التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وخارج الحي إعداد جديد لتصوير النخاع الشوكي الماوس. هذا البروتوكول يسمح لاثنين من الفوتون التصوير من التفاعلات الخلوية الحية في جميع أنحاء الحبل الشوكي.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

نماذج الماوس من إزالة الميالين، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع التجريبي المناعة الذاتية (EAE) والعدوى داخل الجمجمة مع neuroadapted فيروس التهاب الكبد الماوس (MHV)، هي أدوات ممتازة لدراسة المسارات الجزيئية والتفاعلات الخلوية المرتبطة المرض. كما أدت إلى وبدعم وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فعالية العلاجات الدوائية، وتستهدف وقف المناعة الذاتية والتهاب 1 في المقام الأول. ومع ذلك، مرة واحدة وفشلت عودة الميالين الذاتية، والعلاجات المعتمدة حاليا لا إصلاح فعال آفات عديمة الميلين في الجهاز العصبي المركزي. لذلك، والعلاجات التي تركز على إصلاح في هذه المرحلة من المرض الحرجة للتخفيف من الأعراض المزمنة وتحسين نوعية الحياة. في الآونة الأخيرة، أصبحت خلايا العصبية السلائف (الشخصيات) الى الواجهة كطريقة علاجية التجدد المحتملة لاستهداف مناطق الالتهاب وإزالة الميالين. وقد أبرزت العديد من الدراسات قدرة اللجان التحضيرية الوطنية للحث على endogenoلنا عودة الميالين والمشاركة مباشرة في عودة الميالين 2-8. وذلك لأن وتشارك الشخصيات في عودة الميالين المباشر، لا بد من فهم حركية والتفاعلات مع الخلايا الذاتية بعد زرع. بعد زرع، الشخصيات تهاجر البطني إلى مناطق الضرر المادة البيضاء، ثم rostrally ونحو caudally النسبية الى الموقع زرع 5،9. حركية الهجرة تختلف في استجابة لمنبهات البيئية؛ الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي غير التالفة لها سرعات أكبر من الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي التالفة 6. بعد فترة المهاجرة، ونقل الشخصيات تتكاثر على نطاق واسع، بمعدل أعلى في التالفة الحبل الشوكي بالنسبة إلى الحبل الشوكي سليما 6. وأخيرا، فإن غالبية الشخصيات تفرق في قليلة التغصن والشروع 4،6،9 عودة الميالين المباشر.

الآفة عديمة الميلين معقدة ويمكن أن تشمل مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا في مراحل مختلفة منctivation. على سبيل المثال، يمكن أن تشمل على التصلب المتعدد (MS) الآفة النشطة عدد كبير من السكان من خلايا تنشيط T، الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة M1 M1، ولكن يمكن أن تتكون لالمزمنة الصامتة MS الآفة أساسا من الخلايا النجمية على رد الفعل مع عدد قليل من الخلايا الالتهابية 10-13. ونظرا لتنوع الخلايا المستجيب، واثنين من الفوتون (2P) التصوير في نماذج الماوس من إزالة الميالين هو أداة مفيدة للغاية للمساعدة في فهم التفاعلات الخلوية المحلية داخل الآفة. في MS والعديد من النماذج البحثية المستخدمة على نطاق واسع MS، والغالبية العظمى من الآفات وتقع على الجانب البطني من الحبل الشوكي، وهي منطقة يصعب الوصول إليها لتصوير حيوي داخلي 2P بسبب عمق الآفة والمحتوى الدهني المرتفع من الحبل الشوكي. للتحايل على هذه القضايا والتفاعلات دراسة خلية خلية داخل الآفات على طول الحبل الشوكي بطني قمنا بتطوير بسيط خارج الحي 2P إعداد التصوير 6.

هذه الدراسة بمتابعة أساليب نشر السابق، والذي أظهرالإجراء لزرع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) الشخصيات -expressing في الحبل الشوكي للفئران التالية JHMV سلالة من MHV التي يسببها إزالة الميالين 14. يصاب خمسة أسابيع الفئران القديمة مع JHMV وزرعها مع EGFP-الشخصيات على مستوى الصدري 9 في يوم 14 بعد الإصابة. بروتوكول المعروضة هنا يوفر الخطوات مفصلة حول كيفية استخراج النخاع الشوكي، وجعل إعداد فيفو السابقين الاغاروز، وصورة زرع EGFP-NPC التفاعلات مع تعزيز بروتين فلوري الأصفر (EYFP) محاور -expressing. واستخدمت الفئران معربا عن EYFP تحت العصبية محددة Thy1 المروج في هذا الإجراء 15. فقط بعض من محاور التعبير عن EYFP، مما يجعلها مفيدة لتصوير محاور الفردية. نحن هنا تظهر النخاع الشوكي إزالتها في 7 أيام بعد زرع؛ ومع ذلك، النخاع الشوكي يمكن استخراجه في أي نقطة زمنية بعد زرع. في حين نظهر تفاعلات الشخصيات مع محاور التالفة، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع علامات الفلورسنت الوراثيةمن أنواع الخلايا الأخرى للتحقيق في العديد من التفاعلات الخلوية التي تحدث في جميع أنحاء الحبل الشوكي الماوس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتمت الموافقة على بروتوكول للتعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة كاليفورنيا في ايرفين، بروتوكول # 2010-2943: بيان الأخلاق: ملاحظة.

1. إزالة الحبل الشوكي

  1. وضع المناشف الورقية المبللة مع ~ 100٪ الأيزوفلورين السائل، USP في القتل الرحيم الغرفة ووضع المناشف الورقية الجافة على القمة. ضع الماوس في غرفة في أعلى المناشف الورقية الجافة حتى الماوس لا لمس الأيزوفلورين وتأكد من تغطية الغرفة. الانتظار دقيقة واحدة على الأقل بعد التوقف عن التنفس للتأكد من أن الفأر هو الموت الرحيم.
  2. إجراء transection الشوكي من الرقبة لضمان الموت الرحيم الماوس. عدم تنفيذ خلع عنق الرحم وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الحبل الشوكي.
  3. رش الفأر مع الايثانول 70٪ لترطيب الشعر.
  4. استخدام مقص الجميلة حادة لإزالة الشعر والجلد من الجزء الخلفي من الماوس لكشف العمود الفقري من نحو الصفيحة عنق الرحم 1 (C1) إلى الصفيحة العجزية 4 (S4).
  5. باستخدام مشرط بشفرة رقم 10، وجعل شقوق إلى اليسار واليمين من العمود الفقري لفصلها عن العضلات والدهون. وهذا سيجعل إزالة الحبل الشوكي أسهل بكثير.
  6. اختياري: أ رينجرز لور منحني يمكن أن تستخدم لحلج القطن بعيدا اللحم إضافية.
  7. في حين عقد الجزء العلوي من فقرات العمود الفقري مع ملقط غريف مسننة، وإدراج التيتانيوم منحني مقص Vannas مع الجانب المنحني تصل إلى العمود الفقري تتعرض في C1، والحرص على عدم لمس الحبل الشوكي.
  8. حرك التيتانيوم منحني مقص Vannas على طول الطريق إلى اليمين وجعل قطع صغيرة واحدة. يجب أن يسمع صوت أزمة صغير وشعرت كما قطعت مقص الفقرات. كرر هذا الخفض على الجانب أقصى اليسار من الحبل. يجب الحرص على عدم ذهاب بسرعة كبيرة جدا أو جعل كبيرة جدا من حيث سيؤدي ذلك إلى خفض خطر إتلاف سلك مع مقص.
  9. وينبغي أن تكون الصفيحة واحدة قادرة على أن يرفع مع ملقط مرة واحدة يتم قطع جانبي الفقرات. REPEAT هذه الخطوة لكل الصفيحة حتى S4، والاستمرار في عقد وسحب فقرات العمود الفقري.
    ملاحظة: سوف فقرات فوق موقع زرع المرجح أن يأتي قبالة بمجرد أقطعها الى الموقع زرع. مواصلة الإجراء ابتداء من أسفل الموقع زرع.
  10. اختياري: وضع فقرات أسفل لرؤية حيث الموقع زرع هو وقياس وخفض ~ 20 مم منقاري والذيلية الى الموقع زرع.
    ملاحظة: عندما زرع الشخصيات أكثر لن تكون هناك حاجة لأن الشخصيات المزروع عموما لا تهاجر أبعد من 15 ملم. فإن مقدار الحبل الشوكي حاجة أن تعتمد على التجربة والهجرة خصائص نوع من الخلايا المزروعة. مما يجعل تخفيضات منقاري والذيلية التي هي على مسافة واحدة الى الموقع زرع تمكين الموقع زرع أن تقع بسهولة أكبر أثناء التصوير.
  11. باستخدام مشرط بشفرة # 11 قطع بعناية العقد على اليمين واليسار من الجانب البطني من الحبل الشوكي ابتداء من نهاية منقاري. هذا ثسوء تمكين الحبل الشوكي إلى إزالتها من فقرات البطنية أكثر سهولة.
    ملاحظة: تم بسرعة (الخطوات 1،7 حتي 1،11)، والحبل الشوكي لا تجف. ومع ذلك، برنامج تلفزيوني 1X يمكن أن تدار على الحبل لإبقائها رطبة.
  12. عكس الماوس مع الاستمرار على الماوس لأعلى حتى النخاع الشوكي لأسفل. قشر بعناية الحبل الشوكي باستخدام ملقط مغلقة غريف مسننة. دون الخدش الحبل الشوكي، وقطع بعناية أي العقد المتبقية للسماح الحبل الشوكي إلى أن يرفع في قطعة سليمة واحد.
  13. تأكد من أن الحبل الشوكي هو في RPMI-1640 ووضعه على الجليد لنقلها إلى المجهر 2P.

2. إعداد الحبل الشوكي للتصوير

  1. تضمين الحبل الشوكي في الاغاروز
    1. الحفاظ على الحبل الشوكي معزولة في برود RPMI-1640 على الجليد قبل التصوير.
    2. تزن خارج الاغاروز (انخفاض درجة حرارة التبلور) وإعداد محلول 5٪ في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الميكروويف الحل الاغاروز 5٪ لمدة 15 ثانية على حل AGنشأت وترك الحل بارد إلى 37 درجة مئوية.
    3. إعداد الحبل الشوكي عن طريق وضعها على ورقة من بارافيلم مع الجانب البطني مواجهة.
    4. الماصة حوالي 5 مل من 5٪ محلول الاغاروز على الجانب البطني من الحبل الشوكي. السماح للالاغاروز يصلب عن طريق التبريد إلى درجة حرارة الغرفة. التصلب الكامل يستغرق حوالي 5 دقائق.
    5. تطبيق طبقة خفيفة من مادة لاصقة من الأنسجة إلى 22 مم غطاء مربع زلة.
    6. عكس الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ، ووضع الجانب البطني على بارافيلم. والآن الجانب الظهري أن مواجهة. الالتزام انزلاق الغطاء إلى الجانب الظهري، وغمر الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الحبل الشوكي / تغطية إعداد الانزلاق في RMPI لترسيخ لاصقة. إزالة الزائدة طدت الاغاروز باستخدام شفرة حلاقة.
  2. تركيب الحبل الشوكي على المسرح المجهر
    1. تطبيق الفازلين على الجزء السفلي من انزلاق الغطاء. وهذا الاستقرار في إعداد خلال نضح.
    2. ضع إعداد الحبل الشوكي فيالتصوير بشكل جيد على المسرح المجهر مع الجانب البطني مواجهة نحو الهدف غمس 25X. التصوير جيدا مبنية خصيصا حوالي 20 ملم عميق، 50 مم طويل، و 50 مم عبر.
    3. صورة بينما superfusing إعداد مع درجة حرارة (37 درجة مئوية)، المؤكسج (95: 5 الأكسجين: ثاني أكسيد الكربون-كربوجين) المتوسطة RPMI-1640 دون المصل.
      1. وسائل الإعلام قبل دافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وذلك لربط أنابيب مضخة عن طريق إدخال الأنبوب في زجاجة سائل الإعلام.
      2. الإبقاء على درجة حرارة سائل الإعلام في 37 ° C جهاز سخان في ربط أنابيب إلى غرفة. وسائل الإعلام Superfuse من خلال جيدا في 3 مل / دقيقة باستخدام أنابيب متصلة أنابيب مضخة (الشكل 1B).

3. 2P التصوير من الحبل الشوكي بطني

  1. الإعداد المجهر
    1. الحصول على صور من النخاع الشوكي Thy1-EYFP باستخدام الحرباء الترا تي: ليزر الياقوت ضبطها إلى 900 نانومتر. تخفيف قوة الليزر فيعينة إلى <5٪ لضمان الحد الأدنى من الضيائية 16. الحفاظ على درجة الحرارة عن طريق perfusing-perfused لالأكسجين RPMI-1640 في ثابت 37 ° C باستخدام واحد سخان حل مضمنة لضمان التصوير مستقرة، ومنع الانجراف الأنسجة وتلف الخلايا.
    2. لفصل EGFP وEYFP إشارة الفلورسنت، ووضع 520 نانومتر مزدوج اللون واحدة الحافة و560 نانومتر واحد حافة مزدوج اللون شعاع الخائن في سلسلة لفصل 2P الانبعاثات إلى ثلاث قنوات، تقسيم عمدا انبعاث الأخضر لتعزيز الرؤية.
      ملاحظة: هذه القناة ويشار إلى الأزرق والأخضر (الانبعاثات <520 نانومتر) والأخضر والأصفر (520-560 نانومتر)، والأحمر (الانبعاثات> 560 نانومتر). أنابيب مضخم كشف تنبعث الضوء في كل قناة.
  2. تحديد مناطق التصوير الفائدة
    1. باستخدام العدسة ومصدر الضوء الساطع المجال، والتركيز على الهدف غمس على حافة بطني من الحبل الشوكي لتحديد نقطة مرجعية.
    2. جعل مصدر الضوء المؤكد المحيطة هو خارج وجنوب غربحكة ل2P الإثارة عن طريق فتح مصراع الليزر.
    3. إذا كان متوفرا، عند البحث الأنسجة لمجالات الاهتمام، استخدام دقة إعداد أقل، وارتفاع حجم دون تقريب رقمي، وأعلى معدل المسح مما كانت عليه عندما الحصول على الصور النهائية. إعدادات نموذجية مع هذا النظام عند البحث عن الأنسجة المنطقة ذات الاهتمام هي: القرار: 256 بكسل. حجم: س = 600 ميكرون، ذ = 600 ميكرون، ض = 0-300 ميكرون.
    4. مراقبة محاور EYFP بالقرب من الحافة البطنية من النخاع الشوكي. سوف إشارة التوافقية الثانية من الكولاجين (الأزرق) سيكون ألمع في العمود الفقري حافة نسيج الحبل. تحديد محاور EYFP فقط الظهرية للإشارة التوافقية الثانية من الكولاجين وتصور إشارة EYFP في القناة الخضراء والأصفر.
    5. تحديد الموقع زرع في وسط الطولي للإعداد الحبل الشوكي 14. بالنسبة للفئران 1 يوم بعد زرع EGFP-مجلس الشعب، حدد موقع الموقع زرع من خلال التركيز على مسار شعاع في الطائرة ض عمق الأنسجة. واي الموقع زرعليرة لبنانية تختلف قليلا بين الحيوانات ولكن يقع عموما ~ 200 ميكرون من على حافة بطني. مراقبة مجموعات من EGFP-الشخصيات في مساحات المادة البيضاء، وأقرب إلى حواف البطنية والجانبية في الفئران بعد يوم 1 بعد الزرع.
  3. الحصول على الصور النهائية
    1. الحصول على صورة من القرار 512 بكسل. حجم: س = 270 ميكرون، ذ = 212 ميكرون، و z = 100 ميكرون باستخدام Slidebook 6 البرمجيات. تجميع أكوام Z-من خلال الحصول على طائرات التنسيق متتابعة في 2.5 ميكرون الزيادات.
    2. إجراء فحص ثنائي الاتجاه مع حابك السليم تعويض لضمان الكمي السريع للأي أجسام المهاجرة في الحبل الشوكي. ضمان المثالي معدل الإطار الاستحواذ لتحديد سرعة الخلوية داخل الحبل الشوكي هو حوالي 1 إطار / ثانية.
      يمكن تغيير إعدادات التصوير لتفضيلات المستخدم الفردية، مثل اكتساب معدل الإطار، القرار التصوير وأحجام التصوير: ملاحظة. سوف أحجام التصوير اكبر يستغرق عادة وقتا أطول لاكتساب في GIVقرار أون.
    3. تحليل، والمحاصيل، على نحو سلس، وpseudocolor ملفات Slidebook صورة مع برنامج تحليل الصور مثل Bitplane Imaris 7.7. إنتاج النهائية الفيديو الوقت الفاصل عن طريق تمشيط أحجام التصوير متتالية باستخدام عملية مؤتمتة في Slidebook وImaris.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في حين أن بروتوكول التصوير الحبل الشوكي explanted يمكن استخدامها لتصور أي مضان داخل الحبل الشوكي، نتائج ممثلة لدينا تظهر التفاعلات EGFP-NPC مع EYFP-محاور عصبية. أولا، نقدم لك مجموعة من بطني إعداد الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ في الشكل 1A. وبعد ذلك، نقدم لك مجموعة من الإعداد 2P المجهر والمكونات الرئيسية في الشكل 1B الشكل 2 يوضح EGFP وEYFP مضان في واحد ض المكدس داخل الحبل الشوكي بطني. اكتساب متتالية ض مداخن يمكن جمعها لإنتاج أشرطة الفيديو الوقت الفاصل بين لتحليل الوقت الحقيقي ديناميات الخلوية داخل أنسجة سليمة. باستخدام 520 نانومتر مزدوج اللون واحدة الحافة و560 نانومتر واحد حافة مزدوج اللون شعاع الخائن، كما لوحظ في البروتوكول، يمكن فصل EGFP وEYFP الإشارة. القنوات الفردية يمكن pseudocolored الأخضر والأصفر باستخدام برامج التصوير.

80 / 52580fig1.jpg "/>
الشكل 1: الحبل الشوكي والإعداد المجهر. (A) والحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ من agarose هلام 5٪ (يسار) والتي شنت على ساترة بعد إزالة الاغاروز الزائد (يمين). (ب) صورة من الإعداد المجهر مع المكونات الرئيسية المسمى. 1. حمام مجموعة المياه عند 37 درجة مئوية. 2. قبل تحسنت RPMI-1640. 3. C / L مضخة متغير السرعة الأنابيب. 4. واحد مضمنة سخان الحل. 5. الهدف الغمس. 6. ميزان الحرارة الرقمي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: مثال 2P صورة حصلت داخل الحبل الشوكي بطني اعادة البناء 3D من الجانب البطني من غير مصاب، غير التالفة (A) وJHMV المصابة، عديمة الميلين (B) الحبل الشوكي.من Thy1-EYFP الماوس بعد زرع مع الشخصيات EGFP المسمى. وpseudocolored محاور fluorescently المسمى والأصفر والأخضر pseudocolored الشخصيات. دقة وضوح الصورة: 512 بكسل. حجم الصورة: (A) س = 239 ميكرون، ذ = 259 ميكرون، ض = 65 ميكرومتر شيدت باستخدام 26 ض مداخن متباعدة 2.5 ميكرون، وبصرف النظر (B) س = 497 ميكرون، ذ = 389 ميكرون، ض = 127.5 ميكرون شيدت باستخدام 51 ض مداخن متباعدة 2.5 ميكرومتر إربا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في الوقت الحقيقي هو مطلوب 2P التصوير من الأنسجة سليمة للتحقيق حركية مجلس الشعب والتفاعلات التالية زرع في النخاع الشوكي الماوس عديمة الميلين. ويستخدم حيوي داخلي 2P التصوير عادة لتحديد ديناميات الخلوية على الجانب الظهري للحبل الشوكي في الفئران الحية، واستخدمت لدراسة الظهرية إزالة الميالين في المزيل للمرض 17-19. ومع ذلك، لأن الشخصيات المزروع تهاجر إلى المادة البيضاء بطني، التي تقع عميق جدا لصورة في الموقع باستخدام 2P المجهر، وإعداد فيفو السابقين أمر ضروري. وقد استخدمت هذه المنهجية في المختبر لتحديد الحركة وعودة الميالين حركية الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي التالفة وغير التالفة-6. خارج الحي الاستعدادات تمكن المسح من النخاع الشوكي طوليا فحسب، بل أيضا بالعرض من الجانب البطني 6،20 . وهذا يسمح لتحليل الاختلافات في حركة الخلية (سرعة واتجاه) والتفاعلات في رالموقع ransplant، المتاخمة لموقع الزرع، وعلى مسافات مختلفة من موقع زرع 6. في حين أننا وضعت في البداية هذا تمهيدا لصورة زرع EGFP-الشخصيات على الجانب البطني من الحبل الشوكي، ويمكن استخدامه لصورة أي fluorescently المسمى أو خلية مصبوغ من بطني، ظهري، أو الجانبين الجانبية عن طريق تغيير التوجه الحبل الشوكي هو شنت. فوائد هذا المستحضر على التصوير حيوي داخلي تتضمن السماح التصوير الجانب البطني وتفتقر إلى الحاجة إلى التخدير والجراحة البقاء على قيد الحياة، والتي لا تزال هناك حاجة مع الاستعدادات حيوي داخلي جديدة باستخدام "زجاج النافذة" الإعداد التي تسمح للدورات التصوير متعددة دون عمليات جراحية متكررة 19،21 . وتجدر الإشارة إلى أن الحد واحد من هذا الإجراء مقارنة مع نهج "زجاج النافذة" في تركيبة مع التصوير حيوي داخلي هو عدم القدرة على الحصول على نقاط زمنية متعددة من ماوس واحدة، حيث يتم إزالة الحبل الشوكي والموت الرحيم الماوس.

هي مناسبة بشكل مثالي ل2P التصوير حل ديناميات الخلايا واحد داخل أنسجة سليمة 22،23. 2P الإثارة تستخدم الفوتونات بالقرب الأشعة تحت الحمراء التي تسمح لفترات طويلة من التصوير الأنسجة العميقة مع الحد الأدنى من الضيائية. يحدث 2P الإثارة على امتصاص وقت واحد من اثنين من الفوتونات من قبل fluorophore. ويتم تحقيق نسبة عالية من الفوتونات اللازمة ل2P الإثارة التي ضغط المكانية والزمانية لانتاج الليزر 2P في المستوى البؤري واحدة. هذا يقيد الإثارة الفلورسنت إلى النقطة المحورية وهو ما يقلل الضيائية في مناطق النخاع الشوكي خارج البؤري. كما خفضت فوتونات الأشعة تحت الحمراء القريبة نثر، مما يتيح التصوير تصل إلى ما يقرب من 300 ميكرون من الجانب البطني من الحبل الشوكي 16.

كما هو الحال مع أي تقنية جديدة، ومع ذلك، 2P التصوير من الحبل الشوكي explanted والقيود التي يجب أن يوضع في الاعتبار. هذا البروتوكول التصوير يستخدم لdichro 520 نانومترجيم المرآة التي تمكن فصل EGFP وEYFP مضان من خلال تحويل الانبعاثات EGFP في القناة الفلورسنت محفوظة عادة للضوء الأزرق. يبدو الجيل الثاني التوافقي التي أنشأتها الكولاجين في النخاع الشوكي أيضا في القناة الزرقاء، ولكن يتميز بسهولة من خلايا EGFP المسمى والتي هي أكثر إشراقا بكثير في هذا الإعداد، والحصول على نسبة من الانبعاثات تحديدها في القناة الأخضر والأصفر كما الكولاجين لا. هذه التقنية من قناة مزج وفصل أجزاء مختلفة من أطياف الانبعاثات باستخدام dichroics محددة غالبا ما تكون مفيدة لتحديد البصرية أو الآلي من fluorophores الفردية مع قريب أو تداخل تقريبا أطياف الانبعاثات. الضيائية هو الحد آخر من هذا البروتوكول التصوير 2P. الخلايا داخل مجلد واحد التصوير حساسة للالضيائية. لذلك، يجب أن يكون التجريبي يدرك تماما من علامات الضيائية. الضيائية هو عادة واضحا لأول مرة في تخفيض أو عدم وجود خليةحركية، تليها photobleaching من و / أو تغيرات شكلية في الأنسجة المحلية. يمكن أن عدة عوامل تلف الأنسجة مما يؤدي إلى الضيائية أو جعلها غير صالحة للتصوير الخلايا الحية. فمن الأهمية بمكان لمراقبة قوة الليزر والحرارة والأوكسجين من perfused لRPMI-1640. ومن الضروري أيضا لضمان إزالة المناسبة من الحبل الشوكي من الماوس دون الإفراط في التمدد أو ضغط من الحبل الشوكي ودون قطع الحبل الشوكي مع ريش. إذا ما تم تناوله بشكل صحيح، فإن إعداد الحبل الشوكي explanted تبقى قابلة للحياة لمدة تصل إلى عشر ساعات، على النحو الذي يحدده الحركة الخلوية قوية داخل الحبل الشوكي بطني مع أي انتقاص في عشر ساعات ما بعد الاستخراج. وتصوير مجموعة متنوعة من الأنسجة المستخرجة عادة لفترات طويلة من الزمن وتعتبر قابلة للحياة 23-26. ولذلك، الكمي لديناميات الخلوية في مناطق متعددة داخل الحبل الشوكي واحد هو ممكن. وأخيرا، تجدر الإشارة إلى أن الغالبية العظمى من الخلايا ثالن يتم تصور من قبل هذا المستحضر (إلا إذا autofluorescent بشكل طبيعي) ر لا fluorescently المسمى، وأنه من المهم أن نعترف بأن الخلايا المسمى والتفاعل مع بيئة معقدة من الخلايا غير المسماة أخرى على ما يبدو غير مرئية الداخلية والعناصر الهيكلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456, (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212, (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224, (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235, (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30, (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86, (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30, (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17, (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590, (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12, (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8, (3), e58033 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics