Fare Omurilik Hücresel Dynamics İki foton Görüntüleme

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fare omuriliği görüntülenmesi için yeni bir ex vivo hazırlık. Bu protokol, omurilik boyunca canlı hücresel etkileşimlerin iki foton görüntüleme için izin verir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Weinger, J. G., Greenberg, M. L., Matheu, M. P., Parker, I., Walsh, C. M., Lane, T. E., Cahalan, M. D. Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord. J. Vis. Exp. (96), e52580, doi:10.3791/52580 (2015).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Introduction

Deneysel otoimmün ensefalomyelit (EAE) ve neuroadapted fare hepatit virüsü (Geminin) ile intrakranial enfeksiyon dahil demiyelinizasyon Fare modelleri, moleküler yollar ve hastalıkla ilişkili hücresel etkileşimleri çalışmak için mükemmel araçlardır. Onlar yol ve FDA etkinliği ağırlıklı olarak otoimmünite ve inflamasyon 1 durması hedefleyen, ilaç tedavileri kabul desteklemiştir. Endojen remiyelinizasyon başarısız sonra, ancak, şu anda onaylanan terapiler, etkili bir şekilde, merkezi sinir sisteminde miyelin kaybetmiş lezyonlar, onarım yapmaz. Bu nedenle, hastalığın bu aşamada onarım odaklı tedaviler kronik semptomlar ve yaşam kalitesinin iyileştirilmesi giderilmesi için kritik öneme sahiptir. Son zamanlarda, nöral öncü hücreler (NPC) inflamasyon ve demiyelinizasyon alanları hedef potansiyel rejeneratif tedavi yöntemi olarak ön plana çıkmıştır. Çeşitli çalışmalar, endogeno indükleme NPC yeteneğini ortaya çıkarmıştırBize remiyelinizasyon ve remiyelinizasyon 2-8 doğrudan katılmak. NPC doğrudan remiyelinizasyon dahil Çünkü, bu nakli sonrası endojen hücreler ile kinetik ve etkileşimleri anlamak şarttır. Transplantasyon sonrası, NPC sonra rostrally ve nakli sitesine 5,9 kaudal göreli beyaz cevher hasarı alanları ile ventral göç. göç kinetik çevresel uyaranlara yanıt olarak farklılık; Olmayan bir hasar omuriliğe nakledilen NPC hasarlı omurilik 6 nakledilen NPC daha büyük hızlara sahip. Bir göç süre sonra, bir sağlıklı omurilik 6 bozuk bir omurilik nispetle daha yüksek bir hızda, NPC yaygın olarak çoğalırlar transfer edilir. Son olarak, NPC çoğunluğu oligodentrositlere farklılaştırmak ve doğrudan remiyelinizasyon 4,6,9 başlatmak.

miyelin kaybetmiş lezyon karmaşıktır ve çeşitli aşamalarında bir hücre, farklı popülasyon ihtiva edebilirctivation. Örneğin, bir aktif multipl skleroz (MS), lezyon aktive edilmiş T hücreleri, M1, mikroglia ve M1 makrofajlar, ancak kronik sessiz MS lezyon temel olarak birkaç enflamatuar hücreler 10-13 ile reaktif astrositler içerebilir önemli bir nüfus içerebilir. Çünkü efektör hücrelerin çeşitliliği, demiyelinizasyon fare modellerinde iki-foton (2P) görüntüleme lezyon içinde yerel hücresel etkileşimleri anlamak için son derece yararlı bir araçtır. MS ve birçok yaygın olarak kullanılan MS araştırma modellerinde, lezyonların çoğunluğu nedeniyle lezyon derinliği ve omurilik yüksek yağ içeriği omurilik, intravital 2P görüntüleme erişilemez bir bölge ventral tarafında yer almaktadır. Ventral spinal kord boyunca lezyonlarında bu konuları ve çalışma hücre-hücre etkileşimleri aşmak için biz ex vivo 2P görüntüleme hazırlık 6 basit geliştirdik.

Bu çalışma gösterdi Önceki yöntemler yayın, takipMHV kaynaklı demiyelinasyon 14 JHMV suşu ardından fare omuriliğe gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) -expressing NPC nakli için prosedür. Beş haftalık fareler JHMV ile enfekte ve gün 14 sonrası enfeksiyon torakal seviyede 9'da eGFP-NPC ile nakledilen. Burada sunulan protokol bir ex vivo agaroz hazırlık yapmak, omuriliği ayıklamak ve gelişmiş sarı floresan protein (EYFP) -expressing akson görüntü nakledilen eGFP-NPC etkileşimleri konusunda ayrıntılı adımları sağlar. Nöronal spesifik Thy1 promotörün kontrolü altında EYFP sentezleyen Fareler Bu prosedür 15 kullanılmıştır. Sadece akson bazı bireysel aksonlar görüntüleme için yararlı hale EYFP ifade eder. Burada 7 gün transplantasyon sonrası çıkarılmış omurilikleri göstermektedir; Bununla birlikte, omurilik transplantasyonundan sonra herhangi bir zaman noktasında elde edilebilir. Zarar görmüş aksonlar NPC etkileşimlerini gösterirken, protokol genetik floresan işaretler ile kombinasyon halinde de kullanılabilirdiğer hücre türleri fare omurilik oluşan hücresel etkileşimler çok sayıda araştırmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Etik Açıklama: hayvan taşıma için protokol California, Irvine, protokol # 2010-2943 Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı.

Omurilik 1. Kaldırma

  1. Bölmesine euthanizing içinde ~% 100 sıvı izofluran, USP ile ıslatılmış kağıt havlu yerleştirin ve üstüne kuru kağıt havlu yerleştirin. Fare izofluran dokunmadan değil çok kuru kağıt havlu üstüne odasında fare yerleştirin ve oda kapalı olduğundan emin olun. Fare ötenazi olduğundan emin olmak için nefes kesilmesinden sonra en az bir dakika bekleyin.
  2. Fare ötenazi sağlamak için boyun spinal transeksiyonu gerçekleştirin. Bu omuriliği zarar verebilir gibi bir servikal dislokasyon yapmayın.
  3. Saç ıslak% 70 etanol ile fare püskürtün.
  4. (Yaklaşık servikal lamina 1 omuriliğe maruz C1 fare arkasından saç ve cilt kaldırmak için keskin bir makas kullanın İnce) Sakral lamina 4 (S4) için.
  5. Bir 10. bıçak ile bir neşter kullanarak, kas ve yağ ayırmak için omurganın sol ve sağ kesiler yapmak. Bu omurilik çıkarılması çok daha kolay hale getirecek.
  6. opsiyonel: eğimli bir Luer rongeurs ilave etini kepçe için kullanılabilir.
  7. Tırtıklı Graefe forseps ile omurilik vertebra üst tutarken, omurilik dokunmamaya dikkat ederek, yukarı C1 maruz omuriliğin içine kavisli tarafı titanyum kavisli Vannas makas yerleştirin.
  8. Tüm yol sağa titanyum kavisli Vannas makas kaydırın ve bir küçük bir kesim yapmak. Küçük krizi sesi duydum ve makas omurları kesilerek olarak hissettim edilmelidir. Kablonun kadar sol tarafında bu kesim tekrarlayın. Çok hızlı gitmek veya bu makas ile kabloya zarar riski gibi bir kesim çok büyük yapmak için dikkatli olun.
  9. Tek lamina omurları kenarları kesilir kez forseps ile kaldırılması gerekir. Rtutun ve omurilik vertebra geri çekmeye devam S4 kadar her tabakanın için bu adımı EPEAT.
    NOT: nakli sitesine kısmak kez nakli sitenin üstünde vertebra olasılıkla kapalı gelecektir. Sadece nakli sitesi altında başlayan prosedürü devam edin.
  10. İsteğe bağlı: nakli site ve ölçü ve ~ nakli sitesine 20 mm rostral ve kaudal kesmek nerede görmek için aşağı omurga yatıyordu.
    NOT: Daha fazla genellikle 15 mm'den daha öteye göç yok nakledilen NPC olarak ihtiyaç olmayacaktır NPC nakli. gerekli omurilik miktarı nakledilen hücre tipi deney ve göç özelliklerine bağlı olacaktır. Nakli sitesine eşit uzaklıkta olan rostral ve kaudal kesim yapma görüntüleme sırasında daha kolay bulunduğu için nakli sitesini sağlayacaktır.
  11. # 11 bıçak ile bir neşter kullanılarak dikkatle sağda ganglionlar kesti ve rostral sonunda başlayan omurilik ventral tarafında sol. Bu ağırlıkhasta daha kolay ventral omurları kaldırılacak omuriliği etkinleştirin.
    NOT: Hızlı Bitti (1,7-1,11 adımları), spinal kord kurumasına olmayacaktır. Bununla birlikte, 1 x PBS nemli tutmak için kordon tatbik edilebilir.
  12. Fareyi ters çevirin ve böylece omurilik aşağı bakacak fareyi tutun. Dikkatle kapalı dişli Graefe forseps kullanarak omuriliği dışarıda soyun. Omuriliği nicklemek olmadan, dikkatle omurilik tek sağlam bir parça dışarı kaldırdı izin vermek için kalan ganglionlar kesti.
  13. Spinal kord RPMI-1640 olduğundan emin olun ve 2P mikroskop ulaşım için buz üzerine yerleştirin.

Görüntüleme Omurilik 2. Hazırlık

  1. Agaroz omuriliği katıştırma
    1. Görüntü vermeden önce, buz üzerinde soğutulmuş, RPMI-1640 içinde ve izole spinal tutun.
    2. Agaroz (düşük jelleşme sıcaklığı) tartıldı ve 1 x PBS, 5 ml% 5 solüsyon hazırlanır. Ag çözmek için 15 saniye için% 5 agaroz çözümü mikrodalgaortaya çıkan ve 37 ° C serin çözüm sağlar.
    3. Ventral yüzü yukarı bakacak Parafilm bir levha üzerine yerleştirilerek omuriliği hazırlayın.
    4. Pipet omurilik ventral yan üzerinde 5% agaroz çözeltisi, yaklaşık 5 mi. Agaroz, oda sıcaklığına kadar soğutma yoluyla katılaşır olsun. Tam katılaşma yaklaşık 5 dakika sürer.
    5. 22 mm kare kapak kayma doku yapıştırıcı hafif bir kat uygulayın.
    6. Parafilm ventral tarafı yerleştirerek, gömülü omuriliği ters çevirin. dorsal tarafı şimdi karşı karşıya olacak. Dorsal tarafına kapak kayma uyun ve yapıştırıcı katılaşmaya RMPI agaroz gömülü omurilik / kapak kayma hazırlık daldırın. Aşırı bir jilet kullanarak agaroz katılaşmış çıkarın.
  2. Mikroskop sahnede omuriliği Montaj
    1. Kapak kayma altına vazelin uygulayın. Bu perfüzyon sırasında hazırlık stabilize edecek.
    2. Bir omurilik hazırlık yerleştirin25X daldırma hedefi doğru yukarı bakacak ventral yüzü mikroskop sahnede iyi görüntüleme. ısmarlama görüntüleme de yaklaşık 20 mm, 50 mm uzunluğunda derin ve karşısında 50 mm.
    3. Resim oksijenli ısıtılmış ile hazırlanması (37 ° C) superfusing ise serumsuz (95: karbon dioksit karbojen: 5 oksijen), RPMI-1640 ortamı.
      1. Pre-sıcak su banyosu içinde 37 ° C'ye kadar ortam ve ortam şişeye borunun sokulmasıyla boru pompasına bağlanır.
      2. Bölmeye boru bağlantısı 37 ° C arasındaki bir ısıtıcı cihaz ile ortam sıcaklığı muhafaza edin. Superfuse ortam maddesi de yoluyla 3 mL / tüp pompası (Şekil 1B) bağlı bir hortum kullanılarak Min.

Ventral Omurilik 3. 2P Görüntüleme

  1. Mikroskop Kurulum
    1. 900 nm ayarlı Sapphire lazer: Bir Chameleon Ultra Ti kullanarak Thy1-EYFP omurilik görüntüleri edinin. Lazer gücünü zayıflatır<% 5 örnek minimum fototoksisite 16 sağlamak. Istikrarlı görüntüleme sağlamak için, ve doku sürüklenme ve hücresel hasarı önlemek için tek bir satır içi çözüm ısıtıcı kullanarak sabit 37 ° C'de oksijen-perfüze RPMI-1640 perfüze sıcaklığını korumak.
    2. EGFP ve EYFP floresan sinyalini ayırmak için, bilerek görünürlüğünü artırmak için yeşil emisyonu bölme, üç kanal içine 2P emisyon ayırmak için seri bir 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı yerleştirin.
      NOT: Bu kanal mavi-yeşil (emisyon <520 nm), (520-560 nm), yeşil-sarı, kırmızı ve (emisyon> 560 nm) olarak adlandırılır. Fotomultiplier tüpler her kanalda yayılan ışığın saptar.
  2. Ilgi yerlerinin görüntüleme alanları
    1. Mercek ve parlak bir alan ışık kaynağı kullanarak, bir referans noktası ayarlamak için omuriliğe ventral kenarında daldırma hedefi odak.
    2. Emin ortam ışık kaynağı kapalı ve sw olunLazer deklanşörü açarak 2P uyarım kaşıntı.
    3. Varsa ilgi alanları için doku ararken, son görüntüler satın alırken daha düşük bir çözünürlük ayarı, dijital zoom olmadan yüksek hacim ve yüksek tarama hızı kullanın. Ilgi bölge için doku arıyor bu sistem ile tipik ayarlar şunlardır: çözünürlük: 256 piksel; hacim: x = y 600 mikron = 600 mikron, z = 0-300 mikron.
    4. Spinal kord ventral kenarında EYFP aksonlar gözlemleyin. Kolajen (mavi) ikinci harmonik sinyal omurilik dokusu kenarında parlak olacaktır. EYFP aksonlar sadece kolajen ikinci harmonik sinyal dorsal bulun ve EYFP sinyali yeşil-sarı kanalda görüntülenmiştir.
    5. Omurilik hazırlama 14 uzunlamasına merkezi nakli sitesi bulun. EGFP-NPC nakli sonrası fareler 1 gün için, derin dokuya z düzleminde ışın yolunu odaklanarak nakli sitesini bulun. nakli sitesi will hayvanlar arasında biraz değişir ama genel olarak ventral kenarından ~ 200 mikron yer almaktadır. 1 gün sonra transplantasyonundan sonra farelerde ventral ve lateral kenarları daha yakın, beyaz madde yollarının EGFP-NPC kümeleri dikkate alınmalıdır.
  3. Nihai görüntüleri alınıyor
    1. 512 piksel görüntü çözünürlüğü Edinme; hacim: x = 270 y um, = 212 mikron ve z = 100 mikron kullanarak Slidebook 6 yazılımı. 2.5 mikron artışlarla sıralı odak uçakları alarak z-yığınları Derleme.
    2. Spinal kord herhangi göç nesnelerin hızlı ölçümünü sağlamak için ofset uygun geçmeli ile çift yönlü tarama gerçekleştirin. Omurilik yaklaşık 1 kare / sn içinde ideal bir kazanım kare hızı hücresel hız belirlemek için emin olun.
      NOT: Görüntüleme ayarları, satın alma kare hızı, görüntüleme çözünürlüğü ve görüntüleme hacimleri gibi bireysel kullanıcı tercihlerine, değiştirilebilir. Büyük görüntüleme hacimleri genellikle GIV de kazanmak için daha uzun sürertr çözünürlük.
    3. Böyle Bitplane Imaris 7.7 olarak görüntü analiz yazılımı ile kırpma, pürüzsüz, ve Pseudocolor Slidebook görüntü dosyaları, analiz. Slidebook ve Imaris bir otomatik işlem kullanarak ardışık görüntüleme birimleri penye nihai time-lapse videolar üretmek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Çıkarılan omurilik görüntüleme protokolü omurilik içinde herhangi bir floresan görselleştirmek için kullanılabilir iken, bizim temsilcisi sonuçları EYFP-akson ile eGFP-NPC etkileşimleri göstermek. Öncelikle, biz Şekil 1A gömülü ventral spinal kord hazırlanmasını göstermektedir. Sonra, Şekil 1B 2P mikroskop kurulum ve anahtar bileşenleri göstermektedir. 2 ventral spinal kord içinde bir tek z-yığın içinde eGFP ve EYFP floresan gösterir Şekil. Ardışık z-yığınlarının kazanılması sağlam doku içindeki gerçek zamanlı hücresel dinamikleri analiz etmek time-lapse videolar üretmek için derlenmiş olabilir. 520 nm tek kenar dikroik ve 560 nm tek kenar dichroic ışın ayırıcı kullanarak, protokol belirtildiği gibi, EGFP ve EYFP sinyalini ayırabilirsiniz. Bireysel kanallar yeşil ve sarı kullanarak görüntüleme yazılımı yalancı olabilir.

80 / 52580fig1.jpg "/>
Şekil 1: Omurilik ve mikroskop kurulumu. (A) (sol)% 5 agaroz jel gömülü bir spinal kord ve aşırı agaroz (sağda) çıkarılmasının ardından bir lamel üzerine monte edilmiş. (B) işaretli anahtar bileşenleri ile mikroskop kurulum bir görüntü. 1. Su banyosu 37 ° C olarak belirlenmiştir. 2. RPMI-1640 Ön ısıtıldı. 3. C / L değişken hızlı boru Pompası. 4. Tek satır içi çözüm ısıtıcı. 5. Daldırma hedefi. 6. Dijital termometre. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2: Örnek 2P görüntü ventral spinal kord içinde edinilen bulaşmamış, olmayan hasarlı (A) ventral tarafında ve JHMV-enfekte, demiyelinize (B) omuriliğin 3D rekonstrüksiyon.EGFP-etiketli NPC ile Thy1-EYFP fare aşağıdaki nakli gelen. Floresan-etiketli aksonlar sarı yalancı ve NPC yeşil yalancı edilir. Görüntü çözünürlüğü: 512 piksel; görüntü hacmi: (a) X = 239 um, y 259 um, 65 um 26 Z-yığınları kullanılarak inşa z = kullanılarak 2.5 birbirinden um ve X = 497 um, y = 389 um, z = 127.5 um inşa (B) aralıklı = 51 z-yığınları 2.5 mikron aralıklı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gerçek zamanlı sağlam doku 2P görüntüleme demiyelinize fare omuriliğe nakli sonrası NPC kinetik ve etkileşimleri araştırmak için gereklidir. Intravital 2P görüntüleme yaygın yaşayan farelerde omurilik dorsal tarafında hücresel dinamikleri belirlemek için kullanılır, ve hastalık 17-19 demiyelinizan dorsal demiyelinizasyonu incelemek için kullanılır olmuştur. Transplant NPC 2P mikroskopi kullanılarak yerinde görüntüye çok derin yatıyor ventral beyaz cevher, göç Ancak, bir ex vivo hazırlık gereklidir. Bu metodoloji hasarlı ve hasarsız omurilik 6 nakledilen NPC motilite ve remiyelinizasyon kinetiği belirlemek için laboratuarımızda kullanılmıştır. Ex vivo hazırlıkları sadece uzunlamasına omurilik taranmasını sağlamak değil, aynı zamanda enine ventral yüzü 6,20 den . Bu T hücre hareketi farklılıklar (hız ve yön) ve etkileşimlerin analizine izin verirtransplant alanının bitişik ve transplant alanının 6 çeşitli mesafelerde ransplant Alanı. Başlangıçta, omurilik ventral tarafında EGFP-NPC nakledilen görüntüye bu hazırlığı tasarlanmış ise, bu görüntüye kullanılabilecek herhangi bir floresan etiketli ventral, dorsal boyalı hücre veya yan yüzler omurilik yönünü değiştirerek monte. Intravital görüntüleme üzerinden bu hazırlık Faydaları ventral yüzü görüntüleme sağlayan ve hala tekrarlanan ameliyatlar 19,21 olmadan birden fazla görüntüleme oturumları için izin bir 'cam pencere' kurulumu kullanarak yeni intravital hazırlıkları ile gerekli anesthetization ve sağkalım ameliyat gereksinimini, eksik dahil . Bu omurilik kaldırılır beri intravital görüntüleme ile birlikte 'cam pencere' yaklaşımı ile karşılaştırıldığında bu prosedürün bir sınırlama, tek bir fare birden fazla kez puan elde edememek olduğunu belirtmek gerekir ve fare ötenazi.

2P görüntüleme ideal dokulara 22,23 tek hücre dinamiklerini çözülmesi için uygundur. 2P uyarma az fototoksisite derin doku görüntüleme uzun süre izin yakın kızılötesi fotonları kullanır. 2P uyarma fluorofor iki foton aynı anda emilimi üzerine oluşur. 2P uyarılması için gerekli olan foton yüksek konsantrasyonu, tek bir odak düzleminde 2P, lazer çıkışının uzay-zaman sıkıştırma ile elde edilir. Bu daha odak düzlemi dışında omurilik bölgelerinde fototoksisite en aza indirerek, odak noktasına floresan uyarma kısıtlar. Yakın-Kızılötesi fotonlar da yaklaşık 300 mikron omurilik 16 ventral tarafında kadar görüntüleme sağlayan, saçılma azalttı.

Herhangi bir yeni tekniği ile olduğu gibi, ancak, Eksplante omurilik 2P görüntüleme akılda tutulmalıdır sınırlamaları vardır. Bu görüntüleme protokolü 520 nm Dichro kullanırgenellikle mavi ışık için ayrılmış floresan kanala eGFP emisyonunu aktarma ile eGFP ve EYFP floresan ayrılmasını sağlayan ic ayna. Omurilikteki kollajen tarafından oluşturulan ikinci harmonik üretimi de mavi kanal görünür, ancak yeşil-sarı kanal olarak tanımlanabilir bu hazırlık ölçüde parlak ve onların emisyon bir kısmını sahip eGFP etiketli hücrelerin kolayca ayırt edilir kollajen değil. Kanal harmanlama ve spesifik dichroics kullanan bir emisyon spektrumları farklı kısımlarının ayrılması Bu teknik genellikle yakın ya da hemen hemen üst üste emisyon spektrumu ile tek tek florofor görsel ya da otomatik tanımlanması için yararlıdır. Fototoksisite Bu 2P görüntüleme protokolü başka bir sınırlama olduğunu. Tek bir görüntüleme hacmi içinde Hücreler fototoksisite duyarlı; Bu nedenle, Deneyciler fototoksisite belirtileri hevesle farkında olmalıdır. Fototoksisite tipik olarak azaltılması veya hücre olmaması ilk belirgindirmotilite, lokal dokularda ve / veya morfolojik değişiklikler ışıkla ağartma eklenmiştir. Çeşitli faktörler doku fototoksisite giden veya canlı hücre görüntüleme için uygun hale getirerek zarar verebilir. Bu perfüze RPMI-1640 lazer gücü ve sıcaklık ve oksijen izlemek için çok önemlidir. Aşırı germe veya omurilik bası olmadan ve bıçaklar ile omuriliği kesmeden fare spinal kord uygun kaldırılmasını sağlamak için de zorunludur. Gerei Eğer on saat sonrası çıkarma hiçbir azalma ile birlikte ventral spinal kord içinde sağlam hücresel hareketlilik tarafından belirlendiği gibi, eksplante omurilik hazırlık, en fazla on saat boyunca canlı kalacaktır. Ekstre dokusunun çeşitli yaygın uzun uzunlukları için görüntülü ve 23-26 canlı kabul edilir. Bu nedenle, tek bir omurilik dokusu içinde birden çok bölgede hücresel dinamiklerinin ölçümü mümkündür. Son olarak, not edilmelidir ki hücreler tha büyük çoğunluğut floresan (doğal autofluorescent sürece) bu hazırlık tarafından görüntülenmiştir olmayacak etiketli değildir, ve bu etiketli hücreleri diğer etiketsiz, görünüşte görünmez endojen hücreler ve yapısal elemanların karmaşık bir çevre ile etkileşim kabul etmek önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Piramal Critical Care, Inc N/A
Fine scissors Fine Science Tools 14060-09 sharp
scalpel blade #10 Fine Science Tools 10010-00
scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Luer rongeurs Fine Science Tools 16001-15
Graefe forceps Fine Science Tools 11052-10
Vannas scissors Fine Science Tools 15615-08
scalpel blade #11 Fine Science Tools 10011-00
RPMI-1640 Gibco 12-115F
agarose, low gelling temperature Sigma A9414-25G
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12
Vetbond (tissue adhesive) 3M 1469SB
22 mm square cover slip Fisher Scientific 12-547
25X dipping objective, 1.1 NA Nikon CFI Apo LWD 25XW
Single inline solution heater Warner Instruments 64-0102
520 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF520-Di02-25x36 Brightline
560 nm single-edge dichroic beam splitter Semrock FF560-FDi01-25x36 Brightline
photomultiplier tubes Hamamatsu R928
C/L variable-speed tubing pump Masterflex 77122-22
digital thermometer Comar Instruments 3501
Chameleon Ultra Ti:Sapphire laser  Coherent N/A
Slidebook 6 software 3i N/A
Imaris 7.7 software Bitplane N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456, (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212, (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187, (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224, (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235, (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422, (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30, (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35 (2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86, (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177, (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834 (2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30, (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17, (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826 (2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9, (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22 (2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590, (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12, (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8, (3), e58033 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics