Forward Genetica schermi usando macrofagi per identificare * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) è un intracellulare obbligato, patogeno da protozoi. E 'l'agente eziologico della toxoplasmosi, un pericolo per la salute in soggetti immunocompromessi. E 'anche il sistema di modello per altri patogeni Apicomplexa che infettano gli esseri umani, tra cui Cryptosporidium e Cyclospora. La toxoplasmosi è più comunemente acquisito attraverso l'ingestione di cibo o acqua contaminati con la fase bradyzoite o oocisti del parassita. Dopo l'ingestione, queste fasi convertono alla fase tachizoite del parassita che replica all'interno di cellule ospiti e diffonde per via sistemica. Cellule T, IFN-γ e, in misura minore, ossido nitrico 1-4, sono importanti per il controllo di infezione, ma non sono in grado di eliminare la malattia, in proporzione tachizoiti convertono alla fase bradyzoite che sono protetti all'interno cisti tissutali causando una infezione cronica di lunga durata. In realtà, non esistono terapie efficaci contro la cisti s cronicatage della malattia. Grave toxoplasmosi è più spesso dovuta alla riattivazione di infezione persistente, con la fase bradyzoite del parassita riconversione palco rapidamente replicando caratteristico tachizoite di infezione primaria e acuta.

Sopravvivenza All'inizio faccia della risposta immunitaria innata è importante per permettere al parassita di raggiungere numeri parassiti sufficiente, nonché di raggiungere siti distali, per consentire costituzione di infezione cronica. T. gondii è evoluto strategie per contrastare i meccanismi di difesa dell'ospite che probabilmente contribuiscono alla sua capacità di replicare e diffondere all'inizio dell'infezione. Primo, T. gondii forma un PV unico durante parassita invasione che è in gran parte separata dai processi endocitiche e esocitosi della cellula ospite rispetto ad altri patogeni intracellulari 5-9. Inoltre, come tutti di successo patogeni intracellulari T. gondii modifica la sua cellula ospite per creare un ambiente permissivo fo la crescita. Questo include l'espressione genica della cellula ospite riprogrammazione alterando fattori di trascrizione della cellula ospite, comprese quelle importanti per la regolazione attivazione delle cellule 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 e GRA16 GRA24 22 hanno tutti dimostrato di essere importante nella regolazione della risposta trascrizionale e segnalazione cellulare cascate di cellule ospiti infettate con T. gondii. Studi recenti, con incroci genetici tra ceppi di parassiti con fenotipi distinti sono stati molto produttivi per identificare i geni che sono alla base di parassiti tratti genotipo-dipendente parassiti, tra cui l'evasione legate all'immunità GTPases (IRG) 16,19,23-26. Nei topi, legate all'immunità GTPasi (IRG) sono fondamentali per il controllo di tipo II e III genotipi del parassita, mentre il tipo molto virulenta I genotipi sono evoluti meccanismi per eludere le IRG murini. Tuttavia, è anche evidente che il parassita è evoluto meccanismi per eludere mezzi antimicrobicatori in aggiunta ai IRGs e che alcuni di questi meccanismi possono essere conservati tutti genotipi parassita 27,28. Inoltre, si sa molto poco circa i mediatori critici di cellule dell'immunità autonoma contro T. gondii durante toxoplasmosi umana. Parasite geni importanti per la resistenza ai mediatori di cellule dell'immunità autonoma possono essere importanti per la sopravvivenza durante tachizoite a bradyzoite conversione che può anche essere attivato da risposta immunitaria. Ad esempio, l'ossido nitrico ad alti livelli può sopprimere la replicazione parassita in macrofagi infettati ma può anche stimolare tachizoite a bradyzoite conversione con conseguente produzione cisti 30-32.

ToxoDB è un database genomica funzionale per T. gondii che funziona come una risorsa critica per il campo in termini di fornitura di informazioni di sequenza del genoma del parassita e l'accesso ai dati in scala genomica editi e inediti tra cui le annotazioni di comunità, gene exp ression e proteomica dati 33. Simili molti patogeni protozoarie, la maggior parte del genoma è costituito da geni ipotetici senza informazioni disponibili sulla base gene omologia fornire una conoscenza loro potenziali funzioni. Così, la genetica in avanti è un potente strumento per identificare i geni parassiti nuovi importanti per evasione immune, la conversione cisti e altre funzioni critiche per parassita patogenesi e per la conversione tra le varie fasi di sviluppo differenti. Un ulteriore punto di forza genetica diretta è che può essere usato come un approccio relativamente non polarizzato per interrogare il parassita per i geni che sono importanti per compiti specifici in patogenesi, comprese evasione immune e formazione di cisti. Recenti miglioramenti a sequenziamento di nuova generazione per la profilazione mutazionale hanno fatto un metodo di scelta per identificare i geni parassita responsabile di genetica a termine studi utilizzando sia chimico inserzionale mutagenesi 34-37.

S copi "> E 'importante identificare le vulnerabilità in T. gondii che possono essere sfruttate per migliorare l'efficacia delle cellule meccanismi immunitari autonomi contro il parassita particolare quelli che potrebbero essere anche attivo contro il palco cisti resistente. A tal fine, in vitro murino infezione macrofagi e modello di attivazione è stato sviluppato per identificare le mutazioni nel parassita che specificamente compromettere T. gondii idoneità dopo l'attivazione dei macrofagi infetti, ma non in macrofagi ingenui. Questa schermata macrofagi è stata utilizzata per interrogare una libreria di T. gondii mutanti inserzionali per fine identificare i geni T. gondii importanti per la resistenza a ossido nitrico 27,28. L'isolamento di un pannello di mutanti T. gondii con resistenza ridotta alla attivazione di macrofagi infettati, in particolare una marcata sensibilità per ossido nitrico, dimostrato l'utilità di schermo per identificare geni parassita importanti per la resistenzaai mediatori di cellule dell'immunità autonome diverso i meccanismi di resistenza descritti per i IRG murini 28. Mutagenesi inserzionale presenta vantaggi rispetto mutagenesi chimica in termini di generazione di un numero limitato di mutazioni casuali in ogni clone parassita e, in teoria, più facile identificazione del sito di mutazione. Tuttavia, identificando il sito di inserzione del plasmide genomico in T. mutanti inserzionali gondii, in pratica, è stato sorprendentemente difficile in molti casi 37. Inserimento di un plasmide in un gene è anche probabile che interrompere la funzione di un gene in contrasto mutagenesi chimica che provoca tipicamente cambiamenti singolo nucleotide. Tuttavia, mutagenesi chimica sia con N-etil-N-nitrosourea (ITA) o sulfonato ethylmethane (EMS) può offrire una maggiore capacità di analizzare una porzione più ampia del genoma del parassita, rispetto alla mutagenesi inserzionale, in quanto crea più polimorfismi a singolo nucleotide ( stimato a 10 -100) per mutante 34, 38. Inoltre, i recenti progressi in tutto il profiling genoma ha reso possibile l'utilizzo di sequenziamento di nuova generazione per identificare i geni candidati più probabili responsabili del fenotipo identificato di un parassita mutato 34,38. Indipendentemente dal metodo mutagenesi, conferma del ruolo del gene parassita resistenza alla attivazione dei macrofagi richiede infine delezione genica e complementazione di soddisfare postulati di Koch molecolare.

La capacità di analizzare la funzione di un gene mediante manipolazione genetica sia del parassita e macrofagi è importante in quanto molti dei geni identificati tramite genetica diretta in T. gondii, così come altri agenti patogeni, sono ancora caratterizzati come geni ipotetici con poca o nessuna omologia di sequenza con altre proteine ​​con funzioni note. La carta corrente delinea un approccio generale che può essere utilizzato per identificare se il gene interrotto in un mutante è importante per la resistenza ad una nota osconosciuto mediatore della cellula immunità autonoma. L'analisi iniziale di accoglienza fattori antimicrobici è effettuata valutando la sopravvivenza di tipo selvatico e parassiti mutanti in macrofagi da topi wild type rispetto a quelli con specifiche delezioni geniche in ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS), gp-91 phox (NADPH ossidasi), e specifiche GTPasi legate all'immunità (IRG). Questo determinerà se i geni identificati parassita sono importanti per la resistenza a ossido nitrico, intermedi reattivi dell'ossigeno o legate all'immunità GTPases 28 rispettivamente o se un meccanismo immunitario sconosciuto è coinvolto. L'attivazione dei macrofagi infetti sia con IFN-γ e LPS, descritti nel protocollo attuale, si traduce principalmente nel isolamento di geni importanti per la resistenza dei parassiti a ossido nitrico 28. L'uso di agenti farmacologici che inducono ossido nitrico in assenza di attivazione dei macrofagi (donatori di ossido nitrico) ha confermato che la maggior parte dei geni identificati fosse importante per riresistenza a ossido nitrico, piuttosto che l'ossido di azoto in concerto con i mediatori aggiuntivi associati macrofagi attivazione 28.

Fase uno e due descrivono uno schermo genetica avanti volto a isolare i mutanti del parassita con un difetto di forma fisica dopo l'attivazione dei macrofagi del midollo osseo infette in vitro. Passo si descrive un'analisi titolazione della dose per determinare empiricamente una dose di IFN-γ e LPS da utilizzare per l'attivazione dei macrofagi, che riduce la replicazione del parassita, ma non inibisce completamente la replica di tipo T. selvaggia ceppo parentale gondii che viene utilizzato per la creazione della biblioteca di mutanti del parassita. Fase due descrive la schermata genetica avanti dei cloni mutanti nei macrofagi in piastre da 96 pozzetti. Fase tre delinea un approccio per confermare il fenotipo di ogni mutante identificato nella schermata dei 96 pozzetti e di valutare se il difetto in ogni mutante influenza la sopravvivenza del parassita, la replica,o di produzione cisti in risposta all'attivazione dei macrofagi. Fase quattro descrive l'uso di macrofagi del midollo osseo da topi con delezioni in specifiche vie antimicrobiche per identificare i mediatori immunitari a cui il mutante parassita è specificamente sensibili. Fase cinque delinea un approccio per determinare se un mutante parassita è anche compromesso da in vivo patogenesi come valutato dalla produzione cisti nel cervello dei topi infettati.

Protocol

NOTA: Tutti i protocolli che prevedono l'uso di animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali del New York Medical College and Use Committee.
NOTA: dettagliata protocolli per mutagenesi chimica 38, isolamento di parassiti, limitando la diluizione 38, isolamento di murine macrofagi midollo osseo derivate 39, la crescita di T. gondii in fibroblasti prepuzio umano (HFF) cellule e cisti produzione nei macrofagi e analisi di base immunofluorescenza (IFA) 32 viene fatto riferimento. Eseguire tutti coltura cellulare a 37 ° C in 5% CO 2 in mezzi D10 (Dulbecco Modified alta glucosio Eagle Medium supplementato con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina) . Conservare tutti i reagenti sterili tutto isolamenti cellulari e colture cellulari.

1. La titolazione della dose di IFN-γ e LPS per determinare la Concentrni utilizzare per attivare macrofagi infetti per lo schermo Forward Genetics

  1. Culture osseo murino derivate dal midollo macrofagi O / N a otto vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di D10 supporti per ogni camera. Utilizzare macrofagi di uno o due settimane dopo l'isolamento dal midollo osseo.
    NOTA: diapositive Camera sono acquistati che hanno una crescita RS migliorando lavare.
  2. Utilizzare un emocitometro per contare i parassiti di tipo selvatico raccolti da fibroblasti prepuzio umano (HFF), le cellule coltivate in un pallone di coltura tissutale T25. Risospendere parassiti ad una concentrazione di 5 x 10 5 Tipo parassiti selvatici per ml in mezzi D10. Questa concentrazione si tradurrà in una molteplicità di infezione di circa 1: 1 come i macrofagi sono moltiplicate O / N. Utilizzare provette di polistirene o PET per tutte le manipolazioni con i parassiti come i bastoncini parassita polipropilene.
  3. Rimuovere il supporto D10 nelle diapositive da camera e sostituirlo con 250 microlitri dellasospensione del tipo parassiti selvatici. Aggiungere delicatamente la sospensione parassita ciascuna camera della slitta consentendo di scorrere lungo la faccia interna di ciascuna camera. Non permettere macrofagi si asciughino in qualsiasi momento durante il protocollo.
  4. Copertina diapositive da camera infettati con i parassiti con il coperchio scorrevole della camera e posto in un incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 per 4 ore per dare il tempo per il parassita di invadere e stabilire un PV.
  5. Effettuare diluizioni di LPS e IFN-γ in 1 ml di mezzi D10 in provette sterili per le titolazioni di dosaggio. Per la dose titolazioni mantenere sia LPS o costante concentrazione IFN e variano l'altro stimolo 40.
    1. Ad esempio, mantenere LPS costante a 10 ng per ml LPS e variare la concentrazione di IFN-γ (0, 1 unità / ml, 10 unità / ml, 100 unità / ml, 1.000 unità / ml). Tenere IFN-γ costante a 100 unità / ml e variare la concentrazione di LPS (0, 0,1 ng / ml, 1 ng / ml, 10 ng / ml, 100 ng / ml). Brevemente agli ultrasuoni magazzino LPS per 2 min senzariscaldamento in un bagno sonicatore (non con un sonicatore punta) prima della diluizione.
      NOTA: Sonicazione si consiglia di interrompere aggregati micelle formate da LPS che non possono vincolare adeguatamente per ospitare le cellule.
  6. 4 ore dopo l'inizio della co-coltura tra i parassiti e macrofagi aderenti nella camera di diapositiva, scartare il supporto D10 in ciascuna camera e sostituirlo con 300 ml di diluizioni appropriate di IFN-γ e LPS in mezzi D10. Include un controllo con solo supporti D10 per valutare replica parassita in assenza di attivazione dei macrofagi.
  7. Re-cover diapositive da camera con il coperchio scorrevole della camera e posto in un incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 per 24 a 30 ore aggiuntive.
    NOTA: Il tempo di incubazione dipende dal tempo di raddoppio del ceppo wild type parassita che può variare 6-12 ore a seconda del ceppo parassita. Un punto di tempo viene scelto prima parassita lisi dei macrofagi ingenui, ma abbastanza a lungo da permettere almeno 3-4 doutempi bling.
  8. Fare una soluzione di formaldeide 2,5% in tampone fosfato di Dulbecco (PBS). Eliminare i media nella diapositiva da camera e sostituirlo con 300 ml di soluzione di formaldeide 2,5%. Fix per 20 minuti a temperatura ambiente.
  9. Slitta Rinse (s) due volte con 300 ml di PBS per ogni camera. Per ogni risciacquo, scartare il PBS nel vetrino e nuova PBS delicatamente la superficie interna di ciascuna camera di scorrimento per non ostacolare i macrofagi aderito alla slitta. Aggiungere 300 ml di PBS per camera e il coperchio posto sul vetrino della camera per evitare che scivoli si secchi prima della colorazione.
    NOTA: Le diapositive possono essere posizionato a 4 ° C per un massimo di 3 giorni in questo punto prima della colorazione.
  10. Protocollo di colorazione per T. rilevamento gondii microscopio immunofluorescenza (IFA).
    1. Effettuare una soluzione allo 0,2% Triton X-100 in PBS (tampone di permeabilizzazione). Porre la soluzione in un tubo a 37 ° C bagnomaria e brevemente vortice di garantire il Triton X-100 va in soluzione. Eliminare ilPBS nelle diapositive da camera e sostituirlo con 300 ml di buffer permeabilizzazione. Lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
    2. Fare una soluzione di siero di capra 10% in PBS (soluzione bloccante). Eliminare il buffer permeabilizzazione nella diapositiva e sostituire con 300 ml di soluzione bloccante per ogni camera. Lasciare a temperatura ambiente per 30 min.
      NOTA: il siero fetale di vitello può essere sostituito con siero di capra in tutti i protocolli di colorazione.
    3. Per un protocollo di colorazione IFA un passo, fare una diluizione 1: 1000 di un anticorpo fluorescente coniugato T. gondii nel bloccare soluzione. Rimuovere la soluzione di blocco da diapositive e aggiungere 150 ml di soluzione di anticorpi per ogni camera. Riposizionare il coperchio scorrevole sul vetrino della camera per evitare che le cellule si secchi. Incubare per 1 ora a RT.
      NOTA: concentrazione di anticorpo deve essere determinata empiricamente a seconda della sorgente. Anticorpo viene acquistato direttamente coniugato ad un fluorocromo o coniugato ad un fluorocromo dall'utente.
      1. Per due fasi IFA colorazioneprotocollo con un anticorpo coniugato a T. gondii e un anticorpo secondario coniugato fluorescente, diapositive macchia con 150 ml di anticorpo primario non coniugato contro T. gondii in tampone bloccante per 1 ora a RT. Sciacquare 3x con 300 ml di PBS più siero di capra 1% (tampone di lavaggio).
      2. Aggiungere 150 ml di anticorpo secondario fluorescente coniugato specifici per la specie di origine per l'anticorpo primario. Riposizionare il coperchio scorrevole sul vetrino della camera per evitare che le cellule si secchi. Incubare per 1 ora a RT.
    4. Sciacquare i vetrini 3x con PBS più siero di capra 1% (tampone di lavaggio). Per ogni risciacquo, rimuovere la soluzione nella camera di diapositive scaricando i suoi contenuti e sostituirlo con 300 ml di tampone di lavaggio.
    5. Sciacquare i vetrini 2x con 300 ml di PBS.
    6. Togliere la camera dalla diapositiva camera secondo le istruzioni del produttore.
    7. Montare i vetrini con supporto contenente DAPI montaggio (4'6-diamidino-2-fenilindolo, Dilattato) e 22 mm x 50 millimetri coprioggetto.
  11. Esaminare i vetrini con contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Determinare il numero medio di parassiti per vacuole esaminando un minimo di 100 PV per camera di bene. La dose scelta di IFN-γ e LPS per lo schermo deve essere sufficiente per sopprimere, ma non impedisce, replica di parassiti wild type (vedi Figura 1).

2. Isolamento di Parasite Mutants con un fitness difetto dopo l'attivazione di macrofagi infetti

NOTA: Una libreria di T. casuale mutanti gondii è necessario per la schermata di genetica in avanti. Mutagenesi casuale di T. gondii può essere eseguita da chimica (ITA / EMS) o mutagenesi inserzionale 27,28,38. A seguito di mutagenesi, parassiti clone limitando la diluizione e crescere singoli cloni in piastre da 96 pozzetti contenenti cellule HFF aderenti in un volume di 200 ml di supporti D10 32,38.E 'fondamentale che le piastre a 96 pozzetti per lo screening di parassiti in macrofagi mediante microscopia ottica hanno fondi per consentire lo screening microscopica. Contrasto di fase e microscopia a fluorescenza per lo screening macchiati piastre a 96 pozzetti richiede un microscopio a fluorescenza invertito con contrasto di fase 4, 10, 20 o obiettivo 40X attrezzato per lunghe distanze di lavoro. Un obiettivo 4X è utile per vedere l'intero perfetto ma migliore risoluzione dei parassiti viene raggiunto con l'obiettivo 20X.

  1. Trasferire 50 ml di mutanti tachizoiti coltivate in cellule HFF confluenti in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti in due replicano piastre a 96 pozzetti contenenti macrofagi derivate dal midollo osseo di topo (1-2 settimane dopo l'isolamento) in 100 ml di mezzi D10.
    NOTA: Eseguire la schermata iniziale in piastre da 96 pozzetti del parassita in base al volume della cultura parassita per evitare di dover contare il numero di parassiti trasmessi per ciascun pozzetto. Pertanto, l'analisi di microscopia a 2,6 si basa su qualitativamente tavoer i parassiti sono in genere replicate o meno replicato. Fase 3 descrive l'approccio di confermare il fenotipo dei mutanti in diapositive da camera con un numero uguale di tipo selvatico o parassiti mutanti di infettare i macrofagi.
    1. Direttamente aggiungere parassiti ai media D10 già in ogni pozzetto. Infettare due pozzi con tipo tachizoiti selvatici come controllo positivo per la replica del parassita.
  2. Porre le cellule infette in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 4 ore per consentire parassiti tempo di invadere le cellule e creare la PV.
  3. Rimozione di supporti da una piastra a scarico il contenuto della piastra. Utilizzare una sola vibrazione del polso di scaricare i media nella piastra in una vasca di scarto contenente un Cidal detersivo per i parassiti.
    1. Aggiungere 100 ml di "supporti l'attivazione dei macrofagi" utilizzando un bacino sterile per i media e una pipetta multicanale. Utilizzare la concentrazione ottimale di LPS e IFN-γ determinata dal passo 1 per il macmezzi di attivazione rophage. Allo stesso modo rimuovere il supporto dalla piastra di controllo duplicato e sostituirlo con 100 ml di mezzi D10.
  4. Porre le cellule infette in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per un ulteriore 24-30 hr.
  5. Protocollo di colorazione per piastre a 96 pozzetti per IFA.
    1. Eliminare i media nel piatto e sostituirlo con 100 ml di 2,5% di formaldeide in PBS. Incubare per 20 minuti a RT. Utilizzare un bacino sterile per la formaldeide e una pipetta multicanale.
    2. Eliminare la soluzione di formaldeide nella piastra e aggiungere 100 microlitri di PBS per lavare formaldeide dalla piastra.
    3. Eliminare la soluzione nella piastra e aggiungere 100 ml di tampone di permeabilizzazione (PBS con 0,2% Triton X-100) a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a RT.
    4. Eliminare la soluzione nella piastra e aggiungere 100 ml di soluzione di bloccaggio (PBS con siero di capra 10%) a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a RT.
    5. Eliminare la soluzione nella pin ritardo. Aggiungere 50 ml / pozzetto di un anti T. fluorescente coniugato anticorpo gondii diluito 1: siero di capra 1000 in PBS più 1%. Incubare per 1 ora a RT con il coperchio e piastra su un bilanciere.
      1. In alternativa, utilizzare un anticorpo primario non coniugato contro T. gondii seguita da colorazione con un anticorpo secondario coniugato fluorescente come descritto in 1.10.3.1.
    6. Eliminare la soluzione di anticorpi nel piatto e sostituirlo con 100 ml / pozzetto di PBS più siero di capra 1%. Eseguire questo 3x risciacquo seguito da 2 risciacqui aggiuntivi con solo PBS. Lasciare 200 microlitri di PBS in ciascun pozzetto e sostituire il coperchio sulla piastra da 96 pozzetti per evitare i pozzetti da essiccazione.
      NOTA: La piastra con il coperchio può essere avvolto in parafilm e posto a 4 ° C per 3 giorni prima analisi al microscopio.
  6. Esaminare le cellule al microscopio a fluorescenza rovesciato con un obiettivo 20-40x. Selezionare i mutanti che replicano nella na &# 239; ve piatto macrofagi, ma soprattutto non riescono a replicare oltre un parassita / vacuole in "macrofagi attivati" o che appaiono amorfa o degradati in "macrofagi attivati".
    NOTA: Il numero di parassiti di tipo selvatico per vacuolo dipende dalla dose di IFN-γ e LPS utilizzati ma idealmente è di circa 4 parassiti per vacuole; un numero che riflette soppressione della crescita ma non completa inibizione della replicazione dallo stimolo di attivazione.

3. Valutare i Mutanti per determinare se il difetto è a livello di Parasite sopravvivenza o di replica dopo l'attivazione dei macrofagi infetti

  1. Trasferimento scelto mutanti parassiti da piastre a 96 pozzetti (contenuti dell'intero bene) per T25s contenenti cellule HFF e consentire la replica.
  2. Culture midollo osseo macrofagi derivati ​​O / N a 8 vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di supporti D10. Preparare una diapositiva per confrontare pareplica rasite in macrofagi ingenui e uno scivolo ulteriore per confrontare replica parassita dopo l'attivazione dei macrofagi infetti.
  3. Harvest parassiti tachizoiti e contano in un emocitometro. Aggiungere 5 × 10 4 T. gondii parassiti ad una camera ben contenente macrofagi nei media e nella cultura D10 per 4 ore. Includere un pozzetto con wild type parassiti genitori come controllo. Seminare uno scivolo replicare identico con lo stesso clone parassita che non riceverà supporti attivazione al fine di monitorare la replica di parassiti in macrofagi naïve.
  4. Eliminare supporti D10 dal 1 delle diapositive da camera replicati e sostituirlo con 250 ml di "mezzi di attivazione". Eliminare supporti D10 dall'altra vetrino camera di replicare e sostituirlo con 250 ml di mezzi D10. Incubare sia il "attivati" e "naif" slide macrofagi con il coperchio scorrevole sulla camera a 37 ° C e 5% CO 2 per un additionale 24-30 ore.
  5. Fix, permeabilize, e scivoli blocco per IFA colorazione e l'analisi dei parassiti, come descritto al punto 1. Eseguire IFA colorazione con le camere intatti.
    1. Cellule Co-macchia con un anticorpo di membrana lisosomiale 1 associato (LAMPADA1) o Lysotracker e gli anticorpi del T. gondii per valutare se l'attivazione dei macrofagi infetti sta provocando la fusione delle PV mutanti con i lisosomi (Figura 4).
    2. Usare anticorpi contro specifici comparti / organelli all'interno del parassita / PV per la colorazione da IFA per identificare alterazioni del mutante parassita che sono evidenti presto seguito macrofagi attivazione 28.
      NOTA: Tali alterazioni possono fornire una conoscenza del meccanismo che sta alla base del deficit di sopravvivenza / replica del mutante dopo l'attivazione dei macrofagi.
  6. Esaminare i vetrini con un microscopio a fluorescenza e obiettivo 100X olio fase.
    1. Valutare replica parassita determinando lanumero di parassiti per fotovoltaico in 100 vacuoli casuali. Eseguire almeno 2 conti di 100 vacuoli ciascuno per l'analisi statistica.
    2. Valutare morfologia parassita generale utilizzando sia analisi di fluorescenza e microscopio a contrasto di fase. Vedi parassiti sotto dell'obiettivo 100x fase. Parassiti sani hanno parassiti ermeticamente racchiuso all'interno di un vacuolo parassitoforo aderente. Parassiti che hanno amorfi vacuoli spaziose con fase cerchi dense o parassiti amorfi suggeriscono parassita morte piuttosto che solo un difetto in replica (figure 1 e 3).

4. Valutare se la suscettibilità di Mutant Parassiti per attivazione dei macrofagi infetti è associato a noti mediatori anti-microbiche

  1. Isolare macrofagi derivate dal midollo osseo da wild type C57 / BL6 topi, iNOS - / -, gp91-phox - / - o Irgm1 / Irgm3 - / - mice 32.
  2. Mac Cultura rispettivo midollo osseo derivaterophages O / N a 8 vetrini camera ad una concentrazione di 3 x 10 5 cellule / ml in 250 ml di supporti D10.
  3. Procedere con la sfida parassita, IFA colorazione e l'analisi come descritto al punto 3.
  4. Determinare se la capacità dei parassiti mutanti per sopravvivere e replicarsi dopo l'attivazione dei macrofagi infetti viene ripristinato in assenza di ossigeno reattivo o specie di azoto o immunità specifica GTPases 28 connessi.
  5. Utilizzare agenti farmacologici, come donatori di ossido di azoto, per valutare se specifici mediatori anti-microbici sono sufficienti da soli a mettere in pericolo i parassiti mutanti nelle cellule HFF o macrofagi ingenui o se agiscono solo di concerto con altri mediatori di macrofagi attivazione 28.

5. Valutare se il difetto nella infezione cronica Mutant Parasite Compromessi

  1. Isolare tachizoiti da wild type, mutante o gene cancellato parassiti mirati cresciuta in T25s containing cellule HFF. Parassiti devono essere appena lisati da colture HFF.
  2. Conte parassiti con un emocitometro. Parassiti Risospendere in soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) ad una concentrazione appropriata per ml per una dose subletale del parassita consegnato in 200 microlitri da iniezione intraperitoneale (IP).
  3. Utilizzare una siringa tubercolina 1 ml e 25 G ago per iniettare parassiti, con un volume di 200 ml per via intraperitoneale (IP). La dose dipende dal tipo ceppo selvatico del parassita e il genotipo mouse.
    NOTA: di tipo I genotipi del parassita sono letali per i topi durante la fase acuta dell'infezione, indipendentemente dalla dose parassita e non sono adatti per gli studi di infezione cronica in assenza di chemioterapia per T. gondii per sopprimere la replicazione del parassita.
  4. Trenta giorni dopo sfida parassita, sacrificare i topi per inalazione di CO 2 da un serbatoio pressurizzato in una camera poco affollato (una gabbia standard di dimensione del mouse può contenere non più di 5 mghiaccio) seguita da dislocazione cervicale.
  5. Isolare il cervello dal mouse utilizzando procedure stabilite 41-43.
    1. Posare il mouse sul lato anteriore. Spruzzare la testa con etanolo al 70% per sterilizzare l'area.
    2. Utilizzare forbici affilate per tagliare il tronco cerebrale. Utilizzare forbici dissezione per fare un taglio superficiale lateralmente attorno destra e poi il lato sinistro del cranio partendo dalla base del tronco cerebrale. Utilizzare pinze a buccia delicatamente indietro il cranio per esporre il cervello.
    3. Sollevare delicatamente le forbici del cervello e tra il cervello e la base del cranio, per tagliare il nervo olfattivo per liberare il cervello. Estrarre il cervello con pinza sterile o una spatola e mettere in un piatto Petri batteriologico contenente 10 ml di PBS sterile.
  6. Tagliare il cervello a metà con un bisturi sterile attraverso il centro tra il emisferi destro e sinistro.
  7. Aggiungere metà del cervello di un piccolo mortaio contenente 1 ml di PBS. Utilizzare il mortaio e pestello perfare una sospensione di tessuto pregiato del cervello che può passare attraverso un ampio foro 20-200 microlitri punta della pipetta.
    NOTA: L'altra metà del cervello deve essere fissato in 2,5% di formaldeide per 1 ora se sono necessarie sezioni di tessuto per istopatologia.
  8. Mettere 100 ml di lisato cervello in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml. Aggiungere 1 ml di 2,5% di formaldeide in PBS nella provetta contenente il lisato cervello per riparare la sospensione cervello per la colorazione. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  9. Centrifugare il lisato a 8000 xg per 5 minuti in una microcentrifuga e scartare con cura il supernatante.
  10. Aggiungere 1 ml di permeabilizzazione / tampone bloccante al lisato (siero di capra 10%, 0,2% Triton X-100 in PBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
  11. Centrifuga lisato a 8.000 xg per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
  12. Aggiungere 200 ml di FITC-coniugato dolico biflorus agglutin (DBA). Utilizzare una diluizione 1: 100 della lectina in PBS più siero di capra 10%. Risospendere delicatamente il lisato pipettando. Covareper 1 ora a RT.
    NOTA: DBA è un ligando che si lega CST1 sulla parete parassita cisti.
  13. Centrifuga lisato a 8.000 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. Aggiungere 1 ml di PBS al pellet. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere PBS lavaggio 3x. Eliminare il surnatante termine del lavaggio finale con una pipetta.
  14. Utilizzare un ampio foro 20-200 microlitri punta della pipetta di redigere 5 ml di lisato cervello macchiato e posto su un vetrino da microscopio. Montare il vetrino con una copertura di slittamento mm 25 x 25 per creare un supporto umido del lisato cervello. Fai 3 scivoli replicati con 5 ml di cervello lisato ciascuno.
  15. Contare il numero di cisti per ciascuna aliquota 5 ml al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 10X (Figura 6).
    NOTA: Alcune cisti sono grandi (8 o più parassiti circa), mentre alcuni sono molto piccole (1-2 parassiti per cisti). Contare il numero totale di cisti per ciascun numero di diapositiva ma documento del gran numero di contro piccole cisti.
  16. Aggiungere il numero di cisti detette in tre diverse aliquote 5 microlitri e moltiplicare per il fattore di diluizione totale x 2 (solo la metà del cervello è stata fatta in un lisato) per stimare il numero di cisti totali per il cervello.

Representative Results

Toxoplasma gondii replica liberamente nei macrofagi naïve e ha un tempo di raddoppio tra 6-12 ore a seconda del ceppo del parassita. La figura 1 mostra i parassiti di rappresentanza in ingenuo rispetto macrofagi derivate dal midollo osseo attivate. La figura 2 mostra la morfologia generale di parassiti in HFF cellule ospiti a 2, 4, 8, 16 e 32 parassiti / PV. Nel protocollo attuale, il parassita è permesso di invadere macrofagi naïve e stabilire un vacuolo nascente parassitoforo (PV) prima della consegna di uno stimolo di attivazione potente, LPS e IFN, ai macrofagi infetti. In questo modello, la replica di tipo parassiti selvatici è rallentata, ma la replica parassita procede ancora per circa 24 ore durante il quale i macrofagi diventano progressivamente più abili a inibire la replicazione del parassita. Lo schermo è progettato per funzionare come un modello di concorrenza modificato tra il tempo richiesto per un potente macrofagictivation funzione del tempo durante il quale il tipo selvatico o parassita parassita mutante possono continuare a replicare nel suo PV. Il primo passo nella schermata è scegliere una dose di LPS e IFN-γ da utilizzare per l'attivazione dei macrofagi infetti. La dose è empiricamente determinata valutando replica parassita macrofagi attivati ​​con un dosaggio costante di IFN-γ in combinazione con un intervallo di concentrazioni LPS o una dose costante di LPS con una gamma di concentrazioni IFN (Fase 1). La dose di stimoli di attivazione deve essere valutato per i genitori parassiti wild type utilizzati per la creazione dei mutanti parassita di mutagenesi chimica o inserzionale. Idealmente la dose di LPS e IFN-γ permetterà replica parassita ad una media di 2-8 parassiti per PV 24-30 ore dopo l'attivazione rispetto al 8-16 parassiti per PV in macrofagi naïve (Figure 1 e 2).

Una volta che la concentrazione adeguata di LPS e IFN-^7; è determinato, i mutanti sono proiettati in fondo ottica piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti. Il fondo ottico piastre è importante perché irregolarità nella plastica che viene utilizzata per piastre di coltura dei tessuti tradizionali rende difficile ottenere la risoluzione appropriata per schermare i parassiti di contrasto di fase e microscopia a fluorescenza. Contrasto di fase e microscopia di fluorescenza delle piastre a 96 pozzetti richiede anche un microscopio a fluorescenza invertito con contrasto di fase 4, 10, 20 o 40x obiettivo attrezzato per lunghe distanze di lavoro. Mutanti sono proiettati in lastre ripetute contenenti macrofagi derivate dal midollo osseo di topo. Dopo sfida con mutanti del parassita, macrofagi infetti nei pozzetti di una piastra sono attivati ​​con LPS e IFN-γ, mentre l'altra piastra contenente macrofagi infettati è coltivato in soli mezzi D10. Le piastre vengono incubate a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-30 ore dopo l'aggiunta di LPS e IFN-γ. Dopo l'incubazione, le cellule sono fissa, macchiato per i parassiti e analizzati da IFA utilizzando sia fluorescenza e microscopia a contrasto di fase. Mutanti sono selezionati che hanno numeri normali parassiti e la replica in macrofagi naïve, ma un minor numero di parassiti o vacuoli più piccole con un numero inferiore di parassiti in macrofagi infetti che vengono attivate. Una volta mutanti sono selezionati devono essere nuovo controllo in camera di diapositive (fase 3) in macrofagi attivati ​​ingenua e in due esperimenti indipendenti per consentire l'analisi di parassita della morfologia con ingrandimenti maggiori (obiettivo 100X e petrolio) e per confermare che hanno normale replica in macrofagi naïve ma un difetto di replica / sopravvivenza dopo l'attivazione dei macrofagi.

I fenotipi dei mutanti con difetti di resistenza alla attivazione dei macrofagi infetti in genere rientrano in due grandi categorie: i parassiti che appaiono morfologicamente intatto, ma non sono in grado di replicare al di là di un singolo parassita per PV; e parassiti che sembrano essere Degraded e può anche essere in amorfi PV spaziose (Figure 1 e 3). La morfologia e ultrastruttura del parassita e PV è visualizzato la meglio su diapositive utilizzando un obiettivo e olio 100X e al microscopio a contrasto di fase in combinazione con l'analisi di fluorescenza. La colorazione dei parassiti per IFA con un anticorpo di membrana lisosomiale associata proteina-1 (LAMP1) è utile per determinare se il difetto nel mutante è associato ad una incapacità del PV per evitare la fusione con i lisosomi. In figura 4 è un parassita entro un fagolisosoma (LAMP1 positivo) contro un parassita che è in un PV che è in gran parte separata dal sistema endocitico della cellula ospite (LAMP1 negativo). Il fagolisosoma è evidente da una solida fascia continua di LAMPADA1 sforzare intorno all'intera parassita. Al contrario, un PV ha spesso organelli lisosomi nella zona ma non fascia continua di LAMP1 colorazione attorno alla sua circonferenza. L'uso di anticorpi definite strutture / organelli all'interno tlui parassita e / o PV sono utili in seguito studi IFA per identificare anomalie in ogni mutante associato con l'attivazione dei macrofagi infetti. Tali interrogatori con anticorpi possono approfondire la conoscenza dei meccanismi che sono alla base del difetto di replica / sopravvivenza in un mutante. Ad esempio, la Figura 5 mostra il T. mitocondrio gondii macchiato con l'anticorpo monoclonale anti-5F4 F1 ATPasi subunità beta (un gentile dono di Peter Bradley) 24 ore dopo l'attivazione dei macrofagi infettati da parassiti wild type o mutanti parassiti. T. gondii è stato co-tinto con un anticorpo monoclonale anti-T. gondii anticorpi. Tipo selvaggio T. gondii ha un unico mitocondrio che si estende attorno alla circonferenza del parassita. Mitocondrio unica del parassita di tipo parassiti selvatici dopo l'attivazione dei macrofagi infettati era intatto rispetto ad un mitocondrio frammentato in parassiti mutanti. I mitocondri frammentazione era evidente non solo in degradate / amorfoparassiti, ma anche in parassiti che hanno mostrato un normale morfologia valutata mediante microscopia a contrasto di fase. Ciò suggerisce che il difetto nel mutante parassita può aumentare la suscettibilità del mitocondrio parassita ospitare mediatori cellulari indotti da attivazione dei macrofagi.

L'attuale modello utilizza una combinazione di IFN-γ e LPS per attivare i macrofagi infetti. Γ IFN stimola il fattore di trascrizione STAT1. LPS, come TNF-α, stimola il fattore di trascrizione NF-kB. IFN-γ Conosciuto mediatori antimicrobici -dipendenti importanti nella cella immunità autonoma contro T. gondii comprendono una serie di IFN-γ-dipendente GTPases legate all'immunità (IRG, Gbps) e reattive di ossigeno e azoto specie in aggiunta ad altri agenti. Per determinare se il difetto in ogni mutante è specificamente associata con la produzione di IFN-γ noto mediatori antimicrobici -inducible, macrofagi del midollo osseo sono isolati daliNOS - / -, gp 91 phox - / - o gene cancellato topi IRG / GBP specifici e analizzati per l'attività contro i parassiti mutanti. La combinazione di IFN-γ e LPS di attivare i macrofagi infetti si traduce preferenzialmente in mutanti con una maggiore suscettibilità a ossido nitrico rispetto al tipo selvaggio parassiti 28.

L'attivazione dei macrofagi infetti può indurre la differenziazione fase dei parassiti dal tachizoiti a bradyzoites contenuti in cisti tissutali. Tali cisti sono caratteristici di infezione cronica. Così, mutanti parassita che sono difettosi per la replica / sopravvivenza dopo l'attivazione dei macrofagi infetti possono essere difettosi per la conversione di cisti durante l'infezione in vivo. Al fine di valutare la produzione di cisti durante l'infezione cronica, i topi sono chiamati per via intraperitoneale (ip) con una dose non letale del parassita ceppo parentale o il clone mutante. Le cisti nell'intervallo cervello nel formato da meno di 10 _6;. M di diametro maggiore di 50 micron, come mostrato in figura 6 Contare il numero di grandi e piccole cisti di IFA ma mantengono i conteggi separati al fine di determinare se il mutante parassita è compromessa per produzione totale cisti o solo per lo stabilimento e manutenzione di grandi cisti.

Figura 1
Figura 1. ingenui macrofagi derivate dal midollo osseo di topo sono permissive per la replica di T. gondii ma attivazione con IFN-γ e LPS inibisce sostanzialmente replica. (A) A vacuolo parassitoforo (PV) del wild type T. gondii 24 ore dopo l'invasione dei macrofagi del midollo osseo murino naïve. (B) A PV di selvaggio tipo T. gondii Parassiti composto da quattro parassiti per vacuole 24 ore dopo l'attivazione dei macrofagi infetti.(C) Un esempio di un parassita mutante incapace di replicarsi e ancora in un'altra parassita / PV 24 ore dopo l'attivazione dei macrofagi infettati. (D) Un esempio di un parassita mutante che appare degradata amorfo PV 24 ore dopo l'attivazione dei macrofagi infettati . La riga superiore mostra immagini di fase dei parassiti e la riga in basso mostra le immagini fluorescenti con un anti-siero policlonale contro T. gondii. La barra della scala rappresenta il 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2
Figura 2. Parasite replica valutato per il numero di parassiti per fotovoltaico. Le immagini mostrano 2, 4, 8, 16 e 32 per i parassiti PV nelle cellule HFF. Ogni immagine è una immagine fusa fase thin mostra policlonale anticorpi colorazione del parassita in rosso e il nucleo HFF in blu (DAPI). La barra della scala rappresenta il 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3. Mutants presentano una serie di fenotipi dopo l'attivazione di macrofagi infettati. La colonna di sinistra è un'immagine di fase del parassita nei macrofagi, colonna centrale è un'immagine fluorescente utilizzando un anticorpo a T. gondii, e la colonna di destra è una fusione della fase e l'immagine fluorescente. Il parassita è mostrato in verde e il nucleo macrofagi in blu. La barra della scala rappresenta il 5 micron. Cliccate qui per vedere una più grandeversione di questa figura.

Figura 4
Figura 4. LAMP1 colorazione distingue PV da phagolysomes-contenenti parassiti. I parassiti sono colorate con un policlonale anti T. gondii anticorpi (rosso) e LAMPADA1 con il mAb 1D4B (verde). Una freccia indica un PV parassita che ha fuso con i lisosomi. Il parassita, senza la freccia è in un vacuolo parassitoforo (PV), che non ha fuso con i lisosomi. La barra della scala rappresenta il 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5
Figura 5. parassiti wild type mantenere un mitocondrio intatto mentre le mitochondrisu è degradata in mutanti parassiti seguenti attivazione dei macrofagi infetti. mitocondrio (verde) di tipi di parassiti selvatici (pannello superiore) rispetto ai tre diversi T. mutante gondii parassiti a diversi stadi di degradazione (in basso tre pannelli) 24 ore dopo l'attivazione dei macrofagi infetti. La barra della scala rappresenta il 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Individuazione delle cisti di parassiti nel cervello utilizzando Dolichos FITC-coniugati biflorus lectina. La parete cisti etichettato con la lectina viene visualizzato in verde. La barra della scala rappresenta 50 micron. Cliccate qui per vedere un grande version di questa figura.

Discussion

Il protocollo descritto fornisce un approccio non-polarizzato che utilizza attivazione dei macrofagi murini derivate dal midollo osseo e la genetica avanti per isolare T. mutanti gondii con un difetto nella loro capacità di sopravvivere attivazione dei macrofagi infetti. Il fenotipo dei mutanti dopo l'attivazione dei macrofagi cade in genere in una delle due grandi categorie: 1) I parassiti appaiono intatte ma non riescono a replicare oltre 1 parassita per PV; 2) I parassiti apparire di qualità inferiore e possono essere in ampie PV, amorfi. Il fatto che i mutanti hanno un fenotipo come parassiti wild type in macrofagi naive in assenza di attivazione dimostra il protocollo può specificamente essere utilizzato per identificare mutanti che sono specificamente compromettere la capacità di resistere attivazione dei macrofagi. L'uso di macrofagi derivati ​​dal midollo osseo primario è raccomandato contro la linea cellulare 264.7 macrofago RAW per lo schermo perché la morfologia dei parassiti e il numero parassita per vacuole sono più facilmente visualizzati in macrofagi derivate dal midollo osseo.

La schermata descritta in combinazione con la genetica avanti fornisce uno strumento versatile per analizzare i geni del parassita e le vie in ultima analisi genetiche importanti per la resistenza ai mediatori specifici di cellule dell'immunità autonoma. Tali studi di genetica previsionali sono importanti per identificare i geni di parassiti che possono essere seguiti come una stringa per iniziare svelare percorsi parassiti importanti per resistere specifici mediatori antimicrobici sia in vitro e durante patogenesi. Una difficoltà precedenti con approcci genetici in avanti è stato l'identificazione del gene chiave interrotto in ogni mutante. Cosmide biblioteca complementazione in T. gondii è stato molto efficace per complementazione funzionale di mutanti divisione cellulare. Tuttavia, il fatto che la replica di tipo selvatico parassiti sono anche soppressa da IFN-γ e LPS solo in misura minore rispetto ai mutanti, rende più difficile complementazione funzionale than per mutanti divisione cellulare. Intero genoma mutazionale profiling sia mutanti chimici e inserzionali in T. gondii è recentemente emerso come un produttivo, e anche redditizio, viale per identificare i geni responsabili di fenotipi di mutanti in genetica avanti schermi 34,36,37,44. Di conseguenza, tutto il profiling mutazionale genoma utilizzando sequenziamento di nuova generazione ha migliorato le possibilità di utilizzo di mutagenesi chimica di T. gondii in studi genetici avanti per identificare geni importanti per funzioni specifiche. Tale approccio di genetica diretta come descritto nel protocollo corrente sono importanti come la maggior parte del genoma di T. gondii rimane ipotetica con una maggioranza di geni predetti aventi omologia ad altri geni o domini funzionali che potrebbero aiutare nella identificazione di geni candidate parassite importanti per evasione immune.

Analisi IFA di 96 pozzetti non è generalmente considerato uno screening ad alto rendimento incontratohod. Nella nostra esperienza è ragionevole per una persona a macchia e schermo 10 piastre da 96 pozzetti in un giorno o circa 960 mutanti. Nel articolo di Skariah et al., Circa 8.000 mutanti sono stati analizzati e 14 mutanti indipendenti sono stati isolati che sono stati significativamente compromessa per la sopravvivenza / replica in attivo ma non macrofagi ingenue 28. La sopravvivenza alterata dei mutanti era prevalentemente il risultato di una maggiore suscettibilità alle ossido nitrico. La limitazione nel metodo generale è principalmente a livello di ottenere singoli cloni del parassita piuttosto che lo screening mediante microscopia come schermata iniziale in piastre da 96 pozzetti è qualitativa e ragionevolmente rapida. La conferma del fenotipo dei mutanti identificati nella schermata del piatto ben 96 è seguito al punto 3 per l'analisi quantitativa e qualitativa con macrofagi nelle diapositive da camera e con l'aggiunta di un numero uguale di tipo selvatico o parassiti mutanti. L'uso di altri metodi di screening analiticiquali fluorometria a livello della popolazione totale di parassiti, piuttosto che il livello parassita individuo come valutato mediante microscopia, sono problematici nel protocollo corrente come molti dei parassiti degradati macchia con l'anticorpo policlonale contro T. gondii come robusto come parassiti wild type con la differenza nel mutante essendo più qualitativa che quantitativa a livello di intensità fluoresence. Inoltre, la dose di IFN-γ e LPS necessarie per isolare mutanti con un difetto nella resistenza alla attivazione di macrofagi infettati risultati nella replicazione soppressa di tipo selvatico parassiti seppure in momenti successivi. Pertanto, la misurazione del numero totale parassita per la schermata genetica avanti compreso l'uso di parassiti luminescenti è problematica. Tuttavia, è possibile che il protocollo di colorazione può essere eliminato nella fase di screening se i cloni parassita parentale impiegata per mutagenesi chimica o inserzionale espressi fluorescente o Lucifero costitutiva o inducibilemarcatore ase. Il protocollo descritto con IFA e microscopia proiezione di macrofagi in 96 pozzetti consente per l'isolamento dei mutanti difettose per la sopravvivenza / replica nei macrofagi attivati ​​ma anche manca chiaramente alcuni potenziali mutanti a causa della risoluzione microscopica limitata ottenibile utilizzando il formato a 96 pozzetti come a questa risoluzione vacuoli gonfie amorfi che macchiano per l'antigene parassita possono essere scambiati per i parassiti replica sani all'interno di un PV normale. Sostituzione di lastre di vetro 96 e coperchio, invece di piastre a 96 pozzetti con una superficie ottica, è in grado di raggiungere una maggiore risoluzione durante la schermata di macrofagi infettati in piastre da 96 pozzetti.

La stragrande maggioranza dei mutanti identificati con IFN-γ e LPS nel protocollo descritto per attivare i macrofagi seguenti invasione parassita ha un difetto nella loro capacità di proteggere se stessi da ossido di azoto 28. A questo proposito, lo schermo anche se destinato ad essere non polarizzato,può arricchire per l'isolamento di mutanti parassita con maggiore suscettibilità alle specifiche mediatori antimicrobici seconda delle condizioni di attivazione, il tipo e specie di macrofagi e la tempistica di parassita invasione relativa all'attivazione dei macrofagi che sono scelti per lo schermo. Così la cellula immunitaria innata scelto per lo schermo e gli stimoli di attivazione applicati sono parametri critici che influenzano il tipo di mediatori antimicrobici a cui i mutanti parassita risultanti potrebbero essere sensibili. Il genotipo del parassita è anche un parametro critico come tipo I genotipi del parassita sono relativamente resistenti alla legate all'immunità GTPases (IRG) indotti in risposta a IFN-γ, mentre le II e III genotipi tipo sono più suscettibili 26,45,46. Nel protocollo descritto, i macrofagi vengono attivati ​​dopo l'invasione del parassita. Sebbene il genotipo di tipo II, ceppo Prugnaud, utilizzata nella schermata descritto è suscettibile all'azione di GTPasi legate all'immunità, unllowing il parassita di invadere macrofagi consente prima replica di tipo parassiti selvatici prima della piena induzione degli IRG. Inoltre, non è chiaro che IRGs sono efficaci contro il parassita se sono indotti in macrofagi successive parassita invasione e inizio della replicazione.

Il protocollo descritto utilizza macrofagi per identificare geni parassiti importanti per la resistenza a IFN-γ-dipendente mediatori di immunità cellulare autonoma, specialmente ossido nitrico. L'isolamento di un pool di mutanti parassita che condividono una marcata suscettibilità a ossido di azoto e un fenotipo comune di ossido nitrico dipendente frammentazione mitocondriale fornisce un unico insieme di strumenti per identificare geni parassiti e percorsi importanti per la resistenza all'ossido di azoto e di comprensione l'azione dell'ossido nitrico più ampia contro T. gondii e altro protocollo descritto pathogens.The eucariotica con piccole modifiche possono essere utilizzati per la genetica avanti studies per identificare geni importanti per la resistenza parassita a diversi mediatori della cella immunità autonoma. I potenziali modifiche includono alterando il tipo di cellula ospite infettato, gli stimoli di attivazione, o al momento dell'attivazione rispetto a Parasite invasione. Ad esempio, pre-attivazione di macrofagi murini con IFN-γ prima dell'aggiunta parassiti comporterebbe attivazione di GTPasi legate all'immunità. Tale modello potrebbe essere utilizzato per identificare i geni del parassita in Tipo I genotipi di T. gondii che può contribuire alla resistenza mediata da ROP18 e ROP5 di immunità GTPases correlati 24,25. Mediatori di cellule dell'immunità autonoma contro T. gondii in cellule immunitarie innate umani non sono così ben definiti come nei roditori. Pertanto, l'uso di monociti umani di sangue periferico per schermare mutanti chimici di T. gondii può individuare sia i geni importanti per la sopravvivenza del parassita durante l'infezione umana in cellule immunitarie innate e meccanismi importanti nell'uomo for resistenza antimicrobica a T. gondii. Parasite geni importanti per la resistenza alla possono essere identificati isolando mutanti incapaci di sopravvivere esposizione delle cellule ospiti infette ad agenti farmacologici come ossigeno o azoto specie reattive specifici mediatori antimicrobici. Allo stesso modo il protocollo può essere modificato per isolare i mutanti del parassita con aumento della suscettibilità alle inflammasome attivazione 47-49 o la stimolazione ATP dei macrofagi recettori purinergici 50.

Nel loro insieme, i protocolli descrivono un approccio utilizzando forward genetica e cellule immunitarie innate di isolare i mutanti parassita importanti per T. resistenza gondii a IFN-γ-dipendente delle cellule dell'immunità autonoma. È importante sottolineare che l'approccio stese è versatile e può essere facilmente modificato per isolare i geni parassita importante per eludere specifici mediatori antimicrobici, la sopravvivenza del parassita in tipi specifici di cellule ospiti o resistenza alle condizioni di stress encounterosso durante la toxoplasmosi. Inoltre, i geni parassiti importanti per resistere attivazione della cellula ospite in molti casi possono anche svolgere un ruolo, direttamente o indirettamente, nella produzione di cisti in vivo durante l'infezione.

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Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

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