Myh6-प्रमोटर-चुनाव के साथ संयोजन में ते सेल प्रोग्रामिंग पर आधारित Murine कार्डियक पेसमेकर सेल समुच्चय का सृजन

1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy, University of Rostock
Developmental Biology

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Summary

इस प्रोटोकॉल murine स्टेम सेल (पीएससी) से कार्यात्मक साइनस नोडल ऊतक का निर्माण करने के लिए कैसे करें। टी Box3 (TBX3) overexpression प्लस हृदय मायोसिन- भारी श्रृंखला (Myh6) प्रमोटर एंटीबायोटिक चयन अत्यधिक शुद्ध पेसमेकर सेल समुच्चय की ओर जाता है। ये "प्रेरित सिनोट्रायल-निकायों" ("iSABs"), अत्यधिक पिटाई दरों में वृद्धि हुई दिखाने के 80% से अधिक पेसमेकर कोशिकाओं होते हैं और मायोकार्डियम पूर्व vivo गति करने में सक्षम हैं।

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Rimmbach, C., Jung, J. J., David, R. Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection. J. Vis. Exp. (96), e52465, doi:10.3791/52465 (2015).

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Abstract

"बीमार साइनस सिंड्रोम" का उपचार कृत्रिम पेसमेकर पर आधारित है। ये ऐसे बैटरी की विफलता और संक्रमण के रूप में खतरों सहन। इसके अलावा, वे हार्मोन जवाबदेही की कमी है और समग्र प्रक्रिया लागत गहन है। पीएससी से उत्पन्न "जैविक पेसमेकर" एक विकल्प बन सकता है, अभी तक embryoid निकायों में पेसमेकर कोशिकाओं के विशिष्ट सामग्री (ईबीएस) बेहद कम है। वर्णित प्रोटोकॉल Myh6-प्रमोटर आधारित एंटीबायोटिक चयन के साथ साइनस नोड inducer के TBX3 के माध्यम से murine पीएससी की "आगे प्रोग्रामिंग" को जोड़ती है। यह> 80% physiologically कार्यात्मक पेसमेकर कोशिकाओं के अनुरूप cardiomyocyte समुच्चय पैदावार। ये "प्रेरित-सिनोट्रायल-निकायों" ("iSABs") अनायास माउस दिलों से अलग नोडल कोशिकाओं को इसी अभी तक दूर दराज आवृत्तियों (400-500 बीपीएम) में करार और murine मायोकार्डियम पूर्व vivo गति करने में सक्षम होते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल अत्यधिक शुद्ध साइनस का प्रयोगनोडल एकल कक्षों में इन विट्रो दवा परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जैसे उत्पन्न किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पन्न iSABs दिल ऊतक इंजीनियरिंग की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है।

Introduction

शब्द "बीमार साइनस सिंड्रोम" कार्डियक पेसमेकर प्रणाली की गिरावट जाने वाले अनेक रोगों का सार। यह रोग, लक्षण साइनस मंदनाड़ी, सिनोट्रायल ब्लॉक, साइनस की गिरफ्तारी के साथ ही क्षिप्रहृदयता-मंदनाड़ी सिंड्रोम शामिल हैं। इस प्रकार, एक "बीमार साइनस सिंड्रोम" अक्सर इस तरह के एक इस्कीमिक हृदय रोग, cardiomyopathies या मायोकार्डिटिस के रूप में सामान्य हृदय रोगों के साथ है। वर्तमान में, चिकित्सकीय दृष्टिकोण बिजली पेसमेकर का प्रत्यारोपण पर आधारित हैं। हालांकि, इस तरह के संक्रमण और बैटरी विफलता के रूप में जोखिम के एक नंबर के साथ साथ चला जाता है। कुल मिलाकर, जटिलताओं की घटना अभी भी मरीजों के लिए एक कृत्रिम पेसमेकर प्रत्यारोपित होने में बहुत अधिक है। अंतर्जात पेसमेकर के लिए विरोध के रूप में इसके अलावा, इन उपकरणों हार्मोन उत्तेजना का जवाब नहीं है।

एक भविष्य वैकल्पिक जिसके लिए पीएससी की सेवा कर सकता "जैविक पेसमेकर" की उपलब्धता पर निर्भर हो सकता हैएक उपयुक्त सेलुलर स्रोत और के रूप में जो भी इन विट्रो दवा के परीक्षण के लिए अत्यधिक मूल्यवान होगा। फिर भी, एक बड़ी समस्या embryoid निकायों (ईबीएस) के भीतर साइनस नोडल कोशिकाओं की बहुत दुर्लभ उपस्थिति में निहित है - यह आमतौर पर ~ 0.5% एक से अधिक नहीं है।

इससे पहले, यह विशिष्ट cardiomyocyte उपप्रकार की ओर "आगे प्रोग्रामिंग" इस तरह संबंधित mesoderm-विशेष के पीछे एक (MesP1) और NK2 प्रतिलेखन कारक, ठिकाना 5 (Nkx2.5) के रूप में 2 अलग जल्दी हृदय प्रतिलेखन कारक की overexpression के माध्यम से संभव है कि दिखाया गया था, 3। सामान्य आकार और सिनोट्रायल नोड (सैन) के समारोह के लिए, टी बॉक्स प्रतिलेखन कारक Tbx3 पेसमेकर जीन कार्यक्रम आरंभ करने के लिए और सैन 4 के भेदभाव को नियंत्रित करने के लिए दिखाया गया है, जो महत्वपूर्ण है। इस कार्यात्मक पेसमेकर कोशिकाओं की उपस्थिति को बढ़ाया है, जबकि सामग्री अभी भी पूरे cardiomyocytic सेल आबादी के भीतर ~ 40% से अधिक नहीं था।

इसलिए, एक अतिरिक्त Myh6-प्रमोटर आधारित एंटीबायोटिक चयन चरण 5 हमारे द्वारा पेश किया गया था। इन विट्रो की खेती करने के लिए एक murine दिल के उन लोगों और तुलनीय approximating पहली बार के लिए इन विट्रो में अत्यधिक वृद्धि हुई पिटाई आवृत्तियों (> 400 बीपीएम) दिखा रहे हैं, जो; यह अंततः अभी तक अप्रत्यक्ष cardiomyocyte समुच्चय (iSABs "" प्रेरित चीन आलिंद निकायों ") की ओर जाता है एक murine दिल 6 से अलग साइनस नोडल कोशिकाओं। Isoprenaline प्रशासन के तहत 550 धड़कन प्रति मिनट की भी पिटाई आवृत्तियों प्राप्त कर रहे हैं। विशेष रूप से, iSABs 7 का विश्लेषण करती है व्यापक शारीरिक से स्पष्ट रूप में 80% से अधिक कार्यात्मक नोडल कोशिकाओं से मिलकर बनता है। हाल ही में, कई दृष्टिकोण प्रत्यक्ष reprogramming 19 का उपयोग कर साइनस नोडल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए, सतह 16,17 वर्णित किया गया छोटे अणुओं के साथ 14 या औषधीय उपचार मार्करों। फिर भी, इन तरीकों में से कोई पेसमेकर कोशिकाओं के इस तरह के एक उच्च शुद्धता के लिए नेतृत्व और murine के करीब आवृत्तियों पिटाई वहकला iSABs में मनाया जाता है।

इसके अलावा, उनके सहज पिटाई गतिविधि को खो दिया है, जो खेती वयस्क माउस निलय स्लाइस की एक पूर्व vivo मॉडल में, iSABs, टुकड़ा ऊतक में एकीकृत जिससे अनायास सक्रिय शेष और मजबूती के साथ संकुचन से 7 दिल स्लाइस पेसिंग करने में सक्षम हैं। इन iSABs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल इस पत्र में वर्णित है।

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Protocol

1. सिफारिशें शुरू करने से पहले

  1. वे साइनस नोड कोशिकाओं में ठीक से अंतर नहीं होगा क्योंकि माइकोप्लाज्मा के साथ दूषित पीएससी का प्रयोग न करें। प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए टेस्ट। Mycoplasmas की तेजी, अत्यधिक संवेदनशील पता लगाने के लिए एक पीसीआर किट का उपयोग कर यह करो और manufacturer`s प्रोटोकॉल का पालन करें।
  2. प्रत्येक पेट्री डिश (कदम 2.3.4), कोट एक 10 सेमी 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए ठंडे पानी की मछली की त्वचा से बाँझ 7 मिलीलीटर 0.1% जिलेटिन के साथ 2 सेल संस्कृति डिश के लिए। एक बाँझ बेंच में बाँझ शर्तों के तहत पकवान सूखा जिलेटिन निकालें और दें।
  3. एक स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग कर TBX3 i) विधान अधिक अभिव्यक्ति: यदि आप भेदभाव प्रोटोकॉल शुरू कर सकते हैं इससे पहले कि आप निम्न सुविधाओं से युक्त एक डबल ट्रांसफ़ेक्ट स्थिर माउस ES सेल लाइन क्लोन की जरूरत है। Ii) Myh6-प्रमोटर 5 के नियंत्रण के तहत G418 प्रतिरोध जीन।
  4. समान पीएससी कोशिकाओं सह-खेती की जानी चाहिएवर्णित एक मानक के रूप में शर्तों के तहत विकिरणित फीडर कोशिकाओं के साथ डी।

2. भेदभाव प्रक्रिया

  1. दो दिनों के भेदभाव से पहले - फीडर कोशिकाओं से पीएससी निकालें।
    1. , 10 एमएल फॉस्फेट बफर खारा पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने, मध्यम Aspirate 7 मिलीलीटर Collagenase चतुर्थ समाधान जोड़ने और 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक बाँझ 40 माइक्रोन फिल्टर रखें।
    2. ध्यान से पीएससी कालोनियों कुल्ला ऊपर और नीचे 5 बार collagenase समाधान pipetting द्वारा (फीडर कोशिकाओं को हटाने के लिए बचने के लिए)।
    3. एक 40 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण 8 मिलीलीटर पीबीएस के साथ फिल्टर तीन बार कुल्ला। फिल्टर चारों ओर मुड़ें और उल्टा एक पेट्री डिश में जगह है। फिल्टर की तह तक 10 मिलीलीटर पीबीएस pipetting द्वारा पीएससी सेल कालोनियों निकालें।
    4. 300 x जी पर 5 मिनट के लिए एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र सेल निलंबन स्थानांतरण।
    5. 1 मिलीलीटर Accutase और मैं में कोशिकाओं को निलंबित, पीबीएस निकालें5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर ncubate।
    6. , 10 एमएल पीबीएस जोड़ें x जी 300 पर 5 मिनट के लिए नीचे 5 बार और सेंट्रीफ्यूज यह ऊपर pipetting और से सेल समाधान मिश्रण।
    7. पीबीएस निकालें 10 मिलीलीटर की खेती मध्यम में कोशिकाओं को निलंबित और सेल नंबर निर्धारित करते हैं।
    8. बीज 15,000 कोशिकाओं / 75 2 सेमी फिल्टर कुप्पी पर 2 सेमी और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में 2 दिनों के लिए उन्हें खेती। दो दिनों के बाद कुप्पी 50-70% मिला हुआ होना चाहिए।
  2. दिवस 0 - भेदभाव का प्रारंभ
    1. मध्यम निकालें और 10 एमएल पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    2. पीबीएस Aspirate 2 मिलीलीटर Accutase जोड़ने और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में एक बाँझ 40 माइक्रोन फिल्टर रखें।
    3. 40 माइक्रोन फिल्टर करने के लिए सेल निलंबन हस्तांतरण, 10 एमएल पीबीएस जोड़ें 10 एमएल पीबीएस के अलावा और सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से फिल्टर कुल्ला प्रवाह के माध्यम से 300 x जी पर 5 मिनट के लिए।
    4. 10 एमएल भेदभाव मध्यम में कोशिकाओं को निरस्त करने और सेल नंबर निर्धारित करते हैं।
    5. टी पतलावह 20,000 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए भेदभाव के माध्यम से निलंबन सेल।
    6. पिपेट 20 मिलीलीटर पानी और HDs के सूखने-बाहर से बचने के लिए एक द्विघात पेट्री डिश में ड्रॉप (एचडी) समाधान फांसी 5 मिलीलीटर।
      नोट: प्रत्येक 24 अच्छी तरह से थाली युक्त iSABs के लिए 16 पेट्री डिश के साथ शुरू (धारा 2.8.6.4/2.8.7 देखें)।
    7. एक ट्रे में 50 मिलीलीटर सेल निलंबन के लिए ऊपर पिपेट।
    8. पेट्री डिश के ढक्कन चारों ओर मुड़ें। एक 12 चैनल पिपेट का उपयोग ढक्कन पर 180 HDs प्रत्येक युक्त 20 μl (400 कोशिकाओं / एच.डी.) सेल निलंबन रखें।
    9. ध्यान से ढक्कन चारों ओर मोड़ और पेट्री डिश पर जगह है।
      नोट: ढक्कन के चारों ओर मोड़ की गति बहुत महत्वपूर्ण है। ढक्कन भी धीमी गति से या बहुत तेजी से घूमा रहा है, तो सेल निलंबन की सतह तनाव फांसी ढक्कन पर चला जाता है बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं है। मध्यम के 20 μl बूंदों के साथ ढक्कन के आसपास घूम पहली बार अभ्यास के लिए HDs निर्माण करने के लिए प्रयास करने से पहले।
    10. तीन में दो दिनों के लिए कोशिकाओं खेती7 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 उन्हें ईबीएस फार्म जाने के लिए।
      नोट: 5 पेट्री डिश के एक ढेर के शीर्ष पर पानी से भरा प्लेस एक पेट्री डिश। अन्यथा ऊपरी पेट्री डिश में HD सूख जाएगा।
  3. दूसरा दिन
    1. ध्यान से द्विघात पेट्री डिश के ढक्कन चारों ओर मोड़ और एक 50 मिलीलीटर ट्यूब को दो पेट्री डिश (360 ईबीएस) से ली गई ईबीएस हस्तांतरण।
    2. ईबीएस ट्यूब के नीचे बसा जाने के लिए 10 मिनट रुको (ईबीएस अपकेंद्रित्र नहीं है)।
    3. महाप्राण संभव के रूप में ज्यादा माध्यम के रूप में, 10 एमएल भेदभाव माध्यम में ईबीएस को निलंबित और एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए निलंबन हस्तांतरण।
  4. दिवस 2-6 निलंबन संस्कृति
    1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के लिए निलंबन में ईबीएस खेती, 5% सीओ 2, 2 दिनों के बाद मध्यम बदल जाते हैं।
      नोट: ईबीएस अक्सर सतह के लिए देते हैं (एक सेल संस्कृति डिश के खिलाफ) पेट्री डिश में लिपटे भले ही नहीं है। ईबीएस संलग्न ईबीएस हर दिन के लिए और आवश्यक अलग अगर पेट्री डिश को नियंत्रित करेंकोमल pipetting द्वारा सतह से। वैकल्पिक: निलंबन संस्कृति की अवधि के दौरान लगातार पेट्री डिश हिलाएँ। प्रकार के बरतन की गति के साथ सावधान रहें। ईबीएस न तो बीच में जमा है और न ही पेट्री डिश की सीमा को फ्लोट चाहिए।
  5. दिन 6
    1. एक जिलेटिन लेपित 10 सेमी 2 सेल संस्कृति डिश के लिए एक पेट्री डिश से ईबीएस स्थानांतरण।
  6. दिवस 7-12
    1. कोशिकाओं 8-12 दिनों के बाद हरा करने के लिए शुरू करना चाहिए। दैनिक एक खुर्दबीन के नीचे कोशिकाओं के foci की धड़कन के लिए जाँच करें। कोशिकाओं को एक परत के रूप में शुरू करते हैं।
    2. मध्यम दैनिक बदलें।
      नोट: मध्यम बदलने के बाद, कोशिकाओं को ठीक करने के लिए और फिर पिटाई शुरू करने के लिए 3-4 घंटे की आवश्यकता है।
  7. साइनस नोडल कोशिकाओं के दिन 12-15 चयन।
    1. कोशिकाओं (दिन 12-15 के आसपास) पिटाई शुरू कर दिया है तीन दिनों के बाद, कोशिकाओं के लिए 400 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / G418 युक्त ताजा भेदभाव मध्यम से मध्यम और पिपेट 10 एमएल aspirate।
  8. नोट: यह सेल परत पहले से ही सतह से अलग है कि संभव है।
    1. सेल परत aspirating बिना ध्यान से मध्यम निकालें।
    2. पीबीएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें और सेल परत aspirating बिना ध्यान से पीबीएस को हटा दें।
    3. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब कोशिकाओं हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं, Collagenase चतुर्थ समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और 10 बार नीचे निलंबन मिश्रण और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं। छोटे समूहों के निलंबन हो जाना चाहिए। अभी भी छोड़ दिया परत की भारी भागों रहे हैं, तो कदम 2.8.4 दो बार दोहराएँ।
    5. 300 x जी पर 10 मिनट के लिए 20 पीबीएस के मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र जोड़ें।
    6. पीबीएस ध्यान से aspirate।
      नोट: iSABs कदम 2.8.7 के साथ आगे बढ़ना उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। ISAB व्युत्पन्न साइनस नोडल एकल कक्षों उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं कदम 2.9 के साथ पर जाओ।
    7. कोशिकाओं निलंबित12 एमएल में भेदभाव मध्यम 400 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / G418 युक्त और लेपित जिलेटिन के 6 कुओं 24 कुओं (/ अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर) पर बीज उन्हें।
  9. एकल नोडल सेल की पीढ़ी।
    1. 5 मिलीलीटर Accutase में कदम 2.8.6 से कोशिकाओं को सस्पेंड और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. सख्ती से ऊपर pipetting द्वारा और 10 बार नीचे निलंबन मिश्रण और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं सेते हैं।
    3. 300 x जी पर 5 मिनट के लिए 20 पीबीएस के मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र जोड़ें।
    4. 400 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम / G418 युक्त 12 एमएल भेदभाव मध्यम में कोशिकाओं को सस्पेंड और 24 कुओं (2 मिलीग्राम / अच्छी तरह से) लेपित एक जिलेटिन के 6 कुओं पर बीज उन्हें।
  10. हदबंदी के बाद 2 दिन, मध्यम aspirate और पीबीएस के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं। अच्छी तरह से / 1 मिलीलीटर भेदभाव मध्यम जोड़ें।
  11. दिवस 4-8 हदबंदी के बाद, हर 2 एन डी दिन मध्यम बदल जाते हैं। हदबंदी उपयोग iSABs या iSAB व्युत्पन्न साइनस के बाद 10 दिन पर नोडल एकल कक्षों आगे के विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं।

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Representative Results

वर्णित प्रोटोकॉल माउस दिल की धड़कन आवृत्ति के पास है, जो (फिल्म में दिखाया गया है) पीएससी से लगभग 450 धड़कन प्रति मिनट की एक मार आवृत्ति के साथ iSABs की पीढ़ी की अनुमति देता है। चित्रा 1 में दिखाया गया है iSABs की हदबंदी (कदम 2.8.8) के बाद मनाया एकल कक्षों साइनस नोड (धुरी और मकड़ी कोशिकाओं) की कोशिकाओं के विशिष्ट आकार दिखाते हैं। इन कोशिकाओं में जाना जाता है जो अत्यधिक एक्सप्रेस प्रोटीन समारोह के लिए आवश्यक हो hyperpolarization सक्रिय चक्रीय न्यूक्लियोटाइड-गेटेड कटियन चैनल 4 (Hcn4), Connexin45 (Cx45), Connexin30.2 (Cx30.2) और Myh6 (- सी 2A चित्रा) की तरह साइनस नोड की। दवाइयों के साथ iSAB ली गई कोशिकाओं के इलाज के बाद, कोशिकाओं की उम्मीद है और व्यवहार दिखाने: साइनस नोड में की तरह, मजेदार चैनल अवरोधक ZD7288 (चित्रा 3 ए) के रूप में अच्छी तरह से मुस्कारिनिक रिसेप्टर agonist carbachol (3B चित्रा), दोनों एक काफी कम पिटाई का कारण iSAB deriv की आवृत्तिएड कोशिकाओं। β-adrenoreceptor एगोनिस्ट isoprenaline एक ऊंचा पिटाई आवृत्ति (चित्रा -3 सी) की ओर जाता है।

चित्र 1
चित्रा 1: धुरी और मकड़ी कोशिकाओं iSAB व्युत्पन्न धुरी (ए) और मकड़ी (बी) के नोडल सेल की विशिष्ट सेलुलर आकार के सेलुलर आकार। स्केल बार 20 माइक्रोन।

चित्र 2
चित्रा 2: साइनस नोड मार्करों की अभिव्यक्ति। (ए) (पीला) HCN4 और Cx45 (मैजंटा), साइनस नोड कोशिकाओं में Cx45 (मैजंटा) और (पीला) Cx30.2 (बी) अभिव्यक्ति और (सी) Myh6 (मैजंटा) की अभिव्यक्ति है। नाभिक (turquois) की counterstaining। स्केल बार 20 माइक्रोन।


चित्रा 3: भेषज iSABs प्रतिनिधि के उपचार (नियंत्रण) से पहले iSABs की आवृत्ति की धड़कन और ZD7288 (ए), Carbachol (बी) और Isoprenaline (सी) के साथ इलाज के बाद। डेटा आठ स्वतंत्र iSABs प्रतिनिधित्व करते हैं और मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। *** पी <0.001

चित्रा 4
चित्रा 4: भेदभाव प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध। ISAB पीढ़ी के लिए प्रयोगात्मक प्रवाह चार्ट को दर्शाती सरलीकृत कार्टून।

मूवी:। हदबंदी के बाद एक ठेठ प्रेरित सिनोट्रायल शरीर (iSAB) की iSABs पिटाई की धड़कन प्लीएसई इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

क्षमता "जैविक पेसमेकर" के अर्थ में उचित हृदय लय के पुनर्गठन की अनुमति दे सकता सेल व्युत्पन्न कार्डियक पेसमेकर स्टेम कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए। इसी तरह, इन विट्रो में औषधि परीक्षण उनकी उपलब्धता से लाभ होगा। पीएससी पेसमेकर सेल गुण 8,9,10,11,12,13 साथ cardiomyocytes सहित स्तनधारी शरीर के किसी भी प्रकार की कोशिका को जन्म दे सकते हैं। हालांकि, आम तौर पर "embryoid निकायों" के भीतर सेल आबादी अनिवार्य रूप से विश्वसनीय चयन और अलगाव की रणनीतियों की आवश्यकता की ओर जाता है, जो अत्यधिक विषम हैं - यह हृदय नोडल कोशिकाओं की बहुत दुर्लभ सेल टाइप करने के लिए विशेष रूप से लागू होता है। बहिर्जात और अंतर्जात सतह के आधार पर कई दृष्टिकोण छोटे अणुओं 15,16,17 के औषधीय प्रशासन पर और 18,19 पालन किया गया है प्रत्यक्ष reprogramming रणनीतियों पर, 14 मार्करों। इसके अलावा, गैर स्टेम सेल आधारित दृष्टिकोण जैविक पेसमेकर की नकल करने के उद्देश्य सेपूरी तरह कार्यात्मक नोडल कोशिकाओं 20,21 के बजाय डी नोवो की sarcolemmal इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी अंतर्निहित पैदा करने टर्मिनल प्रेरक अणुओं के हेरफेर के माध्यम से।

फिर भी, इन में से न तो आवश्यक उच्च सहज संकुचन आवृत्तियों और सेलुलर पवित्रता के साथ आया था। इसके विपरीत, हमारे प्रोटोकॉल केवल बिजली दोलनों लेकिन यह भी सूक्ष्म electrophysiological और कैल्शियम संकेतन विशेषताओं के साथ ही अंतर्जात पेसमेकर कोशिकाओं 7 की विशिष्ट रूपात्मक सुविधाओं प्रदर्शन नहीं करते हैं कि कोशिकाओं की ओर जाता है। यह तकनीक इलेक्ट्रॉनिक पेसिंग उपकरणों के लिए विकल्प के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त बन सकते हैं।

इस प्रोटोकॉल अपने विकास के दौरान अनुकूलित किया गया था हालांकि, अभी भी समस्या का कारण हो सकता है कि कुछ कदम उठाए हैं: iSAB के चयन के लिए प्रारंभिक बिंदु के प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं की पिटाई कोशिकाओं फर्क में αMHC-अभिव्यक्ति के लिए एक सूचक है। Myh6-अभिव्यक्ति पूर्व के साथ साथ चला जाता हैG418 प्रतिरोध जीन की अभिव्यक्ति। बहुत जल्दी चयन शुरू संभावित cardiomyocytes में अंतर होता है और इसलिए साइनस नोडल कोशिकाओं की कुल पैदावार में कमी होगी, जो कोशिकाओं का एक बहुत बुझाने होगा। एक और महत्वपूर्ण कदम सेल परत (कदम 2.8) की हदबंदी है। इस के लिए कारण कोशिकाओं को एक मजबूत बाह्य मैट्रिक्स के रूप में और एक मजबूत ताकत सेल परत को अलग कर देना आवश्यक है। यदि आवश्यक हो, कदम 2.8.4 कोशिकाओं के छोटे समूहों सेल परत से विकसित किया है जब तक दोहराया जाना चाहिए। यह बहुत ही कम क्षमता का निकला क्योंकि जैसे ट्रिप्सिन द्वारा सेल परत के प्रत्यक्ष हदबंदी से बचें।

भविष्य नैदानिक ​​अनुप्रयोगों के लिए, निम्न बाधाएं अभी भी संबोधित किया जाना चाहिए: भविष्य सेल थेरेपी की ओर और इन विट्रो दवा के परीक्षण में एक महत्वपूर्ण कदम हो सकता है, जो मानव iSABs की पीढ़ी के लिए दृष्टिकोण के स्थानांतरण। इसके अलावा, तकनीक अभी भी स्थिर आनुवंशिक modifi पर आधारित हैयह रोगियों के लिए लागू किया जा सकता से पहले इसलिए पीएससी और की फैटायनों संशोधित करने की आवश्यकता होगी।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Iscove's liquid medium with stable glutamine Biochrom AG FG 0465
DMEM liquid medium without Na-pyruvate, with stable glutamine Biochrom AG FG 0435
CLS type IV, CLS IV Biochrom AG C4-22
Non-essential amino acids Biochrom AG K 0293
FBS Superior Biochrom AG S 0615
Sodium pyruvate (100 mM) Biochrom AG L 0473
G 418-BC liquid (ready-to-use solution), sterile Biochrom AG A 2912
Reagent reservoir PP f.multichannel pip. 60ml,sterile Brand 703409
Accutase eBioscience,Inc. 00-4555-56
Eppendorf Xplorer/Xplorer plus, electronic pipette Eppendorf 4861000155
Falcon Cell Strainer 40 µm Falcon 352340
Penicillin/Streptomycin  GE Healthcare P11-010
Petri Dishes Greiner BioOne 663102
DPBS without Ca and Mg PAN-Biotech P04-36500
Fetal bovine serum PAN-Biotech P30-3302
Leukemia inhibitory factor Phoenix Europe GmbH LIF-250
Quadratic petri dishes Roth PX67.1
Gelatin from cold water fish skin SigmaAldrich G7765
2-Mercaptoethanol SigmaAldrich M3148 
1-Thioglycerol SigmaAldrich M6145
Tissue culture dishes TPP 93100
Tissue culture flask TPP 90076
Tissue culture test plates (24 well) TPP 92424

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References

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