A Большой процедура Боковой Краниотомии для мезомасштабного широкоугольных оптического Визуализация активности мозга

* These authors contributed equally
Neuroscience

GE Global Research must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот протокол представляет собой метод создания большого односторонний краниотомия над височной и теменной областей коры головного мозга мыши. Это особенно полезно для реального времени визуализации более экспансивной области коркового полушария.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity. J. Vis. Exp. (123), e52642, doi:10.3791/52642 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Краниотомия - это обычно выполняемая процедура, при которой мозг подвергается экспериментам in vivo . В исследованиях мыши большинство лабораторий используют небольшую краниотомию, обычно 3 мм x 3 мм. Этот протокол вводит метод создания значительно большего 7 мм х 6 мм краниального окна, обнажающего большую часть полушария головного мозга над височной и теменной корой ( например, bregma 2,5-4,5 мм, боковые 0-6 мм). Чтобы выполнить эту операцию, голова должна быть наклонена приблизительно на 30 °, и большая часть височной мышцы должна быть втянута. Из-за большого количества удаления кости эта процедура предназначена только для острых экспериментов с животными, которых анестезировали во время операции и эксперимента.

Главным преимуществом этого инновационного большого бокового краниального окна является одновременный доступ как к медиальной, так и к боковым областям коры. Это большое одностороннее краниальное окно может быть использовано для изучения нейронной динамики между клетками,а также между различными областями коры путем объединения нескольких электродов электрофизиологических записей, визуализации нейронной активности (например, внутреннее или внешнее изображения), и оптогенетики стимуляции. Кроме того, эта большая краниотомия также предоставляет большую площадь корковых кровеносных сосудов, что позволяет для прямого манипулирования бокового корковых сосудистой сети.

Introduction

Краниотомию является стандартной процедурой используется неврологами, чтобы показать часть мозга. Испокон электрофизиологии, трепанация позволила беспрецедентным прорывы в области нейробиологии. Плотные картирование коры головного мозга с электродами приводят к экспериментам для проверки гипотез и теорий, основанных на этих картах. Недавно мы вступили в новую эру , где краниотомия утилизируется для получения изображения в естественных условиях коркового кровотока 1, 2, 3 и сосудисто архитектуры 4, что позволяет в реальном времени визуализации корковой активности в открытых участках 5, 6, 7. Хотя многие исследования используют краниотомии в сочетании с методами оптической визуализации в естественных условиях для изучения структуры и функции корковых нейронов, глии и кора8 , 9 дальнейшие исследования ограничены небольшими участками открытой коры (см. 10 ).

Цель этого протокола заключается в том, чтобы предоставить способ создания крупной боковой краниотомии, подвергая кору головного мозга от средней линии до кости чешуи и выходящей за пределы брегмы и лямбды. Эта крупная краниотомия позволяет одновременно наблюдать коры ассоциации (ретросплениальный, поясной и париетальный), первичный и вторичный мотор, соматосенсорный, зрительный и слуховой коры. Этот метод ранее был связан с чувствительным к напряжению изображением красителя (VSDI), чтобы исследовать, как несколько областей коры взаимодействуют друг с другом во время спонтанной и индуцированной стимулом кортикальной активности 5 , 11 , 12 . Наиболее сложными аспектами этой процедуры являются позиционирование головыживотное, фиксируя пластины головки, и избегая кровоизлияние при отделении височной мышцы от теменной кости. Кроме того, следует принимать во время процессов бурения и удаления черепа как кривые черепов под косым углом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующий протокол следует Университет Летбридж животных комитета Care (ACC) руководящих принципов, и проводится в соответствии со стандартами Канадского совета по уходу за животными (ССАС).

1. Подготовка

  1. Для длительных периодов исследования, автоклав всех открытых хирургических материалов и обеспечить стерильность сохраняется в течение операции. Если несколько операций требуется, автоклавный между операциями.
  2. Убедитесь, что есть много буфера мозга на руках (по крайней мере, 50 мл). Раствор состоит из 134 мМ хлорида натрия, 5,4 мМ калиев, 1 мМ гексагидрата хлорида магния, дигидрата хлорида кальция 1,8 мМ и 5 мМ HEPES натрия, рН 7,4 сбалансированного с хлористыми 5 М водорода.
  3. Поместите мышь в индукционной камере и анестезию с 3 - 4% изофлураном. Следуйте с 1,0 - 2,0% изофлураном для поддержания во время операции. Дальнейшее сокращение до минимального 0,4 - 0,8% во время формирования изображенияS = "xref"> 5 , 13 , 14 , 15 , при условии поддержания надлежащей анестезии. Эти низкие уровни анестезии требуют бдительного и частого наблюдения за мышью (примерно каждые 5 минут), чтобы убедиться, что она остается изофлексической к болевым стимулам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обезвоживание может стать проблематичным из-за высокого отношения поверхности к объему мыши и усугубляется длительным использованием изофлурана.
    1. Используйте подкожные инъекции физиологического раствора, 0,1 мл на 10 г веса тела, каждые 1 - 2 часа. При достаточной гидратации мышь будет мочиться один раз каждые 1-2 часа.
  4. Внимательно контролируйте мышь, чтобы обеспечить постоянную анестезию во время операции и визуализации. Не оставляйте мышь без присмотра и следите за тем, чтобы она никогда не пришла в сознание.
  5. Перенесите обезболиваемую мышь в подставку держателя и установите на терморегулирующую грелку, установленную на 37 ° C. Закрепите верхнюю тройкуч в держателе зубов.
  6. Поворот головы мыши в направлении влево примерно на 30 ° , чтобы выставить правую боковую сторону головы и зафиксировать голову мыши с тупым концом стержней уха (Фигура 1А).
  7. Применение глазной мази для предотвращения высыхания роговицы.
  8. Для уменьшения отека мозга, инъекция дексаметазона (4 мг / кг) внутримышечно.
  9. Протрите кожу над хирургической областью с ватным тампоном, смоченным в 4% хлоргексидине (3 раза) и 70% -ный этанола (3 раза). Используйте каждый ватный тампон только один раз.
  10. Донские хирургические перчатки и покрывают животное с клейкой полиэтиленовой пленкой. Обеспечить местную анестезию путем инъекции лидокаина (8 - 10 мг / кг; 2% эпинефрина) подкожно через сайт краниотомии. Подождите 3 - 5 мин для лекарственного средства, чтобы быть поглощенными в ткань.

2. Удаление кожи и втягивание мышц от черепа

  1. Выполните почти все эти процедуры при просмотре черепа в аРассекающий микроскоп ( например, мощность 0,7-4,5 раз, в зависимости от ситуации).
  2. Поднимите кожу на 1 мм слева от срединной линии (сразу за ухом) щипцами и сделайте небольшой горизонтальный разрез хирургическими ножницами.
  3. Сделайте боковой разрез 5-6 мм к правому уху, а затем разрежьте к ростральному концу головы.
  4. При начальной точке разреза вставьте ножницы и отрежьте 10 мм рострально.
  5. Обрежьте кожу вокруг правого уха и возле правого глаза, чтобы обнажить правую сторону черепа и височную мышцу. Убедитесь, что самая широкая часть открытой области не менее 7 мм. Обрезайте кожу дальше, если хирургическая область должна быть расширена.
  6. Закрепите кожу вокруг надреза, поместив несколько капель бутилцианоакрилатного клея между черепом и кожей. Обеспечьте, чтобы ткань была предварительно высушена с помощью аппликаторов с хлопчатобумажным покрытием или прокатанных тканей, чтобы повысить эффективность клея.
  7. Используя ватный тампон, протрите поверхностьчерепа в круговом движении, чтобы удалить из надкостницы черепа. Убедитесь в том, что никто не остается на полностью высушивание черепа.
  8. Используя пружинные ножницы и пинцет, отделить от височной мышцы черепа; вырезать и не втягивать мышцы в поперечном направлении до достижения чешуйчатой кости (рис 1C). Проявляйте особую осторожность, чтобы не повредить поверхностную височную вену, которая проходит вдоль уровня чешуйчатой ​​кости вблизи глаза, в противном случае может произойти кровоизлияние.
  9. Контроль кровотечение с гелем пены предварительно замачивали в буфере мозга. Для серьезных кровотечений использовать тепло cauterizer. Отбросьте бутиловый цианакрилатный клей на участки кровотечения после обработки с тепловым cauterizer. Убедитесь, что область сушат заранее с помощью хлопка наконечником аппликаторы или свернутые ткани, чтобы повысить эффективность клея.

3. Краниотомия

Примечание: Хирург должен оставаться прилежным во время удаления черепа иТвердые, чтобы избежать ненужных осложнений. Действия по устранению неполадок включены должны возникнуть осложнения.

  1. Отметьте расположение темени либо с тонким кончиком маркера или вырезать небольшой треугольный кусок ленты и указать угол на темени (Рисунок 2A) , чтобы ориентировать основные области мозга.
  2. До крепления головки пластины убедитесь, что череп полностью высохнет. Черепа быстро высохнуть на воздухе после нанесения пены гель замачивают в буфере мозга, если больше сушки необходимо, использовать ватные тампоны наконечник. Этот шаг является решающим для головы пластины фиксации (Фиг.).
    Примечание: Если есть надкостницы слева на черепе, или если череп не сухой перед склеиванием на верхней плите, она, вероятно, будет отделяться. Если это произойдет, аккуратно удалите голову пластину и начать все сначала. Кровотечение может произойти в ходе этого процесса; позволяют несколько минут для того, чтобы свернуться, а затем аккуратно удалить. Этот процесс не рекомендуется повторять более чем в два раза.
  3. <литий> Применить Этилцианакрилат клей вокруг нижней кромки пластины головки 16, и склеить пластины головки над краниотомией области (рис 1D и фиг.2).
  4. Заполните отверстие пространства между черепом и траверсой с зубными цемента оставляя только область краниотомии воздействию. Дождитесь зубного цемента , чтобы высушить и затвердевают, обычно 5 - 10 мин (рис 2В).
    1. После того, как цемент установлен, на короткое время заполнения скважины с буфером мозга и позволяют впитаться в течение 3 - 5 мин. Используйте свернутую ткань для удаления буфера мозга перед бурением (фиг.2с).
  5. Outline хирургической области, слегка забив поверхность черепа с бормашиной. Используйте дрель (пневматический набор максимум до 20 PSI), с FG ¼ заусенцев, и управляется с помощью переменной скорости педали ноги.
  6. Аккуратно проследить сверло по исходному скоринг углубить его, еnsuring сверла не проникает через череп в мозг (рис 2D). Сменяться каждые несколько минут между бурением и вытирать поверхность черепа с увлажненными рулонными тканями. Это позволит уменьшить нагрев и сушку черепа от механического трения и длительной экспозиции.
    Примечание: Череп быстро высохнуть на воздухе после нанесения пены влажного геля. Если больше сушки необходима, используйте ватные тампоны наконечника.
    Внимание: Череп неравномерно по толщине. Например, теменной-временный хребет является самой толстой областью, в то время как череп области вблизи средней линии и чешуйчатые ориентиры являются относительно тонких.
  7. Во время бурения, периодически проверять наличие продольного изгиба черепа, слегка нажав на него пинцетом или бурового долота без движущейся. Когда кость начинает пряжку, прекратить бурение и погрузить все окно в буфере мозга.
    Примечание: Если кровь устремляется из области, то можно предположить, что Твердый было повреждено. Если это так, то место СЭМя мокрый гель пена над районом и попытаться впитать кровь, мягко применяя давление на пену геля с хлопком наконечником тампоном.
  8. Подождите, по крайней мере, 5 минут перед удалением черепа, чтобы смягчить кости и уменьшить вероятность твердой мозговой оболочки, торчащие к кости, что делает процесс удаления черепа легче.
  9. Выполните процесс удаления черепа, а череп погружают в буфере мозга.
    Примечание: Если часть черепа остается упорно прилагается, скальпель лезвие # 11 может быть использовано, чтобы аккуратно забить череп. Проявляйте особую осторожность, чтобы не проколоть лезвие через череп и в мозг.
  10. Начиная от переднего края, аккуратно приподнимите свободный череп с твердой мозговой оболочки с помощью щипцов.
    Примечание: Если небольшое количество кровотечения возникает в процессе удаления черепа, удалить буфер с передачей пипеткой или шприцем, а затем заменить новый буфер.
  11. После того, как кость свободно и «плавающий» на ТМО, крепко возьмитесь за кость с пинцетом и приподнять кость отТвердой мозговой оболочки. Убедитесь, что кость никогда не проникает в мозг.
  12. Для контроля кровотечения поверните уголок ткани в точку и удалите большую часть буфера из краниальной лунки. Быстро нанесите гель-пену, предварительно пропитанную в буфере, в область кровоточивости, добавляя очень легкое давление с помощью тампона с хлопковым кончиком.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Кровотечение обычно происходит от края кости или поверхности твердой мозговой оболочки; Оба случая нормальные и кровотечение быстро прекратится, если не повреждены крупные кровеносные сосуды. Если кровотечение продолжается, кровь может заполнить все окно, образуя сгусток над областью визуализации.
    1. Чтобы удалить лист сгустка, аккуратно возьмите куски свернувшейся крови из области визуализации, оставляя сгусток крови неповрежденным вокруг источника разрыва кровеносного сосуда. Старайтесь не удалять сгусток крови из источника кровотока, так как это может привести к еще большей кровопотере. Орошайте поверхность мозга буфером мозга, чтобы смыть любую кровь.
    2. Будьте осторожны, чтобы не касатьсятонкая ткань мозга или добавление инородного материала в мозг; повторить , пока кровотечение не остановилось, приблизительно в течение 2 - 5 мин (рис 2Е).
      Примечание: На данный момент, трепанация готова к подготовке черепного окна (см шага 5). При необходимости удалить твердую мозговую оболочку, прежде чем имплантировать черепной окно (см шаг 4).

4. Dura Удаление

Примечание: удаление Dura требует крайней осторожности и может принять в течение 15 мин.

  1. Нарисуйте излишки буфера от трепанации. При сохранении влажную поверхность, возьмите небольшой кусочек твердой мозговой оболочки с пинцетом и аккуратно разорвать твердую мозговую оболочку.
  2. Используйте пинцет и пружинные ножницы, чтобы осторожно оторвать и отрезать твердую мозговую оболочку.
  3. Отбросьте больше буфера мозга на поверхности мозга, чтобы плавать и твердую мозговую оболочку помочь ему отделить от мозга. Продолжайте, пока все Твердое не будет удален из черепного сайта окна. При правильном выполнении мозг будет казаться очень чистым с отчетливым блOOD сосуды и никаких пятен (сравните рис 2E с 2F).
    Внимание: Некоторые области ТМО прикреплены к малому артериолу на поверхности мозга (например, вблизи средней линии ближайшего к ассоциативной области теменной), и удаление таких может привести к разрыву артериола. В таких случаях может быть лучше оставить небольшой кусочек ТМО неповрежденной поверх артериол. ВСД не может проникнуть в эту небольшую область, но это предпочтительно, имеющий главное кровотечение.
  4. Закрепить поверхность мозга в агарозе, как можно скорее, чтобы минимизировать движение от пульсации и предотвратить дальнейший отек (см шаг 5).

5. Подготовка Черепного Окна

  1. Спрей покровного стекла с 70% -ным этанолом и использовать воздушный баллон, чтобы мягко сухой. Убедитесь, что стекло является абсолютно чистым, без пятен или пыль настоящего времени.
  2. Подготовьте 1,3% агарозы нагревания 200 мг агарозного порошка, растворенных в 15 мл буфера мозга. Установите микпр с высоким и высокой температурой в течение 10 - 15 с, в то время, осторожное перемешивание в периоде, пока весь агар не растворятся.
    Примечание: Убедитесь, что никаких пузырей или частиц нет, так как они будут мешать визуализации.
  3. Поместите термометр в горячих агарозах и охладить агарозы до чуть выше температур затвердевания (~ 40 ° С).
    Примечание: Запуск холодной воды за пределы контейнера агарозного может ускорить процесс охлаждения. Аккуратно перемешать непрерывно, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков или твердые частицы присутствуют.
  4. Непосредственно перед нанесением агара, удалить буфер мозга из черепной скважины. Оформите агарозы с пипеткой передачи и падение агарозы непосредственно на мозге. Быстро поместить крышку скольжение по поверхности и закрепить крышку скольжение с агарозами капель по углам.

6. Эвтаназия

Примечание: В нашем опыте, эта процедура занимает опытные хирурги по крайней мере 3 - 4 практика операции для достижения более чем на 90%Шанс успеха. Менее опытные хирурги могут потребовать даже больше практики. Во время краниотомии или durotomy, мозг может привести к повреждению, например, при бурильных пуансонах через кость в мозг. Некоторые незначительные повреждения на краю краниотомии допустимы. Однако, если мозг не выглядит «чистый» с ярко-красными неповрежденными кровеносными сосудами и белой коры, эксперимент, возможно, должен быть прекращен. Примеры плохих препаратов включают мертвый кровеносных сосудов, или когда кора головного мозга отмечена рваными или поврежденные кровеносные сосуды. Если какой-либо из этих признаков присутствуют, эксперимент вряд ли выход данных высокого качества. Было ли успешным или нет операции / эксперимент, гуманно усыпить мыши по окончании эксперимента.

  1. Глубоко анестезия с, по меньшей мере, 3,5% изофлураном. Затем дают внутрибрюшинную инъекцию пентобарбитала натрия при 300 мг / кг. В идеале, если игла вставлена ​​в печень, смерть будет очень быстрой (<1 мин).
  2. Если требуется перфузия, убедитесь, что животное находится глубоко под наркозом, прежде чем продолжить (см шаг 1.3).
  3. С другой стороны, если перфузия не требуется, подождите как минимум 5 минут, а затем проверить, что мышь мертва. Подтвердить отсутствие дыхания, сердцебиения, а также отсутствие снятия боли и рефлексов роговицы. Кроме того, наблюдать за бледно-голубые / белые окраски конечностей и потемнение кровеносных сосудов над корой.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Для изучения взаимодействий между областями коры в пределах одного полушария, мы использовали большую краниотомию, проходящую через сагиттальный синус и 5 - 6 мм сбоку. Это окно черепных входит первичный (двигатель, соматосенсорной, зрительные, слуховые), вторичный (двигатель, визуальный) и ассоциацию (ретроспленальной, поясной извилины, париетальной ассоциации) коре правого полушарий головного мозга (фиг.3А). Для этой работы мы использовали напряжение чувствительного красителя (VSD) томографию, которая отражает изменения мембранного потенциала 3. Этот протокол также будет полезным для других приобретенных (например, кальция 17 и глутамат 18 изображений) или собственных экспериментов с изображениями. При стимуляции задних конечностей, передние конечности, усы, визуальные или слуховая система слегка наркоз мышея с использованием 0,5% изофлурана, мы наблюдали консенсус закономерность корковой деполяризации (> Фигура 3В). В соответствии с предыдущими исследованиями 5, 19, 20, 21, 22, мы обнаружили , что кратко тактильная стимуляция C2 ствола мозга приводило к активации первичных соматосенсорных областей, а также «острова» ответов в рамках функционально смежных областях. Например, первичный двигатель кора (М1) или вторичное представление соматосенсорной коры (S2; Рисунок 3Bi). Один 1 мс тон пип (25 кГц) стимуляция привела к активации первичной слуховой коры (А1) приблизительно 20 мс после стимуляции слухового (рис 3Bii). В течение следующих нескольких миллисекунд, деполяризация распространяется через слуховую кору и передается соседней вторичной соматосенсорной коре. Приблизительно 25 мс после того, как тон начала, вторичное кортикальной деполяризации бы появиться, расположенный 1,07; 0,2 мм медиальных и 1,9 ± 0,1 мм по отношению к задней брегме (п = 9 мышея). Это приблизительно местоположение области париетальной ассоциации (РТА). Сигнал ПЧ затем размножают в области срединной линии, где другие области коры головного мозга ассоциации расположены в том числе ретроспленальной (RS) и поясной извилины (CG). Таким образом, стимуляция слуховая привела к активации двух отдельных целевых областей, из которых бегущих волн ВСД деполяризации распространилась на большую площадь в пределах средней линии мозга. Фокусное раздражение контралатерального глаза с зеленым 1 мс LED импульс, привело к активации первичной зрительной коры в пределах 40 мс (рис 3BV). Эта первичная активация зрительной коры последовало: (1) пространственного расширения VSD деполяризации в соседних участках, расположенных медиально, латерально и кпереди от начальной активированной области; (2) Деполяризация второй медиальной кортикальной области приблизительно 50 мс после стимуляции (N = 8 экспериментов), расположенных вдоль са gittal шовный. Это было похоже на сенсорные раздражения передних конечностей (рис 3Biii), рис (задние конечности 3Biv), C2 усы или прослушивание. Вызванные ответы VSDI от сенсорной стимуляции передних конечностей, задних конечностей или прослушивания первоначально активируются соответствующая первичная сенсорная кора, с последующим распространением анизотропной активности, а также активациями средней линии коры около 20 - 40 мса после стимуляции. Этот результат был похож на ответы от визуальной и усов стимуляции. Распространение сенсорной-вызванная активность вдоль этих срединных путей и частой активации того же областей спонтанной активности-можно предположить , что эти регионы являются центральным узлом соединительного сердечника коры мыши, в котором сенсорная информация может интегрироваться с спонтанной активностью коры.

2fig1.jpg»/>
Рисунок 1. Хирургическая Установка и подготовка. Головка (А) Мышь бреет, очистила, повернет приблизительно на 30 ° для бокового воздействия, и закреплена с тупым концом уха стержней. Isoflurane анестетик доставляются через кусок носа и держатель зубов. Мышь покрыта самоклеящейся полиэтиленовой пленкой для повышения стерильности и тепла. (Б) Крупные план , показывающие кожи и надкостницы удалены из теменного черепа пластины, височная мышца нетронутая. (C) височная мышца удаляется с обнажением временной пластины и чешуйчатой костью, обратите внимание , что поверхностные вены не имеют повреждения. (D) Перед фиксацией, головка пластина расположена в нужном месте с воском. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


Рисунок 2. Шаг за шагом хирургической процедуры. (А) Головка-пластина прикреплена к черепу с Этилцианакрилатом клеем на передние и задних местах. Обратите внимание на расположение темени (черный кусок треугольной ленты). (B) черепных окна получают путем нанесения утолщенную стоматологического цемента между головной пластины и черепа. Обратите внимание, что брегмы и чешуйчатые ориентиры остаются видимыми. (С) После сушки цемента, буфер мозга добавляется , чтобы смягчить череп и предотвратить адгезию твердой мозговой оболочки. Свернутая ткань поможет удалению буфера мозга до бурения. (D) Края трепанации были забиты. Обратите внимание на сосудистую систему более легко увидеть через утонченной кости вблизи зубных цементных краев. (E) теменная и височный череп пластина была УДАЛАред и Твердая видна. Примечание пятна крови на ТМО от незначительного кровотечения, что является нормальным. Тщательное обследование при 2 - 4-кратном увеличении покажет два слой кровеносных сосудов, один в ТМО, а других в Пиа. (F) , Твердый, удаляется выявление нетронутых коры головного мозга. Пиальные васкулатура ярко-красного цвета, без пятен, присутствующих. Обратите внимание, беспризорные куски белого цвета ТМО по краям черепной окна. В этом примере, была незначительной дуральная отводимого на задней части черепа окна, которые быстро свернувшейся. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Уникальная и Консенсус активация Patterns во время многочисленных форм сенсорной стимуляции. < / сильный> (А) Схема односторонний краниотомии , показывающая изображаемые корковые регионы. (Б) Микрофотография широкой односторонний краниотомии с темени , обозначенными белым кругом в каждом изображении. Модели корковой активации приведены в мыши под наркозом с изофлуран (0,5%) после (I) стимуляции (стят) контралатеральной C2 усов, (II) слуховая стимуляцию, (III) стимуляция контралатеральной передней конечности, (IV) контралатеральные задние конечности стимуляция и (v) визуальная стимуляция контралатерального глаза с светоизлучающим диодом (LED). Были срединные активации после всех форм сенсорной стимуляции (белые стрелки) на 10 - 25 мса после первичной сенсорной активации коры головного мозга. Ответы представляют собой среднее из 20 испытаний. Изображение второй слева во втором ряду (II) указывает на переднюю (А), задний (P), медиальной (M) и боковые (L) направления. Модифицированный с разрешения Мохаджерани, и др., 2013.p_upload / 52642 / 52642fig3large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот инновационный протокол для большого черепного окна позволяет одновременно томографию над височной и теменной областей коры головного мозга. В сочетании с оптической визуализацией, он может помочь выявить нейронную динамику в пределах областей коры при спонтанной и стимуле-индуцированной активности. Это экспансивная краниотомия также предоставляет большое расширение кортикальной сети, в том числе сосудистой проксимального конца средней мозговой артерии (MCA), что позволяет в естественных условиях визуализации кровотока и прямого манипулирование боковых сосудов для ишемических моделей. Эта техника будет иметь большое применение для недавно разработанных линий мышей , экспрессирующих напряжения и индикаторные кальция белки 23. Эти мыши обеспечивают практическое преимущество, минуя необходимость инкубирования напряжения чувствительных красителей на коре. Эти внешние красители занять некоторое время, чтобы адекватно проникать в ткани мозга (~ 60 - 90 мин) и ограничены их легкой токсичностью. Большие краниотомии имеют такжебыли ранее использованы для изучения развивающегося мозга крысы с VSDI 11. Новорожденные крысы имеют гораздо большую голову и сравним по размерам с взрослым мышеем. Это дает исследователям уникальную возможность изучить проблемы развития в области неврологии, хотя и не с трансгенными мышами.

Основные недостатки этого способа являются невозможность при хронических экспериментах. Кривизна черепа делает процесс бурения более сложным и трудоемким, чем более мелкие краниотомии. Для этого большого краниотомии, жизненно важно, чтобы позиционировать головку с центральным шовных и чешуйчатой ​​ориентиров быть параллельна плоскости фокусировки объектива. В то время как некоторые искажения мозга, как ожидается, от кривизны мозга, они преодолеваются, сосредоточив в поверхностные слои коры. Эта проблема дополнительно облегчается за счет получения многочисленных повторений стимуляции и усреднения. Таким образом, наша большая техника краниотомия широко приложениеПригодный для изучения текущих проблем нейробиологии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана естественных и технических наук исследовательский совет Канады (NSERC) Discovery Grant # 40352, Campus Alberta инновационной программы кафедры, программы исследований Альберты Альцгеймера в MHM, и NSERC CREATE в БИФ докторских стипендий и AIHS послевузовского общения с МК. Мы благодарим Pu Мин Ван для развития этого протокола и для хирургической подготовки и Беру Мирза Ага и Ди Шао для животноводства.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Heating Pad FHC 40-90-2
Fine Scissors Fine Science Tools 14058-09
Forceps  Fine Science Tools 11251-35 2 or more pairs are recommended
Spring scissors Fine Science Tools 15000-00, 15000-10 1 pair should be designated for dura removal 
Jet tooth shade powder LANG Dental Jet Tooth Shade Powder to be mixed with the Jet Liquid
Jet tooth shade liquid LANG Dental Jet Tooth Shade Liquid to be mixed wihth the Jet Powder 
Drill Heads - Carbide Burs FG 1/4 389 Midwest Dental 385201
Agarose Powder Sigma-Aldrich A9793
Gelfoam Sinclair Dental Canada Pfizer Gelfoam
Isoflurane Western Drug Distribution Centre Ltd 124125
Lidocaine 2% Epinephrine Western Drug Distribution Centre Ltd 125299
Dexamethazone 5 mg/mL Western Drug Distribution Centre Ltd 125231
Butyl cyanoacrylate glue (VetBond) Western Drug Distribution Centre Ltd 12612

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sigler, A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Imaging rapid redistribution of sensory-evoked depolarization through existing cortical pathways after targeted stroke in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (28), 11759-11764 (2009).
  2. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, (7), 1277-1309 (2012).
  3. Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nat Rev Neurosci. 5, (11), 874-885 (2004).
  4. Blinder, P., Shih, A. Y., Rafie, C., Kleinfeld, D. Topological basis for the robust distribution of blood to rodent neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (28), 12670-12675 (2010).
  5. Mohajerani, M. H., et al. Spontaneous cortical activity alternates between motifs defined by regional axonal projections. Nat Neurosci. 16, (10), 1426-1435 (2013).
  6. Mohajerani, M. H., McVea, D. A., Fingas, M., Murphy, T. H. Mirrored bilateral slow-wave cortical activity within local circuits revealed by fast bihemispheric voltage-sensitive dye imaging in anesthetized and awake mice. J Neurosci. 30, (10), 3745-3751 (2010).
  7. Lippert, M. T., Takagaki, K., Xu, W., Huang, X., Wu, J. Y. Methods for voltage-sensitive dye imaging of rat cortical activity with high signal-to-noise ratio. J Neurophysiol. 98, (1), 502-512 (2007).
  8. Misgeld, T., Kerschensteiner, M. In vivo imaging of the diseased nervous system. Nat Rev Neurosci. 7, (6), 449-463 (2006).
  9. Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nat Rev Neurosci. 9, (3), 195-205 (2008).
  10. Aronoff, R., et al. Long-range connectivity of mouse primary somatosensory barrel cortex. Eur J Neurosci. 31, (12), 2221-2233 (2010).
  11. McVea, D. A., Mohajerani, M. H., Murphy, T. H. Voltage-sensitive dye imaging reveals dynamic spatiotemporal properties of cortical activity after spontaneous muscle twitches in the newborn rat. J Neurosci. 32, (32), 10982-10994 (2012).
  12. Sweetnam, D., et al. Diabetes impairs cortical plasticity and functional recovery following ischemic stroke. J Neurosci. 32, (15), 5132-5143 (2012).
  13. Yin, Y. Q., et al. In vivo field recordings effectively monitor the mouse cortex and hippocampus under isoflurane anesthesia. Neural Regeneration Research. 11, (12), 1951-1955 (2016).
  14. Sharp, P. S., et al. Comparison of stimulus-evoked cerebral hemodynamics in the awake mouse and under a novel anesthetic regime. Scientific Reports. 5, 12621 (2015).
  15. Kyweriga, M., Mohajerani, M. H. Optogenetics: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. Kianianmomeni, A. 1408, Humana Press Inc. 251-265 (2016).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Imaging in neuroscience and development : a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  17. Vanni, M. P., Murphy, T. H. Mesoscale transcranial spontaneous activity mapping in GCaMP3 transgenic mice reveals extensive reciprocal connections between areas of somatomotor cortex. J Neurosci. 34, (48), 15931-15946 (2014).
  18. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36, (4), 1261-1272 (2016).
  19. Chan, A. W., Mohajerani, M. H., LeDue, J. M., Wang, Y. T., Murphy, T. H. Mesoscale infraslow spontaneous membrane potential fluctuations recapitulate high-frequency activity cortical motifs. Nat Commun. 6, 7738 (2015).
  20. Lim, D. H., et al. In vivo Large-Scale Cortical Mapping Using Channelrhodopsin-2 Stimulation in Transgenic Mice Reveals Asymmetric and Reciprocal Relationships between Cortical Areas. Front Neural Circuits. 6, (2012).
  21. Ferezou, I., et al. Spatiotemporal dynamics of cortical sensorimotor integration in behaving mice. Neuron. 56, (5), 907-923 (2007).
  22. Mohajerani, M. H., Aminoltejari, K., Murphy, T. H. Targeted mini-strokes produce changes in interhemispheric sensory signal processing that are indicative of disinhibition within minutes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (22), E183-E191 (2011).
  23. Madisen, L., et al. Transgenic mice for intersectional targeting of neural sensors and effectors with high specificity and performance. Neuron. 85, (5), 942-958 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics