Imaging Lokale Ca

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lock, J. T., Ellefsen, K. L., Settle, B., Parker, I., Smith, I. F. Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (97), e52516, doi:10.3791/52516 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cytosolische Ca 2+ -ionen reguleren talrijke aspecten van de cellulaire activiteit in bijna alle celtypen, beheersen van processen zo breed als gen-transcriptie, elektrische prikkelbaarheid en celproliferatie. De diversiteit en specificiteit van Ca 2+ signalering is afgeleid van mechanismen die Ca2 + signalen worden gegenereerd om te handelen over verschillende tijd en ruimtelijke schalen, gaande van cel-brede trillingen en golven die zich over de perioden van minuten tot lokale voorbijgaande Ca 2+ microdomeinen (Ca 2+ pufjes) blijvende milliseconden. Recente ontwikkelingen in de elektron vermenigvuldigd CCD (EMCCD) camera's nu mogelijk voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ signalen met een 128 x 128 pixel ruimtelijke resolutie met een snelheid van> 500 frames sec -1 (fps). Deze aanpak is zeer parallel en maakt de gelijktijdige bewaking van honderden kanalen of bladerdeeg sites in een enkel experiment. Echter, de enorme hoeveelheden gegevens die worden gegenereerd (ca. 1 Gb per min) maken visuele identificatie en analyse van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen onuitvoerbaar. Hier beschrijven we en demonstreren van de procedures voor de verwerving, detectie en analyse van de lokale IP-3-gemedieerde Ca2 + signalen in intacte zoogdiercellen geladen met Ca 2+ indicatoren met behulp van zowel wide-field epi-fluorescentie (WF) en de totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie. Verder beschrijven we een algoritme ontwikkeld binnen de open-source software-omgeving Python dat de identificatie en analyse van deze lokale Ca 2+ signalen automatiseert. Het algoritme lokaliseert websites van Ca 2+ release met sub-pixel resolutie; kan de gebruiker van de gegevens; en uitgangen tijd sequenties van fluorescentieverhouding signalen samen met amplitude en kinetische gegevens in een Excel-compatibele tafel.

Introduction

Calciumionen (Ca 2+) alomtegenwoordig reguleren een divers aanbod van biologische processen, met inbegrip van genexpressie, secretie en langdurige veranderingen in de synaptische plasticiteit 1. Een manier waardoor Ca 2+ kan handelen in zo'n diverse manier is door middel van de verschillende ruimtelijke en temporele patronen van Ca 2+ signaleert een cel kan genereren. Bijvoorbeeld wereldwijde verhogingen in cytosolisch [Ca 2+] trekker contractie van glad spierweefsel 2 terwijl kleinere, plaatselijke voorbijgaande verhogingen (lokale Ca 2+ microdomeinen) stimuleren genexpressie essentieel voor leren en geheugen 3.

Vrije cytosolische [Ca 2+] wordt op ~ 100 nM in rust, maar snel oplopen tot verscheidene micro-molaire na de instroom van Ca2 + in het cytosol door Ca2 + -doorlaatbare ionenkanalen in het plasmamembraan en de bevrijding van Ca 2+ uit intracellulaire stores. Ons laboratorium richt zich op de inositol 1,4,5-trisfosfaatreceptor (IP 3R) dat een Ca2 + afgifte kanaal in het endoplasmatisch reticulum (ER) membraan vormt. Na binding van beide IP-3 en Ca 2+ naar het cytosol activeren van websites van de receptor, de IP 3 R-kanaal opent bevrijden Ca 2+ afgezonderd binnen het ER lumen. De afgifte van Ca2 + kan ruimtelijk beperkt blijven tot een klein cluster van IP3 Rs een lokale microdomein cytosolische Ca 2+ genereren (Ca2 + bladerdeeg 4) of, afhankelijk van de nabijheid van naburige clusters van IP3 Rs, kan propageren gedurende een cel door het aantrekken van meerdere bladerdeeg sites door middel van een proces van Ca 2+ geïnduceerde Ca 2+ -release (CKP) 5,6.

De invoering van fluorescerende klein molecuul Ca 2+ indicatorkleurstoffen ontwikkeld door Roger Tsien 7, in combinatie met geavanceerde microscopie Imaging technieken sterk vergemakkelijkt ons begrip van Ca2 + signalering. Recente ontwikkelingen in de camera's gebruikt voor microscopie nu toe voor de beeldvorming van voorbijgaande lokale Ca 2+ evenementen zoals soesjes met ongekende ruimtelijke en temporele resolutie. Momenteel beschikbare EMCCD camera mogelijk beeldvorming met 128 x 128 pixels bij> 500 frames sec -1 (fps) en de nieuwe generatie Complementary Metal-Oxide Semiconductor (CMOS) camera's hogere pixelresolutie, en zelfs hogere snelheid ten koste van iets hoger geluidsniveaus. In combinatie met de totale interne reflectie (TIRF) microscopie is het nu mogelijk om het beeld enkele Ca 2+ kanaal gebeurtenissen 8,9. Deze benadering maakt de beeldvorming van honderden kanalen / gebeurtenissen gelijktijdig, terwijl het genereren van grote datasets (ca. 1 GB per minuut) dat automatische verwerking visuele identificatie en analyse onuitvoerbaar maken en plaats een last op de ontwikkeling van geautomatiseerde algoritmen.

+ signalen in intacte zoogdiercellen behulp van fluorescente Ca2 + indicatoren. We verder aan te tonen een algoritme ontwikkeld in de open-source omgeving Python dat identificatie en analyse van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen afgebeeld door zowel TIRF en conventionele brede veld epi-fluorescentie (WF) microscopie automatiseert. Hoewel we beschrijven deze benaderingen in de context van IP3 -generated Ca2 + signalen, die zich gemakkelijk lenen om lokale wijzigingen in cytosolisch [Ca 2+] afkomstig van verschillende Ca2 + -doorlaatbare ionenkanalen in ofwel de oppervlaktestudie membraan of intracellulaire organellen 8-10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

We presenteren gedetailleerde procedures voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen in de menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen. Deze procedures kunnen worden aangepast aan het intracellulaire Ca2 + signalen in veel celtypen 8-10.

1. Bereiding van Cellen

  1. De cultuur van de cellen af ​​te beelden volgens de instructies vermeld op de website van hun leverancier.
  2. Een paar dagen voor beeldvorming, oogsten cellen gekweekt in weefselkweek kolf met 1 ml 0,25% trypsine / EDTA (2-3 min). Na onthechting, voeg een gelijk volume kweekmedium aan het trypsine te inactiveren.
  3. Voer een celgetal met behulp van een hemocytometer en zaad cellen in glazen bodem beeldvorming gerechten bij een dichtheid van 3-7 x 10 4 cellen per gerecht. Selecteer de cellen voor beeldvorming experimenten bij het bereiken van 60% samenvloeiing (2-3 dagen).

2. Voorbereiding van oplossingen en reagentia

  1. Bereid een Ca 2+ bevattende HEPES gebufferdzoutoplossing (Ca2 + -HBSS) uit (mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, en 10 glucose; pH = 7,4 bij kamertemperatuur (RT) met NaOH. Bereid Ca2 + -HBSS zonder toevoeging van glucose en bewaar bij 4 ° C; voeg glucose om de oplossing onmiddellijk voor gebruik.
  2. Oplosbaar membraan doordringende vormen van de fluorescente Ca2 + indicator Cal-520 (1 mM), ci-IP3 (200 uM) en EGTA (100 mM) in dimethylsulfoxide (DMSO) met 20% Pluronic F-127. Aliquot deze reagentia in Eppendorf buizen en opslag, afgeschermd van licht en vocht, bij -20 ° C.

3. Laden Cellen met een membraan-permeant Cal-520, ci-IP 3 en EGTA

  1. Bereid de "laadbuffer" door verdunning van de voorraadoplossing van membraan-permeant Cal-520 en ci-IP3 tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM en 1 uM, respectievelijk Ca 2+ -HBSS.
  2. Aspireren culture media en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 + -HBSS driemaal.
  3. Verwijder Ca2 + -HBSS en incubeer cellen in laadbuffer gedurende 60 min bij kamertemperatuur in het donker.
  4. Verwijder laadbuffer en spoel cellen door vervanging van media door Ca2 + -HBSS driemaal.
    1. Indien gewenst, bij deze stap, weegcellen met EGTA / AM door verdunning van de voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM in Ca2 + -HBSS en incubeer cellen gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Na deze incubatie, spoel cellen drie keer met Ca 2+ -HBSS voordat u verder met stap 3.5.
  5. Incubeer de cellen met Ca2 + -HBSS gedurende 30 min om voor de verestering van geladen reagentia.
  6. Onmiddellijk voorafgaand aan beeldvorming vervangen Ca2 + -HBSS met "verse" Ca 2+ -HBSS om elke kleurstof die tijdens de laatste incubatie in het bad kan zijn gelekt verwijderen.

4. Ca 2+

  1. Plaats een kleine druppel immersie olie op de 100X APO TIRF doelstelling (NA 1,49).
  2. Monteer de beeldvorming schotel op het podium van de omgekeerde microscoop en breng de cellen in beeld met behulp van doorvallend licht. Het is belangrijk de beeldvormende schotel te bewegen tijdens de opname voorkomen beveiligen.
  3. Verlichten cellen met een 488 nm laser om Cal-520 prikkelen en te verzamelen uitgezonden fluorescentie (λ> 510 nm) met behulp van een high-speed EMCCD camera.
    Opmerking: Het softwarepakket dat de microscoop werking kan de gebruiker vertaal een focusseerlens waarbij de laserbundel worden ingevoerd hetzij aan de uiterste rand van de doelstelling back opening (voor TIRF excitatie) of meer centraal (voor "WF" excitatie).
  4. Met behulp van de EMCCD software, verminderen het beeldveld van de volledige 512 x 512 pixels, om gegevens te verzamelen bij de noodzakelijke temporele resolutie aan lokale Ca 2+ gebeurtenissen vast te leggen.
    OPMERKING: Bijvoorbeeld, centrum quadacquisitie van 256 x 256 pixels versnelt de overname tarief tot 66 fps. Het is ook mogelijk om verdere toename van de frame rate van de EMCCD camera tot 500 fps met behulp van een geïsoleerde Crop Mode functie.
  5. Configureer de software enkele seconden basislijn activiteit automatisch opnemen geeft een met UV flash om de cellen en blijven opnemen voor een 10-30 sec.
    OPMERKING: Een UV-flitser wordt geleverd met behulp van een Xenon boog lichtbron geïntroduceerd door middel van een UV-reflecterende dichroïde spiegel in de achterkant haven van de microscoop. De duur en intensiteit van de UV flits empirisch op een gewenste frequentie van lokale Ca2 + gebeurtenissen roepen.
  6. Bestanden opslaan als image stacks voor off-line analyse.

5. Geautomatiseerde Ca 2+ Image Analysis

OPMERKING: Het is mogelijk om te bekijken, te verwerken en te analyseren vastgelegde gegevens met behulp van veel commerciële softwarepakketten. We hebben echter een algoritme snel automatiseren identificatie een ontwikkeldd analyse van lokale Ca2 + signalen. Een gedetailleerde beschrijving van de ruimtelijke en temporele filters in dit algoritme kan genereren van de AF / F 0 en identificatie / analyseroutines gevonden in 11. Dit algoritme is ontwikkeld om te draaien op het open-source software platform Python, en kan verkregen worden, samen met het monster experimentele gegevens en gedetailleerde instructies voor de gebruiker, per e-mailen van de desbetreffende auteur (ismith@uci.edu).

  1. Bestanden converteren naar de op maat geschreven algoritme om de multi-plane .tiff bestandsformaat te worden geïmporteerd.
  2. Zoek de map met de analyse-algoritme en dubbelklik op het run.exe.
  3. Selecteer de .tiff bestand te analyseren.
  4. Kies analyse parameters in het dialoogvenster Openen. Zie figuur 2A voor standaard parameters voor de steekproef van gegevens.
  5. Bepaal het zwartniveau worden gecompenseerd door de afbeeldingsstapel door ofwel de cursor naar een deel van het gezichtsveld dat n doetot bevatten een cel (zie figuur 2B) of door het handmatig invoeren van een zwart-niveau met behulp van de 'Set Black Level' prompt.
  6. Observeren vier vensters op het scherm na analyse door de software (figuur 2C-F). C is een monochroom beeld van rustende fluorescentie van cellen geanalyseerd. Witte vierkantjes bovenop dit beeld zijn eventlocaties, bepaald als het zwaartepunt posities van tweedimensionale Gaussische functies gemonteerd gebeurtenissen.
  7. Klik op elk evenement locatie of druk op de cursortoetsen om tussen gebeurtenissen. Op deze momenten de-achtergrond afgetrokken, Gauss gladgestreken fluorescentieverhouding veranderingen (AF / F 0) op elk van deze sites update venster D.
    OPMERKING: Rood gemarkeerd gebeurtenissen zijn vastbesloten om zijn afkomstig uit die bepaalde site en niet uit 'doordrukken' van activiteit gelokaliseerd in aangrenzende sites. De onderste blauw spoor geeft aan waar het fluorescentiesignaal op de gekozen plaats boven het detectiedrempel, terwijl de zwarte lijn geeft gebeurtenissen afkomstig uit die plaats (corresponderend met de rode gemarkeerde events).
  8. Klik op een rode gemarkeerde gebeurtenis bijwerken venster E dat de temporele evolutie van de gebeurtenis weergeeft, en raam F, die toont de ruimtelijke profiel van het evenement gemiddeld over het tijdsverloop, samen met de ruimtelijke profiel van de gemonteerde Gaussische functie.
  9. Handmatig de gebeurtenissen die zijn geïdentificeerd, zodat artefacten uit de analyse kan worden afgewezen. Wis dergelijke evenementen door rechts te klikken op de rode gemarkeerd evenementen.
    LET OP: In onze handen, Ca 2+ flux door één IP-3 R-kanalen oproept signalen met AF / F 0 ongeveer 0,11, dus elke gedetecteerde 'events' aanzienlijk kleiner dan dit zijn waarschijnlijk valse positieven zijn.
  10. Exporteer gegevens door te kiezen voor 'Save to Excel' of exporteren van gegevens op een per cel basis door het tekenen rond de cel van de rente en het selecteren van 'Save CellR17 ;.
    NB: De gegevens worden opgeslagen in dezelfde map als het originele beeld stapel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1A toont een WF beeld van rust Cal-520 fluorescentie in menselijke neuroblastoom SH-SY5Y cellen ook geladen met ci-IP-3. Blootstelling van deze cellen om een 100 msec UV flits van de foto-versie i-IP 3 uitgelokt voorbijgaande Ca 2+ soesjes op discrete sites (opgemerkt door de witte cirkels in figuur 1A). Fluorescentie sporen gemeten in situ vond snelle stijgende fase wegens tijdelijke openingen van IP3 Rs, gevolgd door een veel langzamere dalende fase (Figuur 1B en 1C) Ca 2+ weg van de afgifteplaats langzaam verspreid. Rode gemarkeerde gebeurtenissen in figuur 1B Ca2 + signalen die werden bepaald door het algoritme dat deze uit de geselecteerde plaats. Niet-gemarkeerd gebeurtenissen vertegenwoordigen besmetten Ca 2+ signalen diffunderen van nauw aangrenzende sites.

Om een ​​hogere resolutie beeldvorming van lokale Ca bereiken 2+ buffer EGTA. Deze chelaten Ca2 + ionen diffunderen tussen bladerdeeg locaties en voorkomt de vorming van globale Ca2 + golven die de studie van lokale Ca 2+ puffs gegenereerd door afzonderlijke clusters van IP3 Rs zouden verduisteren. Bovendien EGTA versnelt de ineenstorting van de lokale Ca2 + microdomein maar door zijn langzame binding kinetiek, minimaal verstoort lokaal vrij Ca2 + en zijn binding aan de snelle Ca2 + indicator binnen een cluster. Het netto-effect van EGTA is om 'scherpen' fluorescentie verslagen van soesjes in ruimte en tijd, zonder merkbare vermindering van hun amplitude. Een verdere verbetering van de resolutie ontstaat door TIRF excitatie van de Cal-520 fluoroforen de smalle (<100 nm) uitdovende golf door TIRF beperken. De som van beide benaderingen is een techniek die effectief controleert momentane Ca 2+ 2+ stroom) in plaats van een lekkende integraal van Ca 2+ nadat deze is uitgebracht door het IP 3 R's en langzaam verspreidt weg van de release plaats en wordt uiteindelijk afgezonderd 9. Figuur 1D toont de TIRF 'footprint' van een SH-SY5Y cel wanneer Cal-520 fluoroforen waren slechts opgewonden binnen een nauwe afstand in de cel van het dekglaasje / waterige oplossing interface. Snelle binding van Ca 2+ om de snelle indicator Cal-520 kleurstof binnen de attoliter cytosole volumes gecreëerd door TIRF verlichting, in combinatie met EGTA om 'mop' up diffusief Ca 2+, rendementen fluorescentie signalen die worden aangescherpt, zowel in tijd en ruimte ( Figuur 1E en 1F).

De analyse van het beeld stacks gevangen op deze manier wordt aanzienlijk vergemakkelijkt door middel van een op maat geschreven algoritme ontwikkeld in ons lab draait op het open-source software platform Python 11. Figuur 2A toont het openingsvenster venster waarin de gebruiker parameters worden gebruikt voor identificatie en daaropvolgende analyse van afbeeldingsstapels binnenkomt. Na deze, wordt de gebruiker gevraagd om een zwartniveau selecteren die moet worden afgetrokken van de gehele afbeelding stapel waarna de identificatie en analyse-algoritme loopt figuur 2C-F tonen, respectievelijk, de subcellulaire websites van lokale Ca 2+ release.; activiteit op geselecteerde sites; afzonderlijke gebeurtenissen op een uitgebreide tijdschema; en ruimtelijke profielen van representatieve evenementen (zie figuur 2 legenda voor details). Bij de gebruiker herziening van geïdentificeerde plaatsen, analyseerde gegevens voor alle evenementen (zie tabel 1) kan worden geëxporteerd door het selecteren van de functie 'Save to Excel'.

Figuur 3 toont gegevens illustreren zowel de verbetering van de resolutie bereikt door TIRF beeldvorming EGTA-beladen cellen in vergelijking met WF beeldvorming in onbelaste cellen, en de power van het algoritme bij het ​​identificeren en analyseren van plaatselijke Ca2 + signalen. Figuur 3A toont een representatief lokaal evenement afgebeeld door WF in een cel alleen geladen met Cal-520 en ci-IP3. Ter vergelijking, Figuur 3B toont een soortgelijke gebeurtenis maar nu afgebeeld door TIRF microscopie in een cel verder geladen met EGTA. Gesuperponeerd sporen in figuur 3C en 3D, illustreren bijbehorende temporele (C) en ruimtelijke (D) profielen van de gebeurtenissen opgenomen door WF fluorescentie zonder EGTA (zwart) en door TIRF microscopie met EGTA laden (rood). Figuur 3E percelen: metingen van bladerdeeg amplitudes , verval tijden en ruimtelijke breedte onder deze twee voorwaarden, bepaald met behulp van het algoritme ongeveer 44 (WF) en 88 (TIRF) evenementen te analyseren.

Figuur 1
Figuur 1: IP -evoked lokale Ca 2+ signalen in SH-SY5Y cellen geladen met zwart-wit beeld van Cal-520 en ci-IP 3 afgebeeld door wide-field (A tot en met C) en TIRF (D tot en met F) microscopie. (A) rustend Cal-520 fluorescentie waarop bladerdeeg plaatse locaties worden aangeduid met witte cirkels; schaal bar = 10 urn. (B) Sporen illustreren puffs opgeroepen op drie verschillende locaties, genummerd als in (A). Rood gemarkeerd gebeurtenissen zijn pufjes geïdentificeerd afkomstig te zijn van die bepaalde site. Pijl geeft de tijd van UV-flitser. (C) Gesuperponeerd sporen van representatieve Ca 2+ trekjes zoals die in (B), uitgelijnd en getoond op een uitgebreide schaal. Monochrome TIRF 'footprint' beeld van rust Cal-520 fluorescentie in SH (D) -SY5Y cellen geladen met ci-IP 3 en EGTA. Witte cirkels duiden bladerdeeg website afkomst. (E) (F) Bovenop sporen representatieve Ca 2+ trekjes zoals die in (E), uitgelijnd en getoond op uitgebreide schaal.

Figuur 2
Figuur 2: De gebruikersinterface van de aangepaste code ontworpen om lokale Ca 2+ signalen in SH-SY5Y cellen afgebeeld door TIRF microscopie automatisch te identificeren en te analyseren (A) openen dialoogvenster waarin identificatie en analyse parameters worden ingevoerd (B) De gebruiker selecteert een.. . gebied van het beeld dat er geen cellen bevat om het zwartniveau dat wordt afgetrokken van de alle frames in het beeld stack define (C - F). Screenshots van de uiteindelijke / identificatie analyse ramen (C) Afbeelding van rust Cal-5 20 fluorescentie waarop zijn gesuperponeerd locaties waar Ca 2+ transiënten werden geïdentificeerd (witte vierkantjes). De gebruiker kan fietsen tussen de locaties door het bewegen van de muis over de afbeelding of het indrukken van de cursortoetsen. (D) Window blijkt fluorescentieverhouding (AF / F 0) spoor bij de geselecteerde gebeurtenis. Rood opgelicht gebeurtenissen worden geïdentificeerd als zijnde ontstaan ​​op de geselecteerde site. De onderste blauwe balk geeft aan gebeurtenissen die de drempel voor detectie bij die site overschrijden; gebeurtenissen niet rood gemarkeerd zijn gelokaliseerd op een aangrenzend terrein. Te klikken op de blauwe balk brengt de gebruiker naar dat evenement plaats. Klikken op een rode gebeurtenis met de muis opent twee andere vensters die de temporele evolutie van het event een uitgebreide tijdschaal (E) en ruimtelijke profielen (F) van het voorval gedurende het tijdsverloop (links) gemiddeld samen met de ruimtelijke profiel de gemonteerde Gauss (rechts).e.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
(A) snapshot beeld van een trekje gevangen op het moment van de piek amplitude, bovenop een achtergrond afbeelding van rust fluorescentie op verbetering in temporele en ruimtelijke trouw van bladerdeeg beeldvorming bereikt door het gebruik van TIRF microscopie in combinatie met intracellulaire laden van EGTA: figuur 3. tonen de cel omtrek. Het beeld werd verkregen door WF microscopie van een cel niet geladen met EGTA. Het beeld bladerdeeg wordt pseudocolored, met hogere Ca 2+ niveaus aangeduid door steeds 'warme' kleuren. (B) Overeenkomstige beeld van een trekje afgebeeld door TIRF microscopie in een cel geladen met EGTA. (C) Sporen, WF (zwart) of TIRF + EGTA (rood), tonen de overeenkomstige verandering in Cal-520 fluorescence tijd voor de Ca2 + trekjes getoond in (A) en (B) hierboven. Sporen zijn genormaliseerd naar dezelfde piek- amplitude en uitgelijnd om hun piektijd de vergelijking van de kinetiek vergemakkelijken. Aantekeningen illustreren metingen van Ca 2+ gebeurtenis parameters (amplitude en daaltijd) gekwantificeerd (E). (D) Sporen, WF (zwart) of TIRF + EGTA (rood), tonen de fluorescentie-intensiteit van een lijn te trekken door de Ca2 + trekjes getoond in (A) en (B). Lijn scans worden genormaliseerd om hun piekamplitudes, en gecentreerd. Het annotatie toont gemeten breedte op halve maximale amplitude (FWHM), zoals gekwantificeerd (E). (E) Bar grafieken gemiddelde maximale amplitude (top), daaltijden van 80% tot 20% van piek amplitude (midden), en ruimtelijke breedte (FWHM) trekjes afgebeeld door WF microscopie in cellen zonder EGTA (open staven) en TIRF microscopie in-EGTA geladen cellen (grijze balken). Gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM met een Mn van ten minste 37 pufjesvoor WF en 79 voor TIRF. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

A. Groep # Evenemententerrein identiteitsnummer
B. GroepX: Bedoel sub-pixel x locatie van alle gebeurtenissen op een bepaalde site
C. Groupy: Bedoel sub-pixel y locatie van alle gebeurtenissen op een bepaalde site
D. Nee Evenementen: Aantal gebeurtenissen op een plaats in de loop van het experiment.
E. Max Amp: Maximale amplitude van een evenement in die bepaalde site (AF / F 0)
F. X: Sub-pixel x lokalisatie van het evenement
G. Y: Subpixel vlocalization van het evenement
H. T_peak: De tijd waar de gebeurtenis bereikt piekamplitude (in framenummer)
I. Amplitude: Amplitude van alle gebeurtenissen die afkomstig zijn van elke site (AF / F 0)
J. Sigmax: X SD Gaussian profiel gemonteerd tijdsverloop van de gebeurtenis (in pixels)
K. Sigmay: Y SD Gaussian profiel gemonteerd tijdsverloop van de gebeurtenis (in pixels)
L. Hoek: Hoek van de lange as van de resulterende elliptische functie van Gaussische gemonteerd tijdsverloop van het evenement
M. R20: Tijd stijgen tot 20% van de maximale amplitude (in frames)
N. R50: Tijd stijgen tot 50% van de maximale amplitude (in frames)
O. R80: Tijd stijgen80% van de maximale amplitude (in frames)
P. R100: Tijd stijgen tot 100% van de maximale amplitude (in frames)
Q. F80: Tijd dalen tot 80% van de maximale amplitude (in frames)
R. F50: Tijd dalen tot 50% van de maximale amplitude (in frames)
S. F20: Tijd dalen tot 20% van max amplitude (in frames)
T. F0: Tijd terugkeren naar pre-event basislijn (in frames)

Tabel 1: Uitvoer gegevens van algoritme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschrijven hier protocollen voor de beeldvorming van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen in gekweekte zoogdiercellen met fluorescerende Ca 2+ indicatoren. Verder beschrijven we een algoritme met een intuïtieve gebruikersinterface die de identificatie en analyse van de verkregen data automatiseert. De hier beschreven procedure gebruik maken van de fluorescerende Ca 2+ indicator Cal-520, maar veel andere Ca 2+ gevoelige kleurstoffen zoals Fluo-3, Fluo-4, Fluo-8 en Oregon Green BAPTA-1 presteren goed genoeg om het Ca 2+ microdomeinen. Care hoeft te worden toegezien dat de hoge affiniteit versies (Kd van ~ 200-400 nM) van deze indicatoren, wordt gebruikt voor lokale Ca2 + microdomeinen, en de optimale belastingstoestanden van deze indicatoren moeten empirisch worden bepaald voor elk celtype onderzocht. Door hun aard Ca 2+ indicatoren binden Ca 2+ en dus fungeren als Ca 2+ buffers; hogere beladingsconcentraties van indicators hebben kunnen aantasten Ca2 + signalen worden opgenomen en / of kunnen worden afgezonderd in intracellulaire organellen, hoewel belastingstoestanden hier beschreven een goed uitgangspunt. Kortom, beeldvorming van de activiteit van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen minimaal invasieve behoud van de natieve structuur van een cel en cytosolische factoren die de kanalen die Ca2 + microdomeinen grondslag kunnen regelen.

Het protocol beschrijven we hier voor hoge-resolutie beeldvorming van lokale Ca 2+ signalen met behulp van TIRF microscopie heeft het duidelijke beperking in dat het beperkt metingen om gebeurtenissen die voortvloeien uit Ca 2+ kanalen liggen binnen het verdwijnende veld. Het is echter niet alleen beperkt tot kanalen in de plasmamembraan, en we tonen de toepasbaarheid op kanalen zoals IP3 R intracellulaire organellen die zijn gevonden preferentieel dichtbij het ​​plasmamembraan 12 maaranders ontoegankelijk voor elektrofysiologische opnames van hun activiteit in de natieve cellulaire milieu. Confocale beeldvorming mogelijk zou beeldvorming van opgewekte dieper in de cel, maar heeft nadelen in vergelijking met TIRF beeldvorming dat de dikte van het optische deel is groter (~ 800 nm vs 100-200 nm) en wordt temporele resolutie beperkt door de noodzaak aan de confocale spot (s) te scannen. Omdat beeldvorming wordt gedaan in een epi-fluorescentie-modus met behulp van een omgekeerde microscoop, kon optische opnames van lokale en single-channel Ca 2+ signalen gemakkelijk worden gecombineerd met gelijktijdige elektrofysiologische patch-clamp-opname.

Door expressie fluorescentie Ca2 + signalen verhouding van rustende fluorescentie (AF / F 0) is het mogelijk om een goede relatieve maat van signaalamplitudes verkrijgen. Echter, we waarschuwen dat de kalibratie van de lokale, voorbijgaande fluorescentie veranderingen in termen van absolute Ca 2+ concentraties isniet geschikt. De gradiënten van vrije [Ca2 +] en Ca2 + -gebonden indicator rond een Ca2 + releasekanaal of cluster kanalen smaller is dan kan worden opgelost door optische microscopie en worden nader wazig door de puntspreidingsfunctie van de microscoop. Bovendien lokale [Ca 2+] in de directe nabijheid van het kanaal porie zal veranderen op een microseconde tijdschaal als kanaal opent en sluit. Dus de fluorescentiesignalen bieden slechts een vage (in ruimte en tijd) representatie van de ware Ca2 + nanodomain onderliggende lokale Ca2 + signalen 13.

De hier beschreven algoritme sterk vergemakkelijkt de analyse van lokale Ca2 + signalen van camera gebaseerde beeldvorming. Door het automatiseren van identificatie en analyse niet alleen wordt de gebruiker vooroordeel geëlimineerd, maar gigabytes van het beeld stacks kan binnen enkele minuten in een zeer parallelle wijze worden verwerkt, waardoor zowel de temporele en ruimtelijke gegevens uit meerdere gebeurtenissen uiteen eencellige tegelijk.

Hoewel de gegevens in dit handschrift worden in de context van IP3 gemedieerde Ca2 + signalen, kan de beschreven benadering gemakkelijk worden uitgebreid om lokale wijzigingen beeldvorming cytosolisch [Ca 2+] afkomstig van verschillende soorten ligand- tweede messenger- en spanningsafhankelijke Ca 2+ -doorlaatbare ionkanalen. De high-throughput aard van het algoritme voor het automatiseren van de identificatie en analyse van de lokale Ca 2+ gebeurtenissen moet ook blijken te zijn zeer nuttig voor de beeldvorming van Ca 2+ kanalopathieën bij de ziekte van staten via single-cell modellen, zoals de ziekte van Alzheimer en autisme spectrum stoornis te zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Neuroblastoma SH-SY5Y cells ATCC CRL-2266
Cal-520/AM AAT Bioquest Inc. 21130
ci-IP3 (D-23-O-Isopropylidene-6-O-(2-nitro-4,5-dimethoxy)benzyl-myo-Inositol 1,4,5-trisphosphate-Hexakis(propionoxymethyl) Ester SiChem cag-iso-2-145-10
DMSO/20% pluronic F127 Invitrogen P-3000MP
EGTA/AM Invitrogen E-1219
35 mm glass-bottom imaging dishes MatTek P35G-1.5-14-C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, (1), 11-21 (2000).
  2. Hill-Eubanks, D. C., Werner, M. E., Heppner, T. J., Nelson, M. T. Calcium signaling in smooth muscle. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (9), a004549 (2011).
  3. Hagenston, A. M., Bading, H. Calcium signaling in synapse-to-nucleus communication. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (11), a004564 (2011).
  4. Berridge, M. J. Elementary and global aspects of calcium signalling. J Physiol. 499, (Pt 2), 291-306 (1997).
  5. Lipp, P., Niggli, E. A hierarchical concept of cellular and subcellular calcium signalling). Prog Biophys Mol Biol. 65, (3), 265-296 (1996).
  6. Parker, I., Yao, Y., Ilyin, V. Fast kinetics of calcium liberation induced in Xenopus oocytes by photoreleased inositol trisphosphate. Biophys J. 70, (1), 222-237 (1996).
  7. Minta, A., Kao, J. P., Tsien, R. Y. Fluorescent indicators for cytosolic calcium based on rhodamine and fluorescein chromophores. J Biol Chem. 264, (14), 8171-8178 (1989).
  8. Demuro, A., Parker, I. Imaging the activity and localization of single voltage-gated Ca(2+) channels by total internal reflection fluorescence microscopy. Biophys J. 86, (5), 3250-3259 (2004).
  9. Smith, I. F., Parker, I. Imaging the quantal substructure of single inositol trisphosphate receptor channel activity during calcium puffs in intact mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (15), 6404-6409 (2009).
  10. Reissner, K. J., et al. A novel postsynaptic mechanism for heterosynaptic sharing of short-term plasticity. J Neurosci. 30, (26), 8797-8806 (2010).
  11. Ellefson, K. S., Parker, B., Smith, I., F, I. An algorithm for automated detection, localization and measurement of local calcium signals from camera-based imaging. Cell Calcium. (2014).
  12. Smith, I. F., Wiltgen, S. M., Parker, I. Localization of puff sites adjacent to the plasma membrane: Functional and spatial characterization of calcium signaling in SH-SY5Y cells utilizing membrane-permeant caged inositol trisphosphate. Cell Calcium. 45, 65-76 (2009).
  13. Shuai, J., Parker, I. Optical single-channel recording by imaging calcium flux through individual ion channels: theoretical considerations and limits to resolution. Cell Calcium. 37, (4), 283-299 (2005).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics