 방법에 대해 설명합니다. T-Box3 (TBX3) 과발현 플러스 심장 미오신 헤비 체인 (My​​h6) 발기인 항생제 선택은 고순도의 페이스 메이커 세포 집합체로 연결됩니다. 이러한 "유도 - 동방 - 몸"( "iSABs")는, 고도의 박동 속도를 증가 보여 80 %의 심장 박동 세포를 포함하고 심근 생체 조절이 할 수 있습니다.

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

"아픈 부비동 증후군 '의 치료는 인공 심장 박동기를 기반으로합니다. 여기에는 배터리 오류 및 감염 등의 위험을 부담. 또한, 그들은 호르몬 응답이 부족하고 전반적인 절차는 비용 집약적이다. PSC를에서 생성 된 "생물 페이스 메이커"는 대안이 될 수있다, 아직 배아의 몸에서 심장 박동 조절 세포의 일반적인 내용 (사채)는 매우 낮다. 설명 프로토콜은 Myh6 발기인 기반 항생제 선택과 부비동 노드 유도의 TBX3을 통해 쥐의 PSC를의 "앞으로 프로그래밍"을 결합합니다. 이> 80 % 생리 학적 기능성 페이스 메이커 세포의 일관된 심근 집계를 산출한다. 이러한 "유도 동방-몸은"( "iSABs") 자발적으로 마우스 마음에서 고립 마디 세포에 해당 아직 미전도 주파수 (400 ~ 500 BPM)에서 계약과 쥐의 심근 생체 조절이 할 수 있습니다. 설명 프로토콜 고순도의 동을 사용하여절점 단셀 약물은 시험 관내 시험을 위해 사용될 수있는 예를 생성 할 수있다. 또한,이 프로토콜에 따라 생성 된 iSABs 심장 조직 공학을 향한 중요한 단계가 될 수 있습니다.

Introduction

용어 "아픈 부비동 증후군은"심장 맥박 조정기 시스템의 악화로 이어지는 여러 질병을 요약 한 것입니다. 그것은 병적 인 증상이 동 서맥, 동방 블록, 부비동 체포뿐만 아니라 빈맥 - 서맥 증후군을 포함한다. 이로써, "아픈 부비동 증후군"은 종종 심근 허혈, 심근 병증 심근염 또는 일반적으로 심장 질환을 수반한다. 현재 치료 방법은 전기 맥박 조정기의 주입을 기반으로합니다. 그러나,이 같은 감염과 배터리 고장 등의 위험 번호와 함께 간다. 전반적으로, 합병증의 발생률은 여전히​​ 환자가 인공 심장 박동기를 이식하는 데에 매우 높습니다. 내인성 박동기 반대로 더욱이, 이러한 장치는 호르몬 자극에 반응하지 않는다.

미래의 대안이되는 PSC를가 봉사 할 수 있었다 "생물학적 페이스 메이커"의 가용성에 의존 할 수있다적합한 셀룰러 소스와 어떤으로 또한 체외 약물 검사에 매우 유용 할 것입니다. 그러나, 큰 문제가 배아 체 (사채) 내에서 동 노드 세포의 매우 드문 모양에있다 - 이것은 일반적으로 ~ 0.5 % 1을 초과하지 않는다.

이전에는 특정 심근 서브 타입을 향해 "앞으로 프로그래밍"등 관련 중배엽 - 별 후방 1 (MesP1) 및 NK2 전사 인자 궤적 5 (Nkx2.5) 2와 별개의 조기 심장 혈관 전사 인자의 과발현을 통해 가능하다 것으로 나타났다, 3. 보통 크기와 동방 노드 (SAN)의 기능을 위해, T-박스 전사 인자 TBX3는 페이스 메이커 유전자 프로그램을 개시하고 SAN (4)의 분화를 제어하기 위해 도시 된, 결정적이다. 이는 기능상 박동기 세포의 모양을 개선하면서, 콘텐츠는 여전히 전체 cardiomyocytic 세포 집단 내에서 ~ 40 %를 초과하지 않았다.

따라서, 추가 Myh6 발기인 기반 항생제 선택 5 단계를 우리가 도입되었다. 체외 배양에 쥐 심장의 사람들과 비교를 근사 처음으로 체외에서 높은 증가 박동 주파수 (> 400 BPM)를 전시; 이것은 궁극적으로 아직 관찰되지 심근 집계 (iSABs ""유도 된 중국 - 심방 기관 ")에 리드 쥐의 심장 (6)에서 분리 된 동 결절 세포. 이소 프레 날린 관리에서 550 BPM 심지어 구타 주파수를 얻을 수있다. 특히, iSABs 7을 분석하여 광범위한 생리에서 명백한 바와 같이 80 % 이상 기능 림프절 세포로 구성되어 있습니다. 최근, 다양한 접근이 직접 리 프로그래밍 (19)을 이용하여 상악동에게 결절 세포를 생성하기 위해, 표면 (16, 17)에 대하여 설명 하였다 소분자 약물 치료 14 또는 마커. 그러나, 이러한 방법 중 어느 것도 페이스 메이커 세포의 이러한 높은 순도 주도하지 않고 쥐에 가까운 주파수를 치고 그예술 iSABs에서 관찰.

또한, 자신의 자율 박동 활동을 잃었다 재배 성인 마우스 심실 조각의 생체 모델, iSABs는 슬라이스 조직으로 통합하여 자발적으로 활성 남아있는 견고하게 수축 7 심장 조각을 페이싱 할 수있다. 이 iSABs의 생성에 대한 자세한 프로토콜은이 문서에 설명되어 있습니다.

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Protocol

1. 권장 사항 시작하기 전에

  1. 그들은 동방 결절 세포로 제대로 구분하지 않기 때문에 마이코 플라즈마 오염 PSC를 사용하지 마십시오. 프로토콜을 시작하기 전에 마이코 플라스마 오염에 대한 테스트합니다. 마이코 플라즈마 신속, 고감도 검출을위한 PCR 키트를 사용하여이 작업을 수행하고 제조자의 프로토콜을 따르십시오.
  2. 각 페트리 접시 (단계 2.3.4), 코트 한 10cm 37 ° C에서 1 시간 동안 차가운 물에 물고기 피부에서 멸균 7 ml의 0.1 % 젤라틴 2 세포 배양 접시하십시오. 멸균 벤치에서 무균 조건에서 요리 건조 젤라틴을 제거 할 수 있습니다.
  3. 포유 동물 발현 벡터를 사용하여 TBX3의 난) 구성 적 과발현 : 당신이 분화 프로토콜을 시작하기 전에 다음과 같은 기능을 포함하는 이중 형질 전환 안정된 마우스 ES 세포주 클론이 필요합니다. ⅱ) Myh6 촉진제 (5)의 제어하에 G418 내성 유전자.
  4. PSC를 미분화 세포 공동 배양되어야설명 1 표준 조건에서 조사 피더 세포와 D.

2. 차별화 절차

  1. 두 일 분화하기 전에 - 피더 세포에서 PSC를 제거합니다.
    1. 10 ml의 포스페이트 완충 식염수 PBS로 세포를 세척 매체 기음 7 ㎖의 콜라게나 제 IV의 용액을 첨가하고, 37 ° C에서 10 분 동안 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다.
    2. 조심스럽게 PSC 식민지를 씻어 위아래로 5 번 콜라겐 솔루션을 피펫 팅 (피더 세포를 제거하는 방지).
    3. , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송 8 ml의 PBS로 세 번 필터를 헹군다. 필터 주변에 돌고 거꾸로 페트리 접시에 놓습니다. 필터의 바닥에 10 ml의 PBS를 피펫 팅하여 PSC 세포 식민지를 제거합니다.
    4. 300 x g에서 5 분 동안 15 ml의 원심 분리 튜브에 세포 현탁액을 전송.
    5. 1 ml의 Accutase 그리고 난에 세포를 일시 중지, PBS를 제거5 분 37 ° C에서 ncubate.
    6. 10 ml의 PBS를 추가 X g 300에서 5 분 동안 아래로 5 회 원심 분리기를 그것을 피펫 팅에 의해 셀 솔루션을 섞는다.
    7. 상기 PBS를 제거 10 ㎖ 배양 배지에서 세포를 중단하고 세포 수를 결정한다.
    8. 종자 15,000 세포 / 75cm 2 필터 플라스크에 2 cm, 37 ° C, 5 % CO2에서 2 일간 배양 그들을. 이일 후 플라스크에 50-70 %의 합류해야합니다.
  2. 0 일 - 차별화의 시작
    1. 매체를 제거하고 10 ml의 PBS로 세포를 씻어.
    2. , PBS 대기음 2ml의 Accutase을 추가 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 50 ML 튜브에 멸균 40 μm의 필터를 놓습니다.
    3. , 40 μm의 필터에 세포 현탁액을 전송하고, 10 ㎖의 PBS를 추가 10 ㎖의 PBS를 첨가하고 원심 분리기를 통해 필터 린스 관류 300 x g에서 5 분간.
    4. 10 ㎖ 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 세포 수를 결정한다.
    5. t을 희석그는 20,000 세포 / ml의 최종 농도로 분화 배지 현탁액 전지.
    6. 피펫 20 ml의 물과 HDS는 건조 아웃을 피하기 위해 차 배양 접시에서 드롭 (HD) 솔루션을 걸려 5 ml의.
      참고 : 각 24 웰 플레이트 포함 iSABs 16 페트리 접시로 시작 (섹션 2.8.6.4/2.8.7 참조​​).
    7. 트레이에 50 ml의 세포 현탁액까지 피펫.
    8. 페트리 접시의 뚜껑 주위를 돌립니다. 12 채널 피펫을 사용하여 뚜껑에 180 HDS는 각각의 포함 20 μL (400 셀 / HD) 세포 현탁액을 놓습니다.
    9. 조심스럽게 뚜껑 돌아서과 페트리 접시에 놓습니다.
      주 : 덮개의 주위를 선회 속도가 매우 중요하다. 뚜껑이 너무 느리거나 너무 빠른 바꾸게되면, 세포 현탁액의 표면 장력이 걸려 뚜껑에 삭제 유지할만큼 충분히 높지 않다. 매체의 20 μl의 방울과 뚜껑 주위를 선회 처음 연습 HDS는 생산하기 전에.
    10. (3)에 2 일 동안 세포 배양7 ° C, 5 % CO 2는 그들이 사채를 형성 할 수있다.
      참고 : 5 페트리 접시의 스택의 상단에 물이 가득 배치 한 페트리 접시. 그렇지 않으면 상위 페트리 접시에 HD 건조합니다.
  3. 2 일
    1. 조심스럽게 차 페트리 접시의 뚜껑 주위를 켜고 50 ㎖ 튜브에 두 개의 배양 접시 (360 사채)에서 파생 된 사채를 전송합니다.
    2. 사채는 튜브의 아래쪽에 정착하자 10 분을 기다립니다 (EB를 원심 분리하지 마십시오).
    3. 대기음 극력 매체로서, 10 ㎖ 분화 배지에서 EB를 중단하고 10cm 페트리 접시에 현탁액을 전송.
  4. 하루 2-6 서스펜션 문화
    1. 37 ° C에서 4 일 동안 정학의 사채를 양성, 5 % CO 2는 2 일 후 매체를 변경합니다.
      주 : EBS는 종종 표면에 부착 (세포 배양 접시는 대조적으로) 배양 접시에 도포되지 않더라도. EB를 부착 사채 매일 매일 필요한 경우 분리 배양 접시를 제어부드러운 피펫 팅에 의해 표면에서. 옵션 : 현탁 배양 기간 동안 지속적으로 배양 접시를 흔들어. 셰이커의 속도에주의하십시오. 사채는 어느 쪽도 중간에 축적되지도 배양 접시의 테두리에 떠 있어야합니다.
  5. 6 일
    1. 한 젤라틴 코팅 10cm 2 세포 배양 접시에 하나의 배양 접시에서 사채를 전송합니다.
  6. 하루 7-12
    1. 세포 8-12 일 후에 이길 시작해야합니다. 매일 현미경으로 세포의 초점을 치고 있는지 확인합니다. 세포는 층을 형성하기 시작한다.
    2. 매체 매일을 변경합니다.
      주 : 매체를 변경 한 후, 세포를 복구하고 다시 박동 3-4 시간을 필요로한다.
  7. 동 노드 세포의 날 12 ~ 15 선택.
    1. 세포 (12 ~ 15 일 정도) 꺾고 사흘 시작한 후, 세포에 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 신선한 배지 분화 배지 10 ml의 피펫 대기음.
  8. 주 : 세포층 이미 표면으로부터 분리되는 것이 가능하다.
    1. 셀 층을 흡입하지 않고 신중하게 매체를 제거합니다.
    2. PBS의 10 ML을 추가하고 세포 층을 흡입하지 않고 조심스럽게 PBS를 제거합니다.
    3. 50 ㎖ 튜브에 세포를 전송하고, 5 분 동안 37 ° C에서 배양 한 세포를 콜라게나 제 IV 용액 10 ㎖를 추가한다.
    4. 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다. 작은 클러스터의 정지가 발생한다. 여전히 남아 층의 큰 부분이 있으면, 단계 2.8.4을 두 번 더 반복한다.
    5. 300 x g에서 10 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다.
    6. PBS를주의 깊게 기음.
      참고 : iSABs 단계 2.8.7을 계속 생성 될 경우. ISAB 파생 동 마디 하나의 세포가 생성 될 경우 단계 2.9에 이동합니다.
    7. 세포를 일시12 ㎖에 분화 배지는 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 코팅 된 젤라틴과 6 웰 24 웰 (/ 웰 2 ㎖)에 그들을 시드.
  9. 단일 노드 세포의 생성.
    1. 5 ㎖ Accutase 단계 2.8.6에서 세포를 일시 중단하고, 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
    2. 격렬하게 피펫 팅하여 10 배의 아래 현탁액을 혼합하고, 5 분 동안 37 ℃에서 세포를 배양한다.
    3. 300 x g에서 5 분 동안 20 ㎖의 PBS와 원심 분리기를 추가합니다.
    4. 400 ㎍ / ㎖의 G418을 함유하는 12 ml의 분화 배지에서 세포를 일시 중단하고 24 웰 (2 ㎖ / 웰) 코팅 젤라틴 6 웰 그들을 시드.
  10. 분리 후 제 2 일, 매체를 대기음하고 PBS로 세포를 세 번 씻는다. 잘 / 1 ml의 차별화 매체를 추가합니다.
  11. 하루 4-8 분리 후, 매 2 일 중간을 변경합니다. 해리 사용 iSABs 또는 ISAB 파생 동 후 10 일에 마디 하나의 세포는 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

설명 프로토콜은 마우스의 심장 박동 주파수에 가까운 (동영상 참조) PSC를에서 약 450 BPM의 구타 주파수 iSABs의 생성을 할 수 있습니다. 도 1에 도시 된 바와 같이 iSABs 해리 (단계 2.8.8) 후에 관찰 된 단일 세포는 동방 결절 (주축 및 거미 세포)의 세포의 일반적인 형태를 나타낸다. 이들 세포를 알려진 고도로 익스프레스 단백질 기능에 필수적인 것으로 과분극 활성화 주기적 뉴클레오티드 문이 양이온 채널 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2)과 Myh6 (- C 그림 2A)와 같은 동방 결절의. 파마 ISAB 유래 세포의 처리 후, 세포는 예상되는 동작을 보여 동방 결절 에서처럼 재미 채널 차단제 ZD7288 (도 3a)뿐만 아니라, 무스 카린 수용체 작용제 카바 콜 (도 3B)가 모두 상당히 감소 매질을 일으킬 ISAB deriv의 주파수에드 셀. β - 아드레날린 수용체 작용제 이소 프레 날린는 상승 박동 주파수 (그림 3C)에 연결됩니다.

그림 1
그림 1 : 스핀들과 거미 세포 ISAB 파생 스핀들 (A)과 거미 (B) 림프절 세포의 전형적인 세포 모양의 세포 모양. 스케일 바 20 μm의.

그림 2
그림 2 : 동방 결절 마커의 발현. (A) (노란색) HCN4과 Cx45 (마젠타), 동방 결절 세포에서 Cx45 (마젠타) 및 (노란색) Cx30.2의 (B) 식 및 (C) Myh6 (마젠타)의 발현. 핵 (turquois)의 대조 염색. 스케일 바 20 μm의.


그림 3 : 약리 iSABs 대표의 처리 (제어) 전에 iSABs의 주파수를 치고 ZD7288 (A), 카르 바콜 (B) 및 이소 프레 날린 (C)와 치료 후. 데이터를 8 iSABs을 대표하고 평균 ± SD으로 표시하고 있습니다. *** p <0.001

그림 4
그림 4 : 분화 프로토콜의 개략도. ISAB 생성을위한 실험 흐름도를 반영 단순화 된 만화.

영화 :. 분리 후 일반적인 유도 동방 몸 (ISAB)의 iSABs 구타의 구타 호소SE는이 비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

능력 "생물학적 박동기"의 의미로 적절한 심박동의 재구성을 허용 할 수있다 세포 유래 심장 페이스 메이커의 줄기 세포를 생성한다. 마찬가지로, 시험관 내에서 약물 검사는 가용성 도움이됩니다. PSC를 페이스 메이커의 셀 속성 8,9,10,11,12,13와 심근을 포함한 포유 동물의 신체의 세포 유형을 야기 할 수 있습니다. 그러나, 전형적으로 "배양체"내의 세포 집단은 필연적으로 안정적인 선택 및 분리 전략을 요구 이르게 매우 이질적이다 - 이것은 심장 세포의 노달 매우 드문 세포 유형에 특히 적용된다. 외인성 및 내인성 표면에 따라 다양한 접근 방법이 작은 분자 15,16,17의 약물 투여와 18, 19가 되어져있는 직접 리 프로그래밍 전략, 14 마커. 또한, 비 - 줄기 세포 - 기반 접근법은 생물학적 박동기 에뮬레이션 겨냥완전한 기능 마디 세포 (20, 21)를 대신 드 노보의 sarcolemmal 전기 생리학의 기초가 생성 터미널 이펙터 분자의 조작을 통해.

그러나, 이들 중 어느 것도 필요한 자발 수축 주파수와 세포 순도를 내놓았다. 반면에, 우리의 프로토콜은 전기 진동뿐만 아니라 미세한 전기 생리 칼슘 시그널링 특성뿐만 아니라 내인성 박동기 셀 (7)의 독특한 형태 학적 특징을 나타내지 않는다 셀 리드. 이 기술은 전자 페이싱 장치에 대한 대안을위한 중요한 전제 조건이 될 수 있습니다.

이 프로토콜이 개발 중에 최적화되었지만, 여전히 문제가 발생할 수있는 몇 가지 단계 : ISAB의 선택을위한 출발점이 프로토콜의 핵심이다. 세포의 박동 세포 분화에 αMHC 표현하는 지표입니다. Myh6 표현은 예와 함께 간다G418 내성 유전자의 Pression의. 너무 일찍 선택을 시작하는 것은 잠재적으로 심근 세포로 분화 것 때문에 동 마디 세포의 전반적인 수율을 감소 세포를 많이 소화합니다. 또 다른 중요한 단계 세포층 (단계 2.8)의 해리이다. 그 이유는 세포가 강력한 세포 외 매트릭스를 형성하고 강한 힘이 세포층을 해리 할 필요가 있다는 것이다. 필요한 경우, 단계 2.8.4 세포의 작은 클러스터가 세포층으로부터 개발 될 때까지 반복되어야한다. 매우 낮은 효율로 밝혀졌다 때문에 예를 들어, 트립신에 의한 세포 층의 직접 분해하지 마십시오.

미래의 임상 적용의 경우, 다음과 같은 장애물은 여전히 해결해야 할 : 미래를 향해 세포 치료 약물 및 시험 관내 테스트에서 중요한 단계가있다 iSABs 인간의 생성 방법의 전입. 또한, 기술은 여전히​​ 안정한 유전 적 변형을 분석에 기초이 환자에 적용 할 수 있기 전에 PSC를 따라서 그리고 양이온은 수정 될 필요가있을 것이다.

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Disclosures

저자가 공개하는 게 없다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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