Forward Génétique écrans à l'aide pour identifier les macrophages * These authors contributed equally

Immunology and Infection
 

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Walwyn, O., Skariah, S., Lynch, B., Kim, N., Ueda, Y., Vohora, N., Choe, J., Mordue, D. G. Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-γ-Dependent Cell Autonomous Immunity. J. Vis. Exp. (97), e52556, doi:10.3791/52556 (2015).

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Abstract

Introduction

Toxoplasma gondii (T. gondii) est un intracellulaire obligatoire, pathogène protozoaire. Il est l'agent causal de la toxoplasmose, un danger pour la santé chez les personnes immunodéprimées. Ce est aussi le système de modèle pour d'autres agents pathogènes qui infectent les humains apicomplexes y compris Cryptosporidium et Cyclospora. La toxoplasmose est le plus souvent acquise par l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés par le stade du parasite bradyzoïte ou oocystes. Lors de l'ingestion, ces étapes se convertir à l'étape de tachyzoïtes du parasite qui se réplique à l'intérieur des cellules hôtes et diffuse de manière systémique. Lymphocytes T, l'IFN-γ et, dans une moindre mesure, de l'oxyde nitrique 4/1, sont importants pour le contrôle de l'infection mais ne sont pas capables d'éliminer la maladie, dans une proportion de tachyzoïtes convertir à l'étape de bradyzoite qui sont protégés à l'intérieur de kystes tissulaires résultant en une infection chronique à long terme. En fait, il ne existe pas de thérapies efficaces contre le kyste chronique stage de la maladie. Toxoplasmose sévère est le plus souvent due à la réactivation d'une infection persistante, avec le stade de bradyzoïte du parasite reconversion à la caractéristique de scène tachyzoïte répliquer rapidement de l'infection primaire et aiguë.

La survie au début de la face de la réponse immunitaire innée est important de permettre au parasite à atteindre nombre de parasites suffisantes, ainsi que pour atteindre les sites distales, pour permettre l'établissement d'une infection chronique. T. gondii a développé des stratégies pour lutter contre les mécanismes de défense de l'hôte qui contribuent probablement sa capacité à reproduire et diffuser au début de l'infection. Premièrement, T. gondii constitue un PV unique lors de l'invasion parasitaire qui est en grande partie séparé des processus d'endocytose et d'exocytose de la cellule hôte par rapport à d'autres agents pathogènes intracellulaires 5-9. En outre, comme tous les succès intracellulaire pathogènes T. gondii modifie sa cellule hôte pour créer un environnement permissif fou la croissance. Cela comprend la reprogrammation hôte d'expression génique des cellules en modifiant les facteurs de transcription de la cellule hôte, y compris ceux qui sont importants pour la régulation de l'activation des cellules 10-15. ROP16 16-19, GRA15 20, 21 et GRA16 GRA24 22 ont tous été montré pour être importante dans la régulation de la réponse transcriptionnelle de signalisation cellulaire et des cascades de cellules hôtes infectées avec T. gondii. Des études récentes utilisant des croisements génétiques entre les souches de parasites avec des phénotypes distincts ont été très productif dans l'identification des gènes parasitaires qui sous-tendent traits parasites génotype dépendant notamment de fraude liées à l'immunité GTPases (IRGS) 16,19,23-26. Chez la souris, l'immunité liée GTPases (IRGS) sont essentiels pour le contrôle de type II et III génotypes du parasite tandis que le type très virulente je génotypes ont développé des mécanismes pour échapper aux IRGS murins. Cependant, il est également clair que le parasite a développé des mécanismes pour échapper médias antimicrobienteurs, en plus des IRGS et que certains de ces mécanismes peuvent être conservées à travers les génotypes de parasites 27,28. En outre, on sait très peu sur les médiateurs critiques de l'immunité cellulaire contre autonome T. gondii pendant la toxoplasmose humaine. Parasite gènes importants pour la résistance aux médiateurs de l'immunité cellulaire autonome peuvent également être importantes pour la survie au cours tachyzoïte à bradyzoïte conversion qui peut également être déclenché par les réponses immunitaires de l'hôte. Par exemple, l'oxyde nitrique à des niveaux élevés peut supprimer la réplication du parasite dans les macrophages infectés, mais il peut aussi stimuler tachyzoïte à bradyzoïte conversion résultant de la production de kystes 30-32.

ToxoDB est une base de données de génomique fonctionnelle pour T. gondii qui fonctionne comme une ressource essentielle pour le domaine en termes de fournir des informations de séquence du génome du parasite et l'accès à des données publiées et non publiées de l'échelle du génome, y compris les annotations de la communauté, le gène exp écrêtages et protéomique données 33. Comme pour de nombreux agents pathogènes protozoaires, la majorité du génome est constitué de gènes hypothétiques avec aucune information disponible sur la base d'homologie de gène de donner un aperçu de leurs fonctions potentielles. Ainsi, la génétique à terme est un outil puissant pour identifier de nouveaux gènes importants pour échapper au système immunitaire, la conversion de kyste et d'autres fonctions critiques pour la pathogenèse du parasite ainsi que pour la conversion entre les stades de développement distincts parasites. Une force supplémentaire vers l'avant de la génétique est qu'il peut être utilisé comme une approche relativement non biaisé pour interroger le parasite à des gènes qui sont importants pour des tâches spécifiques, y compris dans la pathogenèse évasion immunitaire et la formation de kystes. De récentes améliorations dans le séquençage de prochaine génération pour le profilage mutationnel ont fait une méthode de choix pour l'identification des gènes responsables de parasites avant les études de génétique par mutagenèse chimique et insertion 34-37.

MÉNAGEMENT "> Il est important d'identifier les vulnérabilités dans T. gondii qui peuvent être exploitées pour améliorer l'efficacité des mécanismes immunitaires autonomes cellulaires contre le parasite en particulier ceux qui peuvent également être actif contre le stade de kyste résistant. Vers ce but, in vitro murin l'infection des macrophages et le modèle d'activation a été développé pour identifier des mutations dans le parasite qui altère spécifiquement T. gondii remise en forme suite à l'activation des macrophages infectés, mais pas dans les macrophages naïfs. Cet écran de macrophages a été utilisé pour interroger une bibliothèque de T. gondii mutants d'insertion pour finalement identifier les gènes de T. gondii importants pour la résistance à l'oxyde nitrique 27,28. L'isolement d'un panel de mutants de T. gondii avec facultés affaiblies résistance à l'activation des macrophages infectés, en particulier une sensibilité marquée à l'oxyde nitrique, prouvé l'utilité de l'écran pour identifier des gènes pour la résistance parasites importantsde médiateurs de l'immunité cellulaire autonome autre que les mécanismes de résistance décrites pour les IRGS 28 murins. Mutagenèse insertionnelle a des avantages sur mutagenèse chimique en termes de génération d'un nombre limité de mutations aléatoires dans chaque clone parasitaire et, en théorie, une identification plus facile du site de mutation. Toutefois, l'identification du site d'insertion du génome du plasmide en T. mutants d'insertion gondii, dans la pratique, a été étonnamment difficile dans de nombreux cas 37. L'insertion d'un gène dans un plasmide est également susceptible de perturber la fonction d'un gène, contrairement à une mutagenèse chimique qui se traduit généralement par des changements d'un seul nucleotide. Cependant, une mutagenèse chimique avec soit la N-éthyl-N-nitrosourée (ENU) ou un sulfonate d'éthylméthane (EMS) peut offrir une plus grande capacité d'analyser une plus grande portion du génome du parasite, par rapport à une mutagenèse insertionnelle, car il crée plusieurs polymorphismes nucléotidiques simples ( estimé à 10 -100) par mutant 34, 38. En outre, les progrès récents dans le profilage du génome entier a permis d'utiliser le séquençage de prochaine génération pour identifier les gènes candidats les plus probables responsables du phénotype identifié d'un parasite muté 34,38. Indépendamment de l'approche de mutagenèse, la confirmation du rôle du gène parasite dans la résistance à l'activation des macrophages nécessite finalement délétion du gène et la complémentation de remplir les postulats de Koch moléculaire.

La capacité de disséquer la fonction d'un gène par manipulation génétique à la fois du parasite et le macrophage est important car un grand nombre des gènes identifiés par l'avant génétique dans T. gondii, ainsi que d'autres agents pathogènes, se caractérisent encore en tant que gènes hypothétiques avec peu ou pas d'homologie de séquence avec d'autres protéines ayant des fonctions connues. Le présent document décrit une méthode générale qui peut être utilisée pour déterminer si le gène disrupté dans un mutant est important pour la résistance à un connue ouinconnue médiateur de l'immunité cellulaire autonome. L'analyse initiale des hôtes facteurs antimicrobiens est effectué en évaluant la survie de type sauvage et les parasites mutants dans les macrophages de souris de type sauvage par rapport à celles présentant des délétions de gènes spécifiques dans synthase inductible de l'oxyde nitrique (iNOS), GP-91 phox (NADPH oxydase), et liées à l'immunité GTPases spécifiques (IRGS). Cela permettra de déterminer si les gènes parasites identifiés sont importants pour la résistance à l'oxyde nitrique, intermédiaires réactifs de l'oxygène ou de l'immunité liée GTPases 28 respectivement ou si un mécanisme immunitaire inconnu est impliqué. Activation des macrophages infectés à la fois avec l'IFN-γ et LPS, décrites dans le protocole actuel, résulte principalement de l'isolement de gènes importants pour la résistance du parasite à l'oxyde nitrique 28. L'utilisation d'agents pharmacologiques qui induisent l'oxyde nitrique en l'absence d'activation des macrophages (donneurs d'oxyde nitrique) a confirmé que la majorité des gènes identifiés étaient importantes pour rerésistance à l'oxyde nitrique plutôt que l'oxyde nitrique de concert avec des médiateurs supplémentaires associés à l'activation des macrophages 28.

Étape un et deux décrivent un écran de génétique avant conçu pour isoler des mutants parasites avec un défaut de remise en forme suite à l'activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse infectée in vitro. Première étape décrit une analyse de titrage de dose pour déterminer empiriquement une dose de γ et LPS IFN à utiliser pour l'activation des macrophages qui réduit la réplication du parasite mais ne inhibe pas complètement la réplication du type sauvage T. gondii souche parentale qui est utilisé pour la création de la banque de mutants de parasites. Deuxième étape décrit l'écran vers l'avant génétique des clones mutants dans des macrophages dans les plaques à 96 puits. Étape trois présente une approche pour confirmer le phénotype de chaque mutant identifié dans l'écran des plaques à 96 puits et d'évaluer si le défaut de chaque mutant affecte la survie du parasite, la réplication,ou la production de kyste en réponse à l'activation des macrophages. Etape quatre décrit l'utilisation de macrophages dérivés de la moelle osseuse provenant de souris avec des deletions dans les voies d'antimicrobiens pour identifier les médiateurs immunitaires à laquelle le mutant est particulièrement sensible parasite. Cinquième étape décrit une méthode pour déterminer si un mutant de parasite est également compromise par pathogenèse in vivo tel qu'évalué par la production de kystes dans les cerveaux de souris infectées.

Protocol

REMARQUE: Tous les protocoles qui impliquent l'utilisation d'animaux ont été effectuées en conformité avec les directives et règlements établis par le soin des animaux de la Medical College de New York et de l'emploi Comité.
NOTE: détaillée des protocoles de mutagenèse chimique 38, l'isolement de parasites en limitant la dilution 38, isolement des macrophages murins moelle osseuse dérivés 39, la croissance de T. gondii dans des fibroblastes de prépuce humain (HFF) et cellules kyste production dans les macrophages et l'analyse de base d'immunofluorescence (IFA) 32 sont référencés. Effectuer toute culture cellulaire à 37 ° C dans 5% de CO 2 dans des milieux de D10 (Modifié haut glucose milieu Eagle de Dulbecco supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de L-glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine) . Gardez tous les réactifs stériles tout au long isolement de cellules et de la culture cellulaire.

1. Titration de dose d'IFN-γ et LPS pour déterminer les Concentrations à utiliser pour activer macrophages infectés pour l'écran avant Génétique

  1. Culture osseuse murine macrophages dérivés de la moelle O / N à huit lames de verre de la chambre à une concentration de 3 x 10 5 cellules / ml dans 250 ul de milieu de D10 par chambre. Utilisez macrophages une à deux semaines après l'isolement de la moelle osseuse.
    REMARQUE: diapositives de chambre sont achetés qui ont une croissance RS améliorant laver.
  2. Utilisez un hémocytomètre compter les parasites de type sauvage récoltées à partir de fibroblastes de prépuce humain (HFF) cellules cultivées dans un flacon de culture de tissu T25. Remettre en suspension les parasites à une concentration de 5 x 10 5 parasites de type sauvage par ml dans du milieu de D10. Cette concentration se traduira par une multiplicité d'infection d'environ 1: 1 que les macrophages se sont multipliés O / N. Utiliser des tubes de polystyrène ou PET pour toutes les manipulations avec des parasites comme les bâtons de parasites à polypropylène.
  3. Retirez le support de D10 dans les coulisses de la chambre et les remplacer par 250 pi de lasuspension de parasites de type sauvage. Ajouter délicatement la suspension du parasite à chaque chambre de la diapositive en lui permettant de couler la face interne de chaque chambre. Ne laissez pas les macrophages se dessécher à tout moment pendant le protocole.
  4. diapositives de la chambre de couverture infectés par des parasites avec le couvercle chambre de coulissement et placer dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant 4 heures pour laisser le temps pour le parasite d'envahir et d'établir un PV.
  5. Faire des dilutions de LPS et l'IFN-γ dans 1 ml de milieu de D10 dans des tubes stériles pour les titrages de dose. Pour dose titrages garder LPS ou concentration constante IFN et varient l'autre stimulus 40.
    1. Par exemple, garder constant le LPS à 10 ng par ml de LPS et de modification de la concentration d'IFN-γ (0, 1 unité / ml, 10 unités / ml, 100 unités / ml, 1000 unités / ml). Gardez IFN γ constant à 100 unités / ml et la concentration varient de LPS (0, 0,1 ng / mL, 1 ng / ml, 10 ng / mL, 100 ng / ml). Brièvement sonicat stocks LPS pendant 2 min sanschauffage dans un bain sonique (pas avec un appareil à ultrasons de pointe) avant dilution.
      REMARQUE: Sonication est recommandé de perturber agrégats de micelles formées par le LPS qui peuvent ne pas se lier correctement à des cellules hôtes.
  6. 4 heures après le début de co-culture entre les parasites et les macrophages adhérentes dans la diapositive de chambre, jeter les médias de D10 dans chaque chambre et le remplacer par 300 pi des dilutions appropriées de γ et LPS IFN dans les médias de D10. Inclure un contrôle avec uniquement des supports de D10 pour évaluer la réplication du parasite en l'absence de l'activation des macrophages.
  7. RE-COVER diapositives de chambre avec le couvercle chambre de coulissement et placer dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant 24 à 30 heures supplémentaires.
    NOTE: Le temps d'incubation dépend le temps de doublement de la souche du parasite de type sauvage qui peut varier de 6 à 12 h en fonction de la souche de parasite. Un point de temps est choisi avant parasite lyse des macrophages naïfs mais suffisamment longue pour permettre au moins 3-4 doutemps de bling.
  8. Ajouter une solution de formaldehyde à 2,5% dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS). Jeter les médias dans la glissière de la chambre et le remplacer par 300 ul de la solution de formaldehyde à 2,5%. Fixer pendant 20 min à température ambiante.
  9. Diapositive (s) Rincer deux fois avec 300 pi de PBS par chambre. Pour chaque rinçage, jeter le PBS dans la glissière et ajouter nouveau PBS doucement la face interne de chaque chambre de coulissement pour éviter de perturber les macrophages adhéré à la diapositive. Ajouter 300 pi de PBS par chambre et le lieu couvercle sur la chambre diapositive pour empêcher les glissements de sécher avant la coloration.
    REMARQUE: Diapositives peut être placé à 4 ° C pendant jusqu'à trois jours à ce point avant la coloration.
  10. protocole de coloration pour T. gondii détection par microscopie d'immunofluorescence (IFA).
    1. Ajouter une solution de Triton X-100 à 0,2% dans du PBS (tampon de perméabilisation). Placer la solution dans un tube à 37 ° C un bain d'eau et il vortex brièvement pour assurer le Triton X-100 passe en solution. Jeter lePBS dans les coulisses de la chambre et les remplacer par 300 pi du tampon de perméabilisation. Laisser à température ambiante pendant 30 min.
    2. Ajouter une solution de sérum de chèvre à 10% dans du PBS (solution de blocage). Jeter le tampon de perméabilisation de la diapositive et les remplacer par 300 pi de solution de blocage par chambre. Laisser à température ambiante pendant 30 min.
      REMARQUE: sérum de veau fœtal peut être remplacé par du sérum de chèvre dans tous les protocoles de coloration.
    3. Pour une seule étape IFA protocole de coloration, faire un 1: 1000 dilution d'un anticorps fluorescent conjugué à T. gondii dans une solution de blocage. Retirer la solution de blocage de la diapositive et ajouter 150 ul de solution d'anticorps par chambre. Replacer le couvercle coulissant sur chambre diapositive pour empêcher les cellules de se dessécher. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
      REMARQUE: concentration d'anticorps doit être déterminée empiriquement en fonction de la source. L'anticorps est acheté directement conjugué à un fluorochrome ou conjugué à un fluorochrome par l'utilisateur.
      1. Pour un deux étapes IFA colorationprotocole avec un anticorps non conjugué de T. gondii et un anticorps secondaire conjugué par fluorescence, diapositives de tache avec 150 pi de l'anticorps primaire non conjugué contre T. gondii dans un tampon de blocage pendant 1 heure à température ambiante. Rincer 3 fois avec 300 ul de PBS additionné de sérum de chèvre à 1% (tampon de lavage).
      2. Ajouter 150 ul de l'anticorps secondaire conjugué par fluorescence spécifiques de l'espèce d'origine de l'anticorps primaire. Replacer le couvercle coulissant sur chambre diapositive pour empêcher les cellules de se dessécher. Incuber pendant 1 heure à température ambiante.
    4. Rincer les lames 3 fois avec du PBS et du sérum de chèvre à 1% (tampon de lavage). Pour chaque rinçage, enlever la solution dans les coulisses de la chambre par le dumping sur son contenu et de le remplacer avec 300 pi de tampon de lavage.
    5. Rincer les diapositives 2x avec 300 pi de PBS.
    6. Retirer la chambre de la culasse à chambre selon les instructions du fabricant.
    7. Mont glisse avec les médias contenant DAPI montage (4'6-diamidino-2-phénylindole, dilactate) et un 22 mm x 50 mm lamelle.
  11. Examiner les lames à l'aide de contraste de phase et par microscopie de fluorescence. Calculer le nombre moyen de parasites par vacuole en examinant un minimum de 100 PV par chambre bien. La dose choisie γ IFN et LPS pour l'écran doit être suffisante pour supprimer, mais ne empêche pas, la réplication des parasites de type sauvage (voir la figure 1).

2. Isolement de Parasite mutants avec une remise en forme des défauts suite à l'activation des macrophages infectés

REMARQUE: Une bibliothèque de T. aléatoire mutants gondii est nécessaire pour l'écran de la génétique de l'avant. Mutagenèse aléatoire de T. gondii peut être effectuée par voie chimique (FRA / EMS) ou mutagenèse insertionnelle 27,28,38. Suite à la mutagenèse, les parasites de clones par dilution limitante et faire croître des clones individuels dans des plaques à 96 puits contenant des cellules HFF adhérentes dans un volume de 200 ul de milieu D10 32,38.Il est essentiel que les plaques à 96 puits pour le criblage de parasites dans les macrophages ont un fond par microscopie optique afin de permettre le dépistage microscopique. Contraste de phase et par microscopie de fluorescence pour le criblage colorées des plaques 96 puits exige un microscope à fluorescence inversé avec contraste de phase 4, 10, 20 ou objectif 40X équipé pour longues distances de travail. Un objectif 4X est utile pour voir l'ensemble du bien, mais une meilleure résolution des parasites est réalisé avec l'objectif 20X.

  1. Transférer 50 ul de mutants de tachyzoïtes cultivés dans des cellules HFF confluentes dans des plaques 96 puits pour culture de tissus dans deux répliquent plaques à 96 puits contenant des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine (1-2 semaines après l'isolement) dans 100 ul de milieu D10.
    REMARQUE: Effectuer l'écran initial en plaques du parasite en fonction du volume de la culture du parasite de 96 puits pour éviter d'avoir à compter le nombre de parasites transférés par chaque puits. Ainsi, l'analyse par microscopie à 2,6 est basé sur qualitativement whether parasites sont généralement reproduits ou pas répliqué. Étape 3 décrit l'approche pour confirmer le phénotype des mutants dans les diapositives de la chambre en utilisant un nombre égal de type sauvage ou des parasites mutants pour infecter les macrophages.
    1. Ajouter parasites directement sur le support de D10 déjà dans chaque puits. Infect deux puits avec des tachyzoïtes de type sauvage comme témoin positif pour la replication du parasite.
  2. Placer les cellules infectées dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO2) pendant 4 heures pour permettre aux parasites temps d'envahir les cellules et créer leur PV.
  3. Retirez le support d'une plaque par vider le contenu de la plaque. Utilisez un seul geste du poignet pour vider les médias dans la plaque dans un bassin de rejets contenant un bactéricide de détergent pour les parasites.
    1. Ajouter 100 pi de «médias de l'activation des macrophages" en utilisant un bassin stérile pour les médias et une pipette multicanaux. Utilisez la concentration optimale de LPS et l'IFN-γ déterminée à partir de l'étape 1 pour le macmédias d'activation rophage. Retirer même les médias de la plaque de contrôle en double et les remplacer par 100 ul de milieu de D10.
  4. Placer les cellules infectées dans un incubateur (37 ° C et 5% de CO 2) pour un 24 à 30 heures supplémentaires.
  5. protocole de coloration pour plaques à 96 puits pour IFA.
    1. Jeter les médias dans la plaque et les remplacer par 100 pi de 2,5% de formaldéhyde dans du PBS. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Utilisation d'un bassin stérile pour le formaldéhyde et une pipette multicanaux.
    2. Jeter la solution de formaldehyde dans la plaque et ajouter 100 ul de PBS pour rincer le formaldéhyde à partir de la plaque.
    3. Jeter la solution dans la plaque et ajouter 100 ul de tampon de perméabilisation (PBS avec 0,2% de Triton X-100) dans chaque puits. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
    4. Jeter la solution dans la plaque et ajouter 100 ul de solution de blocage (PBS avec du sérum de chèvre à 10%) dans chaque puits. Incuber pendant 30 min à température ambiante.
    5. Jeter la solution dans la pfin. Ajouter 50 pl / puits d'un anti-T. fluorescence conjugué gondii anticorps dilué 1: sérum de chèvre dans du PBS 1000 majoré de 1%. Incuber pendant 1 heure à température ambiante avec le couvercle de la plaque et sur une bascule.
      1. Vous pouvez également utiliser un anticorps primaire non conjugué contre T. gondii suivie par coloration avec un anticorps secondaire conjugué à fluorescence comme décrit dans l'1.10.3.1.
    6. Jeter la solution d'anticorps à la plaque et le remplacer par 100 pl / puits de PBS et du sérum de chèvre à 1%. Effectuez cette 3x de rinçage suivie de deux rinçages supplémentaires avec PBS seul. Donner 200 pi de PBS dans chaque puits et remettez le couvercle sur la plaque à 96 puits pour empêcher les puits de séchage.
      NOTE: La plaque avec le couvercle peut être enveloppé dans du parafilm et placé à 4 ° C pendant jusqu'à trois jours avant l'analyse par microscopie.
  6. Examiner cellules sous un microscope à fluorescence inversée utilisant un objectif 20-40X. Sélectionnez mutants qui se répliquent dans le na &# 239; ve plaque macrophages, mais ne parviennent pas à répliquer principalement delà d'un parasite / vacuole dans "macrophages activés" ou qui apparaissent amorphe ou "dégradée dans les macrophages activés".
    REMARQUE: Le nombre de parasites de type sauvage par vacuole dépendra de la dose d'IFN-γ et LPS utilisés mais, idéalement, est d'environ 4 parasites par vacuole; un nombre qui reflète la suppression de croissance mais pas une inhibition complète de réplication par le stimulus d'activation.

3. Évaluer les mutants pour déterminer si le défaut est au niveau de Parasite Survie ou réplication Après activation des macrophages infectés

  1. Transfert sélectionné mutants parasites à partir de plaques à 96 puits (contenu de l'ensemble de puits) à T25s contenant des cellules HFF et permettre la réplication.
  2. Culture de moelle osseuse macrophages dérivés O / N à 8 lames de verre de la chambre à une concentration de 3 x 10 5 cellules / ml dans 250 ul de milieu D10. Préparer une diapositive à comparer parasite réplication dans les macrophages naïfs et un toboggan supplémentaire pour comparer la réplication du parasite après l'activation des macrophages infectés.
  3. Récolte parasites tachyzoïte et comptent dans un hémocytomètre. Ajouter 5 × 10 4 T. gondii parasites à une chambre et contenant les macrophages dans les médias et la culture D10 pendant 4 heures. Inclure un puits par des parasites parentales de type sauvage comme témoin. Inoculer une diapositive répliquée identiques avec le même clone parasite qui ne sera pas recevoir des supports d'activation afin de contrôler la réplication de parasites dans les macrophages naïfs.
  4. Jeter les médias D10 de 1 des diapositives de chambre répétés et les remplacer par 250 pi de «médias d'activation". Jeter les médias D10 de l'autre lame de chambre de répétition et les remplacer par 250 ul de milieu de D10. Incuber à la fois le "activé" et lame de macrophages «naïve» avec le couvercle de chambre de coulissement à 37 ° C et 5% de CO 2 pour un additional 24-30 h.
  5. Fix, perméabilisent et bloc glisse pour IFA coloration et l'analyse des parasites comme décrit à l'étape 1. Effectuer IFA coloration avec les chambres intactes.
    1. Cellules co-tache avec un anticorps à lysosomales 1 associée à la membrane (LAMPE1) ou Lysotracker et d'anticorps à T. gondii d'évaluer si l'activation de macrophages infectés déclenche fusion des PV mutants avec les lysosomes (figure 4).
    2. Utiliser des anticorps à compartiments / organites spécifiques dans le parasite / PV pour la coloration par l'IFA à identifier les altérations dans le mutant du parasite qui sont évidents au début suite à l'activation des macrophages 28.
      NOTE: De telles altérations peuvent donner un aperçu du mécanisme qui sous-tend la déficient survie / réplication du mutant suivant l'activation des macrophages.
  6. Examiner les lames en utilisant une huile 100X de phase objective et la microscopie de fluorescence.
    1. Évaluer la réplication du parasite par la détermination de lanombre de parasites par PV à 100 vacuoles aléatoires. Effectuer au moins deux chefs d'accusation de 100 vacuoles chacun pour l'analyse statistique.
    2. Évaluer la morphologie générale du parasite en utilisant à la fois une analyse de fluorescence ainsi que la microscopie à contraste de phase. Voir les parasites titre de la phase objectif 100x. Parasites sains ont des parasites étroitement enfermé dans une vacuole parasitophore près du corps. Les parasites qui ont vacuoles spacieuses amorphes avec la phase jantes denses ou des parasites amorphes suggèrent parasite la mort plutôt que de simplement un défaut de réplication (figures 1 et 3).

4. Évaluer si la sensibilité des parasites mutants d'activation des macrophages infectés est associée à l'médiateurs anti-microbiens connus

  1. Isoler les macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris de type sauvage C57 / BL6, iNOS - / -, gp91-phox - / - ou Irgm1 / Irgm3 - / - souris 32.
  2. Culture mac os respectif dérivées de la moellerophages O / N à 8 lames de verre de la chambre à une concentration de 3 x 10 5 cellules / ml dans 250 ul de milieu D10.
  3. Procéder à défi de parasite, IFA coloration, et l'analyse de la manière décrite à l'étape 3.
  4. Déterminer si la capacité des mutants parasites de survivre et de se répliquer après l'activation de macrophages infectés est rétabli en l'absence d'oxygène réactif ou espèces d'azote ou d'une immunité spécifique 28 GTPases liés.
  5. Utiliser des agents pharmacologiques, comme donneurs d'oxyde nitrique, d'évaluer si les médiateurs anti-microbiennes spécifiques sont suffisants par eux-mêmes de porter atteinte à des parasites mutants dans les cellules HFF ou macrophages naïfs ou si elles ne agissent que de concert avec d'autres médiateurs de l'activation des macrophages 28.

5. Évaluer si le Défaut dans l'infection chronique Mutant Parasite compromis

  1. Isoler tachyzoïtes de type sauvage, mutant ou des parasites de gènes ciblés supprimé cultivés dans T25s containing cellules HFF. Les parasites doivent être fraîchement lysées à partir de cultures de HFF.
  2. Comptez parasites utilisant un hémocytomètre. Resuspendre les parasites dans une solution équilibrée de sels de Hanks (HBSS) à une concentration appropriée par ml pour une dose sous-létale du parasite délivré dans 200 pi par voie intraperitoneale (IP) injection.
  3. Utilisez un 1 ml de tuberculine seringue et l'aiguille 25 G pour injecter des parasites avec un volume de 200 pi par voie intrapéritonéale (IP). La dose dépend de la souche de type sauvage du parasite et le génotype de la souris.
    REMARQUE: I génotypes de type de parasite sont mortelles à des souris pendant la phase aiguë de l'infection indépendamment de la dose de parasite et ne sont pas appropriées pour les études de l'infection chronique à l'absence de chimiothérapie pour T. gondii de supprimer la réplication du parasite.
  4. Trente jours après l'épreuve des parasites, sacrifier souris par inhalation de CO 2 à partir d'un réservoir sous pression dans une chambre peu fréquentée (une cage de taille standard de la souris peut pas contenir plus de 5 mglace) suivie par dislocation cervicale.
  5. Isoler le cerveau de la souris à l'aide des procédures établies 41-43.
    1. Placez la souris sur sa face avant. Pulvériser la tête avec 70% d'éthanol pour stériliser la zone.
    2. Utilisez des ciseaux bien aiguisés pour couper à travers le tronc cérébral. Utilisez des ciseaux de dissection pour faire une coupe peu profonde latéralement autour de la droite, puis le côté gauche du crâne à partir de la base du tronc cérébral. Utilisez une pince à peler doucement le crâne afin d'exposer le cerveau.
    3. Soulevez doucement le cerveau et le lieu de ciseaux entre le cerveau et la base du crâne à couper le nerf olfactif pour libérer le cerveau. Soulevez le cerveau avec des pinces stériles ou une spatule et placer dans un boîte de Pétri bactériologique contenant 10 ml de PBS stérile.
  6. Couper le cerveau en deux avec un scalpel stérile par le centre entre les hémisphères droit et gauche.
  7. Ajouter la moitié du cerveau à un petit mortier contenant 1 ml de PBS. Utilisation du mortier et un pilon pourfaire une suspension de tissu fine du cerveau qui peut passer à travers un alésage de 20 à 200 ul pointe de la pipette de large.
    NOTE: L'autre moitié du cerveau devrait être fixé dans 2,5% de formaldéhyde pendant 1 heure si des coupes de tissus sont nécessaires pour l'histopathologie.
  8. Placer 100 pl de lysat de cerveau dans un tube de microcentrifugation de 1,7 ml. Ajouter 1 ml de 2,5% de formaldehyde dans du PBS dans le tube contenant le lysat de cerveau pour fixer la suspension du cerveau pour la coloration. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
  9. Centrifuger le lysat à 8000 g pendant 5 min dans une microcentrifugeuse et prenez soin de le surnageant.
  10. Ajouter 1 ml de perméabilisation / tampon de blocage au lysat (sérum de chèvre à 10%, 0,2% de Triton X-100 dans du PBS). Incuber à température ambiante pendant 30 min.
  11. Centrifugeuse lysat à 8000 g pendant 5 min et retirez surnageant.
  12. Ajouter 200 pi de conjugué FITC dolichos biflorus agglutin (DBA). Utiliser une dilution 1: 100 de la lectine dans du PBS et du sérum de chèvre à 10%. Resuspendre doucement le lysat par pipetage. Incuberpendant 1 heure à température ambiante.
    REMARQUE: DBA est un ligand qui se lie à CST1 sur le mur parasite du kyste.
  13. Centrifugeuse lysat à 8000 g pendant 5 min et éliminer le surnageant. Ajouter 1 ml de PBS au culot. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Répétez PBS lavage 3x. Eliminer le surnageant Après le lavage final à l'aide d'une pipette.
  14. Utilisez un alésage de 20 à 200 ul pointe de la pipette large pour établir cinq ul du lysat de cerveau colorées et les placer sur une lame de microscope. Montez la lame avec un couvercle de glissement mm 25 x 25 pour créer un montage humide du lysat de cerveau. Faire trois diapositives répétés en utilisant 5 pi de chaque lysat cerveau.
  15. Comptez le nombre de kystes par chaque aliquote de 5 ul par microscopie à fluorescence en utilisant un objectif 10X (figure 6).
    NOTE: Certains kystes sont grandes (8 ou plus de parasites environ) alors que certains sont très petites (1-2 parasites par kyste). Compter le nombre total de kystes par chaque diapositive, mais le numéro de la grande fonction du nombre de petits kystes.
  16. Ajouter le nombre de kystes detétées dans les trois différentes aliquotes 5 pi et multiplier par le facteur de dilution total x 2 (seulement la moitié du cerveau a été faite dans un lysat) pour estimer le nombre total de kystes par cerveau.

Representative Results

Toxoplasma gondii reproduit librement dans les macrophages naïfs et a un temps de doublement entre 6-12 h en fonction de la souche du parasite. La figure 1 montre parasites représentatifs de naïf par rapport macrophages dérivés de la moelle osseuse activées. La figure 2 montre la morphologie générale de parasites dans HFF des cellules hôtes à 2, 4, 8, 16 et 32 ​​parasites / PV. Dans le protocole actuel, le parasite est autorisé à envahir macrophages naïfs et d'établir une vacuole naissante parasitophore (PV) avant la livraison d'un stimulus d'activation puissante, LPS et IFN, les macrophages infectés. Dans ce modèle, la réplication des parasites de type sauvage est ralentie, mais la réplication du parasite procède encore pendant environ 24 heures au cours de laquelle les macrophages deviennent progressivement plus aptes à inhiber la réplication du parasite. L'écran est conçu pour fonctionner en tant que modèle de compétition modifié entre le temps nécessaire à un puissant macrophagesctivation en fonction du temps pendant lequel le type sauvage ou parasite parasite mutant peuvent continuer à se répliquer dans son PV. La première étape de l'écran est de choisir une dose de LPS et l'IFN-γ à utiliser pour l'activation des macrophages infectés. La dose est déterminée empiriquement en évaluant la réplication du parasite dans les macrophages activés, soit avec une dose constante de IFN-γ en combinaison avec une gamme de concentrations de LPS ou une dose constante de LPS avec une gamme de concentrations IFN (étape 1). La dose des stimuli d'activation doit être évaluée pour les parasites de type sauvage parentales utilisées pour la création de mutants de parasites par mutagenèse chimique ou insertion. Idéalement, la dose de LPS et IFN-γ permettra réplication du parasite à une moyenne de 2-8 parasites par PV 24-30 h après l'activation par rapport à 8-16 parasites par PV dans les macrophages naïfs (figures 1 et 2).

Une fois la concentration appropriée de LPS et IFN ^7; est déterminé, les mutants sont criblés en bas optique des plaques de culture tissulaire à 96 puits. Le fond optique dans les plaques est important, car des irrégularités dans la matière plastique qui est utilisé pour des plaques de culture de tissus traditionnels, il est difficile de parvenir à la résolution appropriée pour cribler les parasites par contraste de phase et par microscopie de fluorescence. Contraste de phase et par microscopie de fluorescence des plaques à 96 puits nécessite également un microscope à fluorescence inversé avec contraste de phase 4, 10, 20 ou 40x objectif équipé pour longues distances de travail. Les mutants sont criblés dans des plaques répliquées contenant des macrophages dérivés de la moelle osseuse murine. Après épreuve avec des mutants de parasites, les macrophages infectés dans les puits d'une plaque sont activées par le LPS et IFN-γ et l'autre plaque contenant les macrophages infectés sont cultivés dans seulement les médias D10. Les plaques sont incubées à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 à 30 h après l'addition de LPS et l'IFN-γ. Après incubation, les cellules sont fixe, souillé de parasites et analysés par IFA utilisant à la fois la fluorescence et la microscopie à contraste de phase. Les mutants sont sélectionnés qui ont un nombre normal de parasites et la réplication dans les macrophages naïfs mais moins de parasites ou petites vacuoles avec moins de parasites dans les macrophages infectés qui sont activés. Une fois mutants sont sélectionnés, ils doivent être recriblés des lames creuses (étape 3) dans naïve et macrophages activés dans deux expériences indépendantes pour permettre une analyse de morphologie du parasite à des grossissements plus élevés (objectif 100X et de l'huile) et de confirmer qu'ils ont réplication normale dans les macrophages naïfs mais un défaut dans la réplication / survie après l'activation des macrophages.

Les phénotypes des mutants avec des défauts dans la résistance à l'activation des macrophages infectés tombent généralement en deux grandes catégories: les parasites qui apparaissent morphologiquement intactes, mais sont incapables de se répliquer-delà d'un seul parasite par PV; et les parasites qui semblent être Dégraded et peut également être en PV spacieuses amorphes (figures 1 et 3). La morphologie et l'ultrastructure du parasite et PV est optimisé sur des lames en utilisant un objectif 100X et d'huile et par microscopie à contraste de phase associée à l'analyse de fluorescence. Coloration des parasites pour IFA avec un anticorps associé à la membrane lysosomale protéine-1 (LAMP1) est utile pour déterminer si le défaut dans le mutant est associé à l'incapacité de la PV pour empêcher la fusion avec les lysosomes. Représenté sur la figure 4 est un parasite dans un phagolysosome (LAMP1 positive) par rapport à un parasite qui se trouve dans une PV qui est en grande partie séparé du système endocytose de la cellule hôte (LAMP1 négatif). Le phagolysosome est évident par un rebord solide continue de LAMP1 forcer tout autour du parasite. En revanche, un PV a souvent des organites lysosomes à proximité mais pas de rebord continu de coloration LAMP1 autour de sa circonférence. L'utilisation d'anticorps définis à l'intérieur de structures / organelles tqu'il parasite et / ou PV sont utiles dans des études de suivi IFA pour identifier les anomalies dans chaque mutant associé à l'activation des macrophages infectés. Ces interrogatoires avec des anticorps peuvent donner un aperçu des mécanismes qui sous-tendent le défaut réplication / survie dans un mutant. Par exemple, la figure 5 montre le T. mitochondrie gondii colorées avec un anticorps monoclonal anti-F1 sous-unité ATPase 5F4 bêta (une sorte de cadeau de Peter Bradley) 24 heures après l'activation des macrophages infectés par des parasites de type sauvage ou des mutants parasites. T. gondii a été co-coloré avec un anticorps monoclonal anti-T. anticorps gondii. Type sauvage T. gondii a une mitochondrie unique qui se étend autour de la circonférence du parasite. Seule mitochondrie du parasite chez les parasites de type sauvage suite à l'activation des macrophages infectés était intacte par rapport à une mitochondrie fragmenté des parasites mutants. la fragmentation des mitochondries était évident non seulement dans dégradé / amorpheparasites mais aussi chez les parasites qui présentaient une morphologie normale évaluée par microscopie à contraste de phase. Cela donne à penser que le défaut dans le mutant parasite peut augmenter la sensibilité de la mitochondrie de parasite pour accueillir médiateurs cellulaires induits par l'activation des macrophages.

Le modèle actuel utilise une combinaison de LPS et IFN-γ à activer les macrophages infectés. IFN γ stimule la STAT1 facteur de transcription. LPS, comme le TNF-α, stimule le facteur de transcription NF-kB. Connu IFN γ médiateurs antimicrobiens dépendantes importants dans la cellule autonome l'immunité contre T. gondii comprend un tableau de IFN-γ dépendantes liées à l'immunité (GTPases IRGS, Gbps) et les espèces réactives de l'oxygène et de l'azote en plus d'autres agents. Afin de déterminer si le défaut de chaque mutant est spécifiquement associée à la production de IFN-γ connue inductible par des médiateurs anti-microbiens, les macrophages dérivés de la moelle osseuse sont isolées à partir deiNOS - / -, 91 phox gp - / - ou le gène supprimé souris spécifiques IRG / GBP et dosés pour l'activité contre les parasites mutants. La combinaison de γ et LPS IFN pour activer les macrophages infectés résulte préférentiellement dans des mutants présentant une sensibilité accrue à l'oxyde nitrique par rapport au type sauvage parasites 28.

Activation des macrophages infectés peut induire la différenciation de la scène des parasites de tachyzoïtes à bradyzoïtes qui sont contenus dans les kystes tissulaires. Ces kystes sont caractéristiques de l'infection chronique. Ainsi, parasites mutants qui sont défectueux pour la réplication / survie après activation des macrophages infectés peuvent également être défectueux pour la conversion à des kystes cours de l'infection in vivo. Afin d'évaluer la production de kystes cours de l'infection chronique, les souris sont contestées par voie intrapéritonéale (ip) avec une dose non létale de la souche du parasite parentale ou le clone mutant. Les kystes dans la gamme de cerveau de taille de moins de 10 _6;. M de diamètre à plus de 50 um comme indiqué sur la Figure 6 Comptez le nombre de grands et de petits kystes par IFA mais gardez les chefs distincts afin de déterminer si le mutant parasite est compromise pour la production de kystes totale ou juste pour l'établissement et l'entretien des gros kystes.

Figure 1
Figure 1. Les macrophages dérivés de la moelle osseuse murine naïfs sont permissives pour la réplication de T. gondii mais l'activation avec γ IFN et de LPS inhibe sensiblement la réplication. (A) Une vacuole parasitophore (PV) de type sauvage T. gondii 24 h après l'invasion de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris naïves. (B) Un PV de type sauvage T. gondii parasites composé de quatre parasites par vacuole 24 heures après l'activation des macrophages infectés.(C) Un exemple d'un parasite mutant incapable de se répliquer et toujours à une parasite / PV 24 heures après l'activation des macrophages infectés. (D) Un exemple d'un parasite mutant qui est dégradée dans un amorphe PV 24 heures après l'activation des macrophages infectés . La rangée du haut montre des images de phase des parasites et de la rangée du bas montre des images fluorescentes en utilisant un anti-sérum polyclonal contre T. gondii. La barre d'échelle représente 5 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. réplication du parasite évaluée par le nombre de parasites par PV. Les images montrent deux, quatre, huit, 16 et 32 parasites par PV dans les cellules HFF. Chaque image est une image de phase fusionnée eà montre polyclonaux coloration d'anticorps du parasite en rouge et le noyau HFF en bleu (DAPI). La barre d'échelle représente 5 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Des mutants présentent une gamme de phénotypes qui suit l'activation des macrophages infectés. La colonne de gauche est une image de phase du parasite dans les macrophages, la colonne centrale est une image fluorescente en utilisant un anticorps à T. gondii, et la colonne de droite est une fusion de la phase et l'image fluorescente. Le parasite est représenté en vert et le noyau des macrophages en bleu. La barre d'échelle représente 5 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grandeversion de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. LAMP1 coloration distingue PV de phagolysomes contenant parasites. Parasites sont colorées avec un anticorps polyclonal anti-T. anticorps gondii (rouge) et LAMP1 avec le mAb 1D4B (vert). Une flèche marque un PV de parasite qui a fusionné avec les lysosomes. Le parasite sans la flèche se trouve dans une vacuole parasitophore (PV) qui ne est pas fusionné avec les lysosomes. La barre d'échelle représente 5 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. parasites de type sauvage maintenir une mitochondrie intacte tandis que les mitochondrisur est dégradé dans les mutants parasites suivantes activation des macrophages infectés. mitochondrie (vert) dans les parasites de type sauvage (panneau du haut) comparativement à trois mutant T. différente gondii parasites à différents stades de dégradation (en bas trois panneaux) 24 heures après l'activation des macrophages infectés. La barre d'échelle représente 5 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Détection de kystes parasitaires dans le cerveau en utilisant dolichos FITC-conjugués biflorus lectine. La paroi du kyste marqué avec la lectine est représenté en vert. La barre d'échelle représente 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Discussion

Le protocole décrit fournit une approche non biaisée qui utilise l'activation des macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris et de la génétique à terme pour isoler T. gondii mutants avec un défaut dans leur capacité à survivre activation des macrophages infectés. Le phénotype des mutants activation des macrophages suivante tombe généralement dans l'une des deux grandes catégories: 1) Les parasites apparaissent intacts mais ne parviennent pas à reproduire au-delà de 1 parasite par PV; 2) Les parasites apparaissent dégradées et peuvent être dans des PV amorphes spacieuses. Le fait que les mutants ont un phénotype comme des parasites de type sauvage dans les macrophages naïfs en l'absence d'activation prouve le protocole peut être utilisé spécifiquement pour identifier les mutants qui sont spécifiquement dépréciés dans leur capacité à résister à l'activation des macrophages. L'utilisation de macrophages dérivés de la moelle osseuse primaire est recommandé par rapport à la lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 de l'écran parce que la morphologie des parasites et le nombre de parasites par vacuole sont plus facilement visualisé dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse.

L'écran décrit combinée avec la génétique à terme fournit un outil polyvalent pour disséquer gènes parasitaires et finalement voies génétiques importants pour la résistance aux médiateurs spécifiques de l'immunité cellulaire autonome. Ces études de génétique à terme sont importantes pour identifier les gènes parasites qui peuvent être suivies comme une corde pour commencer démêler voies parasites importants pour résister médiateurs antimicrobiens spécifiques à la fois in vitro et au cours de la pathogenèse. Une difficulté précédente avec des approches génétiques à terme était l'identification du gène clé perturbé dans chaque mutant. Cosmide bibliothèque complémentation en T. gondii a été très efficace pour la complémentation fonctionnelle de mutants de la division cellulaire. Cependant, le fait que la réplication des parasites de type sauvage sont également supprimée par l'IFN-γ et LPS seulement dans une moindre mesure que les mutants, permet la complémentation fonctionnelle tha plus difficilen pour les mutants de la division cellulaire. Séquençage mutationnelle profilage pour les deux mutants chimiques et d'insertion en T. gondii a récemment émergé comme un productive, et même rentable, avenue d'identifier les gènes responsables de phénotypes de mutants en génétique écrans avant 34,36,37,44. Par conséquent, toute profilage mutationnelle génome en utilisant le séquençage de prochaine génération a amélioré les utilisations potentielles de mutagenèse chimique de T. gondii dans les études génétiques à terme pour identifier les gènes importants pour des fonctions spécifiques. Une telle approche avant de génétique comme décrit dans le protocole actuel sont importants car la plupart du génome de T. gondii reste hypothétique avec une majorité de gènes prédits ne ayant aucune homologie avec d'autres gènes ou des domaines fonctionnels qui pourraient aider à l'identification des gènes importants pour échapper au système immunitaire de parasites candidat.

IFA analyse des plaques à 96 puits ne est généralement pas considéré comme un criblage à haut débit rencontréhod. Dans notre expérience, il est raisonnable pour une personne à une tache et un écran 10 plaques à 96 puits dans un jour ou environ 960 mutants. Dans l'article de Skariah et al., Environ 8000 mutants ont été analysés et 14 mutants indépendants ont été isolés qui ont été significativement diminuée pour la survie / réplication dans les macrophages activés mais non naïfs 28. La survie des mutants déficients était principalement le résultat d'une sensibilité accrue à l'oxyde nitrique. La limitation de la méthode globale est principalement au niveau de l'obtention des clones uniques du parasite plutôt que le dépistage par microscopie comme écran initial plaques à 96 puits est qualitative et raisonnablement rapide. Confirmation du phénotype des mutants identifiés dans l'écran de la plaque 96 puits est suivie dans l'étape 3 par analyse quantitative et qualitative en utilisant des macrophages dans les diapositives de la chambre et en ajoutant un nombre égal de type sauvage ou des parasites mutants. L'utilisation d'autres procédés de criblage d'analysetels que fluorométrie au niveau de la population totale des parasites, plutôt que le niveau de parasite individu comme évalué par microscopie, sont problématiques dans le protocole actuel autant de parasites dégradées tache avec l'anticorps polyclonaux contre T. gondii aussi énergiquement que les parasites de type sauvage avec la différence dans le mutant étant plus qualitative que quantitative au niveau de l'intensité de fluorescence. De plus, la dose d'IFN-γ et LPS nécessaires pour isoler des mutants présentant une anomalie de la résistance à l'activation des macrophages infectés résultats dans la réplication de suppression des parasites de type sauvage mais à des points de temps ultérieurs. Par conséquent, la mesure du nombre total de parasites de l'écran vers l'avant de la génétique comprenant l'utilisation de parasites luminescents est problématique. Toutefois, il est possible que le protocole de coloration peut être éliminé dans l'étape de criblage des clones si parasitaires parentales utilisées pour la mutagenèse chimique ou insertion d'un fluorescent exprimé ou lucifer constitutif ou inductiblemarqueur ase. Le protocole décrit à l'aide IFA et la microscopie dépistage des macrophages en plaques à 96 puits permet pour l'isolement de mutants défectueux pour la survie / réplication dans les macrophages activés mais il manque clairement certains mutants potentiels dus à la résolution microscopique limitée réalisables en utilisant le format de plaque à 96 ainsi que à cette résolution vacuoles gonflées amorphes qui tachent de l'antigène de parasite peuvent être confondus avec les parasites répliquant sains dans un PV normal. Substitution de 96 puits des plaques de verre de couverture, au lieu de plaques à 96 puits avec une surface optique, est susceptible d'atteindre une plus grande résolution de l'écran au cours de macrophages infectés dans des plaques à 96 puits.

La grande majorité des mutants identifiés en utilisant IFN-γ et LPS dans le protocole décrit pour activer les macrophages suivantes invasion parasitaire ont un défaut dans leur capacité à se protéger de l'oxyde nitrique 28. À cet égard, bien que l'écran destiné à être non biaisée,peut enrichir pour l'isolement de mutants de parasites à une susceptibilité accrue aux médiateurs antimicrobiens spécifiques en fonction des conditions d'activation, le type et les espèces de macrophages et le moment de l'invasion du parasite par rapport à l'activation des macrophages qui sont choisis pour l'écran. Ainsi la cellule immunitaire inné choisi pour l'écran et les stimuli d'activation appliqués sont des paramètres critiques qui ont un impact du type de médiateurs antimicrobiens à laquelle les parasites mutants résultants sont susceptibles d'être sensibles. Le génotype du parasite est également un paramètre critique que le Type I génotypes du parasite sont relativement résistants à l'immunité liée (GTPases) IRGS induits en réponse à l'IFN-γ, tandis que les génotypes de type II et III sont plus sensibles 26,45,46. Dans le protocole décrit, les macrophages sont activés après l'invasion parasitaire. Bien que le génotype de type II, la souche Prugnaud, utilisé dans l'écran décrit est sensible à l'action de l'immunité liée GTPases, unllowing le parasite d'envahir macrophages permet première réplication des parasites de type sauvage avant la pleine induction des IRGS. En outre, il ne est pas clair que IRGS sont efficaces contre le parasite se ils sont induits dans les macrophages postérieurs à parasiter invasion et initiation de la réplication.

Le protocole décrit utilise les macrophages afin d'identifier des gènes importants pour la résistance à l'IFN-γ dépendant médiateurs de l'immunité cellulaire autonome, en particulier l'oxyde nitrique parasites. L'isolement d'un pool de mutants de parasites qui partagent une susceptibilité marquée à l'oxyde nitrique ainsi que d'un phénotype commun des nitrique fragmentation mitochondriale oxyde-dépendante fournit un jeu unique d'outils pour identifier les gènes du parasite et des voies importantes pour la résistance à l'oxyde nitrique et de comprendre l'action de l'oxyde nitrique plus largement contre T. gondii et autres pathogens.The eucaryote protocole décrit avec des modifications mineures peuvent être utilisés pour la génétique avant studies pour identifier des gènes importants pour la résistance du parasite aux différents médiateurs de l'immunité cellulaire autonome. Les modifications possibles comprennent la modification du type de cellule hôte infectée, les stimuli d'activation, ou le moment de l'activation par rapport à parasiter invasion. Par exemple, pré-activation des macrophages murins avec l'IFN-γ avant l'addition des parasites se traduirait par activation de l'immunité liée GTPases. Un tel modèle pourrait être utilisé pour identifier les gènes de parasites dans le type génotypes de T. I gondii qui peut contribuer à la résistance médiée par ROP18 et ROP5 à l'immunité GTPases liés 24,25. Les médiateurs de l'immunité cellulaire autonome contre T. gondii dans les cellules immunitaires innées humains ne sont pas aussi bien définie que chez les rongeurs. Ainsi, l'utilisation de monocytes de sang périphérique humain pour cribler des mutants chimiques de T. gondii pourrait identifier deux gènes parasitaires importantes pour la survie lors de l'infection humaine dans les cellules immunitaires innées ainsi que des mécanismes importants chez l'homme for la résistance aux antimicrobiens à T. gondii. Parasite gènes importants pour la résistance aux antimicrobiens médiateurs spécifiques peuvent être identifiés par isolement de mutants incapables de survivre à l'exposition des cellules hôtes infectées à des agents pharmacologiques tels que les espèces réactives de l'oxygène ou d'azote. De même, le protocole peut être modifié pour isoler des mutants de parasites avec une sensibilité accrue à 47-49 inflammasome activation ou stimulation ATP des récepteurs purinergiques 50 macrophages.

Pris ensemble, les protocoles décrivent une approche utilisant l'avant génétique et cellules immunitaires innées pour isoler des mutants importants pour T. parasitaires gondii résistance à l'IFN-γ dépendant autonome immunité cellulaire. Surtout, l'approche mis en avant est polyvalent et peut être facilement modifié pour isoler des gènes parasitaires important pour échapper médiateurs antimicrobiens spécifiques, la survie du parasite dans les types spécifiques de cellules hôtes ou la résistance à des conditions de stress encounterouge pendant la toxoplasmose. En outre, les gènes de parasites importantes pour résister à l'activation de la cellule hôte dans de nombreux cas, peuvent également jouer un rôle, directement ou indirectement dans la production de kyste in vivo pendant l'infection.

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FITC-conjugated dolichos Vector Labs FL-1031 https://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=188
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Monoclonal mouse anti-Toxoplasma gondii Ab Fitzgerald Industries International 10T19A http://1degreebio.org/reagents/product/1069274/?qid=652947

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